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CN115003626A - 纳米结构二元凝胶组合物及其用途 - Google Patents

纳米结构二元凝胶组合物及其用途 Download PDF

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CN115003626A
CN115003626A CN202080094752.2A CN202080094752A CN115003626A CN 115003626 A CN115003626 A CN 115003626A CN 202080094752 A CN202080094752 A CN 202080094752A CN 115003626 A CN115003626 A CN 115003626A
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polymer
quaternary ammonium
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吉列尔莫·U·鲁伊兹·埃斯帕扎·埃雷拉
康尼·昌
科田·张
萨姆森·阿费维尔基
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Willie Nano Co ltd
Original Assignee
Willie Nano Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种组合物，该组合物包含多个硅酸盐纳米颗粒、亲水性聚合物和水，以及任选地还包含增稠聚合物、多个氧化锌颗粒、含有多个季铵官能团的聚合物、粘附性聚合物、油或多元醇。本发明还涉及该组合物在预防和/或治疗哺乳动物疾病如皮肤病或乳腺炎中的用途。本发明进一步涉及一种包含所述组合物的哺乳动物体内的导管密封剂。

Description

纳米结构二元凝胶组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种包含多个硅酸盐纳米颗粒和亲水性聚合物的水凝胶组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物的疾病如皮肤病或乳腺炎。本发明还涉及一种包含所述组合物的哺乳动物体内导管密封剂。
背景技术
伤口、组织和器官的微生物感染会影响组织的生理机能和愈合过程。微生物感染可导致危及生命的并发症。
在动物疾病领域，乳腺炎，一种灾难性的乳腺炎症过程，是美国奶牛业最常见和最费钱的疾病。
乳腺炎表现为由免疫细胞介导的局部炎症反应，以响应乳头管的微生物入侵，或为化学、机械或热损伤的结果。在微生物感染的情况下，毒素和促炎细胞因子被释放，导致分泌奶的组织和乳腺导管受损，造成乳腺炎。挤奶后微生物感染的机会尤其增多，因为乳头管保持开放15min，这潜在地将导管暴露于污垢、粪便、尿液或其他病原体中。当涉及病原体时，在反复接触受污染的设备和材料后，或使用受污染的手套或手后，可能会传播给其他动物。
乳腺炎可通过观察乳房腺体组织的病理变化如炎症(发热、疼痛、发红和肿胀)、气味和溃疡等来诊断。
由于这种疾病，可以观察到奶成分和外观的变化，从而导致奶质量下降，例如钙、酪蛋白、钾或乳铁蛋白的浓度可能会下降，并且可以观察到含有一些聚集物的奶水稠度更高。奶中体细胞水平的增加可用于诊断乳腺炎。
细菌性乳腺炎可以用抗生素治疗。然而，在药物代谢物从牛体内清除之前，治疗的牛的奶不能供人类食用。尽管接种疫苗可以降低疾病的严重程度，但这种方法已被证明从长远来看是无效的，因为由于存在多种微生物，这种方法不能预防乳腺炎。
在很大程度上，可以通过使用无菌挤奶程序来预防感染；这种程序的第一步包括以喷雾形式将碘施加到乳头和周围区域，第二步在挤奶前擦拭和干燥，以及第三步将挤奶设备应用于乳头管。挤奶结束后，仔细清洁乳头以防止细菌滋生。目前，存在几种预防或治疗乳腺炎的商业产品，例如
Figure BDA0003767061060000021
Figure BDA0003767061060000022
等，它们旨在在挤奶后给予，以形成物理屏障并阻塞乳头管的入口，以防止内部细菌浸润或释放抗生素，从而治疗局部感染。
需要一种用于治疗或预防人类和动物的微生物乳腺炎或用于治疗或预防人类和动物损伤的微生物感染的抗菌密封剂。还需要有效治疗人类和动物感染的局部损伤。
发明内容
本发明的目的是至少部分地克服上述问题，并提供一种改进的用于预防和治疗感染、尤其是奶牛乳腺炎的组合物。
该目的通过包含以下物质或由以下物质组成的组合物实现：
多个硅酸盐纳米颗粒；
任选地，多个氧化锌颗粒；
亲水性聚合物；
增稠聚合物；
任选地，含有多个季铵官能团的聚合物；
任选地，粘附性聚合物；
任选地，油或多元醇；和
水。
在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的任一种组合物，其中所述组合物的pH为5-13。在某些方面，所述组合物的pH为7-13，或8-11。
根据本发明的一个方面，该组合物包含以下物质或由以下物质组成
多个硅酸盐纳米颗粒；
亲水性聚合物；和水，
以及任选地进一步包含增稠聚合物、多个氧化锌颗粒、含有多个季铵官能团的聚合物、粘附性聚合物、油或多元醇。
由于硅酸盐纳米颗粒的增稠性能，增稠聚合物和硅酸盐纳米颗粒可以是相同的成分。
该组合物为生物相容的且可生物降解的。该组合物为无毒的。硅酸盐纳米颗粒或纳米片在体内是稳定、安全且无刺激性的。它们还表现出抗炎性能。它们的表面带负电荷，边缘带正电荷。这种独特的电荷分布允许表面到边缘的静电相互作用，从而形成三维“纸牌屋”结构。当与组合物的其他组分结合时，形成物理上可逆的凝胶。在某些方面，如果组合物中存在某些离子，它们可以静电屏蔽相互作用，从而削弱纳米片的组装。例如，焦磷酸盐吸收到带正电荷的边缘，从而削弱三维结构的形成。在某些方面，该策略可用于逆转凝胶化；加入盐后凝胶很容易去除。
本文所述的组合物具有优于目前市场上的密封剂的优点，包括增强的易用性(包括给药和去除)。该组合物是弹性的(柔韧的)，该组合物为粘膜粘附性的，并且具有持久的组织粘附性。该组合物是可注射的(剪切稀化)。该组合物在约37℃下具有快速凝胶化时间。该组合物是惰性的。此外，在某些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物表现出可定制的剪切稀化性能，这使得在很宽的温度范围内易于输注以及通过从乳头管中手动剥离来去除。从体腔去除后，溶胶-凝胶聚合物组合物可以在室温下恢复为液相。此外，与目前的商业密封剂不同，本公开的组合物在挤奶的初始处理阶段不会粘在不锈钢管(例如，牛奶管线)或散装罐上，并且可以在标准冷水或热水清洗过程中容易地从工业表面清除，从而减少牛奶的污染。
在一些方面，硅酸盐纳米颗粒的特征尺寸为约1nm至约500nm，例如约10nm至约100nm，或约25nm。在一些方面，硅酸盐纳米颗粒的量为0.1重量％至15重量％、或3重量％至12重量％、或约10重量％。在一些方面，硅酸盐纳米颗粒为锂镁钠硅酸盐纳米颗粒。
在一些方面，亲水性聚合物选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：聚(环氧乙烷)、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素和泊洛沙姆(poloxamer)。在一些方面，亲水性聚合物为聚(环氧乙烷)。在一些方面，聚(环氧乙烷)(PEO)的分子量为约1kDa至约10,000,000kDa、或约15kDa至约25kDa、或约20kDa。在一些方面，亲水性聚合物或聚(环氧乙烷)的量为0.5重量％至10重量％、或1重量％至3重量％、或约2重量％。PEO是一种生物相容性且FDA批准的亲水性聚合物。当用作薄膜或物理屏障时，PEO通过表面空间排斥机制将把细胞或纤维蛋白排斥在受保护的组织外部。
由于硅酸盐纳米颗粒和亲水性聚合物的性能，例如粘附性、凝胶形成能力以及抗菌性能，可以获得包含多个硅酸盐纳米颗粒和亲水性聚合物或由多个硅酸盐纳米颗粒和亲水性聚合物组成的组合物并且该组合物可应用于此处提及的所有用途。这种组合物易于获得和制造。这种组合物的成本相对较低。对于所有预期用途，该组合物稳定、可生物降解且无毒。
在一些方面，增稠聚合物选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：硅酸盐纳米颗粒、硅酸盐纳米颗粒(Na0.7[(Mg5.5Li0.3)Si8O20(OH)4]0.7)
Figure BDA0003767061060000041
羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素和琼脂或其衍生物。在一些方面，增稠聚合物为羧甲基纤维素。在一些方面，25℃下，2重量％的增稠聚合物的水溶液的粘度为约200mPa至约2,000mPa、或约400mPa至约900mPa。在一些方面，增稠剂或羧甲基纤维素的量为3重量％至9重量％、或4重量％至8重量％、或约6重量％。增稠剂可以为硅酸盐纳米颗粒。如果需要额外的增稠剂，这些可以很容易地添加到组合物中以进一步提高组合物的稠度。该增稠剂易于以低成本提供、可生物降解且无毒。
例如，纳米硅酸盐
Figure BDA0003767061060000042
先前已被证明是可生物降解的，其降解为无毒产品，如硅酸(Si(OH)4、钠离子(Na+)、镁离子(Mg2+)和锂离子(Li+))(参见：H.Tomás,C.S.Alves,J.Rodrigues,
Figure BDA0003767061060000043
A key nanoplatform for biomedical applications？,Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and Medicine 14(2018)2407-2420)。如前所述增稠剂羧甲基纤维素也公认是可生物降解和无毒的(参见：C.G.VanGinkel,S.Gayton,Thebiodegradability and nontoxicity of carboxymethyl cellulose(DS O.7)andintermediates,Environmental Toxicology and Chemistry,1996,15,270-274)。此外，
Figure BDA0003767061060000051
和羧甲基纤维素因其增稠性能而被广泛用于改善各种制剂的流变性能(参见：F.R.Fitch,P.K.Jenness,S.E.Rangus,Rheological study of blends of Laponite andpolymeric thickeners,Advances in Measurement and Control of ColloidalProcessess,1991,292-307)。
Figure BDA0003767061060000052
是可以以低成本获得的市售纳米硅酸盐(参见：B.Y.K.Additives,Laponite:Performance Additives,Wesel,Germany)。已证明本发明的组合物没有细胞毒性，如图23A-23B和22A-22B所示。
在一些方面，含有多个季铵官能团的聚合物包含多个具有以下结构I的重复单元或由多个具有以下结构I的重复单元组成：
Figure BDA0003767061060000053
其中X-选自包括以下的组或由以下组成的组：Cl-、Br-、BF4 -和PF6 -。在一些方面，含有多个季铵官能团的聚合物选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：含有多个季铵官能团的壳聚糖。
在一些方面，含有多个季铵官能团的聚合物的量为0.2重量％至2重量％、或0.3重量％至10重量％、或约0.4重量％。
壳聚糖，当衍生至含有季铵官能团时，可具有抗微生物和粘膜粘附性能。聚合物可以改善组合物的粘膜粘附性能。含有多个季铵官能团的聚合物因此可以进一步改善组合物的抗微生物或抗感染性能。在这种情况下，众所周知，与相应的壳聚糖相比，季铵官能化的壳聚糖表现出提高的抗菌性能，其中一个原因是与带负电荷的微生物细胞膜的相互作用得到改善(R.C.Goy,D.de Britto,O.B.G.Assis,A review of the antimicrobial activityof chitosan,Polímeros,19,3,2009,241-247；和H.Y.Atay,Antibacterial Activity ofChitosan-Based Systems.In:Jana S.,(eds.)Functional Chitosan.Springer,Singapore,2020,457-489；和Afewerki,S.Bassous,N.Harb,S.Palo-Nieto,C.Ruiz-Esparza,G.U.Marciano,F.R.Webster,T.J.Lobo,A.O.Advances in antimicrobial andosteoinductive biomaterials,In Racing the surface(ed.B.Li等人)SpringerNature,2020,3-34；和Afewerki,S.Bassous,N.Harb,S.Palo-Nieto,C.Ruiz-Esparza,G.U.Marciano,F.R.Webster,T.J.Furtado,A.S.A.Lobo,A.O.Advances in DualFunctional Antimicrobial and Osteoinductive Biomaterials for OrthopedicApplications,Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and Medicine,2020,14,102143)。使用季铵官能化壳聚糖的其他优点是其改善的水溶性，因为壳聚糖不溶于中性和碱性水溶液(D.Zhu等人，Enanced water-solubility and antibacterial activity ofnovel chitosan derivatives modified with quaternary phophoniumsalt.Mater.Sci.Eng.C Mater.Biol.Appl.2016,1；61:79-84)。壳聚糖及其衍生物也被证明是用于伤口愈合的良好候选者(K.Azuma等人，Chitin,Chitosan,and its Derivativesfor Wound Healing:Old and New Materials.J.Funct.Biomater.2015,6(1):104-142；和S.Ahmed,S.Ikram,Chitosan Based Scaffolds and Their Applications in WoundHealing.Achievements in Life Sciences,2016,10,1,27-37)。
在一些方面，多个氧化锌颗粒的量为约0.2重量％至5重量％。氧化锌是FDA批准的材料，并且被认为在食品和局部使用中是安全的。氧化锌可具有抗微生物和粘膜粘附性能。氧化锌因此可以进一步改善组合物的抗微生物或抗感染性能。氧化锌与季铵官能化的壳聚糖结合使用将提供协同抗微生物活性，因为它们既有不同的作用机制，也可作用于不同的微生物。(Afewerki,S.Bassous,N.Harb,S.Palo-Nieto,C.Ruiz-Esparza,G.U.Marciano,F.R.Webster,T.J.Lobo,A.O.Advances in antimicrobial and osteoinductivebiomaterials,In Racing the surface(ed.B.Li等人)Springer Nature,2020,3-34；和Afewerki,S.Bassous,N.Harb,S.Palo-Nieto,C.Ruiz-Esparza,G.U.Marciano,F.R.Webster,T.J.Furtado,A.S.A.Lobo,A.O.Advances in Dual FunctionalAntimicrobial and Osteoinductive Biomaterials for Orthopedic Applications,Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and Medicine,2020,14,102143)。例如，人们认为ZnO的作用机制是通过产生活性氧(氧化应激)或通过静电机制与细菌表面结合(Y.Xie,Y.He,P.L.Irwin,T.Jin,X.Shi,Antibacterial Activity and Mechanism of Action ofZinc Oxide Nanoparticles against Campylobacter jejuni，Appl.Environ.Microbiol.2011,2325-2331；和V.Tiwari等人，Mechanism of Anti-bacterial Activity of Zinc Oxide Nanoparticle Against Carbapenem-ResistantAcinetobacter baumannii,Front.Microbiol.2018,9,1218.)。季铵官能化壳聚糖的机理是通过聚阳离子壳聚糖与微生物中阴离子组分之间的静电相互作用(H.Tan etal.Quaternized Chitosan as an Antimicrobial Agent:Antimicrobial Activity,Mechanism of Action and Biomedical Applications in Orthopedics,Int.J.Mol.Sci.2013,14,1854-1869)。
在一些方面，粘附性聚合物为聚(乙酸乙烯酯)。在一些方面，粘附性聚合物或聚(乙酸乙烯酯)的量为0.1重量％至50重量％、或0.1重量％至5重量％。聚(乙酸乙烯酯)是一种无毒的橡胶状合成聚合物，分子量(Mw)为100,000至500,000。当用作凝胶组合物的添加剂时，粘附性聚合物可以增强组织粘附性。具有组合物最佳粘附性能的优点将确保凝胶保持在应用的位置，例如组织或乳头管中，以防止其浸出或从该处脱落。例如，在预防乳腺炎的应用中，应该能够在整个干奶期(120天)内完整地留在乳头管中而不会渗出。粘附性聚合物聚(乙酸乙烯酯)与组合物中的其他组分相容，并会在组合物中产生粘附性能，而不会对凝胶的性能和表现产生任何负面影响。
在一些方面，油选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：合成油、矿物油、植物油和动物油。在一些方面，油选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：石蜡、椰子油、橄榄油、棕榈油、大豆油、菜籽油(菜籽油)、玉米油、花生油和鳄梨油。在一些方面，油的量为约20重量％至约80重量％。在一些方面，多元醇为甘油。在一些方面，多元醇或甘油的量为1重量％至80重量％、或20重量％至70重量％。甘油(Glycerol)(或丙三醇(glycerin))可用作抗冻剂和抗干燥剂以提高凝胶的长期稳定性。
在一些方面，组合物为凝胶或二元凝胶的形式。在一些方面，在约38℃下，凝胶的密度为1.0g/ml至3.0g/ml。在一些方面，在约38℃下，凝胶的密度为1.1g/ml至5.0g/ml或1.5g/ml至2.5g/ml。该组合能够被涂抹(为可涂抹的(spreadable))。这对于组合物在注射器中使用并将组合物容易且均匀地涂抹在受试者或动物的皮肤上的能力而言是重要的。
在一些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物具有剪切稀化性能，使得组合物可以在室温下在注射器中变形。在某些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物能够使用单筒注射器等注射。在一些方面，凝胶为可注射的，其中注射力<100N，尖端直径为约1.5mm，给药速率为约2.5ml/s。在某些方面，该组合物为剪切稀化的。
在一些方面，凝胶在牛奶或水存在下，在37-40℃下可稳定长达约120天。在一些方面，组合物在约10-1％至约103％的应变值下的机械强度为约102Pa至约105Pa。具有适当机械性能的稳定凝胶的优势将确保凝胶在治疗期间能够抵抗奶牛的动态运动。凝胶中独特的组合物使其获得最佳的机械性能，其在使用环境中保持稳定。该组合物具有适当的机械性能，例如，类似于凝胶所施加到的身体中组织的粘弹性的粘弹性，表明凝胶能够承受身体的恒定动态/机械运动。凝胶组合物内部的物理交联，特别是与来自二氧化硅纳米颗粒的物理交联促进了这些性能。在一些方面，该组合物包含以下物质或由以下物质组成：
1-15重量％的多个锂镁钠硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％的分子量为约1kDa至约10,000kDa的聚(环氧乙烷)；
0.1-50重量％的聚乙酸乙烯酯；
20-70重量％的甘油，和
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
0.2-5重量％的多个氧化锌颗粒，和/或
0.2-2重量％的含有多个季铵官能团的壳聚糖，
其中重量％是组合物总重量的百分比。
这些浓度将为组合物提供活力、抗菌性能和机械性能之间的最佳平衡。成分浓度过高可能会削弱组合物的机械性能，也会对细胞毒性产生负面影响。在一些方面，本文定义的组合物还包含一种或多种药物或试剂。这些药物或试剂可以增加组合物的有用性或效果或促进检测。通过简单地将药物或试剂与组合物的其他成分混合，可以容易地将药物或试剂掺入组合物中。
在一些方面，一种或多种药物选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：抗生素药物、抗寄生虫药物、抗真菌药物、镇痛药或抗炎药物、维生素、皮质类固醇药物和蛋白质。组合物中这些药物的组合对于预防和治疗感染例如乳腺炎、皮肤伤口或本文提到的任何其他疾病或病症可能具有累加或甚至协同作用。这些药物将具有与组合物的抗菌作用模式(机械屏障、季壳聚糖和氧化锌)不同的作用机制，并且组合物和这些药物的组合可以允许治疗和/或预防广谱微生物。
在一些方面，一种或多种药物选自罗丹明B或BSA蛋白。
在一些方面，一种或多种试剂选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：着色剂或染料和比色pH指示剂。该试剂可用作细菌等存在的指示剂。该试剂也可用作在给药后更换组合物的指示剂，或用作组合物质量的指示剂。在组合物中包含一个指示剂将简化对组合物性能的监控，并简化利益相关者的应用程序。在某些方面，该组合物用于医疗和/或兽医用途。尽管从本公开内容中将清楚在人类中应用，但优选的用途涉及施用本文定义的组合物以在产奶动物(dairy animal)的乳头管中形成物理屏障，用于治疗和/或预防可能在动物开始干奶或在干奶期间发生的乳腺疾病，包括将本文定义的组合物给药于动物的乳头和/或乳头管内给药。
本发明还涉及本文定义的组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物的疾病。本发明涉及本文定义的组合物用于制备预防和/或治疗哺乳动物疾病的药物。本发明涉及一种治疗和/或预防疾病、病症或病状的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物例如母牛给药治疗有效量的本文定义的组合物。
在一些方面，本文定义的组合物用于预防和/或治疗哺乳动物的感染。在一些方面，感染是皮肤溃疡、糖尿病溃疡、痤疮、红斑痤疮、脓肿或器官感染。在一些方面，本文定义的组合物用于预防和/或治疗局部、皮下或内部感染。在一些方面，本文定义的组合物用于预防和/或治疗哺乳动物的炎症。
在一些方面，该组合物是抗微生物或抑菌的。在一些方面，该组合物对金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌的MIC50为至少40μg/ml。在一些方面，本文定义的组合物用于预防和/或治疗由金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌引起的感染。
在一些方面，本文定义的组合物用于预防和/或治疗哺乳动物的乳腺炎/微生物乳腺炎。
在一些方面，本文定义的组合物用于预防和/或治疗哺乳动物的皮肤病。
在一些方面，本文定义的组合物用于通过局部给药该组合物来预防和/或治疗动物和/或人类的局部损伤，治疗皮肤伤口，例如撕裂伤、擦伤、刺伤、撕脱伤、溃疡和烧伤。
在一些方面，本文定义的组合物用作哺乳动物体内的导管密封剂/屏障，或用作乳腺导管的乳头密封剂/屏障。一些方面涉及包含本文定义的组合物或由本文定义的组合物组成的哺乳动物体内的导管密封剂或乳头密封剂。在一些方面，组合物在给药后形成物理屏障，从而基本上阻止细胞浸润到凝胶中。在一些方面，组合物在给药/注射后立即凝胶化(例如，或少于60秒、或少于30秒、或少于10秒)。因此，据信该组合物在给予或注射到哺乳动物受试者后能够形成不渗漏、不滴落的塞子或持久密封。
在一些方面，哺乳动物为奶畜动物，例如小母牛或母牛。在一些方面，哺乳动物为山羊、绵羊、马、水牛等。在一些方面，哺乳动物是母牛或奶牛。
在一些方面，组合物在乳腺导管内和/或乳房皮肤上给药。
在一些方面，给药如本文所定义的溶胶-凝胶聚合物组合物包括将溶胶-凝胶聚合物组合物在乳腺组织上局部施用，或在乳头管内(乳房内)施用。在一些方面，局部给药包括将乳头浸入组合物中。在一些方面，组合物通过乳房内给药，例如通过注射或输注给药。
本发明涉及一种给药如本文所定义的组合物的方法，包括以下步骤或由以下步骤组成：在乳头管内(乳房内)和/或局部地施用该组合物。
在一些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物在动物开始干奶或干奶期间给药。在某些方面，该组合物在干奶期保留在乳头管中，从而减少了在干奶期和泌乳的第一阶段(产犊后)的乳腺炎的临床和亚临床病例。通过在整个干奶期保留在乳头管中，溶胶-凝胶聚合物组合物使新鲜产奶动物(pre-fresh dairy animal)在高风险期期间通过乳头管的微生物入侵最小化。在一些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物在健康动物感染之前给药。在一些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物在非泌乳动物的产后期间给药。在一些其他方面，溶胶-凝胶聚合物组合物在动物的产前期间给药。
本发明涉及一种给药如本文所定义的组合物的剂量方案，包括以下步骤或由以下步骤组成：在动物开始干奶或在动物干奶期间，和/或在产后期间和/或在产前期间给药。
在一个方面，在给药本文定义的组合物后从动物获得的奶用于生产奶制品。给药该组合物能够减少从正在接受乳腺炎治疗的动物获得奶的扣留时间，从而减少当动物被给予抗生素时所需的标准奶丢弃期。
在一些方面，本文定义的组合物用于延迟或预防怀孕。在一些方面，本文定义的组合物用于预防怀孕。通过将本文定义的组合物给药至哺乳动物的输卵管，可以阻碍或防止卵巢和子宫之间的流体连通。
在一些方面，本发明涉及一种包含在注射器中的本文定义的组合物的试剂盒，任选地带有注射器使用手册。
在一些方面，本发明涉及一种包含在注射器中的本文定义的组合物的试剂盒，任选地带有注射器使用手册和盐水溶液，任选地包含1-15重量％的焦磷酸四钠，适于从表面或皮肤或乳房或乳头或乳头管去除组合物。在一些方面，低分子量二醇为乙二醇或分子量为50至1000g/mol的聚乙二醇。
附图说明
现在将参考附图通过对本发明的不同实施方案的描述更详细地解释本发明。
图1为示出了不同浓度的壳聚糖季铵盐(qCh)对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)(圆圈)和革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli)(正方形)的抗菌性能的图。*MIC：最小抑制浓度和MIC50：诱导50％生长减少的最小浓度。*示出了市售
Figure BDA0003767061060000111
密封剂(头孢匹林(cephapirin))中使用的抗生素对金黄色葡萄球菌的MIC和头孢匹林对大肠杆菌的MIC50的比较。
图2A为示出了不含0.5重量％的qCh(仅水凝胶)和含有0.5重量％的qCh(0.5％qCh水凝胶)的本发明的水凝胶组合物(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000112
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO，和含有/不含有0.5g qCh)在8h后对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌性能的柱状图。
图2B为示出了不含0.5重量％的qCh(仅水凝胶)和含有0.5重量％的qCh(0.5％qCh水凝胶)的本发明的水凝胶组合物(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000121
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO，和含有/不含有0.5g qCh)在24h后对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌性能的柱状图。
图3A为示出了不含0.5重量％的qCh(仅水凝胶)和含有0.5重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000122
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO，和含有/不含有0.5g qCh)在8h后对革兰氏阴性大肠杆菌的抗菌性能的柱状图。
图3B为示出了不含0.5重量％的qCh水凝胶(仅水凝胶)和含有0.5重量％的qCh的
Figure BDA0003767061060000123
组合物水凝胶(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000124
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO，和含有/不含有0.5g qCh)在24h后对革兰氏阴性大肠杆菌的抗菌性能的柱状图。
图4A为示出了分别含有0.5重量％的qCh或1重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物对革兰氏阴性大肠杆菌在8h后的抗菌性能的柱状图。
Figure BDA0003767061060000127
的抗菌效果作为对照组示出。
图4B为示出了分别含有0.5重量％的qCh或1重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物对革兰氏阴性大肠杆菌在24h后的抗菌性能的柱状图。
Figure BDA0003767061060000125
的抗菌效果作为对照组示出。
图5为示出了来自应变扫描流变实验(strain sweep rheological experiment)的结果的图，证明了1.0重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物I(包含3％PEO(20k分子量)、8％CMC和15％Laponite)的储能模量(G')和损耗模量(G”)与振荡应变的关系。
图6为示出了含有0.5重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000126
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO和0.5g qCh)的剪切稀化性能(粘度随剪切应力变化)的图。观察到在较高剪切应力下粘度降低，这是剪切稀化生物材料的典型性能。
图7为比较了含有0.5重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000131
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO和0.5g qCh)与
Figure BDA0003767061060000132
的可恢复性的图。静止状态设置为1％应变5min，然后施加高应变(100％)5min。监测制剂的恢复。
图8为示出了含有0.5重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物(如实施例2所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000133
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO和0.5g qCh)的注射力的图。可接受的注射力为<88N。
图9A为示出了不含有0.5重量％的qCh的本发明的水凝胶(仅水凝胶)的水凝胶组合物(如实施例2中所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000134
8g羧甲基纤维素(CMC)和3g PEO)在含有或不含有15μg/mL溶菌酶的PBS中的长期稳定性图。
图9B为示出了含有0.5重量％的qCh的本发明的水凝胶组合物(如实施例2中所述配制，具有以下重量比：100g水、10g
Figure BDA0003767061060000135
8g羧甲基纤维素(CMC)、3g PEO和0.5gqCH)在含有或不含有15μg/mL溶菌酶的PBS中的长期稳定性图。
图10为示出了在如实施例14所述的猪模型中产生烧伤伤口损伤的图。
图11A为示出了本发明水凝胶组合物#1施用于如实施例14所述的猪模型中新产生的烧伤伤口损伤的图。
图11B为示出了如实施例14所述与本发明水凝胶组合物#1直接接触施用的成形敷料的图。
图11C为示出了本发明水凝胶组合物#2施用于如实施例14所述的猪模型中新产生的烧伤伤口损伤的图。
图11D为示出了如实施例14所述与本发明水凝胶组合物#2直接接触施用的成形敷料的图。
图11E为示出了本发明水凝胶组合物#3施用于如实施例14所述的猪模型中新产生的烧伤伤口损伤的图。
图11F为示出了如实施例14中所述与本发明水凝胶组合物#3直接接触施用的成形敷料的图。
图12为示出了猪模型烧伤伤口损伤闭合后的图。
图13A为示出了第0天猪模型烧伤伤口损伤的对照实验的图。
图13B为示出了第7天猪模型烧伤伤口损伤的对照实验图，显示伤口有感染。
图14A为示出了使用本发明水凝胶组合物#1处理的猪模型第0天的烧伤伤口损伤的图。
图14B为示出了使用本发明水凝胶组合物#1处理的猪模型第7天的烧伤伤口损伤的图，显示没有任何感染的迹象。
图14C为示出了使用本发明水凝胶组合物#2处理的猪模型第0天的烧伤伤口损伤的图。
图14D为示出了使用本发明水凝胶组合物#2处理的猪模型第7天的烧伤伤口损伤的图，显示没有任何感染的迹象。
图14E为示出了使用本发明水凝胶组合物#3处理的猪模型第0天的烧伤伤口损伤的图。
图14F为示出了使用本发明水凝胶组合物#3处理的猪模型第7天的烧伤伤口损伤的图，显示没有任何感染的迹象。
图15A为示出了如实施例7所述的本发明水凝胶组合物#1-4和商品Orbeseal振幅扫描的表。
图15B为示出了如实施例7所述的本发明水凝胶组合物#4的扫描振荡应变曲线的典型曲线图。
图16A为示出了本发明水凝胶组合物#1的恢复性能的图，如实施例7所述，以高应变(400％)和低应变(0.1％)进行7个循环。
图16B为示出了本发明水凝胶组合物#2的恢复性能的图，如实施例7所述，以高应变(400％)和低应变(0.1％)进行7个循环。
图16C为示出了本发明水凝胶组合物#3的恢复性能的图，如实施例7所述，以高应变(400％)和低应变(0.1％)进行7个循环。
图16D为示出了本发明水凝胶组合物#4的恢复性能的图，如实施例7所述，以高应变(400％)和低应变(0.1％)进行7个循环。
图16E为示出了来自商品Orbeseal的凝胶的恢复性能的图，如实施例7所述，以高应变(400％)和低应变(0.1％)进行7个循环。
图17A为示出了在初始时间点，本发明的水凝胶组合物#1和#4(如实施例13中所述，凝胶用300kDaPEO制备)和商品Orbeseal(OB)的凝胶表面抗菌测试(如实施例5，但使用100μL细菌溶液(金黄色葡萄球菌)(而不是20μL)以完全覆盖凝胶表面。在温育期间以120rpm摇动样品以实现正常细菌生长和组合物向培养物中的可能释放)的图。
图17B为示出了在温育24h后，本发明的水凝胶组合物#1和#4(如实施例13中所述，水凝胶组合物用300kDa PEO制备)和商品Orbeseal(OB)的凝胶表面抗菌测试(如实施例5，但使用100μL细菌溶液(金黄色葡萄球菌)(而不是20μL)以完全覆盖凝胶表面。在温育期间以120rpm摇动样品以实现正常细菌生长和组合物向培养物中的可能释放)的图。
图17C为示出了本发明水凝胶组合物#1和#4(如实施例13所述，水凝胶组合物用300kDa PEO制备)、商品Orbeseal(OB)和70％甘油(与实施例5相同，但使用100μL细菌溶液(金黄色葡萄球菌)(而不是20μL)以完全覆盖凝胶表面。在温育期间以120rpm的速度摇动样品以保证正常的细菌生长和组合物向培养物中的可能释放)在24h后对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌性能的柱状图。
图17D为示出了本发明水凝胶组合物#1和#4(如实施例13所述，水凝胶组合物用300kDa PEO制备)、商品Orbeseal(OB)和70％甘油(与实施例5相同，但使用100μL细菌溶液(金黄色葡萄球菌)(而不是20μL)以完全覆盖凝胶表面。样品未摇晃，这可能会阻止组合物向培养物中的可能释放)在24h后对革兰氏阴性大肠杆菌的抗菌性能的柱状图。
图18A为示出了本发明水凝胶组合物#4和商品Orbeseal对革兰氏阴性大肠杆菌温育9天后的抗菌性能的图，并且通过在600nm波长处的光密度测量来测定细菌污染水平，以及示出了本发明水凝胶组合物#4和商品Orbeseal两者的细菌铺板结果的照片。证明了与商业Orbeseal相比，具有更高和更长的抗菌效果。
图18B为示出了本发明水凝胶组合物#4和商业产品Orbeseal对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌温育9天后的抗菌性能的图，并且通过在600nm波长处的光密度测量来测定细菌污染水平，以及示出了本发明水凝胶组合物#4和商品Orbeseal两者的细菌铺板结果的照片。证明了与商业Orbeseal相比，具有更高和更长的抗菌效果。
图18C为示出了本发明水凝胶组合物#4和商品Orbeseal对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌温育9天后防止细菌侵入(抗菌性能)的柱状图，证明了与商业Orbeseal相比，其在不使用任何抗生素的情况下具有能够高效杀死细菌的抗菌效果。
图19A为示出了本发明水凝胶组合物#1、#2、#3和#4(如实施例13所述，水凝胶组合物用8,000,000kDa PEO制备)和商品Orbeseal(OB)(如实施例5)在24h后对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(108CFU/mL)的抗菌性能的柱状图。
图19B为示出了本发明水凝胶组合物#1和#4(如实施例13中所述，水凝胶组合物用300kDa PEO制备)和商品Orbeseal(OB)(如实施例5)在24h后对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(108CFU/mL)的抗菌性能的柱状图。
图20A为示出了细胞中ZnO的荧光检测的对照样品的图像。
图20B为示出了使用0.1％ZnO温育5min后，细胞中ZnO的荧光检测的图像。
图20C为示出了使用0.1％ZnO温育30min后，细胞中ZnO的荧光检测的图像。
图20D为示出了使用0.1％ZnO温育60min后，细胞中ZnO的荧光检测的图像。
图21为示出了本发明水凝胶组合物#1和#4(如实施例13所述，水凝胶组合物用300kDa和8,000,000kDa PEO制备)和商品Orbeseal(OB)的注射力的图。
图22A为示出了细菌和细胞共培养系统的细胞毒性(成纤维细胞在细胞接种后1天温育。将细胞(50μL，105CFU/mL接种密度)分别添加到覆盖在Transwell插入物(3m孔径)表面上的0.1mL相应样品(水凝胶组合物#4和Orbeseal)中。在密闭室中轻轻摇动5％CO2进行共培养实验)结果的图。
图22B为示出了随着剂量递增的水凝胶组合物#4的细胞毒性结果(如实施例15所述进行)的图。证明无明显毒性。
图23A为示出了如实施例13中所述的300kDa PEO和8,000,000kDa PEO制造的水凝胶组合物#4随质量递增的细胞毒性结果(如实施例15中所述进行)的图。证明无明显毒性且无显著差异。
图23B为示出了10％Laponite、15％Laponite和Orbeseal(OB)的细胞毒性结果(如实施例15所述进行)的柱状图。
图24为示出了通过将凝胶置于研究人员的手指之间来显示水凝胶组合物的粘附性性能的图。
图25为示出了本发明水凝胶组合物#3和#4的基于体细胞计数(奶中炎症细胞的数目)的临床结果(如实施例18所述)的图。该试验证明了水凝胶组合物在60天的整个干奶期间在乳头管中的稳定性，没有降解或渗漏的迹象。使用水凝胶组合物#3和#4的临床试验没有观察到乳腺炎。
图26为示出了基于水凝胶组合物#3和#4的元素锂(Li)的临床结果(如实施例18中所述)的奶和血液的元素分析的表。
图27为表明了使用Nanodrop分光光度计(在实施例19-20中给出)测定BSA从水凝胶组合物(#4)中释放的吸收光谱。
图28为用于测定罗丹明B从水凝胶组合物(#4)中释放的PBS中的罗丹明B的校准曲线。
图29为示出了基于水凝胶组合物#3和#4的观察的临床结果(如实施例18所述)的表。实验表明，所有接受治疗的母牛都没有任何乳腺炎的迹象，而且外观也正常。
具体实施方式
定义
除非本文另有定义，本申请中使用的科学术语和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。给出以下定义仅用于说明结合本公开使用的主要术语的一般含义。
本文中所用的术语“重量％”是指占组合物总重量的百分比。
本文中所用的术语“受试者”应包括人类和陆生动物。例如，受试者可以为家畜物种、实验动物物种、动物园动物、伴侣动物或人。在一个特定方面，“受试者”更具体地指任何泌乳动物。受试者可能为母牛。
术语“有效量”旨在限定将实现治疗或预防疾病或病症目标的组合物的量。“有效”也可指疾病严重程度或发病率比未治疗时有所改善。
术语“疾病”旨在包括病症、病状或其任何等同物。
术语“局部”是指施用于表皮的任何组合物。局部用也应指用作漱口水的组合物。
术语“乳头浸渍”或“乳头浸液”应根据乳品业领域中使用的术语进行广义解释。因此，该组合物不仅旨在用于乳头浸渍，而且可以以其他方式施用，例如通过喷雾，这属于公认的术语乳头浸渍或乳头浸渍组合物或试剂。
在本文中，除非另有说明，否则术语“抗微生物”描述杀生物作用，例如杀死或抑制微生物的生长，其可具有例如抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑菌、抗原生动物、消毒、或杀菌效果。
在本文中，除非另有说明，否则术语“微生物”一词应作广义解释，并且包括病原微生物，例如细菌、真菌、酵母、病毒、原生动物等。
术语“乳房”在本文中是指母牛、山羊、绵羊、水牛等雌性反刍动物的腺体、乳腺结构。在母牛中，乳房包括四个独立的腺体，每个腺体有一个乳头和一个出口导管，而绵羊和山羊有两个腺体。术语“乳头”在本文中是指包含部分奶或乳头窦的乳腺的突出部分。
术语“乳头密封剂”在本文中是指用于在动物乳头表面或内部形成物理屏障的组合物和装置。乳头密封剂可以在乳头表面上、乳头条纹管内部和/或乳头腔(teat cistern)内部。
术语“溶液”在本文中指溶液、悬浮液或分散液，除非另有说明。
本文所用的术语“喷雾”是指雾化组合物，例如由小液滴或大液滴组成，例如通过气溶胶涂药器或泵喷雾涂药器施加，用于将组合物递送到一个区域(比如乳头周围的皮肤)上的预期目的。
术语“输注”在本文中是指将流体或溶液连续引入腔、静脉或贮水器(cistern)。
术语“哺乳动物”在本文中是指哺乳动物纲的温血脊椎动物，包括人类和动物，其皮肤上有毛发或毛皮，由雌性从产奶乳腺分泌奶滋养幼崽，并有四腔心脏。
对于本公开涉及乳腺炎的方面，术语“动物”在本文中是指具有哺乳期的雌性非人类哺乳动物，包括但不限于家畜，例如母牛、绵羊、山羊、马、猪、水牛等。优选地，动物为奶牛。虽然“母牛”和“小母牛”都是雌性牛科动物，但术语“小母牛”在本文中是指任何未生下小牛的年轻母牛，通常是断奶且年龄在3岁以下的母牛。术语“母牛”通常指的是产下小牛的年长雌性动物。
术语“干奶期”在本文中是指母牛或其他产奶动物的泌乳周期的非泌乳阶段。它发生在一个泌乳周期结束和下一个泌乳开始之间。在每个泌乳周期结束时，随着动物进入干奶期，动物开始“干奶”阶段，这包括与动物非泌乳期(干奶期)产奶停止相关的通常的生理、代谢和内分泌变化。
术语“奶制品”在本文中是指含有任何量的液态或粉状奶的产品。它还包括奶酪和酸奶。
术语“产后”在本文中是指产犊后立即开始并持续约六周的时期。术语“产前”在本文中是指怀孕期间的时期，即产犊之前的时期。术语“围产期”在本文中是指产犊前后的时期。
术语“退化”在本文中是指母牛停止产奶后的最初两到三周。
术语“停奶期”或“停乳期”是指在正常使用条件下最后一次给动物给药兽药产品到从该动物生产奶之间的间隔，以确保该奶不含有超过监管机构规定的最大残留限量的残留量。
术语“微生物入侵”在本文中是指病原微生物(例如细菌，尤其是增殖到身体组织或体腔中形成脓液或坏死的细菌、病毒、真菌、酵母、原生动物等)的移动，导致可能发展为感染和/或疾病的组织损伤。“微生物入侵”可以指“细菌入侵”。
术语“溶胶-凝胶聚合物组合物”在本文中是指如本文所述可以在某些条件下经历溶胶-凝胶过程以形成溶胶-凝胶状态的聚合物组合物。
术语“聚合物”在本文中是指包括一组大分子的材料。聚合物中包含的大分子可以相同或以某种方式彼此不同。大分子可以具有多种骨架结构中的任何一种并且可以包括一种或多种类型的单体单元。特别地，大分子可以具有线性或非线性的骨架结构。非线性骨架结构的实例包括分支骨架结构，例如星形分支、梳状分支或树枝状分支，以及网络骨架结构的那些。均聚物中包含的大分子通常包含一种单体单元，而共聚物中包含的大分子通常包含两种或更多种单体单元。共聚物的实例包括统计共聚物、无规共聚物、交替共聚物、周期性共聚物、嵌段共聚物、放射型共聚物和接枝共聚物。
关于聚合物，如本文所用的术语“分子量(MW)”是指聚合物的数均分子量、重均分子量或熔体指数。
术语“弹性模量”(也称为“杨氏模量”或储能模量(G'))在本文中定义为材料中应力随施加应变的变化(即剪切应力(单位面积上的力)与剪切应变(比例变形)的比值)。本质上，弹性模量是弹性材料刚度的定量测量，它测量待测材料恢复其原始形状和尺寸的能力。G'可以使用源自胡克定律的公式计算，该公式指出弹性模量等于应力与应变的比值(即施加的压力与尺寸变化分数的比值)。报告称，弹性模量的测量为每单位面积的力(牛顿与单位面积(N/m2)或帕斯卡(Pa)的标准公制比，其中一帕斯卡相当于施加在一平方米(1m2)面积上的一牛顿(1N)的力)。这个帕斯卡单位是一个本领域公认的术语，通常用于定义压力、拉伸强度、应力和弹性的单位。
如本文所用，术语“药物”是指能够在体内或体外对生物系统(例如原核或真核细胞或生物体)产生生理作用(例如治疗或预防作用)的任何药剂。药物可以选自多种已知类别的药物，包括例如镇痛药、麻醉剂、抗炎剂、驱虫剂、抗心律失常剂、抗哮喘剂、抗生素(包括青霉素)、抗癌剂(包括紫杉醇)、抗凝剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、抗组胺药、镇咳药、抗高血压剂、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂、解热药、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗甲状腺剂、抗病毒剂、抗焦虑镇静剂(安眠药和精神安定药)、收敛剂、抑菌剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、血液制品和替代品、支气管扩张剂、缓冲剂、强心剂、化疗剂、造影剂、皮质类固醇、止咳剂(祛痰药和粘液溶解剂)、利尿剂、多巴胺能药(抗帕金森病药)、自由基清除剂试剂、生长因子、止血剂、免疫剂、脂质调节剂、肌肉松弛剂、蛋白质、肽和多肽、拟副交感神经药、甲状旁腺降钙素和双膦酸盐、前列腺素、放射性药物、激素、性激素(包括类固醇)、时间释放粘合剂、抗过敏剂、兴奋剂和厌食剂、类固醇、拟交感神经药、甲状腺药物、疫苗、血管扩张剂、蛋白质、抗体和黄嘌呤。
如本文所用，术语“蛋白质”是指任何含有至少一条多肽链的大生物分子和大分子。感兴趣的蛋白质可以选自具有不同功能的各种蛋白质，包括酶、抗体、跨膜蛋白、细胞信号蛋白(包括胰岛素)和结构蛋白(包括胶原蛋白)。
本文所用的术语“剪切稀化”是指非牛顿流体的共同特征，其中流体粘度随着剪切速率或应力的增加而降低。在悬浮液、乳液、聚合物溶液和凝胶中观察到剪切变稀。由于剪切稀化属性，降低聚合物、大分子或凝胶的粘度是通过增加剪切速率来实现的。基本上，由于随着剪切速率的增加粘度降低，“剪切变稀”性能是通过从注射器活塞施加轻微的手动压力来使凝胶网络暂时变形的能力的度量。例如，这种剪切变稀现象可用于使原本坚硬的生物相容性凝胶不溶。
本文所用的术语“耐用”是指材料在暴露于条件一段时间后(例如在生理温度下暴露于缓冲溶液一段时间)不会表现出显著的质量损失。例如，在生理温度下暴露于缓冲溶液约4周后，该材料不会损失超过其原始质量的10％。
本文所用的术语“稳定”是指在暴露于条件一段时间后，材料不表现出相分离，如通过差示扫描量热法(DSC)测定的那样。稳定性可以通过进行稳定性测试来评估，例如，如图9A和图9B所示，在PBS和PBS/溶菌酶中。
术语“损耗正切tanδ”或“tanδ”在本文中是指相位角的正切，即粘性模量(G")与弹性模量(G')的比值，流体中弹性的存在和程度的一个有用的量化指标。tanδ值小于1表示以弹性为主(即类固体)的性能，tanδ值大于1表示以粘性为主(即类液体)的性能。在弹性固体中，tanδ"＝0。
如本文中所用，“强”是指在生理温度下，弹性模量G'通常为约420Pa或更高、或约600Pa至约10,000Pa，或约6000Pa至约10,000Pa。例如，根据刚度水平，实体在施加负载时会变形。如果材料是弹性的，则在去除负载后，实体会恢复到其原来的形状。“强固体”通常是在溶胶-凝胶相变后形成的凝胶或固体，其中G'在生理条件(例如，37℃和/或接近生理pH值)下通常高于约560Pa，尽管根据制备、灭菌或储存组合物的加工步骤中的其它因素，可能形成低于约560Pa或高于约10,000Pa的强固体。
本文所用的术语“生理温度”旨在表示哺乳动物的正常体温范围，例如，约35℃至约40℃、约36℃至约40℃、约37℃、约37.5℃等。
术语“一种或多种生理刺激”在本文中是指选择一种或多种刺激，包括但不限于温度(例如，体温，例如约36℃至约40℃的温度，或约37℃)、pH(例如，接近生理pH、碱性或酸性条件)、离子强度(例如，低渗或高渗条件)等。其他类型的生理刺激包括暴露于体液，例如母乳或其他分泌物、血液等。另一种类型的刺激可能来自与主体化学物质或大分子的接触，例如但不限于离子、电解质、钙、钠、细胞毒素、巨噬细胞、酶、抗原、葡萄糖、雌激素等。
如本文所用，术语“特征尺寸”通过透射电子显微镜(TEM)确定，是指特征直径，或对于多个颗粒而言，是平均、中值或众数直径。在一些方面，多个颗粒的“特征尺寸”是指至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的颗粒具有所述特征尺寸。
本文所用的术语“亲水性”是指在约23℃下具有小于约10的辛醇/水分配系数(Kow)的化合物。
如本文所用，“预防”疾病或病症的治疗剂是指在统计样品中，相对于未处理的对照样品，在经处理的样品中减少疾病、病症或病状的发生的化合物或组合物，或相对于未处理的对照样品延迟疾病、病症或病状的一种或多种症状的发作或降低其严重性。
术语“治疗”是本领域公认的，并且包括改善疾病、病症或病状(即阻止疾病或减少其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一方面，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指改善至少一种身体参数，其可能无法被受试者辨别。在又一方面，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可识别症状的稳定化)、生理上(例如，物理参数的稳定化)或两者来调节疾病、病症或病状。在另一方面，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涉及减缓疾病的进展。
在某些方面，凝胶密封剂包含水性介质和有机液体(例如甘油)的组合。
在一些方面，溶胶-凝胶聚合物组合物具有粘弹性和可恢复性。例如，当对凝胶(凝胶的粘弹性区域外)施加100％应变5min时，凝胶会变形。去除100％应变后，施加1％应变5min，凝胶很快恢复到原来的结构，因此表明水凝胶没有永久变形。
组合物
本发明涉及一种组合物，包含
多个硅酸盐纳米颗粒；
任选地，多个氧化锌颗粒；
亲水性聚合物；
增稠聚合物；
任选地，含有多个季铵官能团的聚合物；
任选地，粘附性聚合物；
任选地，油或多元醇；和
水。
硅酸盐纳米颗粒也可以是增稠聚合物，在这种情况下，组合物可以包含多个硅酸盐纳米颗粒；亲水性聚合物；以及任选地进一步包含增稠聚合物；多个氧化锌颗粒；含有多个季铵官能团的聚合物；粘附性聚合物；油或多元醇；和水。
组合物的pH可以为5-13、或6-13、或8-12、9-11。
硅酸盐纳米颗粒可以是任何种类的硅酸盐颗粒。硅酸盐纳米颗粒可以是锂镁钠硅酸盐纳米颗粒。颗粒的尺寸或直径可以为1nm至500nm、或10nm至100nm、或10nm至50nm、或15nm至30nm、或约25nm。
硅酸盐纳米颗粒在组合物中的使用量可以为0.1重量％至20重量％、或5重量％至20重量％、或5重量％至15重量％、或7重量％至15重量％。
组合物中可使用多种亲水性聚合物。一些非限制性实例为亲水性聚合物，所述亲水性聚合物可选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：聚(环氧乙烷)、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素和泊洛沙姆。可以使用一种或多种亲水性聚合物。可以使用具有相同或不同分子量的亲水性聚合物。例如，聚(环氧乙烷)(PEO)可以以两种分子量(例如20kDa和300kDa)的PEO的组合的形式使用。具有这些组合将使PEO具有不同的机械、粘附性和溶解性能。PEO的较大分子量提供了改进的机械强度和粘附性能，并且更粘稠。此外，PEO还可以防止细胞浸润。
或者可以使用一种PEO，其分子量为例如20k Da。在组合物中使用的亲水性聚合物的量可以为0.5重量％至10重量％、或1至7重量％或2至6重量％、或2至5重量％。
组合物中可使用多种增稠聚合物。增稠聚合物可以为硅酸盐纳米颗粒。增稠聚合物的其他实例可以为羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素和琼脂，或其衍生物。可以使用一种或多种增稠聚合物。在25℃的2重量％的增稠聚合物水溶液中，增稠聚合物的粘度可以为约200mPa至约2,000mPa，优选约400mPa至约900mPa。增稠聚合物可以为羧甲基纤维素(CMC)，或CMC钠盐，其在25℃的2％的水中粘度为500-900mPa。
增稠聚合物在组合物中的用量可以为3重量％至9重量％、或3.5重量％至7.5重量％、或4重量％至8重量％、或5重量％至7重量％。
多个季铵官能团可以为多个具有结构式I的重复单元：
Figure BDA0003767061060000251
其中X-可以选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：Cl-、Br-、BF4 -和PF6 -。X可以为Cl。
式I的结构化合物可以为含有多个季铵官能团的壳聚糖。
季铵化合物在组合物中的用量可以为0.1重量％至10重量％、或0.2重量％至5重量％、或0.2重量％至1重量％、或0.2重量％至0.9重量％、0.4重量％至0.8重量％、或约0.5重量％。
组合物中可以使用多种粘附性聚合物。可以使用一种或多种粘附性聚合物。粘附性聚合物的实例可以为聚(乙酸乙烯酯)。该聚合物与组合物的其他成分相容。
粘附性聚合物在组合物中的用量可以为0.1重量％至50重量％、或0.1重量％至10重量％、或0.1重量％至5重量％、0.1重量％至3重量％、0.5重量％至2.5重量％。
多个氧化锌颗粒在组合物中的用量可以为0.1重量％至5重量％、或0.2重量％至1重量％、或0.2重量％至0.75重量％、或0.25重量％至5.5重量％。
组合物中可以使用多种油和多元醇。油的实例可以为合成油、矿物油、植物油和动物油，例如石蜡、椰子油、橄榄油、棕榈油、大豆油、菜籽油(canola oil)(菜籽油(rapeseedoil))、玉米油、花生油或鳄梨油。油在组合物中的用量可以为20重量％至80重量％、或30重量％至60重量％。
多元醇的实例可以为甘油。多元醇可以为凝胶组合物增加若干优点和附加性能，例如抗冻、抗干和抗菌性能。
多元醇或甘油在组合物中的用量可以为1重量％至80重量％、或20重量％至70重量％、或25重量％至55重量％、或30重量％至50重量％。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000261
XLG)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))和增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000262
XLG)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000263
XLG)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC)和粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000264
XLG)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC)和粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000265
XLG)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC))，以及含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000266
XLG)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC))，以及含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000267
XLG)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC))、含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)和粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000271
XLG)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，羧甲基纤维素(CMC))、含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)和粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000272
)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如CMC)、以及多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000273
)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如CMC)和多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000274
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如、CMC)、多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)和粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000275
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，CMC)、多个氧化金属颗粒(例如，氧化锌颗粒)、或含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000276
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如，CMC)、多个氧化金属颗粒(例如，氧化锌颗粒)和含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000277
)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如CMC)、多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)、粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))和含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000281
)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、增稠聚合物(例如CMC)、多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)、粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))、或含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000282
)和亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000283
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))和粘附性聚合物(例如，聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000284
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、粘附性聚合物(例如，聚(乙酸乙烯酯))和多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000285
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、粘附性聚合物(例如，聚(乙酸乙烯酯))和含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000286
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、粘附性聚合物(例如，聚(乙酸乙烯酯))、多个氧化金属颗粒(例如，氧化锌颗粒)和含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000287
)和亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000288
)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))和粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000289
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))和多个氧化金属颗粒(例如氧化锌颗粒)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如
Figure BDA0003767061060000291
)、亲水性聚合物(例如聚(环氧乙烷)(PEO))、粘附性聚合物(例如聚(乙酸乙烯酯))和含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：水、甘油、多个硅酸盐纳米颗粒(例如，
Figure BDA0003767061060000292
)、亲水性聚合物(例如，聚(环氧乙烷)(PEO))、粘附性聚合物(例如，聚(乙酸乙烯酯))、多个氧化金属颗粒(例如，氧化锌颗粒)和含有多个季铵官能团的聚合物(例如，用季铵官能团官能化的壳聚糖)。
作为凝胶密封剂的组合物可以包含水性介质和有机液体(例如甘油)的组合。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：
1-15重量％或8-15重量％的多个硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％或2-6重量％的亲水性聚合物；
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
0-9重量％的增稠剂；
0.2-5重量％或0.2-0.6重量％的多个氧化锌颗粒；
0.2-2重量％或0.3-0.5重量％的含有多个季铵官能团的聚合物；
0.1-50重量％或0.5-2重量％的粘附性聚合物；和
20-80重量％或35-55重量％的甘油。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：
1-15重量％或8-15重量％的多个硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％或2-6重量％的亲水性聚合物；
0.1-50重量％或0.5-2重量％的粘附性聚合物；
20-80重量％或35-55重量％的甘油，和
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
0.2-5重量％或0.2-0.6重量％的多个氧化锌颗粒；
0.2-2重量％或0.3-0.5重量％的含有多个季铵官能团的聚合物。
本发明的组合物可以包含以下物质或由以下物质组成：
1-15重量％或8-15重量％的多个锂镁钠硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％或2-6重量％的分子量为约1kDa至约10,000kDa的聚(环氧乙烷)；
0.1-50重量％或0.5-2重量％的聚乙酸乙烯酯；
20-70重量％或35-55重量％的甘油，和
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
0.2-5重量％或0.2-0.6重量％的多个氧化锌颗粒和/或
0.2-2重量％或0.3-0.5重量％的含有多个季铵官能团的壳聚糖。
本文定义的组合物可进一步包含一种或多种药物或试剂。
一种或多种药物可选自包括以下物质的组：抗生素药物、抗寄生虫药物、抗真菌药物、镇痛药或抗炎药物、维生素、皮质类固醇药物和蛋白质。一种或多种试剂可以选自着色剂或染料和比色pH指示剂。
该组合物可进一步包含一种或多种抗生素药物。抗生素药物可以选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：青霉素类(例如青霉素、青霉素G、海他西林钾(hetacillinpotassium)、氯唑苄星青霉素(cloxacillin benzathine)、氨苄青霉素(ampicillin)和阿莫西林三水合物(amoxicillin trihydrate))、氨基香豆素类(例如新生霉素(novobiocin))、头孢菌素类(例如头孢氨苄、头孢噻呋钠、头孢噻呋盐酸盐、头孢噻呋结晶游离酸)、大环内酯类(例如替地匹罗星(tildipirosin)、泰乐菌素(tylosin)、泰拉霉素(tulathromycin)、红霉素(erythromycin)、克拉霉素(clarithromycin)和阿奇霉素(azithromycin))、喹诺酮类和氟喹诺酮类(例如恩诺沙星(enrofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)和氧氟沙星(ofloxacin))、磺胺类(例如磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明(co-trimoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim))、四环素类(例如四环素、土霉素(oxytetracycline)和强力霉素(doxycycline))、氨基糖苷类(例如硫酸二氢链霉素(dihydrostreptomycin sulfate)、新霉素(neomycin)、庆大霉素(gentamicin)和妥布霉素(tobramycin))、林可酰胺类(例如盐酸匹利霉素(pirlimycinhydrochloride)、林可霉素(lincomycin)、克林霉素(clindamycin)和匹利霉素(pirlimycin))、以及酰胺醇类(amphenicols)(例如氟苯尼考(florfenicol))。
该组合物可进一步包含一种或多种抗寄生虫药。抗寄生虫药可以选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：抗原虫药(例如美拉索醇(melarsoprol)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、甲硝唑(metronidazole)、替硝唑(tinidazole)、米替福新(miltefosine))、抗蠕虫药(例如甲苯咪唑(mebendazole)、双羟萘酸(pyrantel pamoate)、噻苯达唑(thiabendazole)、二乙基氨基甲嗪(diethylcarbamazine)、伊维菌素(ivermectin))、抗虫药(例如氯硝柳胺(niclosamide)、吡喹酮(praziquantel)、阿苯达唑(albendazole))、抗吸虫药(例如吡喹酮(praziquantel))、抗阿米巴药物(例如利福平(rifampin)和两性霉素B(amphotericinB))，以及广谱药物(例如硝唑尼特(nitazoxanide))。
该组合物可进一步包含一种或多种抗真菌药物。所述抗真菌药可以选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：多烯类，例如两性霉素b(amphotericin b)、念珠菌素(candicidin)、菲律宾霉素(filipin)、哈霉素(hamycin)、游霉素(natamycin)、制霉菌素(nystatin)和利莫西丁(rimocidin)；唑类，例如咪唑、三唑、噻唑、联苯苄唑、布康唑(butoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、酮康唑(ketoconazole)、卢立康唑(luliconazole)、咪康唑(miconazole)、奥康唑(omoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、舒康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole)、阿巴康唑(albaconazole)、艾氟康唑(efinaconazole)、氧唑菌(epoxiconazole)、氟康唑(fluconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、丙环唑(propiconazole)、雷武康唑(ravuconazole)、特康唑(terconazole)、伏立康唑(voriconazole)和阿巴芬净(abafungin)；烯丙胺类，例如阿莫罗芬(amorolfin)、布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)和特比萘芬(terbinafine)；棘白菌素类，例如阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)和米卡芬净(micafungin)；和其他的如金黄酮(aurones)、苯甲酸、环吡酮胺、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)、卤代孕酮(haloprogin)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸(undecylenic acid)、甘油三乙酸酯(triacetin)、结晶紫、卡斯特拉尼漆(castellani'spaint)、奥罗托米特(orotomide)(f901318)、米替福新(miltefosine)、碘化钾、煤焦油、铜(ii)硫酸盐、二硫化硒、硫代硫酸钠、吡罗克酮醇胺(piroctone olamine)、碘喹啉(iodoquinol)、氯碘羟喹(clioquinol)、茴香脑(acrisorcin)、吡啶硫酮锌和硫。
该组合物可进一步包含一种或多种镇痛药或抗炎药物。镇痛药或抗炎药物可选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)和萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxen sodium)、双氯芬酸、对乙酰氨基酚、塞来昔布(celecoxib)、吡罗昔康(piroxicam)、吲哚美辛(indomethacin)、美洛昔康(meloxicam)、酮洛芬(ketiprofen)、舒林酸(sulindac)、二氟尼柳(diflunisal)、萘丁美酮(nabumetone)、恶丙嗪(oxaprozin)、托美汀(tolmetin)、莎尔莎特(salsalate)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬酸(meclofenamate)和甲芬那酸(mefenamic acid)。
该组合物可进一步包含一种或多种皮质类固醇药物。皮质类固醇药物可选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：泼尼松(prednisone)、倍他米松(betamethasone)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)和曲安奈德(triamcinoloneacetonide)。
该组合物可进一步包含一种或多种蛋白质。蛋白质可以选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：酶、激素(孕酮、雌激素)、抗体、CAS蛋白、跨膜蛋白、氨基酸、细胞信号蛋白和结构蛋白(如胶原蛋白、透明质酸、弹性蛋白和原弹性蛋白)。
该组合物可进一步包含一种或多种着色剂或染料。着色剂或染料可以选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：喹啉黄(Quinoline yellow)、丽春红4R(Ponceau 4R)、胭脂红(Carmoisine)、专利蓝V(Patent Blue V)、绿S(Greens S)、亮蓝FCF(BrilliantBlue FCF)、靛蓝(Indigotine)、固绿FCF(Fast Green FCF)、赤藓红(Erythrosine)、日落黄(Sunset Yellow)、诱惑红AC(Allura Red AC)、柠檬黄(Tartrazine)、日落黄FCF(SunsetYellow FCF)、螺旋藻(Spirulina)和甜菜素(Betanin)。
该组合物可进一步包含一种或多种比色pH指示剂。比色pH指示剂可选自包括以下物质的组或由以下物质组成的组：溴甲酚紫、溴百里酚蓝、甲基红和酚红。
该组合物为凝胶形式。凝胶在约38℃下的密度为0.5g/ml至3.0g/ml、或0.8g/ml至2.0g/ml、或1g/ml至1.5g/ml。
该溶胶-凝胶聚合物组合物具有剪切稀化性能，使得组合物可以在室温下在注射器中变形。该组合物能够使用单筒注射器等进行注射。该组合物在注射后立即凝胶化(例如在少于60秒内，或在少于30秒内，或在少于10秒内)。
该组合物具有粘弹性和可恢复性。例如，当对凝胶(凝胶的粘弹性区域外)施加100％应变5min时，凝胶会变形。去除100％应变后，施加1％应变5min，凝胶很快恢复到其原来的结构，因此表明水凝胶没有永久变形。凝胶为可注射的，其中注射力<100N，尖端直径为约1.5mm，给药速率为约2.5ml/s。
该组合物在约10-1％至约103％的应变值下的机械强度为约102Pa至约105Pa。
该组合物为剪切稀化性的。例如，铺展性可通过Lardy,F.等人在以下文献中描述的程序进行测量：Functionalization of hydrocolloids:Principal componentanalysis applied to the study of correlations between parameters describingthe consistency of hydrogels.Drug development and industrial pharmacy 26,715-721(2000)，或者可通过Garg,A.等人在以下文献中描述的程序进行测量：Spreading ofsemisolid formulations:an update.Pharmaceutical Technology North America 26,84-84(2002)。
该组合物具有黏膜粘附性(例如由于存在壳聚糖组分)。例如，粘膜粘附性能可通过Shaikh,R.等人在以下文献中描述的程序进行测量：Mucoadhesive drug deliverysystems.J Pharm Bioallied Sci 3,89-100,doi:10.4103/0975-7406.76478(2011)，或者可通过Annabi,N.等人在以下文献中描述的程序进行测量：Engineering a highlyelastic human protein-based sealant for surgical applications.Sci Transl Med9,eaai7466,doi:10.1126/scitranslmed.aai7466(2017)，或者可通过实施例12进行测量。
该组合物在约23℃下可稳定长达120天，或该组合物在约37℃下可稳定长达120天，该组合物在约39℃下可稳定长达120天。该组合物在37-40℃，在奶或水存在的情况下可稳定长达约120天。
由于它们的剪切稀化性能，组合物的施用是可逆的；换言之，可以通过施加剪切应力(挤压或压力)将凝胶从其施用部位去除。
当与组合物的其他组分结合时，会形成一种物理上可逆的凝胶。如果组合物中存在某些离子，它们可能会存在静电屏蔽相互作用，从而削弱纳米片的组装。例如，焦磷酸盐吸收到带正电荷的边缘，从而削弱三维结构的形成。该策略可用于逆转凝胶化；加入盐后凝胶很容易去除。该组合物可以通过添加任选包含焦磷酸四钠或低分子量二醇的盐溶液来去除。盐溶液可以包含1-15重量％的焦磷酸四钠。低分子量二醇可以为乙二醇或分子量为50-1000g/mol的聚乙二醇。
医疗用途
本文定义的组合物或凝胶可用于通过充当物理微生物屏障来治疗局部损伤和预防感染。该凝胶可用作乳房内乳头密封剂以治疗或预防奶牛的乳腺炎。该凝胶可被容易地给药或施用，例如通过用注射器注射。
该组合物具有抗菌或抑菌作用。该组合物对金黄色葡萄球菌或大肠杆菌或两者的MIC50为至少40μg/mL。
本发明涉及一种治疗或预防乳腺炎的方法，包括在有需要的受试者的乳房内乳头管中施用有效量的本文所述的任何组合物，从而治疗或预防乳腺炎。
受试者可以为奶畜动物，优选小母牛或母牛，但也可以包括其他动物，例如山羊、绵羊、马、水牛等。本发明涉及本文所述的任何方法，其中受试者为母牛。
溶胶-凝胶聚合物组合物的给药可以包括将组合物局部施用在乳腺组织上或在乳头管内施用溶胶-凝胶聚合物组合物。局部给药可以包括将乳头浸入组合物中。该组合物可以通过乳房内给药，例如通过注射或输注来给药。
该组合物可以在动物开始干奶时或在动物干奶期间给药。该组合物在干奶期保留在乳头管中，从而减少了在干奶期和泌乳的第一阶段(产犊后)的乳腺炎的临床和亚临床病例。通过在整个干奶期保留在乳头管中，该组合物使新鲜产奶动物在高风险期期间通过乳头管的微生物入侵最小化。该组合物可以在健康动物感染之前给药。该组合物可以在非泌乳动物的产后期间给药。该组合物可以在动物的产前期间给药。施用后从动物获得的奶可用于生产奶制品。
本发明涉及本文所述的任何方法，进一步包括从乳房内乳头管中去除组合物。本发明涉及本文所述的任何方法，其中通过向乳头施加剪切应力来去除组合物。本发明涉及本文所述的任何方法，其中通过使组合物与盐溶液接触来去除组合物。
本发明涉及治疗或预防有需要的受试者的局部、皮下或内部感染的方法，包括向受试者局部给药有效量的本文所述的任何组合物，从而治疗或预防感染。
本发明涉及本文所述的任何方法，其中所述感染为皮肤溃疡、糖尿病溃疡、痤疮、红斑痤疮、脓肿或器官感染。
本发明涉及一种治疗有需要的动物和/或人类受试者的皮肤伤口，例如撕裂伤、擦伤、刺伤、撕脱伤、溃疡和烧伤的方法，包括向受试者局部给药有效量的本文所述的任何组合物，从而治疗皮肤伤口。
该组合物在给药后形成物理屏障，从而基本上阻止细胞浸润到凝胶中。
该组合物为溶胶-凝胶聚合物组合物提供医疗和兽医用途。虽然从本公开内容中将清楚向人类施用，但优选的用途涉及在产奶动物的乳头管中形成物理屏障的方法，用于治疗或预防可能在动物开始干奶时或在干奶期中发生的乳腺疾病，包括向动物的乳头或乳头管内给药本文所述的任何溶胶-凝胶聚合物组合物。该组合物可用于通过防止引起乳腺炎的微生物侵入乳腺来预防感染或乳腺炎的方法。所述组合物可用于治疗或预防微生物性乳腺炎或用于治疗或预防局部损伤的微生物感染，通过局部给药该组合物治疗动物和/或人受试者的皮肤伤口，例如撕裂伤、擦伤、穿刺、撕脱伤、溃疡和烧伤。
本发明涉及延迟或预防受试者怀孕的方法，包括向受试者的输卵管给药足以基本上阻碍或防止卵巢和子宫之间的流体连通的量的本文所述的任何组合物。
本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包含如本文定义的组合物、一个或多个注射器，以及使用说明，并且任选地还包括如上定义的用于在给药后去除组合物的盐溶液。
实施例
为了更充分地理解本文所述的本发明的各个方面，提出了以下实施例。本申请中描述的实施例用于说明本文提供的化合物、药物组合物和方法，并且不应以任何方式解释为限制它们的范围。
材料和方法
化学品和溶剂购自商业供应商或通过标准技术制造和纯化。以下商业试剂未经任何进一步纯化直接使用：壳聚糖(低分子量，Sigma Aldrich 448869)、缩水甘油基三甲基氯化铵水溶液(含20-25％水，Sigma Aldrich 50053)。聚(乙二醇)(Mn＝20kDa，Sigma-Aldrich 81300)，聚(乙二醇)(Mn为约8,000,000kDa，Sigma-Aldrich 372838)，氧化氘(Sigma-Aldrich 1133660025)。
实施例1-壳聚糖季铵盐的合成
壳聚糖季铵盐(qCh)按照下列文献所述的稍作修改来制备(Viviane A.等人，Preparation and characterization of quaternary chitosan salt:adsorptionequilibrium of chromium(VI)ion.Reactive&Functional Polymers 61(2004)347/352)。将壳聚糖(50,000-190,000Da(基于粘度)；75-85％脱乙酰基)(5.0g)和100mL去离子(DI)水加入250mL圆底烧瓶中。随后，将混合物在室温(约23℃)下搅拌30min(壳聚糖没有完全溶解)。然后加入缩水甘油基三甲基氯化铵水溶液(≥90％)(5.0g)。反应烧瓶用套筒塞子封闭。接下来，使用室内真空装置(house vacuum)通过插入塞子中的针来抽空系统。然后使用热板和油浴将反应混合物加热至100℃。当混合物开始沸腾15秒后，移除连接到真空的针头。进行该程序是为了产生惰性气氛以去除反应烧瓶中的氧气。将混合物在所述温度下搅拌24h。然后，将混合物冷却至室温并以等比例加入到各含有30ml乙醇的12×50ml的多个离心管中。离心后，弃上清液，沉淀物用乙醇冲洗3次。接下来，将产品储存在真空吸尘器中，通过“D-AQ”模式将其干燥过夜，温度设置为30℃。通过将干燥产物溶解在D2O中，使用1H-NMR(核磁共振)光谱表征反应。使用与Bruker 600NMR兼容的专用软件分析数据。季铵化和脱乙酰化程度是根据3.23ppm(-N(CH3)3 +)、2.81ppm(吡喃糖环处的1H)和2.06ppm(-C(O)CH3)附近峰的积分面积计算的。
Figure BDA0003767061060000371
方案1.制备qCh的反应方案。
实施例2–制备凝胶的代表性示例
通过混合多种组合物配制了一种剪切变稀的抗菌密封剂水凝胶。首先，将
Figure BDA0003767061060000372
(10g，Laponite-XLG XR，BYK)添加到80ml冷水(4℃)中，并通过实验室均质器在室温下以800rpm的速度混合15min或直到凝胶完全形成。在单独的烧杯中，PEO(Mw＝20kDa，Sigma Aldrich 8.21037)(3g，15重量％)、qCh(1g，5重量％)和不同量的羧甲基纤维素(CMC钠盐，在25℃的水中2％的粘度为500-900mPa·s，TCI America C0045)(2g-4g，10-20重量％)在80℃的DI水(20ml)中通过搅拌使其均质化30min以形成储备溶液。然后将储备溶液(20ml)添加到
Figure BDA0003767061060000373
凝胶(80ml)中，并通过均质器以约1,200rpm的速度剧烈混合。使用前将所得水凝胶在室温下温育12h以进一步稳定化。
实施例3–制备含ZnO的凝胶
将几种成分混合制成一种剪切变稀的抗菌密封剂水凝胶。首先，将PEO(Mw＝20kDa，Sigma Aldrich 8.21037)(3g)溶解在80ml Milli-Q水中。将该溶液冷却至4℃，加入Laponite(10g，Laponite-XLG XR，BYK)和ZnO纳米颗粒(ZnO NPs，粒径<100nm(TEM)，平均粒径≤40nm，在H2O中为20重量％，Sigma Aldrich 721077)(1g)，然后在室温下用实验室均质器以800rpm的速度混合15min或直到凝胶完全形成。在单独的烧杯中，将qCh(1g，5重量％)和不同量的羧甲基纤维素(CMC钠盐，在25℃的水中2％的粘度为500-900mPa·s，TCIAmerica C0045)(2g-4g，10-20重量％)在80℃的DI水(20ml)中搅拌30min以形成储备溶液。然后将储备溶液(20ml)加入到Laponite凝胶(80ml)中并通过均化器以约1,200rpm的速度剧烈混合。使用前将所得水凝胶在室温下温育12h以进一步稳定化。
实施例4–用甘油和ZnO制备二元凝胶
通过添加甘油配制具有抗冻、抗干燥和抗菌性能的二元凝胶。将PEO(Mw～20kDa，Sigma Aldrich 8.21037)(4g)和0.4g PEO(Mw～8,000kDa)分散在44g甘油(Sigma Aldrich1.37028)中。通过水浴将该混合物在90℃加热5min。接下来，加入34ml Milli-Q水，然后混合直至聚合物完全溶解。添加ZnO NPs(2.5g，Sigma Aldrich 721077)并将混合物进一步混合直到其温度达到室温(约23℃)。对于含有pH指示剂的凝胶制剂，可在此步骤中任选添加80μL溴甲酚紫(10mg/ml在乙醇溶液中，Sigma Aldrich 114375)。然后加入15g Laponite，与上述制备的溶液混合直至形成凝胶，并在90℃水浴中温育20min以稳定凝胶。凝胶冷却至50℃或更低后，加入7.167g qCh溶液(7.5％w/w在水中)、11g甘油和2.333g Milli-Q水并剧烈混合。凝胶进一步与12.5ml 0.1g/ml聚(乙酸乙烯酯)(Mw～100kDa，Sigma Aldrich189480)在乙酸乙酯(HPLC Plus，Sigma Aldrich 650528)和300μL冰醋酸(HPLC，SigmaAldrich AX0074)中均匀混合。最后，凝胶混合物在60℃真空下处理5h。
实施例5-凝胶抗微生物性能的评价
所有实验中使用的金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)菌株均来自奶牛场。在每次实验之前，通过在37℃在3.75％脑心浸液(BHI，Sigma Aldrich 53286)肉汤中培养单个细菌菌落至对数期来制备细菌原种培养物。然后将细菌原种培养物稀释至109菌落形成单位(CFU)/ml。为了测试壳聚糖季铵盐(qCh)在溶液中的抗菌性能，将10-312μg/ml的不同浓度的qCh在BHI肉汤中连续稀释。然后将细菌溶液添加到96孔板上新鲜制备的qCh溶液中。最终的细菌接种密度为5*105CFU/ml。对照样品含有在没有qCh的BHI肉汤中生长的细菌。温育24h后，通过波长为600nm(OD 600nm)的光密度(OD)测量细菌密度。参见图1。
将凝胶的抗菌性能与
Figure BDA0003767061060000391
干母牛乳头密封剂(油基中的次硝酸铋(65％w/w))进行了比较。简而言之，将0.2ml实施例2的抗微生物凝胶和0.2ml Orbeseal(在单独的孔中)添加到96孔板(1ml深孔)中。然后将样品离心，并在每个样品中加入20μL细菌溶液(105CFU/ml)。对照孔由含有105CFU/ml上述细菌菌株的BHI肉汤组成。样品在37℃下温育预定时间点。温育后，将样品重新悬浮在高压灭菌水中，在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中连续稀释，然后铺在羊血琼脂板上。然后将琼脂板再温育16h。每个样品的细菌密度(CFU/cm2)由统计的菌落数确定。参见图2A-2B、3A-3B和4A-4B。
实施例6-注射力测定
使用配备500N称重传感器的机械测试仪(Instron Model 5943，Norwood，MA)分析材料的可注射性。简而言之，将凝胶以0.5ml/s的流速添加到5ml Luer lock注射器中。没有针头的注射器插入定制的支架中。使用上压板压下注射器柱塞。使用Bluehill version 3软件(Instron，Norwood，MA)记录力。所有测量至少重复三次。每次重复后清洁支架。参见图8。
实施例7-流变性能评价
流变测试在TA Instruments DHR-2流变仪上，使用40mm锥体在37℃下进行。每次测试或重复都使用一个新的样品。每个样品第一次测量前的温度浸泡时间为20秒。振荡频率为1Hz。两种方法执行如下：
应变扫描
应变以对数方式从0.01％增加到1000％。每十个获取10个数据点。屈服应力和屈服应变分别通过G'、G”随应力变化曲线和G'、G”随应变变化曲线中的模量交叉来确定。参见图5。还报告了粘度随应力变化的曲线。参见图6。应变扫描实验对每种材料至少重复3次。
恢复测试
在100％应变(高于屈服应变)下进行300秒的高应变振荡，然后再进行另外300秒的低应变(1％)振荡。该过程连续重复7次。报告了G'随时间的变化曲线，这证明了在迫使样品屈服后样品的机械性能的可恢复性。参见图7。
实施例8-密度和pH测定
通过将凝胶的质量除以室温下的体积来进行密度测量
通过将1ml每种凝胶样品完全溶解在10ml MilliQ水中来研究凝胶的pH值，然后用pH计测量凝胶悬浮液的pH值。参见表1。
表1.Laponite凝胶(仅水凝胶)、0.5％qCh凝胶(如实施例2所述配制)和1％ZnONPs/0.5％ZnO水凝胶(如实施例3所述配制)的密度和pH值。
Figure BDA0003767061060000401
实施例9–凝胶稳定性
在体外生理缓冲条件下测试凝胶稳定性。将1g每个凝胶样品(仅水凝胶或0.5％qCh水凝胶)置于具有100μm过滤器孔径(Falcon，NC，USA)的细胞容器上。在添加凝胶之前，还测量了空细胞容器的重量。将样品置于PBS(含钙和镁的DPBS，pH 7.4，Fisher 14080055)或含15μg/ml溶菌酶的PBS(来自鸡蛋清，Sigma Aldrich，美国)并在37℃下温育8周。在每个预定的时间间隔，小心地去除底部的多余液体后，对每个装有凝胶的容器进行称重。然后通过减去空容器的重量来计算凝胶的净重。每个实验组一式三份。参见图9A和9B。
实施例10–热分析
使用TA Instruments DSC Q100差示扫描量热仪进行实验。温度以5℃/min的速率从室温下降到-50℃，然后以5℃/min的速率从-50℃升高到100℃。基线是通过用两个空盘来测量的。然后，其中一个空盘装载9.5mg凝胶，另一个未触及并用作参考。报告结果减去基线。
实施例11–铺展性
铺展性测试是在通过平行板法制备凝胶后48h在室温下进行的。将凝胶装入玻璃板模具的中心孔中。孔的直径为1cm。具体而言，将1.0g±0.01g凝胶置于两个水平玻璃板(20×20cm)之间，并用已知重量的板挤压凝胶。随后，在1min后测量铺展直径并根据铺展直径分类如下：
·流体凝胶
Figure BDA0003767061060000411
·半流体凝胶
Figure BDA0003767061060000412
·半刚性凝胶
Figure BDA0003767061060000413
·刚性凝胶
Figure BDA0003767061060000414
·非常坚硬的凝胶
Figure BDA0003767061060000415
实施例12-通过搭接剪切实验进行的组织/粘膜粘附性能测试
根据修改后的ASTM F2255-05标准对组织粘合剂的搭接剪切强度性能进行搭接剪切实验。从当地屠宰场获得新鲜的猪皮，在使用前将它们浸入PBS中以防止变干。将两片新鲜猪皮切成长4cm、宽1cm、厚2mm。这两片用强力胶分别粘在载玻片上(7.5cm×2.5cm)。为准备测试，将80μL凝胶涂在其中一个组织的1cm2区域中，另一片立即放在凝胶上，并在37℃下用夹子在湿塑料袋中施加5min的力，然后进行测量。然后立即使样品以10mm/min的十字头速度拉紧直至失效。对于每种材料，至少进行了3次重复。
实施例13–凝胶组合物
成分：
#1：不含ZnO，不含qCh
#2：仅ZnO(0.5g)，不含qCh
#3：仅qCh(0.5g)，不含ZnO
#4：ZnO(0.5g)和qCh(0.5g)
添加的其他成分：甘油(55g)、水(45g，但在真空干燥过程中会蒸发一部分)、Laponite(15g)、PEO 20k(4g)、聚(乙酸乙烯酯)(1.25g)、PEO 300k(0.4g)。
凝胶制作方案：
将10g聚(乙酸乙烯酯)溶解在乙酸乙酯中，制成100mL溶液以备后用。4.00g PEO(20k分子量)、0.400g PEO(300k分子量)、55g甘油(凝胶#3和#4为44g)和45g水(凝胶#2为43g，和凝胶#4为34g)，将水加入600ml玻璃烧杯中。使用配备有PTFE涂层十字叶轮的均化器进行搅拌。将烧杯放在热板上，热电偶浸入溶液中以控制温度。烧杯用多片食品包装纸包裹以防止水分蒸发。以1250rpm的速度搅拌该混合物，进行43min的PEO溶解过程。首先将其加热至80℃(耗时13min)，然后使其冷却至40℃并保持在40℃，这又需要30min。仅对于凝胶#2和#4，添加2.50g 20％ZnO纳米颗粒水分散体并搅拌1min。添加15g Laponite并在约1min内形成凝胶。温度保持在40℃，搅拌速度保持在1250rpm，直到凝胶形成。一旦形成凝胶，立即停止搅拌和加热。仅对于凝胶#3和#4，加入9.5g qCh水溶液(包含0.5g qCh和9g水)和11g甘油，然后以320rpm搅拌并与凝胶混合10min。加入12.5ml 10％聚(乙酸乙烯酯)溶液和70uL(300uL凝胶#3和#4)冰醋酸，然后在320rpm下搅拌7min，然后在2500rpm下再搅拌10min。凝胶此时粘在烧杯上，看起来非常有粘性。烧杯被一块食品包装纸包裹着，上面戳了几个小孔。然后将其置于真空烘箱(Eppendorf Vacufuge plus)中以蒸发乙酸乙酯和一些水以强化凝胶。设置为60℃和“D-AQ”。蒸发75min后，取出2500rpm搅拌1min，再继续蒸发75min。最后，以2500rpm的转速搅拌5min。
实施例14——孔模型烧伤伤口愈合临床试验实验
1.与3cm×3cm 200℃的金属块接触10秒或20秒以形成伤口。
2.形成伤口后，进行人工清创，使真皮层完全变成死真皮层(直至见点状出血)。然而，受热影响的表皮边界(伤口边缘)(读取热特征的颜色痕迹)被保留，以更真实地模拟烧伤伤口。将实施例13的凝胶组合物#1-3直接施加到伤口并使用无菌刮刀涂抹，形成与凝胶制剂直接接触的敷料。参见图10-14。结果：对照伤口显示感染(全部)，而具有凝胶组合物#1-3的伤口均未显示任何感染。参见图13-14。
实施例15–体外细胞毒性研究
首先，制备哺乳动物细胞培养物。将NIH 3t3成纤维细胞(86041101，SigmaAldrich)在添加了10％新生小牛血清(CS)和1％青霉素/链霉素的杜尔贝克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium)(DMEM；Fisher，Pittsburgh，PA)中培养。所有细胞在37℃、加湿、5％CO2/95％空气环境中培养至90％融合。在这些实验中使用传代数为4-7的细胞。
使用ISO 10993-5中所述的剂量递增和提取方法研究了含有不同组合物的各种凝胶的细胞毒性。对于所有实验，样品通过暴露于紫外线辐射15min进行消毒。在剂量递增法中，将各个凝胶样品以10重量％的浓度分散在无菌Milli-Q水中，并进一步在细胞培养基中连续稀释至0.1-1,000μg/ml。另一方面，在提取方法中，将1g各凝胶样品或市售Orbeseal凝胶与5ml细胞培养基在锥形管中在37℃下温育48h，以彻底释放密封剂残留物。然后离心样品并收集上清液中的细胞培养基。将3T3成纤维细胞以6,000细胞/cm2(1,950个细胞/孔)的细胞密度接种在96孔板上，并温育24h以进行细胞附着。接下来，在指定的时间间隔内，用含有用剂量递增法或提取法制备的样品的细胞培养基处理细胞。温育后，去除细胞培养基中的样品并用PBS冲洗细胞两次。通过PrestoBlueTM细胞活力试剂(A13262，Invitrogen)测定所得细胞密度。简而言之，将试剂与细胞培养基以1:10的体积比混合。然后将细胞与试剂/培养基混合物在37℃下在96孔板中温育1h，并测量每个样品的荧光强度(Em＝560nm/Ex＝590nm)。为了评估每个孔中的细胞数，绘制了表示细胞密度范围与荧光强度(R2>0.95)之间的线性相关性的标准曲线，并根据每个样品中记录的荧光强度用该标准曲线确定细胞数。参见图22B。
实施例16——水凝胶表面抗菌活性评价
将凝胶的抗菌性能与
Figure BDA0003767061060000441
干母牛乳头密封剂(油基中的亚硝酸铋(65％w/w))进行了比较。简而言之，将0.2ml各水凝胶样品或0.2ml Orbeseal(在单独的孔中)添加到单独的1.5ml埃彭多夫管(Eppendorf tubes)中。然后将样品离心，并将100μl细菌溶液(2*107CFU/ml)添加到每个样品中。对照样品是在0.2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中培养的细菌。样品在37℃下以120rpm的速度轻轻摇动温育24h。温育后，将样品重新悬浮在PBS中，连续稀释，然后铺在BHI琼脂板上。然后将琼脂板再温育16h。每个样品的细菌密度(CFU/cm2)由计数的菌落数确定。
此外，还通过BacTiter-GloTM微生物细胞活力测定(Promega,Madison,WI,USA)评估细菌活力。简而言之，温育后，将每个样品完全重悬于PBS中，然后在PBS中进一步稀释10倍。在白色不透明96孔板上，将测定试剂(50μl)与等体积的各样品混合。在室温下温育5min后记录每个样品的发光。
实施例17–水凝胶体外抗细菌入侵的长期疗效评价
使用体外模型评估凝胶防止细菌渗透的能力，并与
Figure BDA0003767061060000442
干母牛乳头密封剂进行比较。将凝胶或
Figure BDA0003767061060000443
(2ml)填充到5ml luer-lock注射器中并以2000rpm的速度离心2min，以确保测试材料没有气泡。注射器固定在50ml锥形管中，其末端朝下。在离心过程中，注射器尖端(无针头)用封口膜密封。然后将所有带有测试材料的注射器用紫外线消毒15min，并打开注射器末端。接下来，将2ml金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的细菌培养物(105CFU/ml)添加到新的50ml锥形管中，并将上述制备的注射器向下放置，使其末端浸入细菌培养物中。此外，在每种测试材料的顶部添加1ml新鲜BHI培养基。然后将样品在37℃下以120rpm的转速温育。每24h，向每个锥形管中的细菌培养物补充新鲜接种物。此外，从每个样品中取出200μl培养基用于OD 600测量和细菌计数，然后加入200μl新鲜培养基。实验进行了14天，每个实验组一式三份。
实施例18–体内安全性和有效性研究的典型程序
效果试验：
实验母牛
本研究将使用完成第二次泌乳的荷斯坦母牛。将使用泌乳后期的母牛(干奶时产奶时间为355+/-30天(DIM))，每天产奶量超过15公斤。选定的母牛在干奶前30天内未接受过亲代或乳房内抗生素或抗炎治疗，有4个功能个体(quarter)，在干奶当天没有出现亚临床或临床乳腺炎，乳头末端评分低于3，并且过去30天内没有临床乳腺炎病史(评分系统基于威斯康星大学提供的标准)。在研究开始前一到两周，将对母牛的乳房进行乳体细胞计数(SCC)、细菌学培养和NAGase活性测定。该程序将在研究开始前重复2天。将包括奶中SCC<200,000细胞/ml、奶培养阴性的母牛。
实验组
将使用具有动物水平治疗分配的分群研究设计，个体动物的所有乳头都将接受相同的治疗。每次治疗将对五头母牛进行，每头母牛有四个乳头。本研究拟测试的五个实验组描述如下：
1)2.6g凝胶配方#1(n＝5)
2)2.6g凝胶配方#2(n＝5)
3)2.6g凝胶配方#3(n＝5)
4)2.6g凝胶配方#4(n＝5)
5)2.6g Orbeseal乳头密封剂作为阳性对照组(n＝5)
6)未经处理的母牛将作为阴性对照组(n＝5)
首先将对每组5只动物进行初步研究(总共25只动物)。如果临床结果显著，动物数量可以增加到每组40头母牛。
密封剂样品的管理
在最后一次挤奶后立即通过乳房内输注进行治疗。每次治疗前，都会用含酒精的乳头湿巾清洁和消毒乳头，以去除固体污染物。输液将由一小部分经过培训的技术人员进行(大概有一名在试点研究中，10名技术人员在全面研究中)。技术人员将在治疗管理方面不知情。输注后密封剂不会被按摩到腺体实质中。[1,6,7]
干奶期密封剂稳定性评价
干奶期母牛的密封剂稳定性将通过干奶期母牛乳头内的密封剂保留程度来评估。两名训练有素且对治疗分配不知情的兽医观察乳头末端。在前12h，每2h记录一次观察，输注后前2周每天记录一次，随后每周进行一次观察，直到第60天干奶期结束。[6]密封剂保留的评分为0到1，其中0对应于在乳头端看不到密封剂，而1对应于从乳头端挤出可见的密封剂。
干奶期结束时，从乳头挤出密封剂，放在滤纸上吸收多余的液体，然后测定剩余密封剂的体积和重量。
干奶期对牛健康的评价
干奶期乳房炎症的发生率，将由两名训练有素且对治疗分配不知情的兽医通过在输注后前12h，每2h观察一次，随后7天每天一次，然后每周一次，直到第60天干奶期结束来评估。临床乳腺炎引起的炎症根据乳腺图表从0到2评分如下：0＝正常，1＝乳房异常(如肿胀、发热、敏感、水肿)和2＝异常牛(发烧、厌食)。测定直肠温度，每天采集2mL血样。[7]
还通过LC-MS对干奶期母牛血清进行代谢组学分析，以诊断亚临床乳腺炎。在输注后0、7、14和21天从尾静脉中采集5mL母牛血液样品。血清样品的制备方法是将血液样品以1,600g在4℃下离心20min，然后在使用前在-80℃下储存。对于代谢组学分析，通过用乙醇/甲醇(1:1v/v)进行1:4稀释从血清样品中提取代谢物。然后将样品涡旋，在4℃下以16,000g离心20min，并用0.22μm膜过滤。分析血清淀粉样蛋白A、内脂素和α-生育酚的水平。通过将3μl每个样品注入LC-MS进行代谢组学分析。在Acquity UPLC BEH酰胺色谱柱(2.1mm×150mm，1.7μm，Waters)上分离代谢物。流动相A为水/乙腈(95:5，体积/体积)，流动相B为水/乙腈(5:95，体积/体积)；两种流动相均含有0.1％甲酸。洗脱梯度为0min，99％B；7.5min，40％B；9min，99％B；10min，99％B；和12min，99％B，流速为0.4mL/min。柱温箱的温度设置为45℃。自动进样器托盘保持在6℃。样品分析在12min的总运行时间内进行。[8]
产犊后临床乳腺炎的评估
产犊后，临床乳腺炎将每天记录30天。如前所述临床乳腺炎将定义为无临床乳腺炎(0)、奶异常(1)、奶异常伴有炎症或个体(quarter)发红(2)，或母牛异常(3)。每次挤奶前，应目视检查每个个体并使用条形杯在预剥离过程中获得的奶来观察每个个体的这些迹象。诊断出患有临床乳腺炎的母牛将根据农场协议在诊断时进行治疗。
产犊后奶中SCC的测量
体细胞计数在变干时测定，并在泌乳早期再次测定。奶样品(200ml)是从个体在干奶、1、3、6和12天以及30天的奶(DIM)中新鲜收集的。奶样品用溴硝醇片剂保存，并在SCC测试前冷藏。细胞通过血细胞计数器或流式细胞仪手动计数。样品可以用微滤脱脂奶稀释，直到获得的SCC在100-200个细胞/μL范围内。诊断为亚临床乳腺炎的母牛将根据农场协议在诊断时进行治疗。
产犊后奶中的微生物学检查
与Orbeseal或无产品相比，为了评估凝胶制剂在降低IMI发生率方面的效果，将在干奶期结束时收集的奶样品(100μL)铺在222200乳腺炎SSGN四方板(Eurofins)上，它允许通过菌落的外观来视觉识别引起乳腺炎的生物，包括葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌。奶样品将使用无菌棉签在琼脂上划线，并在37℃下温育24-48h。对于那些有细菌生长的平板，记录细菌种类的鉴定。[9]
用于培养的奶样品将在干奶、1、3、6、12和30天时收集。此外，奶样品将在诊断出临床乳腺炎的任何时候进行培养。
乳房内感染病例根据奶中的微生物检查结果分类如下：
AI-IMI：干奶期获得感染。至少有一种在干奶时不存在，但在干奶期后在个体中被识别出来的有机体。
UI-IMI：在干奶期新鲜未感染。干奶时不存在且在干奶期后在同一个体未发现的有机体。
奶中Laponite残留的检验
在干奶期结束时收集1.00ml奶，将2.0ml 25％四甲基氢氧化铵溶液和2.5ml水添加到PTFE管中。消化混合物在超声波浴中预处理30min。使用由MLS(Leutkirch，德国)提供的用于加压消化的ultraCLAVETM微波高压釜进行消化。微波功率设置为600W，持续10min，然后在800W下进行30min。消化温度为140℃。它保持约30min。使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析消化物中的锂含量，并添加铍作为内标。[10、11、12]
使用上述方法测量用凝胶处理和未处理的母牛的奶样品中的锂浓度，看看它们是否有显著差异。
安全试验：
组织学检查
将进行组织学测试以评估由密封剂引起的局部炎症反应。本研究将选择10头每天产大约7公斤奶并符合与前面描述的相同健康标准的泌乳母牛。[1]这些母牛在最后一个泌乳期后被屠宰。最后一次挤奶后，将密封剂注入每头母牛的乳头。在60天的干奶期后，将从个体中去除密封剂并处死母牛。切除实质外组织后，收集乳房并将其分成两半。每个个体的条纹管、乳头腔和乳房将被收集和处理以进行组织学分析。在邻近腺池的腺体基部(区域1)、腺池和乳腺实质背侧边界之间的中间位置(区域2)以及背侧实质边界附近(区域3)对每个实质取样。[2]组织在10％中性缓冲福尔马林中固定24h，在自动组织处理器上处理并包埋在石蜡中。切片将以4μm厚度在三个水平上切割，并用苏木精和伊红(H&E)染色剂染色。此外，牛PMN的免疫染色是在单独的实验中进行的。为了检测白细胞粘附，福尔马林固定的组织切片(5μm厚)将通过在4℃下温育60min，用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的小鼠抗牛CD11bmAb(Serotec，IgG2b同种型的克隆CC126)染色。用PBS清洗两次后，组织样品将用共聚焦荧光显微镜成像。[3]
炎症程度根据多形核中性白细胞(PMN)浸润的程度从1到3进行评分：1＝没有炎症反应；2＝密封剂和组织界面之间的中度PMN浸润；3＝密封剂和组织界面之间的PMN标记有坏死迹象。[4]
参考文献
[1]K.R.Petrovski,A.Caicedo-Caldas,N.B.Williamson,Efficacy of a novelinternal dry period teat sealant containing 0.5％chlorhexidine againstexperimental challenge with Streptococcus uberis in dairy cattle,J.DairySci.94:3366–3375,2011。
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[3]T.Ozawa,Y.Kiku,M.Mizuno,et al.,Effect of intramammary infusion ofrbGM-CSF on SCC and expression of polymorphonuclear neutrophil adhesionmolecules in subclinical mastitis cows,Vet Res Commun,36:21–27,2012。
[4]J.Gogoi-Tiwari,V.Williams,C.B.Waryah,et al.,Mammary glandpathology subsequent to acute infection with strong versus weak biofilmforming staphylococcus aureus bovine mastitis isolates:a pilot study usingnon-invasive mouse mastitis model,PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0170668,2017。
[5]S.Godden,P.Rapnicki,S.Stewart,et al.,Effectiveness of an internalteat seal in the prevention of new intramammary infections during the dry andearly-lactation periods in dairy cows when used with a dry cow intramammaryantibiotic,J.Dairy Sci.86:3899–3911,2003。
[6]G.H.Lim,K.E.Leslie,D.F.Kelton,et al.Adherence and efficacy of anexternal teat sealant to prevent new intramammary infections in the dryperiod.J.Dairy Sci.90:1289–1300,2007。
[7]S.Lanctot,P.Fustier,A.R.Taherian,et al.,Effect of intramammaryinfusion of chitosan hydrogels at drying-off on bovine mammary glandinvolution,J.Dairy Sci.100:2269–2281,2017。
[8]F.Zandkarimi,J.Vanegas,Fern,C.S.Maier,and G.Bobe,Metabotypes withelevated protein and lipid catabolism and inflammation precede clinicalmastitis inprepartal transition dairy cows,J.Dairy Sci.101:5531–5548。
[9]S.Pyorala,L.Kaartinen,and H.Kack,Efficacy of two therapy regimensfor treatment of experimentally induced Escherichia coli mastitis in cows,JDairy Sci 77:453-461,1994。
[10]S.Hauptkorn,J.Pavel,and H.Seltner,Determination of silicon inbiological samples by ICP-OES after non-oxidative decomposition underalkaline conditions,Fresenius J.Anal.Chem.370:246-250,2001。
[11]H.Vanhoe and C.Vandecasteele,Determination of lithium inbiological samples by inductively coupled plasma mass spectrometry,Anal.Chim.244:259-267,1991。
[12]D.Saribal.ICP-MS Analysis of Trace Element Concentrations in Cow′s Milk Sample from Supermarkets in Istanbul,Turkey,Biol.Trace Elem.Res.193:166-173,2020。
实施例19–将试剂(例如蛋白质、药物等)负载到凝胶上的典型程序
凝胶的制备：
将10g聚(乙酸乙烯酯)溶解在乙酸乙酯中，制成100ml溶液以备后用。将4.00g PEO(20k分子量)、0.400g PEO(300k分子量)、44g甘油和34g水加入到600ml玻璃烧杯中。使用配备有PTFE涂层十字叶轮的均化器进行搅拌。将烧杯放在热板上，热电偶浸入溶液中以控制温度。烧杯用多片食品包装纸包裹以防止水分蒸发。在370rpm搅拌下将混合物加热至90℃。将其在90℃下保持5min，然后使其冷却至室温。加入2.50g 20％ZnO纳米颗粒水分散体并搅拌1min。加入15g Laponite并搅拌以充分混合。凝胶形成后，在90℃水浴中加热20min。将凝胶冷却至室温，然后分成两等份，分别加入牛血清白蛋白(BSA)和罗丹明B。
负载蛋白：
牛血清白蛋白(BSA)加入125mg BSA、4.75g qCh水溶液(含有0.25g qCh和4.5g水)和5.5g甘油，然后在100℃下以320rpm搅拌并与凝胶混合10min。加入6.25ml 10％聚(乙酸乙烯酯)溶液和150μL冰醋酸，然后以320rpm搅拌7min，然后以2500rpm再搅拌10min。
负载药物：
罗丹明B(罗丹明B为模型药物)加入4.75g qCh水溶液(含有0.25g qCh和4.5g水)，和5.5g甘油，然后在100℃以320rpm搅拌并与凝胶混合10min。加入110mg罗丹明B、6.25ml10％聚(乙酸乙烯酯)溶液和150μL冰醋酸，然后以320rpm的速度搅拌7min，然后以2500rpm的速度再搅拌10min。
两种凝胶此时都粘在烧杯上，看起来非常有粘性。烧杯被一块食品包装纸包裹着，上面戳了几个小孔。然后将其置于真空烘箱(Eppendorf Vacufuge plus)中以蒸发乙酸乙酯和一些水以强化凝胶。设置为60℃和“D-AQ”。蒸发2h 30min后，取出以2500rpm搅拌1min。将25ml PBS添加到每个烧杯中。将烧杯放在板式振动器(Delfia1296-004)上并在“低”档下振动10h。将液体以21130rcf离心10min，取上清液进行分析。
实施例20——各种药剂从凝胶中的释放研究
BSA释放百分比：
从纳米颗粒中释放的BSA蛋白质通过纳滴分光光度计进行量化，以确定上清液中蛋白质的浓度，在离心产生纳米颗粒颗粒后，所有这些都是在室温下在PBS中温育10h后进行的。在室温下在PBS中温育10h后定量释放，在凝胶的上清液中检测到浓度为0.111mg/ml的BSA蛋白。释放量对应于2.78mg和2.2％释放。参见图27。
罗丹明B释放百分比：
罗丹明B的释放浓度通过10h后的上清液测定，离心并将溶液稀释10倍。随后，通过使用读板器(Varioskan Lux)测量吸光度并与校准曲线进行比较。测定的上清液浓度为252μ/ml，对应于6.3mg和5.7％的释放。参见图28。
通过引用并入
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Claims (20)

1.一种组合物，包含
多个硅酸盐纳米颗粒；
亲水性聚合物；和
水，
以及任选地进一步包含增稠聚合物、多个氧化锌颗粒、含有多个季铵官能团的聚合物、粘附性聚合物、油或多元醇。
2.根据权利要求1所述的组合物，包含
1-15重量％的多个硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％的亲水性聚合物；
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
3-9重量％的增稠剂；
0.2-5重量％的多个氧化锌颗粒；
0.2-2重量％的含有多个季铵官能团的聚合物；
0.1-50重量％的粘附性聚合物；和
20-80重量％的油或1-80重量％的多元醇，
其中重量％是组合物总重量的百分比。
3.根据权利要求1所述的组合物，包含
1-15重量％的多个硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％的亲水性聚合物；
0.1-50重量％的粘附性聚合物；
20-80重量％的油或1-80重量％的甘油，和
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
0.2-5重量％的多个氧化锌颗粒，和/或
0.2-2重量％的含有多个季铵官能团的聚合物，
其中重量％是组合物总重量的百分比。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述硅酸盐纳米颗粒为锂镁钠硅酸盐纳米颗粒。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述亲水性聚合物选自包括以下物质的组：聚(环氧乙烷)、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素和泊洛沙姆。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述亲水性聚合物为分子量为约1kDa至约10,000kD的聚(环氧乙烷)，并且其中2重量％的增稠聚合物的水溶液在25℃的粘度为约200mPa至约2,000mPa。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述增稠聚合物选自包括以下物质的组：硅酸盐纳米颗粒、锂镁钠硅酸盐纳米颗粒、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素和琼脂，或其衍生物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物含有多个季铵官能团，所述季铵官能团包含多个具有以下结构I的重复单元：
Figure FDA0003767061050000021
其中X-选自包括以下的组：Cl-、Br-、BF4 -和PF6 -。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述含有多个季铵官能团的聚合物为含有多个季铵官能团的壳聚糖。
10.根据权利要求1所述的组合物，包含
1-15重量％的多个锂镁钠硅酸盐纳米颗粒；
0.5-10重量％的分子量为约1kDa至约10,000kDa的聚(环氧乙烷)；
0.1-50重量％的聚乙酸乙烯酯；
20-70重量％的甘油，和
最高100重量％的水；以及任选地进一步包含
0.2-5重量％的多个氧化锌颗粒，和/或
0.2-2重量％的含有多个季铵官能团的壳聚糖。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种药物或试剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述一种或多种药物选自包括以下的组：抗生素药物、抗寄生虫药物、抗真菌药物、镇痛药或抗炎药物、维生素、皮质类固醇药物和蛋白质。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述一种或多种试剂选自包括以下的组：着色剂或染料和比色pH指示剂。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物为凝胶形式，在约38℃下的密度为1.1g/ml至5.0g/ml。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物的疾病。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物的乳腺炎。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物的皮肤病。
18.一种哺乳动物体内的导管密封剂，其包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物为母牛。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物给药在乳腺导管内和/或乳房皮肤上。
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