CN115004032A - 一种用于检测cd141+树突状细胞亚群表型和功能的方法及其应用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合及其分析方法和应用，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合包括CD141抗体、Linage抗体、HLA‑DR抗体、IL‑10抗体、IL‑12抗体、IL‑23抗体和IL‑27抗体。本申请还提供了一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒，所述试剂盒可高效快速地分析外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群表型及其功能，所述试剂盒的准确率高，同时能降低因检测大量表面抗原分子产生的经济成本，且检测、分析方法简单易行，具有重要的应用价值。

Description

一种用于检测CD141+树突状细胞亚群表型和功能的方法及其 应用试剂盒

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合及其分析方法和应用。

背景技术

CD141⁺树突状细胞分布于人外周血中，是近年来新发现的一个树突状细胞亚群。临床和基础研究表明，CD141⁺树突状细胞亚群在多种疾病的发生中起重要作用，例如恶性肿瘤(如肺癌、黑色素瘤、前列腺癌和肾癌)、皮炎、病毒感染(如HIV-1感染)、传染病(如疟疾)以及一些自身免疫病(如类风湿关节炎等)，临床数据表明在这些疾病中CD141⁺树突状细胞都显现出表型和功能的异常。因此CD141⁺树突状细胞的表型和功能测定的临床数据可成为临床医生判断上述疾病发展状况和临床治疗效果的辅助判断指标，具有十分重要的临床诊断意义。

流式细胞仪分析技术已作为免疫学的主要技术，广泛应用于临床和科研工作。树突状细胞作为人体内免疫系统中起主要调控作用的细胞，是免疫学研究热点之一。目前树突状细胞的检测主要依靠流式细胞仪分析技术，但检测树突状细胞的流式细胞仪的分析方案多种多样，没有一个统一标准化的模式。树突状细胞的研究日新月异，多种不同的树突状细胞亚型不断被报导发现，然而，针对树突状细胞检测的流式细胞仪的分析方案较为粗放，已不能满足目前临床针对不同亚型的树突状细胞的精确分析要求。

CN105911292A公开了一种用于组合分析CD11c⁺、CD11b⁺树突状细胞亚群及其分化程度和功能的试剂盒，所述试剂盒包含以下8种抗体：CD11c抗体、CD80抗体、CD86抗体、CD11b抗体、HLA-DR抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体。所述试剂盒可一次性检测CD11c⁺、CD11b⁺树突状细胞亚群及其分化程度和功能的全套数据。但树突状细胞的形态、免疫功能不尽相同，其表面抗原分子数量众多，针对不同树突状细胞亚群需要选择不同的特异性分子进行检测。

研究表明CD11c⁺、CD11b⁺树突状细胞亚群的功能与CD141⁺树突状细胞亚群的功能完全不同，并且在不同的疾病中起用。因此，所述分析CD11c⁺、CD11b⁺树突状细胞亚群及其分化程度和功能的试剂盒并不能满足研究CD141⁺树突状细胞亚群的需要。因此，研发提供一种用于检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的免疫检测试剂盒具有重要意义。

发明内容

本申请提供了一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合及其分析方法和应用。所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合所检测的抗原包括CD141、Linage、HLA-DR、IL-10、IL-12、IL-23和IL-27；本申请还提供一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒，所述试剂盒可高效快速地分析外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群表型及其功能，所述试剂盒的准确率高，同时降低因检测大量表面抗原分子产生的经济成本，且检测、分析方法简单易行，具有重要的应用价值。

第一方面，本申请提供一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合包括CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体。

在现有技术中通过流式细胞仪鉴定树突状细胞亚群通常需要分离提取外周血单核细胞，该过程复杂繁琐，时间周期长，若通过细胞分子表面抗原检测的方式分析细胞亚群则通常需要选择大量树突状细胞表面抗原分子进行检测，才能提高检测的准确性和特异性，但大量表面抗原的检测分析需要较长时间，且检测的经济成本较高，不利于快速高效地进行树突状细胞亚群分析研究。本申请通过特异性选择的7个抗体分子的组合对树突状细胞亚群的表型和功能进行检测，包括CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体，该配方设计可以高特异性和高灵敏度地检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能，为相关科学研究奠定基础。

优选地，所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合中的抗体带有荧光色素标记。

优选地，所述荧光色素包括BV510、BV-786、Pacific blue、PE-Cy7、AF700、eFluor660或PE中任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本申请提供一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒包括第一方面所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合。

目前市售的树突状细胞测试的试剂盒只能笼统地分析总体树突状细胞的数据，且不包括功能分析。随着科学研究的发展，人外周血中多个树突状细胞新亚群已经被发现，如CD141⁺树突状细胞，它们的表型和功能各不相同。本申请提供的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒能分析树突状细胞亚群中CD141⁺表型的比例，能对CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况进行判断，还可以分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

第三方面，本申请提供一种第二方面所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法，所述分析方法包括如下步骤：

(1)对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞；

(2)用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测；以及

(3)用流式细胞仪进行检测和分析。

本申请中，所述分析方法采用人体全血一步法测定人外周血中树突状细胞亚群及其功能，与使用外周血单核细胞(PBMC)分离技术测定树突状细胞相比，本申请中所述的分析方法简便易行、节约成本。用传统的PBMC分离技术分离树突状细胞，需要较大的采血量(通常几十毫升不等)，消耗时间长。而本申请采用人体全血一步法测定，只需患者一滴血(10～100μL)即可检测得到所需的全套信息。省去了分离PBMC的大量时间，能够简单快速、一步测定到位。适合临床大批量样品的测试。

优选地，步骤(1)中，所述对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞的步骤包括：

将外周血与红细胞裂解液混合，避光静置，离心，分离出CD141⁺树突状细胞，将所述CD141⁺树突状细胞重悬于细胞染色液中，加入白细胞刺激因子孵育。

本申请中，所述外周血的体积为10～100μL，例如可以是10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL或100μL等。

本申请中，所述外周血与红细胞裂解液混合的体积比为(1～10):200，例如可以是1:200、3:200、5:200、7:200、9:200或10:200等。

优选地，所述避光静置的时间为10～15min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min或15min等，所述避光静置的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。

本申请中，所述离心的离心力为300～350g，例如可以是300g、310g、320g、330g、340g或350g等，所述离心的时间为5～10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min等。

优选地，所述细胞染色液包括含胎牛血清的PBS缓冲液。

优选地，所述白细胞刺激因子在CD141⁺树突状细胞重悬液中的终浓度为0.08～0.1wt％，例如可以是0.08wt％、0.09wt％或0.1wt％等。

优选地，所述孵育的时间为4～6h，例如可以是4h、5h或6h等，所述孵育的温度为35～38℃，例如可以是35℃、36℃、37℃或38℃等。

优选地，步骤(2)中，所述用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测的步骤包括：

(a)用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体对CD141⁺树突状细胞进行首次孵育；

(b)用不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行二次孵育。

优选地，步骤(a)中，所述用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体对CD141⁺树突状细胞进行首次孵育的步骤包括：

将步骤(1)中孵育后的CD141⁺树突状细胞重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体进行首次孵育，用福尔马林溶液固定CD141⁺树突状细胞，遮光孵育。

优选地，所述福尔马林溶液的质量分数为1.5～2.5vol％，例如可以是1.5vol％、1.8vol％、2.0vol％、2.2vol％或2.5vol％等。

优选地，所述首次孵育的时间为25～35min，例如可以是25min、28min、30min、32min或35min等，所述首次孵育的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。

优选地，所述遮光孵育的时间为15～20min，例如可以是15min、16min、17min、18min、19min或20min等，所述遮光孵育的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。

优选地，步骤(b)中，用不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行二次孵育的步骤包括：

将步骤(a)所得的CD141⁺树突状细胞用细胞穿透液重悬，离心去上清，将沉淀用细胞穿透液重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液与不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体进行二次孵育。

优选地，所述离心的离心力为300～350g，例如可以是300g、310g、320g、330g、340g或350g等，所述离心的时间为5～10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min等。

优选地，所述二次孵育的时间为24～26h，例如可以是24h、25h或26h等，所述二次孵育的温度为0～4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃等。

优选地，所述二次孵育在遮光的条件下进行。

优选地，步骤(3)中，用流式细胞仪进行检测和分析的步骤包括：

将二次孵育后的CD141⁺树突状细胞用细胞穿透液重悬，离心去上清，将沉淀细胞用细胞染色液重悬，用流式细胞仪进行分析检测。

优选地，所述离心的离心力为300～350g，例如可以是300g、310g、320g、330g、340g或350g等，所述离心的时间为5～10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min等。

优选地，所述分析的方法包括：

根据CD141抗体和Linage抗体与CD141⁺树突状细胞表面的CD141和Linage的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群CD141⁺表型的比例；

根据HLA-DR抗体与CD141⁺树突状细胞表面的HLA-DR的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况；以及

根据IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体与CD141⁺树突状细胞表面的IL-10、IL-12、IL-23和IL-27的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

作为本申请的优选技术方案，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法包括如下步骤：

(1)对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞：

将10～100μL外周血与红细胞裂解液混合，20～25℃避光静置10～15min，300～350g离心5～10min，分离出CD141⁺树突状细胞，将所述CD141⁺树突状细胞重悬于细胞染色液中，加入白细胞刺激因子35～38℃孵育4～6h，所述白细胞刺激因子在CD141⁺树突状细胞重悬液中的终浓度为0.08～0.1％。

(2)用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测：

(a)将步骤(1)中孵育后的CD141⁺树突状细胞重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液与不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体进行首次孵育，所述首次孵育的时间为25～35min、温度为20～25℃，所述CD141⁺树突状细胞重悬液与CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体的体积比为100:(2～2.5):(2～2.5):(2～2.5)，用质量分数为1.5～2.5vol％福尔马林溶液固定CD141⁺树突状细胞，20～25℃遮光孵育15～20min；

(b)将步骤(a)所得的CD141⁺树突状细胞用细胞穿透液重悬，300～350g离心5～10min去上清，将沉淀用细胞穿透液重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液与不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体进行二次孵育，所述CD141⁺树突状细胞重悬液与IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体的体积比为100:(2～2.5):(2～2.5):(2～2.5):(2～2.5)，所述二次孵育在遮光的条件下进行，所述二次孵育的时间为24～26h、温度为0～4℃。

(3)用流式细胞仪进行检测和分析：

将二次孵育后的CD141⁺树突状细胞用细胞穿透液重悬，300～350g离心5～10min去上清，将沉淀细胞用细胞染色液重悬，用流式细胞仪进行检测和分析；

根据CD141抗体和Linage抗体与CD141⁺树突状细胞表面的CD141和Linage的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群CD141⁺表型的比例；

根据HLA-DR抗体与CD141⁺树突状细胞表面的HLA-DR的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况；以及

根据IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体与CD141⁺树突状细胞表面的IL-10、IL-12、IL-23和IL-27的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

第四方面，本申请提供一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的系统，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的系统包括：

(1)样品处理模块：对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞；

(2)检测模块：用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测；以及

(3)分析模块：用流式细胞仪进行检测和分析。

第五方面，本申请提供第一方面所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合、第二方面所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒或第四方面所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的系统中任意一种或至少两种的组合在鉴定CD141⁺树突状细胞亚群表型和功能和/或制备鉴定CD141⁺树突状细胞亚群表型和功能的产品中的应用。

优选地，所述产品包括检测恶性肿瘤的试剂盒和/或检测试剂；

优选地，所述恶性肿瘤包括肺癌、黑色素瘤、前列腺癌或肾癌中的任意一种或至少两种的组合。

本申请所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本申请具有以下有益效果：

(1)本申请所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法简单、快速易行。采用人体全血一步法测定人外周血中树突状细胞亚群及其功能，与使用外周血单核细胞(PBMC)分离技术测定树突状细胞相比，本申请中所述分析方法简便易行、节约成本。用传统的PBMC分离技术分离树突状细胞，需要较大的采血量(通常几十毫升不等)，消耗时间长。而本申请采用人体全血一步法测定，只需患者一滴血(10～100μL)即可检测得到所需的全套信息。省去了分离PBMC的大量时间，能够简单快速、一步测定到位，适合临床的大批量样品的测试。

(2)本申请所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方发的结果信息全面。本申请通过特异性地选择7个抗体分子组合，包括CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体，该配方设计可以高特异性和高灵敏度地分析CD141⁺树突状细胞亚群中CD141⁺表型的比例，能对CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况进行判断，还可以分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

(3)本申请所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方发的结果准确性高。本申请中检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方案，相较其它技术具有灵明度高，特异性好的优点，检测的结果更加准确可靠。

(4)目前市售的树突状细胞分析试剂盒的分析方案只能测试总体树突状细胞的数据，且不包括功能分析。本申请所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒可以精细地提供人外周血中最新的CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的全套数据，相较于先前已开发的方案，本申请首次把CD141⁺树突状细胞亚群的表型与功能相结合来进行测试。

附图说明

图1为实施例3中健康人外周血细胞FSC-SSC散点图。

图2为实施例3中健康人外周血的流式细胞分析图。

图3为实施例3中健康人/非小细胞肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞亚群的流式细胞仪分析结果图。

图4为实施例3中健康人/非小细胞肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞亚群HLA-DR的表达情况的统计图。

图5为实施例3中IL-10在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达比例图。

图6为实施例3中IL-10在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达情况的统计图。

图7为实施例3中IL-12在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达比例图。

图8为实施例3中IL-12在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达情况的统计图。

图9为实施例3中IL-23在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达比例图。

图10为实施例3中IL-23在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达情况的统计图。

图11为实施例3中IL-27在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达比例图。

图12为实施例3中IL-27在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141+树突状细胞上的表达情况的统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本申请，不应视为对本申请的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

以下具体实施方式中所使用的实验材料如下：

流式细胞仪(Cytek)；linage抗体(Biolegend)；CD141抗体(Biolegend)：HLA-DR抗体(eBioscience)；IL-10抗体(BD)；IL-12抗体(Biolegend)；IL-23抗体(eBioscience)；和IL-27抗体(Biolegend)。

实施例1

本实施例提供一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合包括CD141抗体(Biolegend)、Linage抗体(Biolegend)、HLA-DR抗体(eBioscience)、IL-10抗体(BD)、IL-12抗体(Biolegend)、IL-23抗体(eBioscience)和IL-27抗体(Biolegend)。

所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合中的抗体带有荧光色素标记。所述CD141抗体的荧光色素为BV510；所述Linage抗体的荧光色素为BV786；所述HLA-DR抗体的荧光色素为Pacific blue；所述IL-10抗体的荧光色素为PE-Cy7；所述IL-12抗体的荧光色素为AF700；所述IL-23抗体的荧光色素为eFluor660；所述IL-27抗体的荧光色素为PE。

实施例2

本实施例提供一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒，所述检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒中包括实施例1中所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合。

实施例3

本实施例使用实施例2中所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒对非小细胞肺癌病人(实验组)与健康人(对照组)的外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群进行分化和功能分析，同时对同型对照进行分析。

(1)对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞：

分别取非小细胞肺癌病人和健康成年人的静脉外周血100μL，并进行抗凝处理；将外周血全血混合于2mL 1×红细胞裂解液(Biolegend)中，旋转震荡10s后，25℃避光静置15min，用离心机离心(350g离心5min)，倾倒上清液，将沉淀细胞悬浮于2mL细胞染色液(含2.5％胎牛血清的PBS溶液)中，加入白细胞刺激因子(BD)在37℃恒温孵育细胞6h备用，所述白细胞刺激因子在CD141⁺树突状细胞重悬液中的终浓度为0.1％。

(2)用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测：

(a)将步骤(1)中所得的CD141⁺树突状细胞重悬于100μL细胞染色液中，将CD141⁺树突状细胞重悬液与2μL BV510标记的CD141抗体、2μL BV786标记的Linage抗体和2μLPacific blue标记的HLA-DR抗体进行首次孵育，所述首次孵育的时间为30min、温度为25℃，加2mL细胞染色液，350g离心5min，重复离心两次，用2mL质量分数为2％福尔马林溶液固定CD141⁺树突状细胞，25℃遮光孵育20min；

(b)将步骤(a)所得的CD141⁺树突状细胞用2mL细胞穿透液(Biolegend)重悬，350g离心5min，重复离心两次，将沉淀用100μL细胞穿透液重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液与2μL PE-Cy7标记的IL-10抗体、2μL AF700标记的IL-12抗体、2μL eFluor660标记的IL-23抗体和2μL PE标记的IL-27抗体进行二次孵育，所述二次孵育在遮光的条件下进行，所述二次孵育的时间为30min、温度为25℃。

(3)用流式细胞仪进行检测和分析。

将二次孵育后的CD141⁺树突状细胞用2mL细胞穿透液重悬，350g离心5min去上清，将沉淀细胞用0.5mL细胞染色液重悬，用流式细胞仪进行检测和分析。

通过以上方法，使用流式细胞仪一次性得到了关于树突状细胞亚群(通过CD141和Linage的表达情况表征)、分化程度(HLA-DR的表达情况表征)以及细胞功能(通过IL-10、IL-12、IL-23和IL-27的表达情况表征)的所有信息，并可通过这些信息的比较对非小细胞肺癌病人与健康人的差异进行研究，从而为研究非小细胞肺癌病人的免疫调节机制提供依据。

分析结果：

(1)通过CD141抗体和Linage(Lin)抗体与CD141⁺树突状细胞表面的CD141和Linage的结合情况，分析树突状细胞CD141⁺表型的比例。检测结果如图1所示，图1为健康人外周血细胞FSC-SSC散点图，FSC代表细胞的大小，SSC代表细胞的颗粒度；图2为健康人外周血的流式细胞分析图，左图为Linage在健康人外周血中的树突状细胞的表达比例图，Linage^-(Lin^-)占总细胞数的12.9％，右图为CD141在健康人外周血中的树突状细胞的表达比例图，CD141⁺占总细胞数的41.9％。

(2)采用流式细胞仪检测共信号刺激分子HLA-DR在人外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群上的表达状况，此数据用于评估人外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况。图3为健康人/非小细胞肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群的流式细胞仪分析结果图，图4为健康人/非小细胞肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群HLA-DR的表达情况的统计图，其中图3中粗线表示健康人，虚线表示非小细胞肺癌病人，结果表明，CD141⁺树突状细胞表面HLA-DR共表达越高，CD141⁺树突状细胞的免疫成熟度越高，从图3和图4的结果也可以看出健康人的CD141⁺树突状细胞表面的HLA-DR共表达明显多于肺癌病人；表明肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞的免疫成熟程度显著低于健康人。

(3)通过IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体测定CD141⁺树突状细胞表面的IL-10、IL-12、IL-23和IL-27的分泌表达情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

图5为IL-10在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达比例图，图6为IL-10在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达情况的统计图；IL-10有抑制体内免疫功能的作用，通过图5和图6的结果可知，非小细胞肺癌病人的CD141⁺树突状细胞比健康人的CD141⁺树突状细胞分泌更多的IL-10，结果表明非小细胞肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞通过分泌较多的IL-10来抑制体内的抗肿瘤免疫反应。

图7为IL-12在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达比例图，图8为IL-12在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达情况的统计图。IL-12是促进免疫反应的细胞因子，通过图7和图8的结果可知，非小细胞肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞比健康人的CD141⁺树突状细胞分泌较少的IL-12，结果表明非小细胞肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞分泌IL-12的数量不足，这很可能影响IL-12介导的抗肿瘤免疫反应。

图9为IL-23在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达比例图，图10为IL-23在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达情况的统计图，图11为IL-27在同型对照/健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达比例图，图12为IL-27在健康人/肺癌病人的外周血中的CD141⁺树突状细胞上的表达情况的统计图。从图中可知IL-23和IL-27在健康人CD141⁺树突状细胞上的表达比例分别为17.7％和36.6％；而IL-23和IL-27在非小细胞肺癌病人CD141⁺树突状细胞上的表达比例分别为22.2％和38.8％。

IL-23是一个促进免疫反应的细胞因子，如果树突状细胞能分泌较多的IL-23，表明树突状细胞能够通过分泌较多的IL-23来促进免疫反应，图9和图10的结果表明，正常健康人的CD141⁺树突状细胞分泌的IL-23与肺癌病人CD141⁺树突状细胞分泌的IL-23相似，这表明肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞不是通过调控IL-23来影响CD141⁺DC介导的免疫反应。

IL-27是一个能抑制免疫功能的细胞因子，如果树突状细胞分泌较多的IL-27，表明树突状细胞具有免疫抑制功效，树突状细胞能够通过分泌较多的IL-27来抑制免疫反应。图11和图12的检测结果表明，肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞与正常健康人的CD141⁺树突状细胞分泌的IL-27数量相比无明显区别，这表明肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞不是通过分泌更多的IL-27来抑制免疫功能，肺癌病人体内的CD141⁺树突状细胞相较于健康人体内的CD141⁺树突状细胞是一种具有免疫抑制功能的树突状细胞。

上述结果表明，本申请的抗体分子组合以及分析方法可以有效鉴别外周血中的CD141⁺树突状细胞亚群，并分析其分化成熟情况以及功能。

综上所述，本申请特异性地选择7个抗体分子组合，包括CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体，该配方设计可以高特异性和高灵敏度地分析CD141⁺树突状细胞亚群中CD141⁺表型的比例，能对CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况进行判断，还可以分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

申请人声明，以上所述仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合，其包括CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体。

2.根据权利要求1所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合，其中，所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合中的抗体带有荧光色素标记。

3.根据权利要求2所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合，其中，所述荧光色素包括BV510、BV-786、Pacific blue、PE-Cy7、AF700、eFluor660或PE中任意一种或至少两种的组合。

4.一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合。

5.一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法，其包括如下步骤：

(1)对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞；

(2)用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测；以及

(3)用流式细胞仪进行检测和分析。

6.根据权利要求5所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法，其中，步骤(1)中，所述对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞的步骤包括：

将外周血与红细胞裂解液混合，避光静置，离心，分离出CD141⁺树突状细胞，将所述CD141⁺树突状细胞重悬于细胞染色液中，加入白细胞刺激因子孵育；

优选地，所述避光静置的时间为10～15min，所述避光静置的温度为20～25℃；

优选地，所述细胞染色液包括含胎牛血清的PBS缓冲液；

优选地，所述白细胞刺激因子在CD141⁺树突状细胞重悬液中的终浓度为0.08～0.1wt％；

优选地，所述孵育的时间为4～6h，所述孵育的温度为35～38℃。

7.根据权利要求5或6所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法，其中，步骤(2)中，所述用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测的步骤包括：

(a)用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体对CD141⁺树突状细胞进行首次孵育；

(b)用不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行二次孵育。

8.根据权利要求7所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法，其中，步骤(a)中，所述用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体对CD141⁺树突状细胞进行首次孵育的步骤包括：

将步骤(1)中孵育后的CD141⁺树突状细胞重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液与不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体和HLA-DR抗体进行首次孵育，用福尔马林溶液固定CD141⁺树突状细胞，遮光孵育；

优选地，所述福尔马林溶液的质量分数为1.5～2.5vol％；

优选地，所述首次孵育的时间为25～35min，所述首次孵育的温度为20～25℃；

优选地，所述遮光孵育的时间为15～20min，所述遮光孵育的温度为20～25℃；

优选地，步骤(b)中，所述用不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行二次孵育的步骤包括：

将步骤(a)所得的CD141⁺树突状细胞用细胞穿透液重悬，离心去上清，将沉淀用细胞穿透液重悬，将CD141⁺树突状细胞重悬液与不同荧光色素标记的IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体进行二次孵育；

优选地，所述离心的离心力为300～350g，所述离心的时间为5～10min；

优选地，所述二次孵育的时间为24～26h，所述二次孵育的温度为0～4℃；

优选地，所述二次孵育在遮光的条件下进行。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的分析方法，其中，步骤(3)中，所述用流式细胞仪进行检测和分析的步骤包括：

将二次孵育后的CD141⁺树突状细胞用细胞穿透液重悬，离心去上清，将沉淀细胞用细胞染色液重悬，用流式细胞仪进行检测和分析；

优选地，所述离心的离心力为300～350g，所述离心的时间为5～10min；

优选地，所述分析的方法包括：

根据CD141抗体和Linage抗体与CD141⁺树突状细胞表面的CD141和Linage的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群中CD141⁺表型的比例；

根据HLA-DR抗体与CD141⁺树突状细胞表面的HLA-DR的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的分化成熟状况；以及

根据IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体与CD141⁺树突状细胞表面的IL-10、IL-12、IL-23和IL-27的结合情况，分析CD141⁺树突状细胞亚群的功能。

10.一种检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的系统，其包括：

(1)样品处理模块：对外周血进行预处理分离出CD141⁺树突状细胞；

(2)检测模块：用不同荧光色素标记的CD141抗体、Linage抗体、HLA-DR抗体、IL-10抗体、IL-12抗体、IL-23抗体和IL-27抗体对CD141⁺树突状细胞进行孵育检测；以及

(3)分析模块：用流式细胞仪进行检测和分析。

11.权利要求1-3任一项所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的抗体组合、权利要求4所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的试剂盒或权利要求10所述的检测CD141⁺树突状细胞亚群的表型和功能的系统中任意一种或至少两种的组合在鉴定CD141⁺树突状细胞亚群表型和功能和/或制备鉴定CD141⁺树突状细胞亚群表型和功能的产品中的应用；

优选地，所述产品包括检测恶性肿瘤的试剂盒和/或检测试剂；

优选地，所述恶性肿瘤包括肺癌、黑色素瘤、前列腺癌或肾癌中的任意一种或至少两种的组合。

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