CN114901801A - 用于治疗镰状细胞病的数个否决细胞的用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种治疗或预防有需要的一受试者的一镰状细胞病的方法。所述方法包括：(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；及(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

Description

用于治疗镰状细胞病的数个否决细胞的用途

相关申请

本申请主张2019年11月5日申请的美国临时专利申请案第62/930,634号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域与背景技术

在其一些实施例中，本发明涉及包含中枢记忆T淋巴细胞表型的诱导耐受的抗第三方细胞的用途，作为用于治疗镰状细胞病的造血干细胞移植的辅助治疗。

镰状细胞病(SCD)是指一组影响血红蛋白的常见遗传疾病，红血球细胞(红血球细胞)中的分子将氧气输送到整个身体的细胞。血红蛋白由四个蛋白质亚基组成，通常，两个亚基称为α-珠蛋白，两个亚基称为β-珠蛋白。所述HBB基因的不同突变导致各种版本的β-珠蛋白。一个特殊的HBB基因突变会产生一种异常版本的β-珠蛋白，称为血红蛋白S(HbS)。所述HBB基因的其他突变导致额外的β-珠蛋白异常版本，例如血红蛋白C(HbC)及血红蛋白E(HbE)。一镰状细胞病患者通常遗传两个异常血红蛋白基因，一个来自父母双方。在镰状细胞病中，两个异常基因中的至少一个所述编码个非典型HbS分子，这种异常HbS是由一在所述编码基因中谷氨酸的单一缬氨酸取代引起的用于人β-珠蛋白亚基(beta-globinsubunit)。这种HbS突变增加了红血球细胞的刚性并扭曲了它们的细胞膜，导致镰状红血球细胞。其他与镰状细胞病中的HbS相关的异常血红蛋白基因包括HbC、HbE及与β-地中海贫血表型相关的突变HBB基因。

镰状红血球细胞的可塑性及流变特性受损，并显示出细胞对血管内皮的粘附改变。所述镰状细胞病的临床表现多种多样，包括血管闭塞性危象、贫血、阴茎异常勃起、脾隔离症、急性胸综合征、再生障碍性危象、溶血性危象、中风、坏死、急性呼吸窘迫综合征及一增加对感染的易感性。镰状细胞病可导致眼睛、肾脏、肺、大脑、肝脏、心脏、骨骼、关节及脾脏等器官的慢性功能障碍，这与显着的死亡率及发病率有关。

尽管镰状细胞病(SCD)可以使用延长生命的药物治疗，但异基因造血干细胞移植(HSCT)被认为是一种首选治疗方法[Ozdogu等人，骨髓移植Bone Marrow Transplant92018)53(7):880-890)]。然而，HSCT存在一些局限性，包括条件相关毒性及移植物抗宿主病(GVHD)，尤其是在使用MHC不同移植物时。虽然所述在降低强度调节(RIC)下使用T细胞耗竭HSCT(TD-HSCT)可以有效降低GVHD及调节毒性的风险，但仍然排斥TD-HSCT一个挑战。Reisner及其同事[Ophir等人。血液Blood(2013)121(7):1220-1228]先前在野生型小鼠中证明，可以使用来自供体的否决细胞来克服这一障碍。

否决活性基于某些细胞攻击宿主CTL前体(CTLp)的能力，所述前体针对在否决细胞本身上表达的抗原，保留不针对所述否决细胞的细胞包括防御病原体所需的T细胞。中枢记忆CD8⁺T细胞在移植时表现出所述最强大的否决活性，然而，这些细胞也具有显着的移植物抗宿主(GVH)活性。Reisner及其同事通过在有利于中枢记忆表型表达的培养条件下，分别针对3^rd方MHC或病毒抗原扩增初始或记忆CD8⁺T细胞，从而克服了这一问题。这种具有明显否决权的抗3^rd党中枢记忆CD8⁺T细胞(Tcm)在完全不匹配的接受者中也表现出GVHD风险降低[Reisner Y，Or-Geva N.，Semin Hematol。(2019)56(3):173-182]。

已经考虑了各种方法来产生没有GVH反应性的耐受诱导细胞以及将其用作移植物移植的辅助治疗，其中一些总结如下。

PCT公开号WO 2001/049243公开了非同种异体反应性抗第三方细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其中非同种异体反应性抗第三方CTL通过引导所述供体的T淋巴细胞对抗3^rd-party刺激剂在没有外源性IL-2的情况下。这种方法基于观察到只有激活的细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)能够在所述原代培养中的IL-2剥夺中存活(IL-2饥饿导致非细胞凋亡诱导的T细胞)。将这些抗3^rd方否决CTLs引入接受者(连同一移植物)在不诱导移植物GVHD的情况下防止了移植物排斥。

PCT公开号WO 2007/023491公开了所述在受试者中使用致耐受性细胞减少或预防一非同源移植物的移植排斥。所述公开的耐受性T调节细胞(例如CD4⁺CD25⁺细胞)可以来自与受试者及移植物(例如骨髓)可以来自与所述受试者同种异体或异种的任何移植物供体。

PCT公开号WO 2002/102971公开了所述使用包含增强的否决活性的培养的造血祖细胞(HPC)用于诱导对从供体移植到一接受者的移植物的耐受性。公开的致耐受性细胞优选表达CD33并且在所述移植物(例如细胞或器官移植)移植之前、同时或之后施用。

PCT公开号WO 2010/049935及WO 2012/032526公开了分离的细胞群，其包含具有一Tcm表型的非GVHD诱导抗第三方细胞，细胞是耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢到淋巴结。具体而言，WO 2010/049935及WO 2012/032526教导了未成熟造血干细胞与抗第三方Tcm细胞的共同移植。使用所述抗第三方Tcm细胞能够植入未成熟的造血细胞，而不会出现移植物抗宿主病(GVHD)。

PCT公开号WO 2013/035099及WO 2018/002924公开了产生包含具有一Tcm表型的抗第三方细胞的分离细胞群的方法，细胞是耐受诱导细胞及/或具有抗疾病活性，并且能够在移植后归巢至所述淋巴结。

发明内容

根据本发明的数个实施例的一方面，提供了一种治疗或预防有需要的一受试者的一镰状细胞病的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；及

(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，从而治疗所述受试者的所述镰状细胞病。

根据本发明的数个实施例的一方面，提供了一种未成熟造血细胞移植及一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，用于治疗或预防有需要的一受试者的镰状细胞病。

根据本发明的数个实施例的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是用于与所述未成熟造血细胞移植同时施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是用于所述未成熟造血细胞移植后的施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是在所述未成熟造血细胞移植后的第4至10天施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是在所述未成熟造血细胞移植后第7天施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群以每公斤理想体重的至少0.5x10⁶个CD8⁺细胞的一剂量施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群以每公斤理想体重的0.5x10⁶个至10x10⁶个CD8⁺细胞的一剂量施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群用于减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

根据本发明的数个实施例，使用所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群作为一辅助治疗，以减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群通过一方法产生，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个外周血单核细胞与在缺乏数个细胞因子的一培养物中的一或数个第三方抗原接触，以允许数个抗原反应性细胞的富集；及

(b)在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞，以允许包括所述中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞的增殖，从而产生所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括在与所述一或数个第三方抗原接触之前从所述数个外周血单核细胞中消耗数个CD4⁺及/或CD56⁺表达细胞。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括选择数个CD45RA⁺表达细胞，以获得表达一CD45RA⁺CD8⁺表型的数个初始T细胞的一族群。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括消耗数个CD45RA⁺表达细胞，以获得富含数个记忆T细胞的一族群，所述数个记忆T细胞表达一CD45RA^-CD8⁺表型。

根据本发明的数个实施例，步骤(a)中与所述一或数个抗原的所述接触是在IL-21的存在下起作用。

根据本发明的数个实施例，在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的步骤包括在IL-15的存在下培养所述数个细胞。

根据本发明的数个实施例，在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的步骤包括在IL-21、IL-15及/或IL-7的存在下培养所述数个细胞。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原选自由一病毒抗原、一细菌抗原、一肿瘤抗原、一自身免疫性疾病相关抗原、一蛋白质提取物、一纯化蛋白质及一合成肽组成的群组。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原由数个同源抗原呈现细胞、数个非同源抗原呈现细胞、数个人工载体或数个人工抗原呈现细胞所呈现。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原由与所述数个外周血单核细胞同源的数个抗原呈现细胞所呈现。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原包括数个刺激细胞，所述数个刺激细胞选自从数个外周血淋巴细胞、脾脏或数个淋巴结、细胞因子动员的数个PBL、体外扩增的数个抗原呈现细胞、体外扩增的数个树突状细胞及数个人工抗原呈现细胞中纯化的数个细胞所组成的群组。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括选择CD3⁺、CD8⁺、CD62L⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺特征。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞包括数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞耗尽了CD3⁺及/或CD19⁺表达细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞包括少于所述受试者的每公斤理想体重的5×10⁵个CD3⁺表达细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞移植与所述受试者是非同源的。

根据本发明的数个实施例，所述未成熟造血细胞移植及所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群从相同的供体中获得。

根据本发明的数个实施例，所述方法还包括在非清髓性调节下调节所述受试者(例如所述移植前)。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括一非清髓性调节(移植前调节)。

根据本发明的数个实施例，所述非清髓性调节包括全身照射、局部照射、化疗剂、抗体免疫疗法或共刺激阻断中的至少一者。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射包括1至6Gy的范围内的一照射剂量。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射将在所述移植的第-3天至第0天中的任何一天施用。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射将在所述移植的第-3天至第-1天中的任何一天施用。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射将在所述移植之前的一天或两天施用。

根据本发明的数个实施例，所述化疗剂包括依维莫司、氟达拉滨、环磷酰胺、白消安、三磺安、美法仑或噻替帕中的至少一者。

根据本发明的数个实施例，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的雷帕霉素。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括一治疗有效量的雷帕霉素。

根据本发明的数个实施例，所述治疗有效量的雷帕霉素包括所述受试者的每公斤理想体重的每天至少0.1mg雷帕霉素。

根据本发明的数个实施例，所述雷帕霉素用于在所述移植的第-4天至第+10天向所述受试者施用。

根据本发明的数个实施例，所述雷帕霉素用于在所述移植的第-1天至第+4天向所述受试者施用。

根据本发明的数个实施例，所述非清髓性调节包括T细胞减灭。

根据本发明的数个实施例，所述T细胞减灭由数个抗胸腺细胞球蛋白抗体、数个抗CD52抗体或数个抗CD3抗体中的至少一者实现。

根据本发明的数个实施例，所述非清髓性调节包括一治疗有效量的氟达拉滨。

根据本发明的数个实施例，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括一治疗有效量的环磷酰胺。

根据本发明的数个实施例，所述治疗有效量的环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg。

根据本发明的数个实施例，所述环磷酰胺用于在所述移植的第+3天及第+4天向所述受试者施用。

根据本发明的数个实施例，所述方法包括以下步骤：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射及一免疫抑制剂，其中所述全身照射及所述免疫抑制剂在移植的第-4天至第+4天施用；

(b)向所述受试者移植一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×106个CD34+细胞；及

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

根据本发明的数个实施例，所述免疫抑制剂包括雷帕霉素。

根据本发明的数个实施方案，所述雷帕霉素在移植的第-1天至第+4天施用。

根据本发明的数个实施方案，在移植的第-3天至第0天施用TBI。

根据本发明的数个实施方案，在移植前的第-1天施用TBI。

根据本发明的数个实施例，所述步骤(b)及步骤(c)同时进行。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第1至20天施用。

根据本发明的数个实施例，所述方法包括：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射及一化疗剂，其中所述全身照射及所述化疗剂在移植的第-6天到第0天施用；

(b)向所述受试者移植一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×106个CD34+细胞；

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺，其中所述治疗有效量的所述环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg环磷酰胺，并且其中在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第+3天及第+4天，将所述治疗有效量的环磷酰胺以两剂施用于所述受试者；及

(d)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，数个非GVHD诱导抗第三方细胞的所述分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，其中数个非GVHD诱导抗第三方细胞的所述分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后第+5天至第+10天施用。

根据本发明的数个实施例，所述化疗剂包括氟达拉滨。

根据本发明的数个实施例，所述氟达拉滨在所述移植前的第-6天至第-3天施用。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射在所述移植前的第-1天施用。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括在步骤(a)之前进行T细胞减灭。

根据本发明的数个实施例，所述T细胞减灭通过在所述移植前的第-9天至第-7天施用的抗胸腺细胞球蛋白实现。

根据本发明的数个实施例，在T细胞耗尽的未成熟造血细胞的所述移植后的第+7天后施用所述数个非GVHD诱导细胞的分离族群。

根据本发明的数个实施例，所述镰状细胞病选自由镰状细胞性贫血、HbSC病、血红蛋白Sβ地中海贫血、HbSD病及HbSE病所组成的群组。

根据本发明的数个实施例，所述受试者是一人类受试者。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些相似或等效的方法及材料，但是示例性方法及/或材料在下文描述。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法及示例仅是说明性的，并非旨在必然地进行限制。

附图说明

本发明的一些实施例在此仅通过示例的方式参考附图进行描述。现在具体参考附图，强调所示的细节是示例性的并且是为了对本发明的实施例进行说明性讨论。在这点上，结合附图的描述使本领域技术人员清楚所述可以如何实施本发明的实施例。

在所述数个图式中：

图1是T细胞耗尽骨髓的降低强度调节(RIC)方案的一示意图，

图2A至图2B说明了通过4.5Gy及5.0Gy TBI调节后通过否决Tcm(图2A)及镰状病校正(图2B)增强不匹配的骨髓移植。

图3A至图3D说明了在用5Gy TBI调节后，通过否决Tcm(图3A至图3B)增强错配骨髓移植及校准镰状病(图3C至图3D)。

图4A至图4F说明在移植大剂量T细胞耗尽的allo-HSCT(Nude-Balb/c；H-2K^d))后镰状细胞病(SCD)(H-2K^b)接受者小鼠(伯克利模型)中的嵌合诱导与供体来源的否决CD8⁺T细胞及短期雷帕霉素组合使用。图4A显示了移植过程的示意图，比较了4.5Gy TBI(n＝7)与5Gy TBI(n＝9)的调节；图4B至图4C分别显示了在第+35天及第+140天的外周血嵌合；图4D至图4E分别显示存活及体重追踪；图4F显示了血红蛋白电泳。值得注意的是，所有19个样品都在带有两个梳子的单一凝胶上一起运行，并且所述凝胶被裁剪以产生一单一线性图像。

图5A至图5C说明了移植后供体型嵌合体及镰状血红蛋白的长期追踪。图5A显示移植的SCD小鼠在第+381天的外周血嵌合体，用5Gy TBI调节与用4.5Gy TBI调节的小鼠；图5B显示了用5Gy TBI与4.5Gy TBI调节的SCD小鼠向正常血红蛋白的转化；图5C显示了5Gy TBI与4.5Gy TBI条件下SCD小鼠的存活率。值得注意的是，对于血红蛋白电泳，所有所述14个样品在具有两个梳子的单一凝胶上一起运行，所述凝胶被裁剪以产生一单一线性图像。

图6A至图6E说明了大剂量T细胞耗尽的allo-HSCT与供体衍生的否决CD8+T细胞及短期雷帕霉素组合移植后SCD小鼠中的嵌合体诱导。图6A显示出代表性FACS分析，所述代表性FACS分析描述在移植后第44天的H-2K^b染色(宿主；Y轴)及H-2K^d染色(供体；X轴)水平；图6B显示出在移植后第44天不同治疗方案后的外周血嵌合；图6C显示出在追踪308天期间不同实验组的外周血嵌合现象；图6D显示出具有代表性的FACS分析，描述了移植后第318天不同淋巴组织中的嵌合水平。通常，表达供体及宿主抗原的双阳性细胞代表一嵌合小鼠的所述胸腺有一定程度的吞噬作用；图6E显示出比较移植后第318天不同淋巴组织中平均嵌合水平的图表。数据显示为平均值±标准差，每组N＝5。

图7A至图7G显示出嵌合小鼠与C57BL/c(宿主型)、Balb/c小鼠(供体型)及SCD小鼠相比的血液学参数。(图7A)血红蛋白电泳；(图7B)外周血网织红血球细胞的典型FACS分析；(图7C)网织红血球细胞百分比；(图7D)白血球细胞(WBC)；(图7E)血红蛋白；(图7F)血细胞比容；(图7G)平均红血球细胞血红蛋白。值得注意的是，对于血红蛋白电泳样品在两种不同的凝胶上运行相同的时间及电压。所述图像被裁剪并设法生成一单一线性图像。同时包括两种凝胶对照。

图8A至图8H说明了嵌合小鼠中SCD的内部器官病理学的校正。(图8A)移植后318天SCD小鼠(n＝6)与嵌合小鼠(n＝9)的平均脾脏重量；(图8B)移植后318天SCD小鼠(图中左侧两个脾脏)与嵌合小鼠(图中右侧三个脾脏)脾脏大小的典型示例；(图8C至图8D)镰刀型(图8C)及嵌合型(图8D)小鼠的代表性外周血涂片。镰状红血球细胞(RBC)用箭头表示(50μm比例尺)；(图8E至图8F)镰刀型及嵌合型小鼠脾脏的典型组织学。值得注意的是，在镰状小鼠中，结构异常，具有镰状红血球细胞(图8E)累积的异常的结构，在嵌合小鼠中不存在(图8F)(50μm比例尺)；(图8G至图8H)镰刀型及嵌合型小鼠肾脏的典型组织学。值得注意的是，镰状肾具有肾小球肾炎以及镰状红血球细胞的积累(图8G)的特征，而嵌合小鼠的代表性肾脏表现出完整的肾小球结构及不具有镰状红血球细胞的汇集(图8H)(50μm比例尺)。

具体实施方式

本发明在其一些实施例中涉及包含诱导耐受的数个抗第三方细胞的用途，诱导耐受的所述数个抗第三方细胞包括中枢记忆T淋巴细胞表型，作为用于治疗镰状细胞病的造血干细胞移植的一辅助治疗。

本发明的数个原理及操作可以通过参考所述数个附图及所附说明书来得到更好的理解。

在详细说明本发明的至少一实施例之前，应理解本发明的应用并不一定限于在以下描述中通过所述数个范例阐述或举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例或以各种方式实践或执行。此外，应理解在此使用的词语及术语是为了所述描述的目的而不应被视为限制性的。

同种异体造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem celltransplantation，HSCT)被认为是镰状细胞病(sickle cell disease，SCD)的一种治疗选择。然而，同种异体造血干细胞移植存在一些局限性，包括调节相关毒性(conditioning-related toxicity)及移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)，尤其是在使用数个MHC不同移植物时。虽然所述在降低强度调节(reduced intensity conditioning，RIC)下的T细胞耗尽型同种异体造血干细胞移植(TD-HSCT)的用途，可以有效降低移植物抗宿主病(GVHD)及调节毒性的风险，但T细胞耗尽型同种异体造血干细胞移植(TD-HSCT)的排斥仍然是一个挑战。

在将本发明付诸实践的同时，本发明人发现通过第三方刺激产生的供体来源的数个否决细胞(donor-derived veto cells)可以安全有效地用于预防镰状细胞病的所述治疗中的同种异体造血干细胞移植(HSCT)的移植排斥及移植物抗宿主病(GVHD)。

如本文下面及随后的所述数个范例部分所示，本发明人通过劳动性实验发现了治疗镰状细胞病的一方案，包括移植MHC不同的骨髓细胞及抗第三方否决Tcm细胞(参见图1)。根据所述治疗方案，首先对所述受试者进行一降低强度的调节，包括在第-1天的全身照射(total body irradiation，TBI)及在第-1天至第+4天的短期雷帕霉素(rapamycin)，然后骨髓移植(第0天)及第+7天的抗第三方否决Tcm细胞。所述方案说明了SCD小鼠中抗第三方否决Tcm细胞及雷帕霉素之间的协同作用。值得注意的是，目前的结果表示出，单独使用否决Tcm或短期低剂量雷帕霉素不足以克服排斥反应，而两种药物的一组合在一长期追踪期间诱导植入(engraftment)及嵌合(chimerism)，在不存在移植后移植物抗宿主病(GVHD)预防下的不具有任何移植物抗宿主病迹象。所述否决CD8 T细胞及雷帕霉素之间的这种协同作用可以通过这些药物活性的不同机制来解释。具体而言，所述否决机制是基于同源抗供体宿主T细胞中的TCR激活及随后的Fas上调，通过FasL对所述数个否决细胞的触发导致它们的细胞凋亡。相比之下，雷帕霉素(rapamycin)通过抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR)复合物激活来干扰T细胞激活的一下游途径，而不阻断TCR诱导的信号传导。此外，虽然雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)信号传导的抑制导致Th1、Th2及Th17效应(effector)T细胞的抑制，但其也促进T细胞分化为Foxp3+T-reg表型。因此，雷帕霉素可以通过与基于Fas-FasL的所述否决机制进行协同作用的数个否决独立机制在同种异体造血干细胞移植(HSCT)后在误匹配小鼠中诱导耐受(tolerance)及嵌合(chimerism)。

具体而言，治疗SCD的所述方案能够实现长期植入，这在移植后35天至44天(参见图3A至图3B、图4B及图6A至图6C)、移植后140天(参见图4C至图4E)、甚至移植后300天(参见图5A及图6D至图6E)不具有移植排斥及移植物抗宿主病。所述供体嵌合(donor chimerism)伴随着镰状病症状的逆转，包括所有移植小鼠中的数个网织红血球细胞水平(reticulocyte levels)(参见图3C)及野生型血红蛋白的表达(参见图3D)。此外，发现在移植后300天观察到的显着造血嵌合体(marked hematopoietic chimerism)与转化为正常供体来源的红血球细胞(参见表1及图7A)、脾肿大正常化(参见图8A至图8B)、以及使SCD小鼠典型的其他关键血液学参数正常化有关，包括所述循环网织红血球细胞水平(参见图7B至图7C)、白血球细胞(WBC)计数(参见图7D)、血细胞比容(参见图7F)、血红蛋白(见图7E)及平均红血球细胞血红蛋白(参见图7G)。在嵌合小鼠中也观察到包括脾、肾、肝及肺在内的不同器官的正常组织学而不具有任何镰状红血球细胞的证据，这与向供体型血红蛋白的转化一致(参见图8E至图8F)。

总之，本方案为镰状细胞病患者提供一种治疗方法，通过移植MHC不同的造血干细胞(例如同种异体HSCT)在一短期准备方案及在不具有长期GVHD预防(例如移植后7-10天以上)的情况下，能够实现安全和长期的治愈，而不会出现移植排斥及GVHD。

因此，根据本发明的一方面，提供了治疗或预防有需要的一受试者的一镰状细胞病的方法，所述方法包括：(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

根据本发明的另一方面，提供一种未成熟造血细胞移植及一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，其特征在于，包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，用于治疗或预防有需要的一受试者的镰状细胞病。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转所述状况的进展，基本上改善一状况的临床或美学症状或基本上预防所述一种病症的临床或外观(aesthetical)症状的出现。

如本文所用，所述术语“预防”是指防止疾病、病症或病症在一可能处于所述疾病或病症风险但尚未被诊断为患有所述疾病或障碍，例如一镰状细胞病。

如本文所用，所述术语“受试者”或“有需要的受试者”是指一哺乳动物，优选为患有一镰状细胞病或处于发展一镰状细胞病的高风险(例如具有镰状细胞病的遗传易感性)状况下的任何年龄的一人类(男性或女性)。通常所述受试者需要一未成熟造血细胞移植(在本文中也称为接受者(recipient))以治疗或预防所述镰状细胞病。

如本文所用，术语“镰状细胞病(sickle cell disease)”或“SCD”是指与HbS基因相关的遗传性疾病。镰状细胞病的典型特征是存在具有一新月形(类似于一镰刀)的形状异常的红血球细胞(RBC)，称为镰状红血球细胞(sickled RBCs)。通常，镰状红血球细胞占受试者血液中至少约50％的血细胞。

镰状细胞病的症状包括但不限于贫血、疲劳、发烧、细菌感染、疼痛危象、腹痛、慢性疼痛、关节痛、骨梗塞、指炎(所述手及/或脚)及关节炎、风湿病、气促脾脏及肝脏淤血、肺及心脏损伤以及腿部溃疡。

一些症状是所有年龄组的典型症状(例如贫血、疲劳)，然而，一些所述症状与年龄有关。例如，婴儿及幼儿通常表现出以下症状，包括发烧、腹痛、肺炎球菌感染、手脚疼痛肿胀(趾炎)及脾隔离症。青少年及年轻人更常出现腿部溃疡、无菌性坏死及眼睛损伤。成人的症状通常是由于骨骼、肌肉或内脏损伤而导致的间歇性疼痛发作。

镰状细胞病包括但不限于纯合子HbSS病(homozygotic HbSS disease)(也称为镰状细胞性贫血或血红蛋白SS病)、HbSC病(也称为血红蛋白SC病)、HbSB+(β)地中海贫血(血红蛋白Sβ地中海贫血)、镰状SB 0(β-0)地中海贫血、HbS/遗传性持续性胎儿Hb(S/HPHP)、HbS/HbE综合征、血红蛋白SD病(HbSD病)、血红蛋白SE病(HbSE病)、血红蛋白SO病(HbSO病)、旁遮普病(Punjab disease)。

根据一具体实施例，所述镰状细胞病是镰状细胞性贫血。

镰状细胞病的治疗通过将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者中来实现。

如本文所用，所述短语“移植”是指将一体细胞(例如一单一细胞或一组细胞)施用给一受试者。

如本文所用所述短语“未成熟造血细胞”是指包含前体造血细胞(例如造血干细胞)的造血组织或细胞制剂。此类组织/细胞制剂包括或源自一生物样品，例如骨髓、动员的外周血(例如动员的CD34⁺表达细胞以提高它们的浓度)、脐带血(例如脐带)、胎肝、卵黄囊及/或胎盘。另外，纯化的CD34⁺细胞或其他造血干细胞如CD131⁺细胞可以根据本教导使用，不论在具有或不具有离体(ex-vivo)扩展。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包括T细胞耗尽的未成熟造血细胞。

如本文所用所述短语“T细胞耗尽的未成熟造血细胞(T cell depleted immaturehematopoietic cells)”是指一T淋巴细胞耗尽的数个前体造血细胞的一族群。所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞可能包括例如CD34⁺、CD33⁺及/或CD56⁺细胞。所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞可能耗尽CD3⁺细胞、CD2⁺细胞、CD8⁺细胞、CD4⁺细胞、α/βT细胞及/或γ/δT细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包括T细胞耗尽的动员血细胞，其富含CD34⁺未成熟造血细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的个0.1x10⁶至20x10⁶个CD34⁺细胞(例如1x10⁶-10x10⁶个CD34⁺细胞)。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约0.1×10⁶个CD34⁺细胞、0.5×10⁶个CD34⁺细胞、1x10⁶个CD34⁺细胞、2x10⁶个CD34⁺细胞、3x10⁶个CD34⁺细胞、4x10⁶个CD34⁺细胞、5x10⁶个CD34⁺细胞、6x10⁶个CD34⁺细胞、7x10⁶个CD34⁺细胞、8x10⁶个CD34⁺细胞、9x10⁶个CD34⁺细胞、10x10⁶个CD34⁺细胞、15x10⁶个CD34⁺细胞或20x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约5x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约6x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约8x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约10x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了CD3⁺及/或CD19⁺细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁴个-1x10⁶个(例如1x10⁵个-50x10⁵个)CD3⁺细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约50x10⁵个CD3⁺细胞、40x10⁵个CD3⁺细胞、30x10⁵个CD3⁺细胞、20x10⁵个CD3⁺细胞、15x10⁵个CD3⁺细胞、10x10⁵个CD3⁺细胞、9x10⁵个CD3⁺细胞、8x10⁵个CD3⁺细胞、7x10⁵个CD3⁺细胞、6x10⁵个CD3⁺细胞、5x10⁵个CD3⁺细胞、4x10⁵个CD3⁺细胞、3x10⁵个CD3⁺细胞、2x10⁵个CD3⁺细胞、1x10⁵个CD3⁺细胞、0.5x10⁵个CD3⁺细胞或0.1x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于5x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于3×10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于2x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了CD8⁺细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁴-1x10⁶个CD8⁺细胞(例如1x10⁴个-4x10⁵个CD8⁺细胞)。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约50x10⁵个CD8⁺细胞、25x10⁵个CD8⁺细胞、15x10⁵个CD8⁺细胞、10x10⁵个CD8⁺细胞、9x10⁵个CD8⁺细胞、8x10⁵个CD8⁺细胞、7x10⁵个CD8⁺细胞、6x10⁵个CD8⁺细胞、5x10⁵个CD8⁺细胞、4x10⁵个CD8⁺细胞、、3x10⁵个CD8⁺细胞、2x10⁵个CD8⁺细胞、1x10⁵个CD8⁺细胞、9x10⁴个CD8⁺细胞、8x10⁴个CD8⁺细胞、7x10⁴个CD8⁺细胞、6x10⁴个CD8⁺细胞、5x10⁴个CD8⁺细胞、4x10⁴个CD8⁺细胞、3x10⁴个CD8⁺细胞、2x10⁴个CD8⁺细胞或1x10⁴个CD8⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于4x10⁵个CD8⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10³个-1x10⁶个CD8⁺TCRα/β^-细胞(例如1x10⁴个-1x10⁵个CD8⁺TCRα/β^-细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约1x10⁶个CD8⁺TCRα/β^-细胞、0.5x10⁶个CD8⁺TCRα/β-细胞、1x10⁵个CD8⁺TCRα/β-细胞、0.5x10⁵个CD8⁺TCRα/β^-细胞、1x10⁴个CD8⁺TCRα/β^-细胞、0.5x10⁴个CD8⁺TCRα/β^-细胞、1x10³个CD8⁺TCRα/β^-细胞或0.5x10³个CD8⁺TCRα/β^-细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁶个CD8⁺TCRα/β^-细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了B细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了B细胞(CD19⁺及/或CD20⁺细胞)。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁴个-1x10⁶个CD19⁺及/或CD20⁺细胞(例如1x10⁵个-50x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞)。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约50×10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、40x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、30x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、20x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、10x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、9x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、8x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、7x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、6x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、5x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、4x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、3x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、2x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞或1x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞。

根据一具体实施例，所述未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于3×10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞。

T细胞(例如CD3⁺、CD2⁺、TCRα/β⁺、CD4⁺及/或CD8⁺细胞)或B细胞(例如CD19⁺及/或CD20⁺细胞)的耗尽，可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过用特异性抗体的根除(例如杀死)或通过基于亲和力的纯化，例如例如通过使用磁性细胞分离技术、FACS分选器及/或捕获ELISA标记。

此类方法在本文及所述THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY第1至4卷(编辑者D.N.Weir)及FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING(编辑者A.Radbruch，SpringerVerlag，1992年)中有所描述。例如，细胞可以通过例如流式细胞术或FACS分选。因此，可以使用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)并且可以具有不同程度的颜色通道、低角度及钝角光散射检测通道以及阻抗通道。本领域已知的任何配体依赖性分离技术可以与依赖所述细胞的物理性质而不是抗体亲和力的阳性及阴性分离技术结合使用，包括但不限于淘析及密度梯度离心。

用于细胞分选的其他方法包括，例如使用亲和力技术的淘选及分离，包括使用例如数个板、数个珠及数个柱的数个固体支持物的那些技术。因此，生物样品可以通过用连接到一固体基质(例如连接到一板)的一抗体“淘选”来分离。

或者，可以通过数个磁分离技术来分选/分离细胞，其中一些方法利用数个磁珠。可从数个来源获得不同的磁珠，包括例如Dynal(挪威)、Advanced Magnetics(美国马萨诸塞州剑桥)、Immuncon(Philadelphia，U.S.A.)，Immunotec(法国马赛)、Invitrogen、Stemcell Technologies(美国)及Cellpro(美国)。或者，抗体可以被生物素化或与地高辛(digoxigenin)结合，并与抗生物素蛋白或抗地高辛包被的亲和柱结合使用。

根据一实施例，细胞可以在

柱(可从Miltenyi Biotec获得)上进行处理。

根据一实施例，可以组合不同的耗尽/分离方法，例如，可以将磁性细胞分选与FACS结合，以提高所述分离质量或允许通过数个参数进行分选。

根据一具体实施例，T细胞耗尽的未成熟造血细胞通过一种方法获得，所述方法包括从一供体受试者(例如为产生非GVHD诱导抗第三方细胞而收集非动员PBMC的同一供体受试者，如下所述)。

根据一实施例，动员受G-CSF影响。

根据一实施例，动员受G-CSF及普乐沙福(plerixafor)影响。

根据一具体实施例，动员的PBMC的所述收集在一单一集合中获得。

根据一具体实施例，动员的PBMC的所述收集是在每天两次、三次、四次、五次或更多次收集中获得的，例如每天三次收集(例如，在随后的几天或相隔几天内)。

根据一实施例，CD34⁺表达细胞的富集通过将所述PBMC与一CD34结合剂一起温育来实现。

根据一具体实施例，所述CD34结合剂是抗体，例如一单克隆抗体。

根据一具体实施例，所述CD34单克隆抗体与数个磁性颗粒结合，例如数个超顺磁性颗粒。

根据一具体实施例，所述CD34⁺标记的细胞通过磁分离技术(如上文详细讨论的)来选择。

根据一具体实施例，所述CD34磁性标记细胞(即CD34⁺表达细胞)被所述分离柱(即阳性选择)保留，以及所述CD34^-细胞被去除。然后将所述CD34⁺细胞从所述柱中释放并收集。

根据一实施例，T细胞的耗尽通过将所述PBMC与一CD3、CD2、TCRα/β、CD4及/或CD8结合剂一起温育来实现。

根据一实施例，B细胞的耗尽通过将所述PBMC与一CD19及/或CD20结合剂一起温育来实现。

根据一具体实施例，所述CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20结合剂是一抗体，例如单克隆抗体。

根据一具体实施例，所述CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20单克隆抗体与数个磁性颗粒结合，例如数个超顺磁性颗粒。

根据一实施例，CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20标记细胞通过数个磁分离技术来选择(如上文详细讨论的)。

根据一具体实施例，所述CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20磁性标记细胞(即CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20表达细胞)被所述分离柱(即阴性选择)及所述CD3-、CD2-、TCRα/β-、CD4-、CD8-、CD19-及/或CD20-细胞被收集。

根据一实施例，T细胞耗尽的未成熟造血细胞及用于产生诱导非GVHD的抗第三方细胞(即用于产生如下所述的否决细胞)的所述PBMC是从相同的供体受试者获得。

根据应用，所述方法可能会受到使用数个供体细胞的影响(例如，T细胞耗尽的未成熟造血细胞及用于生成非GVHD诱导抗第三方细胞的PBMC，如下所述)，所述数个供体细胞与所述接受者(recipient)受试者为同源的或非同源的(例如同种异体的)。

如本文所用，术语“同源(syngeneic)”细胞是指与所述受试者或所述受试者的基本上所有淋巴细胞在遗传上基本相同的数个细胞。同源细胞数个范例包括来自所述受试者的细胞(在本领域中也称为“自体(autologous)”)、来自所述受试者的一克隆或来自所述受试者的一同卵双胞胎。

如本文所用，术语“非同源(non-syngeneic)”细胞是指与所述受试者或所述受试者的基本上所有淋巴细胞在遗传上不基本相同的数个细胞，例如同种异体细胞(allogeneic cells)或异种细胞(xenogeneic cells)。

如本文所用，所述术语“同种异体(allogeneic)”是指源自一供体受试者的数个细胞，所述供体受试者与所述接受者(recipient)受试者为相同物种，但与所述接受者受试者基本上是非克隆的。通常，相同物种的远交、非合子双胞胎哺乳动物彼此是同种异体的。应当理解，对于所述接受者受试者，一同种异体细胞可以是HLA相同的、部分HLA相同的或HLA不同的(即显示一或数个不同的HLA决定簇)。

根据一实施例，所述供体是一人类。

如本文所用，所述术语“异种(xenogeneic)”是指相对于所述受试者的一大部分所述数个淋巴细胞而基本上表达一不同物种的数个抗原的数个细胞。通常，不同物种的远交哺乳动物彼此是异种的。

本发明设想异种细胞来源于多种物种。因此，根据一实施例，细胞可以来源于任何哺乳动物。细胞的合适物种来源包括主要的驯养或家畜动物及灵长类动物。这样的动物包括但不限于猪类(porcines)(例如猪)、牛类(bovines)(例如牛)、马类(equines)(例如马)、羊类(ovines)(例如山羊、绵羊)、猫类(felines)(例如Felis domestica)、犬科动物(例如Canis domestica)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、沙鼠、仓鼠)及灵长类动物(例如，黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴)。异种来源(例如猪来源)的细胞优选从已知不含人畜共患病的来源(例如猪内源性逆转录病毒)获得。类似地，人源细胞或组织优选地从基本上无病原体的来源获得。

因此，细胞的来源将根据其预期用途来确定，并且完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

本发明的一些实施例的未成熟造血细胞(例如，T细胞耗尽的未成熟造血细胞)可以使用本领域已知的任何细胞移植方法移植到所述受试者中，例如但不限于细胞输注(例如I.V.)或通过一腹膜内途径，如下文详细讨论的。

本发明的一些实施例的未成熟造血细胞可以在一单次输注中(例如在第0天)、或在2次、3次、4次或更多次输注中(例如在随后的几天或相隔几天内，例如在第-1天及第0天；或在第0天及第1天)施用。因此，本发明的一些实施例的所述未成熟造血细胞可以在每天2次、3次、4次或更多次的收集中获得，例如每天2次、3次、4次或更多次收集，例如每天2次收集(例如，在随后的几天或相隔几天内)。

根据一实施例，在计划移植日期之前的任何时间收集所述未成熟造血细胞(例如，已耗尽的T细胞)。这样的细胞可以储存以备将来使用(例如冷冻保存)。

在根据本教导将所述数个未成熟造血细胞移植到所述受试者中之后，根据标准医学实务，建议根据各种标准技术中的任一种监测细胞的生长功能及免疫相容性。例如，可以通过标准血液及骨髓测试(例如通过FACS分析)在一受试者中监测数个未成熟造血细胞的细胞数量。

如后面的所述数个范例部分所示，抗第三方中枢记忆T细胞具有特定的否决活性(veto activity)，可在数个造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells)的非同源(例如异基因)移植具有保证的情况下用作移植促进细胞。

根据一实施例，本发明的的一些实施例的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞可用作数个未成熟造血细胞移植的辅助疗法(如上文所述)。

根据一实施例，所述数个非GVHD诱导的抗第三方细胞可用于避免移植排斥、移植物抗宿主病及/或诱导供体特异性耐受性(即所述未成熟造血细胞的供体特异性耐受性)。

因此，根据一实施例，向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴(Tcm)表型的数个细胞，所述数个细胞是耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

术语“分离的”是指从其自然环境(例如，所述人体)中分离出来的细胞。

根据一实施例，数个细胞的一族群是指一异质细胞混合物。

如本文所用，术语“非移植物抗宿主病”或“非GVHD”是指具有显着降低或不具有诱导移植物抗宿主(GVH)的反应性。因此，本发明的一些实施例的细胞被生成为不会显着引起移植物抗宿主病(GVHD)，如移植后30天至120天的所述移植受试者的存活率、体重及整体外观所证明。评估一受试者GVHD降低的方法是本领域技术人员众所周知的。

根据一实施例，本发明的一些实施例的所述数个细胞相对于并非根据本教导产生的细胞而具有对于一宿主的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至100％降低反应性。

所述如本文所用的短语“中枢记忆T淋巴细胞(central memory T-lymphocyte，Tcm)表型”是指归巢于所述数个淋巴结的数个细胞毒性T细胞的一子集，在人类中，通常包括一CD3⁺/CD8⁺/CD62L⁺/CD45RO⁺/CD45RA^-特征(signature)。应当理解，Tcm细胞可以在一单一细胞上表达所有所述特征标记，或者可以在一单一细胞上仅表达所述特征标记的一部分。一细胞表型的确定可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)或捕获ELISA标记。

根据一实施例，至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或甚至100％的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群具有所述Tcm细胞特征。

根据一具体实施例，约10-20％、约10-30％、约10-40％、约10-50％、约20-30％、约20-40％、约30-50％、约40-60％、约50-70％、约60-80％、约70-90％、约80-100％或约90-100％的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群具有所述Tcm细胞特征。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的10-30％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的10-50％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的20-40％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的30-50％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的50-70％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的20％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的30％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的40％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的50％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的60％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的70％。

包括一本发明的一Tcm表型的所述数个非GVHD诱导细胞在本文中也称为“Tcm细胞”。

如前所述，移植后数个Tcm细胞通常归巢于所述数个淋巴结。根据一些实施例，本发明的一些实施例的数个细胞的所述分离族群可以归巢于移植后的任何淋巴结，例如所述数个外周淋巴结及所述数个肠系膜淋巴结。所述这些细胞的所述归巢特性使它们能够以一快速且有效的方式发挥其否决效果。

包括本发明的一些实施例的一Tcm表型的所述数个非GVHD诱导细胞是数个耐受诱导细胞。

如本文所用的短语“耐受诱导细胞”是指相较于不存在施用的耐受诱导细胞的情况下的所述接受者的细胞的所述反应，与所述接受者的细胞接触时引起所述接受者的细胞(例如，接受者的T细胞)的反应性降低。耐受诱导细胞包括如先前在PCT公开号WO 2001/049243及WO 2002/102971中描述的否决细胞(即，在与宿主T细胞接触时导致宿主T细胞凋亡的T细胞)。

术语“否决活性(veto activity)”涉及免疫细胞(例如，供体来源的T细胞)，其在识别并与否决细胞结合后导致抗供体接受者T细胞失活。根据一实施例，失活导致所述抗供体接受者T细胞凋亡。

包括一本发明的一Tcm表型的所述非GVHD诱导细胞在本文中也称为“否决细胞”。

如本文所用的短语“抗第三方细胞”是指(通过T细胞识别)针对一或数个第三方抗原的T淋巴细胞。

如本文所用所述短语“一或数个第三方抗原”是指一可溶性或不可溶性(例如膜相关)抗原或不存在于所述供体或接受者中的抗原，如下文详细描述。

例如，一或数个抗原可以是数个全细胞(例如数个活细胞或数个死细胞)、数个细胞部分(例如数个裂解细胞)、数个细胞抗原(例如数个细胞表面抗原/数个蛋白质)、一蛋白质提取物、一合成肽。

根据一实施例，所述一或数个第三方抗原是一非自身抗原，即所述供体的所述免疫系统不识别为一种自身抗原的一或数个抗原。

根据一实施例，所述一或数个抗原是非哺乳动物的，例如是非人类的(例如为一鸟类、爬行动物、病毒、细菌、真菌等来源的非人类动物或微生物的数个蛋白质或数个肽)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括一第三方(例如第三方树突细胞、脾细胞或肿瘤细胞)的MHC抗原。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括病毒抗原。

示例性病毒抗原包括但不限于一爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(Adv)、巨细胞病毒(CMV)、感冒病毒、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及C病毒、单纯疱疹病毒、HIV、流感、日本脑炎、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病、呼吸道合胞体、风疹、天花、水痘带状疱疹、轮状病毒、西尼罗河病毒、多瘤病毒(Polyomavirus)(例如BK病毒)、寨卡病毒(zikavirus)、细小病毒(parvovirus)(例如细小病毒B19)、水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)及单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)。

作为病毒抗原的进一步具体实例，BK病毒抗原包括但不限于BKV LT；BKV(衣壳(capsid)VP1)、BKV(衣壳蛋白VP2)、BKV(衣壳蛋白VP2、等孔(isoporm)VP3)、BKV(小T抗原)；腺病毒抗原包括但不限于Adv-penton或Adv-hexon；CMV抗原包括但不限于包膜糖蛋白B、CMV IE-1及CMV pp65、UL28、UL32、UL36、UL40、UL48、UL55、UL84、UL94、UL99 UL103、UL151、UL153、US 29、US 32；EBV抗原包括但不限于EBV LMP2、EBV BZLF1、EBV EBNA1、EBV P18及EBV P23；肝炎抗原包括但不限于乙型肝炎病毒的S、M及L蛋白、乙型肝炎病毒的前S抗原、HBCAG DELTA、HBV HBE、丙型肝炎病毒RNA、HCV NS3及HCV NS4；单纯疱疹病毒抗原包括但不限于即早蛋白(immediate early proteins)及糖蛋白D；HIV抗原包括但不限于gag、pol及env基因的基因产物，例如HIV gp32、HIV gp41、HIV gp120、HIV gp160、HIV P17/24、HIVP24、HIV P55 GAG、HIV P66 POL、HIV TAT、HIV GP36、Nef蛋白及逆转录酶；流感抗原包括但不限于血凝素及神经氨酸酶；日本脑炎病毒抗原包括但不限于蛋白质E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A及80％E；麻疹抗原包括但不限于麻疹病毒融合蛋白(measles virus fusionprotein)；狂犬病抗原包括但不限于狂犬病糖蛋白及狂犬病核蛋白；呼吸道合胞病毒抗原包括但不限于RSV融合蛋白及所述M2蛋白；轮状病毒抗原包括但不限于VP7sc；风疹抗原包括但不限于蛋白质E1及E2；及水痘带状疱疹病毒抗原包括但不限于gpl及gpll。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括病毒肽。

根据一实施例，所述数个小瓶肽(vial peptides)包含1-25种、1-20种、1-15种、1-10种、1-9种、1-8种、1-7种、1-6种、1-5种、1-4种、1-3种、1-2种、2-20种、2-10种、2-8种、2-6种、2-4种、3-20种、3-10种、3-9种、3-7种、3-5种、3-4种、4-20种、4-10种、4-8种、或4-6种病毒肽。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4-10种病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4-8种病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4-6种病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，所述小瓶肽包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种病毒肽(例如一单一配方或多种配方)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4种类型的病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含5种类型的病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含6种类型的病毒肽(例如在一单一制剂或数个制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含来自一单一生物体(即来自一种病毒类型)的肽。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含来自两种或更多种生物体的肽(即一来自2种、3种、4种、5种或更多种病毒类型的混合物)。

根据一实施例，所述病毒肽包含一BK病毒肽。

根据一具体实施例，所述病毒肽包括爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)肽、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)肽、BK病毒肽及一腺病毒(Adenovirus，Adv)肽。

根据一具体实施例，所述数个病毒肽包括EBV-LMP2、EBV-BZLF1、EBV-EBNA1、EBV-BRAF1、EBV-BMLF1、EBV-GP340/350、EBNA2、EBV-EBNA3a、EBV-EBNA3b、EBV-EBNA3c、CMV-pp65、CMV-IE-1、Adv-penton、Adv-hexon、BKV LT、BKV(衣壳VP1)、BKV(衣壳蛋白VP2)、BKV(衣壳蛋白VP2，等孔VP3)及BKV(小T抗原)中的至少一者。

根据一具体实施例，所述数个病毒肽包括AdV5 Hexon、hCMV pp65、EBV select(下文讨论)及BKV LT中的至少一者。

专用软件可用于分析抗原序列以识别免疫原性短肽，即在主要组织相容性复合物(MHC)I类或MHC II类的背景下呈现的肽。

根据一具体实施例，所述一或数个抗原包含一肽混合物的一混合物，其是跨越三种病毒的整个蛋白质序列的所述重迭肽文库(例如，被11个氨基酸重迭的15聚体)：CMV、EBV及Adeno(此类pepmix可以商业购买，例如从JPT Technologies，柏林，德国)。

根据一具体实施例，所述数个病毒肽包含“EBV select”，即一来自美天旎生物技术的商业产品，包含来自来自EBV的13种不同蛋白质的43种MHC 1类及2类限制肽(例如MACSGMP

EBV Select，例如目录号170-076-143)。另外或替代地，所述数个病毒肽包含“collection EBV”，即来自JPT的商业产品具有包含来自14种不同EBV抗原的数个肽的一pepmix。另外或可选地，所述数个病毒肽包括可从JPT商购的PepMix^TM BKV(衣壳蛋白VP1)、PepMix^TM BKV(衣壳蛋白VP2)、PepMix^TM BKV(衣壳蛋白VP2、异构体VP3)、PepMix^TM BKV(大T抗原)、PepMix^TM BKV(小T抗原)。

根据另一具体实施例，所述一或数个抗原包含七种pepmix的一混合物，在所述七种肽的一浓度(例如100ng/肽或700ng/7种肽)下跨越EBV-LMP2、EBV-BZLF1、EBV-EBNA1、CMV-pp65、CMV-IE-1、Adv-penton及Adv-hexon。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括一感染性有机体(例如，细菌、真菌有机体)的一或数个抗原，所述感染性有机体通常影响免疫包括的数个受试者，例如数个移植患者。

根据一实施例，所述抗原是一细菌抗原，例如但不限于一炭疽抗原；革兰氏阴性杆菌、衣原体、白喉、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、疟疾、结核分枝杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次体、葡萄球菌、链球菌及破伤风。

作为细菌抗原的数个进一步具体范例，炭疽抗原包括但不限于炭疽保护性抗原；革兰氏阴性杆菌抗原包括但不限于脂多糖；流感嗜血杆菌抗原包括但不限于荚膜多糖；白喉抗原包括但不限于白喉毒素；结核分枝杆菌抗原包括但不限于分枝杆菌酸、热休克蛋白65(HSP65)、所述30kDa主要分泌蛋白及抗原85A；百日咳毒素抗原包括但不限于血凝素、pertactin、FIM2、FIM3及腺苷酸环化酶；肺炎球菌抗原包括但不限于肺炎球菌溶血素及肺炎球菌荚膜多糖；立克次体抗原包括但不限于rompA；链球菌抗原包括但不限于M蛋白；破伤风抗原包括但不限于破伤风毒素。

根据一实施例，所述抗原是超级细菌抗原(例如多重耐药细菌)。超级细菌的数个范例包括但不限于粪肠球菌(Enterococcus faecium)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)及肠杆菌属(Enterobacter spp.))。

根据一实施例，所述抗原是一真菌抗原。真菌的数个范例包括但不限于念珠菌(candida)、球虫(coccidiodes)、隐球菌(cryptococcus)、组织胞浆菌(histoplasma)、利什曼原虫(leishmania)、疟原虫(plasmodium)、原生动物(protozoa)、寄生虫、血吸虫(schistosomae)、癣(tinea)、弓形虫(toxoplasma)及克氏锥虫(trypanosoma cruzi)。

作为数个真菌抗原的数个进一步具体实例，球虫抗原包括但不限于小球抗原；隐球菌抗原包括但不限于荚膜多糖；组织胞浆菌抗原包括但不限于热休克蛋白60(HSP60)；利什曼原虫抗原包括但不限于gp63及脂磷酸聚糖；恶性疟原虫抗原包括但不限于裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子体/配子表面抗原、原生动物及其他寄生虫抗原，包括血期抗原pf155/RESA；血吸虫抗原包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶及副肌球蛋白；癣真菌抗原包括但不限于毛癣菌素；弓形虫抗原包括但不限于SAG-1及p30；及克氏锥虫抗原包括但不限于75-77kDa抗原及所述56kDa抗原。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括与一恶性疾病相关的抗原(例如，肿瘤抗原)。

根据一实施例，所述抗原是由肿瘤细胞表达的一抗原(或其部分，例如抗原表位)。根据一实施例，所述抗原(或其部分)衍生自在造血组织中表达的蛋白质(例如，造血恶性肿瘤如白血病抗原)或一实体瘤中表达的蛋白质(例如黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、胃肠道癌等)。

数个肿瘤抗原的数个范例包括但不限于A33、BAGE、Bcl-2、B细胞成熟抗原(BCMA)、BCR-ABL、β-连环蛋白、癌睾丸抗原(CTA，例如MAGE-1、MAGE-A2/A3及NY-ESO-1)、CA 125、CA19-9、CA 50、CA 27.29(BR 27.29)、CA 15-3、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD37、CD45、CD123、CEA、c-Met、CS-1、细胞周期蛋白B1、DAGE、EBNA、EGFR、ELA2、ephrinB2、雌激素接受者、FAP、铁蛋白、叶酸结合蛋白、GAGE、G250/CA IX、GD-2、GM2、gp75、gp100(Pmel 17)、HA-1、HA-2、HER-2/neu、HM1.24、HPV E6、HPV E7、hTERT、Ki-67、LRP、间皮素(mesothelin)、粘蛋白样癌相关抗原(mucin-like cancer-associated antigen，MCA)、MUC1、p53、PR1、PRAME、PRTN3、RHAMM(CD168)、WT-1。以下文献中提供了数个进一步肿瘤抗原，包括MolldremJ.Biology of Blood and Marrow Transplantation(2006)12:13-18；Alatrash G.andMolldrem J.,Expert Rev Hematol.(2011)4(1):37–50；Renkvist et al.,Cancerlmmunol lmmunother(2001)50:3-15；van der Bruggen P,Stroobant V,Vigneron N,Vanden Eynde B.Peptide database:T cell-defined tumor antigens.Cancer Immun(2013),www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/；Rittenhouse,Manderino,andHass,Laboratory Medicine(1985)16(9)556-560，所有这些都通过引用并入本文。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含一抗原混合物(例如，所讨论的一组抗原的一抗原混合物，例如病毒抗原；或来自不同组抗原的一抗原混合物，例如病毒及细菌抗原、病毒及肿瘤抗原)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含数个病毒肽及数个肿瘤肽的一混合物(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含数个病毒肽及数个细菌肽的一混合物(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含数个病毒肽及数个真菌肽的一混合物(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，数个第三方抗原(例如数个蛋白质提取物、数个纯化的蛋白质或数个合成肽)可以由受其感染的数个细胞(例如细胞系)呈现或以其他方式被制成表达这些肽或蛋白质。

应当理解，所述数个抗原呈现细胞可以表达一单一细胞上的所有所述抗原，或者可以仅表达一单一细胞上的部分抗原。此外，不同的抗原呈现细胞(例如在相同的制剂中)可能表达不同的抗原。因此，所述数个抗原呈现细胞(例如树突细胞)包含一异质细胞混合物。

第三方抗原可以呈现在细胞、病毒或细菌表面上或从中衍生及/或纯化。此外，病毒或细菌抗原可以展示在受感染的细胞上，细胞抗原可以展示在人工载体(例如脂质体)上，一人工抗原呈现细胞(例如用所述第三方抗原或多种抗原转染的白血病或成纤维细胞系)、自体呈现细胞或非自体呈现细胞上。

根据本发明的一些实施例，所述一或数个抗原(例如数个病毒肽)可以由遗传修饰的抗原呈现细胞或人工抗原呈现细胞呈现，这些细胞呈现出由数个T细胞(例如数个细胞记忆CD8⁺T细胞，例如用一或数个抗原转染的细胞系)可识别的MHC抗原(也称为人白血球细胞抗原(HLA))。

因此，抗原呈现细胞、细胞系、人工载体(例如脂质体)或人工抗原呈现细胞(例如用一或数个抗原转染的白血病或成纤维细胞系)可用于呈现短合成肽融合或加载到其上或呈现蛋白质提取物或纯化的蛋白质。这种短肽、蛋白质提取物或纯化的蛋白质可以是病毒、细菌、真菌或肿瘤抗原衍生的肽或代表任何其他抗原的肽。

根据一实施例，所述数个第三方细胞是选自所述从外周血淋巴细胞(peripheralblood lymphocytes，PBL)、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈现细胞中纯化的细胞的刺激细胞细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞(DC)及人工抗原呈现细胞。

根据一实施例，抗原由与用于产生所述非GVHD诱导抗-第三方单元(即用于生成如下所述的否决细胞)。

根据一实施例，所述第三方细胞包括树突细胞。

根据一实施例，所述第三方细胞包括成熟的树突细胞。

产生第三方树突细胞的方法，其可用作刺激细胞以产生非GVHD诱导抗第三方细胞，在本领域中是众所周知的。因此，作为一非限制性范例，数个外周血单核细胞(PBMC)可以获得一细胞供体。然后使用补充有细胞因子及生长因子的DC细胞培养基(例如CellgroDC培养基)选择并培养(例如在细胞培养板中)表达CD14⁺的细胞。所确定使用的细胞因子及生长因子在本领域技术人员的能力范围内。例如，细胞培养基补充有IL-4(例如200-2000IU/mL，例如1000IU/mL)及GM-CSF(例如1000-4000IU/mL，例如2000IU/mL)。然后将细胞悬液接种(例如在细胞培养板中，例如Cell Factory板中)并培育12-36小时，例如16-24小时，例如24小时，在37℃，5％CO₂中。

为了诱导所述CD14⁺表达细胞成熟为抗原呈现细胞(例如树突细胞)，在存在成熟因子的情况下培养富含CD14+的细胞制剂。所确定使用的成熟因子在本领域技术人员的能力范围内。因此，根据一实施例，所述在IL-4(例如200-2000IU/mL，例如1000IU/mL)、GM-CSF(例如1000-4000IU/mL，例如2000IU/mL)、LPS(例如10-100ng/mL，例如40ng/mL)及IFN-γ(例如50-500IU/mL，例如200IU/mL)中10-24小时，例如14-18小时，例如16小时，在37℃，5％CO₂中。

在培育期之后，抗原呈现细胞(例如成熟的树突细胞，即mDCs)从细胞培养物中获得。根据一实施例，去除非贴壁细胞(non-adherent cells)并将抗原呈现细胞(即，贴壁细胞(adherent cells))从所述培养板分离并装载一或数个抗原。

如本文所用，短语“加载”是指所述将一或数个抗原(例如，如上所述的肽或蛋白质)附着到所述抗原呈现细胞(APC，例如树突状细胞)的表面。

根据一具体实施例，所述第三方细胞包括辐照的树突细胞。

因此，根据一实施例，用约5-10Gy、约10-20Gy、约20-30Gy、约20-40Gy、约20-50Gy、约10-50Gy辐照所述树突细胞(DC)。根据一具体实施例，用约10-50Gy(例如30Gy)辐照所述树突细胞(DC)。

利用细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、病毒肽呈现细胞或细菌肽呈现细胞作为第三方抗原是特别有利的，因为这样的第三方抗原包括多种抗原决定簇并且因此直接形成不同族群的抗第三方细胞，在需要重组的情况下，例如在致死或亚致死辐射或化疗程序之后，这可能进一步用于更快地重组T细胞。

因此，根据一实施例，非GVHD诱导抗第三方细胞可称为抗病毒Tcm细胞、抗细菌Tcm细胞、抗肿瘤Tcm细胞等(即根据所述一或数个抗原用于生成这些细胞)。

根据一些实施例，本发明的一些实施例的包含一Tcm表型的所述数个非GVHD诱导细胞可以是取决于所需的应用(例如要治疗的SCD类型)的非遗传修饰的数个细胞或遗传修饰的数个细胞(例如，已经被遗传工程改造的数个细胞，以表达或不表达特定基因、标记或肽或分泌或不分泌特定细胞因子)。这样的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内。

任何产生抗第三方Tcm细胞的方法都可以根据本发明使用，如先前在PCT公开号WO2010/049935、WO 2012/032526、WO 2013/035099及WO 2018/002924中所述，通过引用并入本文。

因此，例如，具有所述Tcm表型的抗第三方细胞可以通过一方法产生，所述方法包括：(a)在去除数个细胞因子的一培养物中将数个外周血单核细胞(PBMC)与一或数个第三方抗原接触，以使抗原反应细胞富集；(b)在数个细胞因子存在下培养步骤(a)产生的所述数个细胞，以允许包含所述中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的数个细胞的增殖。

根据一实施例，步骤(a)中的所述PBMC在不存在IL-21的情况下与一或数个第三方抗原接触。

根据一实施例，步骤(a)中的所述PBMC在存在IL-21的情况下与一或数个第三方抗原接触。

根据一实施例，步骤(a)中的所述PBMC在去除细胞因子且仅补充IL-21的一培养物中与一或数个第三方抗原接触。

根据一实施例，由步骤(a)产生的细胞在存在IL-15的情况下在一无抗原环境(例如，不向所述细胞培养物中添加一抗原)中培养。

根据一实施例，由步骤(a)产生的细胞在存在IL-15、IL-21及/或IL-7的情况下在一无抗原环境(例如，不向所述细胞培养物中添加一抗原)中培养。

通常通过首先在一无细胞因子培养物(即，不添加所述细胞因子)中或在仅补充IL-21的一培养物中使外周血单核细胞(PBMC，例如为同源的或非同源的，例如与未成熟造血细胞为相同细胞供体的PBMC)接触一或数个第三方抗原来产生本发明的抗第三方Tcm细胞。这种培养条件使得只有那些受到一或数个第三方抗原(即抗原反应性细胞)刺激及激活的细胞才能存活及富集，因为这些细胞分泌细胞因子(例如IL-2)，这些细胞因子能够使它们的存活(所有其余所述数个细胞在这些培养条件下死亡)。所述步骤通常进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天、2-5天、2-6天、1-7天、5-7天、2-8天、8-10天或1-10天，并允许数个抗原反应细胞的富集。

根据一具体实施例，使PBMC与一或数个第三方抗原(如上文所述)接触1-5天(例如3天)。

根据一实施例，用一或数个抗原培养是在存在IL-21的情况下下进行的。所述步骤通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、100-3000IU/ml,1000-3000IU/ml,0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、100-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、250-500IU/ml,100-250IU/ml,0.1-100IU/ml,1-100IU/ml,10-100IU/ml,30-100IU/ml,50-100IU/ml,1-50IU/ml,10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml、或1-10IU/ml IL-21。

根据一具体实施例，IL-21的浓度为50-150IU/ml(例如100IU/ml)。

一或数个第三方抗原(例如树突状细胞)与PBMC的比率通常为约1:1至约1:20，例如约1:2至约1:10，例如约1:4、约1:6、约1:8或约1:10。根据一具体实施例，一或数个第三方抗原(例如树突细胞)与PBMC的比率为约1:2至约1:8(例如1:5)。

接下来，在存在IL-15的情况下(例如在一无抗原环境中)培养所述数个抗第三方细胞，并任选补充IL-21及/或IL-7，以允许包含所述Tcm表型的数个细胞增殖。所述步骤通常进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-20天、1-15天、1-10天、1-5天、5-20天、5-15天、5-10天、1-2天、2-3天、1-3天2-4天、2-5天、2-8天、2-10天、4-10天、4-8天、6-8天、8-10天、7-9天、7-11天、7-13天、7-15天、10-12天、10-14天、12-14天、14-16天、14-18天、16-18天或18-20天。

根据一具体实施例，抗第三方细胞在存在IL-15的情况下培养，并且任选地补充IL-21及/或IL-7，并在一无抗原环境中(例如，不添加抗原)大约7-11天(例如8天)。

根据一实施例，具有IL-15的培养物通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、100-3000IU/ml、125-3000IU/ml、1000-3000IU/ml、0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、100-1000IU/ml、125-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、125-500IU/ml、250-500IU/ml、250-500IU/ml、125-250IU/ml、100-250IU/ml、0.1-100IU/ml、1-100IU/ml、10-100IU/ml、30-100IU/ml、50-100IU/ml、1-50IU/ml、10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml或1-10IU/ml的IL-15的一浓度下受到影响。根据一具体实施例，IL-15的浓度为100-150IU/ml(例如125IU/ml)。

根据一实施例，用IL-21补充IL-15通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、100-3000IU/ml、1000-3000IU/ml、0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、100-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、250-500IU/ml、100-250IU/ml、0.1-100IU/ml、1-100IU/ml、10-100IU/ml、30-100IU/ml、50-100IU/ml、1-50IU/ml、10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml或1-10IU/ml的IL-21的一浓度下受到影响。根据一具体实施例，IL-21的浓度为50-150IU/ml(例如100IU/ml)。

根据一实施例，用IL-7补充IL-15通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、30-3000IU/ml、100-3000IU/ml、1000-3000IU/ml、0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、30-1000IU/ml、100-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、30-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、250-500IU/ml、100-250IU/ml、0.1-100IU/ml、1-100IU/ml、10-100IU/ml、30-100IU/ml、50-100IU/ml、1-50IU/ml、10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml或1-10IU/ml的IL-7的一浓度下受到影响。根据一具体实施例，IL-7的浓度为10-50IU/ml(例如30IU/ml)。

本发明人通过劳动性实验及筛选收集了许多标准，这些标准可用于改善包含缺乏移植物抗宿主(GVH)反应性细胞及/或增强的抗疾病(例如GVL)反应性细胞的一中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的增殖。

根据一实施例，PBMC在与一或数个第三方抗原接触之前耗尽了CD4⁺细胞(例如T辅助细胞)及/或CD56⁺细胞(例如NK细胞)。

CD4⁺及/或CD56⁺细胞的耗尽可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过基于亲和的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)。为了增加所述培养物中CD8⁺细胞的纯度(即消除细胞培养物中的其他淋巴细胞，例如T CD4⁺细胞或NK细胞)或为了增加CD8⁺T细胞的数量，这样的步骤可能是有益的。

根据一实施例，所述PBMC包含CD8⁺T细胞。

根据一实施例，在与一或数个第三方抗原接触之前，所述PBMC被选择以用于CD45RA⁺及/或CD45RO^-细胞(即，初始T细胞)。

初始CD8⁺T细胞的选择可以通过表达CD45RA⁺的细胞及/或表达CD45RO^-的细胞的选择来实现，并且可以使用本领域已知任何方法进行，例如通过基于亲和的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)。

根据一实施例，所述PBMC包含初始CD8⁺T细胞。

根据一实施例，所述初始T细胞包含一CD8⁺CD45RO^-表型。

根据一实施例，所述初始T细胞包含一CD8⁺CD45RA⁺表型。

根据另一实施例，所述初始T细胞包含一CD8⁺CD45RO^-CD45RA⁺表型。

根据一具体实施例，当使用初始T细胞时，用所述一或数个抗原培养的第一步骤通常作用1-5天(例如3天)，且在存在IL-15的情况下培养(在一无抗原环境中)的步骤通常作用6-12天(例如8天)。

或者，在接触一或数个第三方抗原之前，所述PBMC被选择以用于所述CD45RA^-细胞及/或CD45RO⁺(即，记忆T细胞)。

如本文所用，术语“记忆T细胞”指T淋巴细胞的一亚群，其先前已经遇到一抗原并响应所述抗原，也称为抗原经历的T细胞(antigen experienced T cells)。

记忆CD8⁺T细胞的选择可以通过表达CD45RA^-的细胞及/或表达CD45RO⁺的细胞的选择来实现，并且可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过基于亲和的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)。

根据一实施例，所述PBMC包含记忆CD8⁺T细胞。

根据一实施例，进行所述选择以获得包含CD8⁺T细胞的一细胞级分(cellfraction)，其中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多是记忆T细胞。

根据一实施例，所述记忆T细胞包含一CD8⁺CD45RO⁺表型。

根据另一实施例，所述记忆T细胞包含一CD8⁺CD45RA^-表型。

根据另一实施例，所述记忆T细胞包含一CD8⁺CD45RO⁺CD45RA^-表型。

根据一具体实施例，当使用记忆T细胞时，用所述一或数个抗原培养的第一步骤通常作用1-5天(例如3天)，且在存在IL-15的情况下培养(在一无抗原环境中)的步骤通常作用3-10天(例如6天)。

可根据本教导进行的一附加步骤包括在存在IL-15下用一或数个第三方抗原培养所述PBMC细胞，及在从所述细胞培养物中除去所述一或数个第三方抗原之前(即在产生一无抗原环境之前)任选地补充IL-21及/或IL-7。所述步骤通常进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天或2-5天，并且作用于相同剂量的如上文所指出的IL-21、IL-15及IL-7的情况下。根据一具体实施例，在存在IL-21、IL-15及IL-7的情况下用一或数个第三方抗原培养所述PBMC细胞12小时至4天(例如1-2天)。

附加地或替代地，可以进行允许激活细胞的选择及分离的一附加两步骤过程。此一选择步骤有助于在所述PBMC相对于所述受试者非同源的情况下去除潜在的宿主反应性T细胞(例如同种异体反应性细胞)。

因此，可以在一两阶段方法中进行分离数个激活细胞。在IL-15存在下培养所述数个细胞之前选择第一阶段激活的细胞。所述第一阶段通常在所述PBMC与一或数个第三方抗原的所述初始接触之后进行。此选择过程仅挑选那些被所述第三方抗原(例如，如下所述的表达激活标记)激活的数个细胞，并且通常作用在所述PBMC与一或数个第三方抗原的所述初始接触后约12-24小时、约24-36小时、约12-36小时、约36-48小时、约12-48小时、约48-60小时、约12-60小时、约60-72小时、约12-72小时、约72-84小时、约12-84小时、约84-96小时、约12-96小时。根据一具体实施例，所述选择过程作用在所述PBMC与一或数个第三方抗原的所述初始接触后约12-24小时(例如14小时)。

分离数个激活细胞可以通过基于亲和的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)来实现并且可以针对包括数个细胞表面标志物或数个非细胞表面标志物在内的任何激活标志物来实现，所述数个细胞表面标志物例如但不限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137，所述数个非细胞表面标志物例如但不限于IFN-γ及IL-2。分离数个激活细胞也可以通过使用本领域已知的任何方法(例如通过FACS)通过基于形态学的纯化(例如分离大细胞)来实现。通常，所述数个激活细胞也被选择用于表达CD8⁺细胞。此外，上述数个方法的任意组合可用于有效分离数个激活细胞。

根据本发明的一实施例，选择激活细胞是通过选择CD137⁺及/或CD25⁺细胞来实现的。

分离数个激活细胞的第二阶段通常在培养结束时进行(即在不具有添加一抗原的情况下用IL-15培养之后)。所述阶段通过耗尽那些在所述中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)与受辐照的宿主抗原呈现细胞(APC，例如树突细胞)接触后被激活的细胞来耗尽数个同种异体反应性细胞。如上所述，分离数个激活细胞可以通过基于亲和的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)来实现，并且可以针对包括数个细胞表面标志物或数个非细胞表面标志物的任何激活标志物，所述数个细胞表面标志物例如但不限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137，所述数个非细胞表面标志物例如但不限于IFN-γ及IL-2。

根据本发明的一实施例，耗尽所述数个同种异体反应性细胞通过消耗CD137⁺及/或CD25⁺细胞及/或IFNγ捕获。

根据一实施例，由数个本方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群通常包含20-100％的Tcm细胞。

根据一实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约30％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约40％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约50％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约60％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约70％的Tcm细胞。

因此，具有本发明的一中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的所述抗第三方细胞不是天然存在的，也不是自然产物。这些细胞通常是通过离体操作(即，在不存在或存在数个特定细胞因子的情况下暴露于一或数个第三方抗原)产生的。

根据一实施例，所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞获自相同供体(例如人类的供体)。

根据一实施例，所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞获自不同供体(例如人类的供体)。

根据一实施例，所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞(即，数个否决细胞)同时施用，即共同施用(例如在同一天，例如12-24小时内)。

或者，可以在移植所述数个未成熟造血细胞后施用具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞(即，数个否决细胞)。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植数个未成熟造血细胞后1-30天(例如1-25天，例如1-20天，例如1-10天，例如4-10天，例如1-5天)施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天或30天(例如3天、5天、7天、10天)施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后8天施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后7天施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后6天施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后5天施用。

根据一实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞可以一单一剂量施用于所述受试者。或者，所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞可以两剂或多剂(例如三次、四次、五次或更多次)施用于所述受试者。

此一确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

具有本发明的一些实施例的所述Tcm表型的所述数个未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞可以施用于一生物体本身，或在与合适的载体或赋形剂混合的一药物组合物中。

如本文所用，一“药物组合物”是指本文所述的一或数个活性成分与其他化学成分如生理上合适的载体及赋形剂的一制剂。所述药物组合物的目的是促进一化合物对一生物体的施用。

在此术语“活性成分”是指所述数个未成熟造血细胞及/或具有对所述生物学效应负责的所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞。

在下文中，所述短语“生理学上可接受的载体”及“药学上可接受的载体”可以互换使用，是指一载体或一稀释剂，所述载体或所述稀释剂对生物体不会造成显着刺激且不会引起显着刺激，并且不消除所施用的化合物的生物活性及特性。这些短语下包含一佐剂(adjuvant)。

在此所述术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进一活性成分的施用的一惰性物质。赋形剂的数个实例包括但不限于包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖及淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油及聚乙二醇。

可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本”中找到用于药物的配制及施用的技术，其通过引用并入本文。

将所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞施用于所述受试者中可以通过多种方式实现，这取决于各种参数，例如举例为细胞类型；所述接受者的疾病的类型、阶段或严重程度(例如镰状细胞性贫血)；特定于所述受试者的物理或生理参数；及/或期望的治疗结果。

例如，根据应用及目的，所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的施用可以通过选自所述气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、心室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠及肠内的一途径来实现。

根据一实施例，通过静脉内途径进行施用。

或者，向所述受试者施用所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞可以通过将其施用于各种合适的解剖位置中来实现，以达到治疗效果。因此，根据应用及目的，所述数个细胞可以被施用于一同位解剖位置(homotopicanatomical location)(所述数个细胞的所述器官或组织类型的一正常解剖位置)、或施用于一异位解剖位置(所述数个细胞的所述器官或组织类型的一异常解剖位置)。

因此，根据应用及目的，所述数个细胞可以植入(例如移植)肾包膜下，或进入肾脏、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、门静脉、肝脏、脾脏、心腔、心脏、胸腔、胰腺、皮肤及/或腹腔。

本发明的一些实施例的药物组合物可以通过本领域众所周知的方法制造，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。

用于根据本发明的一些实施例使用的数个药物组合物因此可以使用一或数个生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述一或数个生理学上可接受的载体包括数个赋形剂及数个助剂，其有助于将活性成分加工成制剂，所述制剂可以是用于制药。适当的配方取决于所选择的施用途径。

对于注射剂，所述药物组合物的所述数个活性成分可以配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，例如汉克溶液(Hank’s solution)、林格溶液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，适合待渗透屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域中通常是已知的。

对于口服施用，通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合，可以容易地配制所述药物组合物。此类载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬浮液等，供一患者口服摄取。可使用一固体赋形剂制备用于口服的数个药用制剂，任选研磨所产生的混合物，并加工所述颗粒混合物，如果需要，在添加合适的助剂后，获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、碳甲基纤维素钠；及/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮(cross-linked polyvinyl pyrrolidone)、琼脂或海藻酸或其一盐(例如海藻酸钠)。

数个糖衣丸芯配(Dragee cores)有合适的包覆。为此目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液(lacquer solutions)及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的数个药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊以及由明胶及一增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的数个软密封胶囊。数个推入式胶囊可包含活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石)或硬脂酸镁及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。所有口服制剂的剂量都应适合于所选的施用途径。

对于口腔施用，所述数个组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过鼻吸入施用，根据本发明的一些实施例使用的所述数个活性成分以一气溶胶喷雾剂形式方便地递送，所述气溶胶喷雾剂形式来自使用一合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)的一加压包装或一喷雾器。在一加压气雾剂的情况下，所述剂量单位可以通过提供一阀以输送一计量的量来确定。可配制用于分配器的例如明胶的胶囊及药筒，其含有化合物及一合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文所述的药物组合物可配制用于肠胃外施用，例如，通过快速推注或连续输注。注射用制剂可以单位剂型存在，例如在数个安瓿(ampoules)或具有任选的一添加防腐剂的多剂量容器中。所述数个组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含配方剂，例如悬浮剂、稳定剂及/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油性或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体)。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度，以允许高浓度溶液的试剂的所述制备。

或者，所述活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与一合适的载体，例如无菌、无热原的水基溶液构成。

本发明的一些实施例的所述药物组合物也可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)配制在直肠组合物(例如栓剂或保留灌肠剂)中。

适用于本发明的一些实施例的上下文中的数个药物组合物包括数个组合物，所述数个活性成分以一有效量包含在所述数个组合物中以实现所述预期目的。更具体地，一治疗有效量是指活性成分的一量(所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞)有效地预防、减轻或改善一疾病(例如镰状细胞病)的症状或延长被治疗的所述受试者的生存期。

一治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是鉴于所述本文提供的详细公开。

对于本发明的方法中使用的任何制剂，所述治疗有效量或剂量可以最初从体外及细胞培养测定中估计。例如，可以在数个动物模型中制定剂量以达到所需的浓度或效价。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。

例如，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即，数个否决细胞)的数量应大于1x10⁴个/每公斤理想体重。输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量通常应在1x10³个/每公斤理想体重至1x10⁴个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁵个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁶个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁷个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁸个/每公斤理想体重的范围、1x10³个/每公斤理想体重至1x10⁵个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁶个/每公斤理想体重的范围、1x10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁷个/每公斤理想体重的范围、1x10⁵个/每公斤理想体重至1x107个/每公斤理想体重的范围、1x10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁸个/每公斤理想体重的范围、或1x10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁹个/每公斤理想体重的范围。

根据一具体实施例，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应在所述0.5×10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁸个/每公斤理想体重的范围。

根据一具体实施例，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应在1×10⁵个CD8⁺细胞/每公斤理想体重至1x10⁸个CD8⁺细胞/每公斤理想体重的范围。

根据一具体实施例，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少0.5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少1x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少2.5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少7.5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少10x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

数个治疗有效量的数个未成熟造血细胞，例如T细胞耗尽的未成熟造血细胞，在上文中详细讨论。

如本文所用，术语“理想体重”是指临床上用于调整药物剂量、帮助估计肾功能及所述药代动力学(例如肥胖患者)的测量值。

所述以公斤(kg)为单位估算理想体重的公式如下：

男性：IBW＝50公斤+5英尺以上每英寸2.3公斤。

女性：IBW＝45.5公斤+5英尺以上每英寸2.3公斤。

Peterson等人[Am J Clin Nutr 2016；103:1197-203]详细讨论了理想体重，通过引用并入本文。

此处描述的活性成分的毒性及治疗功效可以通过标准药学程序在体外、在细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外及细胞培养试验及动物研究中获得的数据可用于制定用于人体的一剂量范围。所述剂量可以根据使用的剂型及使用的施用途径而变化。具体的配方、施用途径及剂量可以由个别医生根据患者的情况来选择。(参见例如，Fingl等人，1975年，"The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第一章第一页)。

可以单独调整剂量及间隔以提供活性成分的水平足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。每种制剂的MEC会有所不同，但可以根据体外数据进行估算。达到所述MEC所需的剂量将取决于个体特征及施用途径。检测分析可用于确定血浆浓度。

要施用的一组合物的所述量当然取决于被治疗的所述受试者、病痛的严重程度、施用的方式、所述处方医师的判断等。

由于非同源(例如同种异体)细胞在施用于所述受试者时可能诱导一免疫反应，已经开发了几种方法来降低排斥非同源细胞的可能性。这些包括抑制所述接受者免疫系统或在移植前将非自体细胞包裹在免疫隔离的半透膜中。或者，可以使用不表达异种表面抗原的细胞，例如在转基因动物(例如猪)中开发的那些。

在根据本教导将所述数个未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞移植到所述受试者中之后，根据标准医学实务，建议监测所述细胞的存活及功能以及移植排斥及/或移植物抗宿主病的发展。这些方法是本领域技术人员众所周知的。例如，所述可以通过标准血液及骨髓测试(例如通过FACS分析)在一受试者中监测未成熟造血细胞的细胞数量。移植排斥或GVHD可通过血液检查、体格检查(例如监测皮疹、黄色变色、腹部肿胀、呕吐、腹泻、腹部绞痛、恶心、眼睛干燥/刺激增加)及活组织检查(例如肝、肺的活组织检查)。

此外，在根据本教导将所述数个未成熟造血细胞及/或数个非GVHD诱导抗第三方细胞移植到所述受试者中后，建议监测数个镰状细胞症状，包括野生型血红蛋白的表达(例如通过血液分析仪)、网织红血球细胞水平(例如通过流式细胞仪)、红血球细胞比容水平(例如通过血液分析仪)及/或慢性疼痛、慢性疲劳、关节疼痛、风湿病、呼吸困难(例如通过身体检查)。

为了治疗镰状细胞病及/或减轻疾病症状，本发明考虑使用常规的镰状细胞病治疗，包括但不限于输血、抗生素、维生素、止痛药物、羟基脲(例如Droxia、Hydrea)及手术(例如切除受损的脾脏)。这些方法对于本领域技术人员而言是众所周知的，并且它们的用途可以基于所述受试者的年龄及所述疾病阶段及严重程度来确定。

为了治疗镰状细胞病及促进所述数个未成熟造血细胞的植入，所述方法可以进一步包括在亚致死、致死或超致死条件下调节所述受试者。

如本文所用，术语“亚致死”、“致死”及“超致死”，当涉及本发明受试者的调节时，指骨髓毒性及/或淋巴细胞毒性治疗，当应用于所述数个受试者的一族群，通常分别是：对族群的基本上所有成员都是非致命的对人口中的一些但不是所有成员是致命的；或在正常不育条件下对基本上所述族群的所有成员都是致命的。

根据本发明的一些实施例，所述亚致死、致死或超致死调节包括一全身照射(total body irradiation，TBI)、全淋巴照射(total lymphoid irradiation，TLI，即所有淋巴结、胸腺及脾脏的暴露)、部分身体照射(例如肺、肾、脑等的特定暴露)、清髓性调节及/或非清髓性调节，例如具有不同的组合，包括但不限于共刺激阻断、化疗剂及/或抗体免疫疗法。根据本发明的一些实施例，所述调节包括上述任何所述调节方案的一组合(例如化疗剂及TBI、共刺激阻断剂及化疗剂、抗体免疫疗法及化疗剂等)。

根据一实施例，所述调节是通过在超致死条件下调节所述受试者来实现的，例如在数个清髓条件下(即其中所述骨髓细胞被破坏的强化调节方案)。

或者，所述调理可以通过在致死或亚致死条件下调理受试者来实现，例如通过分别在清髓性条件或非清髓性条件下调理所述受试者(即降低强度的调理，这是一种较不积极的调理方案)。

根据一具体实施例，所述调节包括非清髓性调节(例如一降低强度调节方案)。

根据一实施例，所述降低强度调节作用长达2周(例如1-10天或1-7天)。

根据一具体实施例，所述非清髓性调节包括一化疗剂及TBI/TLI。

根据一实施例，所述TBI包含一照射剂量(例如单次或分次照射剂量)，所述照射剂量的范围是0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2Gy、0.5-2.5Gy,0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、1-4.5Gy、1-5Gy、1-5.5Gy、1-6Gy、1-7Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy或10-15Gy。

根据一具体实施例，所述TBI包括在1-7.5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括在1-6Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括在1-5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括6Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括5Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括4Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括3Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一实施例，在移植前1-10天(例如1-3天，例如1天)向所述受试者施用TBI治疗。根据一实施例，所述受试者在移植前1天、2天、3天或4天(例如1天)用TBI调节一次。根据一实施例，TBI在移植当天(即第0天)施用。

根据一具体实施例，所述TBI包含在第-3天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包含在第-2天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包含在第-1天(即移植前一天)的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包含一照射剂量，所述照射剂量的范围是0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2.5Gy、0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、1-4.5Gy、1-5Gy、1-5.5Gy、1-6Gy、1-7Gy、1-1.5Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy、10-15Gy、10-20Gy、10-30Gy、10-40Gy、10-50Gy、0.5-20Gy、0.5-30Gy、0.5-40Gy或0.5-50Gy。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-12Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-7.5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-6Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括6Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括5Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括4Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括3Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一实施例，在移植前1-10天(例如1-3天，例如1天)向所述受试者施用TLI治疗。根据一实施例，所述受试者在移植前1天、2天、3天或4天(例如1天)用TLI调节一次。

根据一具体实施例，所述TLI包含在第-3天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包含在第-2天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包含在第-1天(即移植前一天)的一单次或分次照射剂量。

根据一实施例，所述调节包括一化疗剂。数个示例性化疗剂包括但不限于白消安、白消安、环磷酰胺、依维莫司、氟达拉滨、美法仑、Myleran、三磺胺及噻替帕。

根据一实施例，所述调节包括一免疫抑制剂，例如但不限于雷帕霉素。

所述化学治疗剂及/或免疫抑制剂可以一单次剂量或数次剂量(例如1次)施用于所述受试者。移植前或移植后2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多剂量(例如每日剂量)。

根据一具体实施例，所述受试者被施用雷帕霉素。

雷帕霉素(Rapamycin)(也称为西罗莫司(Sirolimus)及雷帕明(Rapamune))可购买自例如辉瑞。雷帕霉素类似物包括，例如CCI-779、RAD001、AP23573。

根据一实施例，雷帕霉素的一治疗有效量包含0.01mg/天/公斤至3mg/天/公斤理想体重、0.02mg/天/公斤至1.5mg/天/公斤理想体重，例如0.02mg/天公斤至1.5mg/天/公斤理想体重，例如0.05mg/天/公斤至1.0mg/天/公斤，例如0.1mg/天/公斤至0.3mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.1mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.3mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.5mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.7mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约1mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约2mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约2.5mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约3mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，雷帕霉素作用3-10天(例如3天、4天、5天或6天)。例如，雷帕霉素可以从第-4天到第+10天施用，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一实施例，雷帕霉素施用不超过4天、5天、6天或7天。

根据一具体实施例，雷帕霉素可以在诱导所述数个非GVHD抗第三方Tcm细胞(即否决细胞，例如在所述前一天、同一天，或在施用否决细胞后的第二天)。因此，根据一具体实施例，否决细胞在第0天施用，即与所述未成熟造血细胞一起施用，并且雷帕霉素在第-4天至第+4天施用，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。根据另一具体实施例，在第0天施用未成熟造血细胞，在第+7天施用所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)，并且在第-4天到第+4天施用雷帕霉素，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一具体实施例，雷帕霉素在第-1天以0.3mg/天/公斤理想体重的剂量作用，然后以0.1mg/天/公斤理想体重的一剂量施用体重直至第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一具体实施例，雷帕霉素及数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)的所述组合用于在不存在移植排斥及GVHD的情况下进行造血细胞移植。

根据一具体实施方案，雷帕霉素、数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)及辐射(例如TBI或TLI)的所述组合用于在不存在移植排斥及GVHD的情况下进行造血细胞移植。

根据一具体实施例，所述移植方案包括在第-3天至第-1天(例如第-1天)的1-7.5Gy(例如5Gy TBI)的一单次或分次照射剂量。在第0天施用未成熟造血细胞(例如大剂量T细胞耗尽，例如包含所述受试者的每公斤理想体重的至少约5x10⁶个CD34⁺细胞)。在第0天到第20天施用数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即数个否决细胞)，例如在第0-10天，例如在第+7天(例如，在一剂量至少约为0.5x10⁶个/公斤理想体重，例如在一剂量为2.5-10x10⁶个CD8+细胞/公斤理想体重，例如5x10⁶个CD8+细胞/公斤理想体重)。并且，雷帕霉素在第-4天到第+4天施用约0.1-3mg/天/公斤理想体重的一剂量，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一实施例，所述调节包括体内T细胞减灭。

根据一些实施例，所述体内T细胞减灭受数个抗体影响。

根据一些实施例，在TBI或TLI之前实现所述体内T细胞减灭。

根据本发明的一些实施例，所述数个抗体包括一抗CD8抗体、一抗CD4抗体或两者。

根据本发明的一些实施例，可以考虑在TBI之前通过数个抗体使用所述宿主的T细胞减灭。数个抗体包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体、抗CD52抗体或抗CD3(OKT3)抗体。

抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体可购买自例如健赞(Genzyme)及辉瑞(Pfizer)或购自例如在品牌名称Thymoglobulin及Atgam下。

根据一具体实施例，所述受试者在移植前未用ATG治疗。

应当理解，当不使用ATG或使用较低剂量的ATG时，例如单剂或两剂(例如，每剂每公斤理想体重约2毫克)，更高的辐射剂量可用作所述非清髓性调节方案的一部分(例如，TBI的3-5Gy(例如3Gy、4Gy或5Gy)的一单次或分次照射剂量)。

根据一具体实施例，所述受试者被施用环磷酰胺(Cyclophosphamide)。

根据一实施例，所述所述方法包括移植后施用环磷酰胺。

根据一实施例，在移植后1天、2天、3天、4天、5天(即，D+1、+2、+3、+4、+5)向所述受试者施用环磷酰胺。

根据一具体实施例，环磷酰胺在移植后3天及4天以两剂施用于所述受试者。根据一实施例，除了移植后的所述施用之外，本发明还考虑在移植前施用环磷酰胺(例如在移植前的第6天、第5天、第4天或第3天，即D-6至D-3)。

例如，在未成熟造血细胞移植的情况下，环磷酰胺的所述治疗有效量包括所述受试者的每公斤理想体重的约1-25mg、1-50mg、1-75mg、1-100mg、1-250mg、1-500mg、1-750mg、1-1000mg、5-50mg、5-75mg、5-100mg、5-250mg、5-500mg、5-750mg、5-1000mg、10-50mg、10-75mg、10-100mg、10-250mg、10-500mg、10-750mg、10-1000mg、25-50mg、25-75mg、25-100mg、25-125mg、25-200mg、25-300mg、25-400mg、25-500mg、25-750mg、25-1000mg、50-75mg、50-100mg、50-125mg、50-150mg、50-175mg、50-200mg、50-250mg、50-500mg、50-1000mg、75-100mg、75-125mg、75-150mg、75-250mg、75-500mg、75-1000mg、100-125mg、100-150mg、100-200mg、100-300mg、100-400mg、100-500mg、100-1000mg、125-150mg、125-250mg、125-500mg、125-1000mg、150-200mg、150-300mg、150-500mg、150-1000mg、200-300mg、200-400mg、200-500mg、200-750mg、200-1000mg、250-500mg、250-750mg、250-1000mg。

根据一具体实施例，环磷酰胺的治疗有效量为所述受试者的每公斤理想体重的约25-200mg。

根据一实施例，环磷酰胺以单剂量施用。

根据一实施例，环磷酰胺以多剂量施用，例如以多剂量以2剂、3剂、4剂、5剂或更多剂施用。

根据一具体实施例，环磷酰胺以两剂施用。

根据一具体实施例，环磷酰胺不以超过1剂、2剂、3剂、4剂或5剂施用(例如超过1天、2天、3天、4天或5天)。

每次环磷酰胺施用的剂量可以包括所述受试者的每公斤理想体重的约5mg、7.5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、350mg、400mg、450m或500mg。

根据一具体实施例，环磷酰胺的每个剂量是所述受试者的每公斤理想体重的50mg。

环磷酰胺可购自例如Zydus(德国Remedies)、Roxane Laboratories Inc-Boehringer Ingelheim、Bristol-Myers Squibb Co-Mead Johnson及Co、及Pfizer-Pharmacia&Upjohn，购自例如品牌名称Endoxan、Cytoxan、Neosar、Procytox及Revimmune下。

根据一具体实施例，数个否决细胞在环磷酰胺之后施用(例如，在环磷酰胺之后2-5天)。因此，根据一具体实施例，在第0天施用未成熟造血细胞，在第+3天及+4天施用环磷酰胺，并且在第+7天施用否决细胞。

根据一具体实施例，向所述受试者施用氟达拉滨(Fludarabine)。

根据一实施例，氟达拉滨作用3-10天(例如3天、4天、5天或6天，例如4天)。例如，氟达拉滨可以从第-10天到第-7天施用，例如从第-8天到第-5天，例如从第-6天到第-3天(例如在未成熟造血细胞移植前的第-6天、第-5天、第-4天、第-3天)。

根据一实施例，氟达拉滨施用不超过3天、4天、5天、6天或7天。

根据一具体实施例，移植前(例如在第-6至-3天)连续3天、4天、5天或6天(例如连续4天)，氟达拉滨以约5-100mg/m²/天的一剂量施用，例如30mg/m²/天。

氟达拉滨可购自例如氟达拉例如Sanofi Genzyme、Bayer及Teva，购自例如品牌名称Fludara下。

根据一具体实施例，可以在移植前的第-6天至第-3天每天用氟达拉滨治疗所述受试者(例如以约30mg/m²的剂量)，然后在第-3天到第0天(例如在移植前的第-1天)进行低剂量TBI(例如单次或分次照射剂量为例如1-5Gy，例如3Gy)作为准备方案。在第0天施用(例如通过IV输注)未成熟造血细胞(例如耗尽的大剂量T细胞，例如包含所述受试者的每公斤理想体重的至少约5x10⁶个CD34⁺细胞)。在未成熟造血细胞移植后(例如在第+3天及第+4天，以例如所述受试者的每公斤理想体重的25-100mg的剂量)施用环磷酰胺(Cy)两剂，然后在第+5至第+10天(例如在未成熟造血细胞移植后的第+7天)输注抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)，例如剂量为每公斤理想体重的2.5-10x10⁶个CD8⁺细胞(例如，每公斤理想体重的5x10⁶个CD8⁺细胞)。任选地，可以在移植前的第-9天至第-7天每天施用ATG以诱导所述受试者中的T细胞减灭(例如以每公斤理想体重约2mg的剂量)。根据一具体实施例，TBI在T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植当天施用，例如在第-1天或第0天的早上，移植在同一天进行，例如在第-1天的晚上。根据一具体实施例，在后续当天(例如在第0天)进行一第二剂T细胞耗尽未成熟造血细胞。

根据一具体实施例，T细胞耗尽未成熟造血细胞包括新鲜细胞。

根据一具体实施例，T细胞耗尽未成熟造血细胞包括先前获得的、在移植当天冷冻保存及解冻的细胞。

根据一实施例，所述受试者用另外的支持性药物治疗，例如化疗辅助剂。

根据一实施例，在第一剂环磷酰胺之前(例如，在施用第一剂环磷酰胺前2小时、前1小时、前30分钟、前15分钟)用一剂的美司钠(Mesna)(例如10mg/公斤静脉内捎带(intravenous piggy back，IVPB))治疗所述受试者。根据一实施例，每4小时重复施用美司钠，共10剂。

美司钠(Mesna)可购自例如品牌名称Uromitexan及Mesnex下的Baxter。

根据一实施例，在每个剂量的环磷酰胺(Cy)之前用昂丹司琼(ondansetron)(或另一种止吐剂)治疗所述受试者。

根据一实施例，不使用一免疫抑制剂(例如，除了雷帕霉素及否决细胞，或环磷酰胺及否决细胞，如本文所讨论的)治疗所述受试者。

根据一具体实施例，所述受试者不接受长期GVHD预防(例如免疫抑制剂)，例如移植后超过7-14天，例如移植后7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。

根据一实施例，用一免疫抑制剂治疗所述受试者。

免疫抑制剂的数个实例包括但不限于Tacrolimus(也称为FK-506或藤霉素，商品名：Prograf、Advagraf、Protopic)、霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)、霉酚酸钠(Mycophenolate Sodium)、泼尼松(Prednisone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢菌素(cyclosporine)、环孢菌素A(cyclosporin A)、氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(柳氮磺吡啶(sulphasalazpyrine))、金盐(gold salts)、D-青霉胺(D-penicillamine)、来氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、阿那白滞素(anakinra)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE)、依那西普(etanercept)、TNF.alpha阻滞剂、靶向一炎性细胞因子的一生物制剂、及非甾体抗炎药(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug，NSAIDs)。NSAID的数个实例包括但不限于乙酰水杨酸(acetyl salicylic acid)、胆碱水杨酸镁(choline magnesium salicylate)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸镁(magnesiumsalicylate)、水杨酸钠(salsalate)、水杨酸钠(sodium salicylate)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、消炎痛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬酸(meclofenamate)、萘普生(naproxen)、萘丁美酮(nabumetone)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、Cox-2抑制剂、曲马多(tramadol)。这些药剂可以单独或组合施用。

根据一实施例，皮质类固醇不作为对所述数个否决细胞的预处理的一施用。

预计在专利的有效期内，将开发出许多相关的非清髓性调节剂，并且所述术语非清髓性调节剂的范围旨在包括先验(a priori)的所有这些新技术。

如本文所用所述，术语“约”是指±10％。

所述术语“包括”、“包含”("comprises"、"comprising"、"includes"、"including")、“具有”及其变体意思是“包括但不限于”。

所述术语“由……组成”是指“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是额外的成分、步骤及/或部分不实质上改变所述要求保护的组合物、方法或结构的基本及新颖特征。

如本文所用，所述单数形式“一”及“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，所述术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括数个化合物，包括它们的混合物。

在整个本申请中，本发明的各种实施例可以一范围格式呈现。应当理解，所述范围格式的描述仅是为了方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，对一范围的描述应被视为具体公开了所有所述可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，范围如1到6的描述应所述被认为具有具体公开的子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6。无论所述范围的宽度如何，这都适用。

每当一在本文中指出数值范围时，其意在包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。所述短语“范围/范围之间”第一个表示数字，第二个表示数字，“范围/范围从”第一个表示数字“到”第二个表示数字在本文中可互换使用，旨在包括第一个及第二个指示的数字以及所有所述它们之间的小数及整数。

如本文所用，所述术语“方法”是指用于完成一给定任务的方式、手段、技术及程序，包括但不限于已知或易于开发的那些方式、手段、技术及程序所述化学、药理学、生物、生化及医学领域的从业人员已知的方式、手段、技术及程序。

应当理解，本发明的某些特征，为了清楚起见，在所述单独实施例的上下文中描述，也可以在一单一实施例中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单一实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合或在任何其他描述的实施例中提供本发明。在各个实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的基本特征，除非所述实施例在不具有这些元素的情况下是无效的。

如上文所述及如以下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施例及方面在以下数个范例中找到实验支持。

数个范例

现在参照以下数个范例，其与所述以上描述一起以一非限制方式叙述本发明。

通常，在此使用的命名法及在本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物及重组DNA技术。这些技术在所述文献中得到了详尽的解释。例如，参见“分子克隆：实验室手册Molecular Cloning:a laboratory Manual”Sambrook等人，1989年；“分子生物学中的当前方案Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷，Ausubel,R.M.编辑，1994年；Ausubel等人，“分子生物学中的当前方案Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley及Sons，马里兰州(Maryland)巴尔的摩(Baltimore)，1989年；Perbal，“A分子克隆实用指南Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，纽约，1988年；Watson等人，“重组DNA Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，纽约；Birren等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列Genome Analysis:aLaboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1998年；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659及5,272,057中规定的方法；“细胞生物学：实验室手册Cell Biology:a Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis,J.E.编辑，1994年；“目前的免疫学方案Current Protocols in Immunology”卷I-III，Coligan J.E.编辑，1994年；Stites等人编辑，“基础和临床免疫学Basic andClinical Immunology”(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT，1994年；Mishell及Shiigi编辑，“细胞免疫学中的选定方法Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman及Co.，纽约，1980年；所述专利及科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771及5,281,521；“寡核苷酸合成Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.编辑，1984年；“核酸杂交Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.及Higgins S.J.编辑，1985年；“转录和转译Transcription and Translation”Hames,B.D.及Higgins S.J.编辑，1984年；“动物细胞培养Animal Cell Culture”Freshney,R.I.编辑，1986年；“固定化细胞和酶Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，1986年；“分子克隆实用指南APractical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.，1984年；及“"酶学方法Methods inEnzymology”第1-317卷，学术出版社；“PCR方案：方法和应用指南PCR Protocols:a GuideTo Methods And Applications”，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州，1990年；Marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册Strategies for Protein Purificationand Characterization-a Laboratory Course Manual”CSHL出版社1996年；所有这些都通过引用并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在整个文件中提供了其他一般参考。其中的程序被认为是本领域中众所周知的并提供给读者的方便所有其中包含的信息通过引用并入本文。

一般材料及实验程序

所述研究中使用的动物

所有动物研究均按照机构动物护理及使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee，IACUC)的批准及指南在MD安德森癌症中心(MD Anderson CancerCenter)兽医资源学院进行。

镰状小鼠(伯克利(Berkeley)模型)(B6；HbaHbbTg(HBA-HBBs)41Paz/J)购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。镰状小鼠的繁殖群维持在MD安德森癌症中心的动物房设施中。年龄及性别匹配，8周大的雄性及雌性被随机分配到不同的实验组。

Balb/c(H-2^d)、FVB(H-2^q)、C57BL/6(H-2^b)及Balb/c裸色(H-2^d)小鼠也购自Jackson实验室。所述研究中使用的小鼠是8-12周龄的雄性及雌性。使用一对繁殖的镰刀小鼠(H-2^b，伯克利模型)。镰状小鼠(7-12周)在MD安德森癌症中心的动物房设施中通过选择性交配繁殖。对于a-珠蛋白及b-珠蛋白无效等位基因，雄性及雌性都是纯合子。然而，对于镰刀转基因，雌性是半合子，雄性是纯合子。

预先制定的排除标准基于IACUC指南，包括全身性疾病、毒性、呼吸窘迫、拒绝进食及饮水以及大量(>15％)体重减轻。在研究期间，大多数小鼠看起来身体健康，并被纳入所述适当的分析。

Balb/c(H-2^d)及FVB(H-2^q)小鼠用于制备抗第三方否决细胞。Balb/c-裸鼠被用作骨髓(BM)供体。

宿主非反应性供体抗第三方细胞(host non-reactive donor anti 3^rd-partycells)的生成

抗第三方中枢记忆T细胞(Tcms)如前所述制备[Ophir等人，Blood，(2013)121(7):1220-8]。简而言之，将来自供体小鼠的脾细胞(例如Balb/c供体，H-2^d)针对照射过的第三方脾细胞(例如来自FVB第三方，H-2^q)在细胞因子耗尽下持续60小时。此外，CD8⁺细胞通过使用磁性粒子(BD Pharmigen)纯化或使用磁激活细胞分选[

Cell Separation,Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany])并在无抗原环境中培养，每隔一天加入rhIL-15((20ng/Ml；R&D Systems)。培养结束时(第16天)，所述阳性选择Tcms对于CD62L表达(例如CD62L⁺CD44⁺表达)，使用磁激活细胞分选

细胞分离(Miltenyi Biotec)，并检索细胞用于FACS分析。

骨髓制备

从Balb/c-裸鼠(H-2^d，10-12周龄)收获长骨(股骨及胫骨)。通过研磨所述骨头来提取骨髓(BM)以获得一单细胞悬液。对骨髓细胞进行计数并使其达到注射所需的最终浓度。通过尾静脉静脉内(IV)给予所有所述细胞悬液。

低强度调节(Reduced Intensity conditioning，RIC)后的移植

接受者镰状小鼠(8周龄)被随机分配到四个不同的组：1)照射控制组，2)移植NuBM并用雷帕霉素治疗，3)移植NuBM+Tcm，4)移植NuBM+Tcm并用雷帕霉素治疗。所有组在第-1天在铯137辐照器(JL Shephard&Associates,Glendale,CA)中接受4.5Gy或5Gy的亚致死全身辐照(TBI)。第二天(第0天)所述动物被移植“大剂量”Balb/c-nude BM，指定量例如25x10⁶个)。一周后(移植后第+7天)，在所述指定实验组中的动物被移植抗第三方Tcm细胞，即否决细胞(5x10⁶)。一些实验组(如上所示)在第-1至+4天接受皮下注射雷帕霉素(Rapamune，Wyeth Pharmaceuticals Inc.，Philadelphia，PA-Pfizer Inc，纽约)(0.5mg/公斤体重)。所述照射对照组的动物只接受雷帕霉素。每周两次评估所有小鼠的整体外观及体重。定期进行嵌合分析。

移植的小鼠维持在特定的无病原体条件下，移植后将抗生素(Baytril，4ml/350ml水，Bayer Healthcare LLC，Whippany，NJ)添加到饮用水中2周。

流式细胞仪分析

通过荧光激活细胞分选(FACS)分析外周血或选定的细胞群，其通过使用以下针对鼠抗原的荧光染料标记的抗体、抗小鼠CD3-PE/Cy7/FITC、抗小鼠CD4-APC、抗小鼠CD8-PB/PerCP、抗鼠CD45-PE/Cy7/APC/Cy7、抗鼠CD44-PE、抗鼠CD62L-FITC/PB、抗H2Kd-FITC/PE/APC、抗H2Kb-PE/FITC及Ter119-APC(Biolegend)或IgG同种型对照(Biolegend)，对应于一特定面板中的每个抗体。在一LSRFortessa X-20细胞仪(Beckton，Dickinson andcompany，Franklin Lakes，NJ)上用BD FACSDiva软件8.0.1获得染色的细胞。最后，用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。

白血球细胞嵌合分析

外周血嵌合体通过流式细胞术(FACS)测定。通过眼眶后出血收集外周血并进行Ficoll-Paque(例如GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，Sweden)密度离心以分离单核细胞。此外，通过针对供体及宿主表面标志物的直接免疫荧光对每只小鼠的分离的单核细胞进行染色，例如使用供体(抗H2K^d[BALB/c]或接受者(抗H2K^b)抗体。

红血球细胞嵌合体

如先前报道的[Kean LS et al.,Blood(2002)99(5):1840-9]，进行差异血红蛋白电泳以确定实验小鼠中的所述RBC嵌合体。测定在Helena Titan III电泳系统(HelenaLaboratories,Beaumont,Texas)上进行。接受者、供体、镰刀型及野生型小鼠的血红蛋白模式是在所述每个品系的血红蛋白电泳迁移率差异的基础上确定的。

血液学参数分析

外周血通过来自实验小鼠的眶后出血收集。所述使用一西门子ADVIA2120i血液分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics，Erlangen，Germany)进行全血细胞计数。血红蛋白及血细胞比容水平由血液分析仪测定(仪器咨询克里斯蒂娜)。如前所述[Kean LS etal.，Blood(2002)，同上]，通过FACS测定循环网织红血球细胞计数。简而言之，用荧光染料标记的红血球细胞(抗Ter-119APC，Biolegend)、WBC(抗CD45 PECy7或APC/Cy7，Biolegend)及核酸结合荧光抗体对全肝素化外周血、染料，噻唑橙(TO，Sigma，St Louis，MO)进行染色。所述Ter-119⁺、TO⁺及CD45^-的外周血细胞百分比定义为网织红血球细胞计数。

组织病理学

所述从嵌合小鼠及镰刀小鼠中切除包括肾、脾、肝及肺在内的内脏器官。所有切下的器官都固定在4％的多聚甲醛溶液中，随后进行石蜡切片处理。最后，每个切片都用H&E染色，并在显微镜下检查是否有任何病理变化。

血涂片

在含氧条件下制备外周血涂片。然后将涂片进行Wright染色并进行显微镜分析。

统计分析

使用Kaplan-Meier曲线(对数秩检验(log-rank test))进行生存数据分析。使用所述Student的t检验比较两个变量的均值，使用SPSS Statistics 24.0软件通过单向方差分析比较数个变量(超过两个)的均值。P值<0.05被认为具有统计学意义。

范例1

在一降低强度调节后使用否决Tcm细胞及骨髓移植来治疗镰状细胞病

为了产生Tcm否决细胞，从Balb/c供体(H-2^d)获得的脾细胞在细胞因子耗尽下与辐照的第三方脾细胞(FVB；H-2^q)一起培养。所述CD8小鼠T细胞针对第三方刺激物的选择性扩增导致旁观者抗宿主T细胞克隆的选择性“因忽视而死亡(death by neglect)”，这些克隆可能介导GVHD，并且这些被后续的进一步稀释在IL-15存在下所述继续培养期间第三方T克隆的扩增。除了GVH反应性T细胞的选择性损失外，这些培养条件还诱导一种中枢记忆表型，所述中枢记忆表型被证明对于在体内获得强大的否决权活性很重要[Ophir等人，Blood(2013)121(7)：1220-8]。

在最初的研究中，首先校准镰状小鼠(伯克利模型，H-2^b)的最佳照射剂量，比较一调节方案中的4.5Gy与5Gy TBI，所述调节方案还包括短期雷帕霉素治疗(如图1所示)。在接受5Gy TBI的组中发现了更高水平的植入及嵌合体(图2A至图2B)。两个治疗组的所有小鼠都存活了超过140天，没有出现GVHD的迹象。为了进一步评估这种治疗方法，使用图1中描述的方案对8周大的镰状小鼠(N＝7)进行骨髓移植，包括用5Gy TBI调节(第-1天)、雷帕霉素治疗(第-1天至第4天)及NuBM移植(第0天)添加否决细胞(第7天；在图1中描述)。值得注意的是，在移植后44天，接受NuBM+TCM+Rapa的7只小鼠中有6只(85.7％)在外周血中表现出供体嵌合，范围在77％至94％之间(图3A至图3B)，而没有在仅接受调节或仅用NuBM或仅接受否决细胞进行调节及移植的小鼠中检测到嵌合现象。所有组中的所有小鼠均存活(N＝26)，并且在77天的追踪中未检测到GVHD，即使在表现出高供体来源嵌合体的移植组中也是如此。此外，观察到镰状病症状的逆转，包括所有移植小鼠中的网织红血球细胞水平(p＝0.001；图3C)及野生型血红蛋白的表达(图3D)。

综上所述，这些结果提供了治疗镰状病的一概念证明，通过MHC不同的非清髓性T细胞耗尽的HSCT与抗第三方中枢记忆否决CD8⁺T细胞。

范例2

在亚致死TBI调节后，使用大剂量T细胞耗尽的同种异体BM、否决细胞及短期雷帕霉素诱导镰状细胞病(SCD)小鼠的嵌合体

如上所述，以前的研究表示出，一大剂量TCD allo-BM、否决CD8⁺T细胞的组合，以及用一低剂量雷帕霉素的短期移植后治疗，可以成功地在亚致死4.5GY TBI条件下的完全错配的Balb/c接受者中诱导嵌合体[Ophir等人，Blood(2013)supra]。考虑到所述SCD小鼠模型(伯克利模型，H-2K^b)是基于所述C57BL/6小鼠的遗传背景，已知其抗性更强对于TBI，最初试图确定SCD接受者中TBI的最佳剂量。如图4A所示，在大剂量T细胞耗尽的Balb/c裸骨髓(Nu/BM)细胞(H-2K^d；25x10⁶)与5x10⁶抗第三方否决Tcm结合使用。在两组中，雷帕霉素从第-1天到第+4天施用。值得注意的是，在第+35天，接受5Gy TBI(7/7)的组与接受4.5GY TBI(5/9)的组(图4B)相比，植入水平更高，并且这在移植后第140天检查时，发现高水平的嵌合是持久的(图4C)。两个治疗组的所有小鼠都存活下来，表示出移植相关死亡率的风险非常低(图4D)，没有通过体重减轻测量的GvHD证据(图4E)。值得注意的是，在长期所述中，非嵌合小鼠表现出一体重增加的趋势，这是SCD小鼠的典型特征，并且5Gy组中的所有所述嵌合小鼠都表现出供体型RBC嵌合体，如通过血红蛋白电泳(图4F)，尽管WBC及红血球细胞嵌合在接受4.5Gy TBI的组中稍低。

超过381天的进一步长期追踪显示，用5Gy TBI(图5A)调节的组中继续稳定的嵌合体，通过电泳测量(图5B)完全转化为正常血红蛋白。所述组仅一在第215天发生单次死亡，可能是由于眼部出血(所有小鼠在长期追踪期间反复放血以进行嵌合体分析，并且所述死亡立即发生在最后一次出血日+213天)(图5C)。相反地，在接受4.5Gy TBI的组中嵌合体持续逐渐丧失是明显的。因此到第+213天，剩下的三只小鼠不是嵌合的。此外，所述组中的9只小鼠中有6只在381天的随访期间(图5C)死亡，具有显着的SCD病理学。组织病理学显示这些小鼠具有异常的肾及脾病理学。以脾肿大、血红蛋白下降、血小板减少及网状红血球细胞增多为特征的脾隔离症可能是这些小鼠死亡的原因所述(数据未显示)。

基于这些初步实验，研究继续使用5Gy TBI进行调节。移植后44天后，接受Nu/BM+Tcm+Rapa的7只小鼠中有6只(85.7％)在外周血中表现出供体嵌合体，嵌合体水平在77％至94％之间(图6A至图6C)。在没有否决细胞的情况下接受Nu/BM的调节及移植，或在没有雷帕霉素的5Gy TBI后移植否决+Nu/BM细胞的小鼠中未检测到供体嵌合体(图6B)。

值得注意的是，如图6D至图6E所示，在移植后318天对淋巴结(LN；嵌合百分比83.72±7.71)、骨髓(BM；78.82±13.05)进行测试时，还发现了显着且持久的供体嵌合，脾脏(75.42±10.52)及胸腺(59.63±26.74)。

范例3

嵌合小鼠病理参数的标准化

为了评估通过诱导供体衍生的造血嵌合体对镰状病的矫正程度，首先将嵌合小鼠(n＝8)的血液参数与镰状小鼠(n＝14)进行比较。如表1(下)所示，在两个独立实验中移植的14只小鼠中没有一个在移植后的前4个月中表现出移植相关的死亡率。两只小鼠分别在第215天及第231天死于用于嵌合分析的眼部出血，并且一只小鼠排斥了移植物。在移植后300天后通过电泳测量，11只可用小鼠中有10只表现出完全转化为正常血红蛋白，一只小鼠表现出混合血红蛋白嵌合体(下表1及图7A)。所述嵌合小鼠还表现出所有相关血液学参数的显着正常化，包括循环网织红血球细胞(图7B至图7C)、WBC计数(图7D)、血红蛋白(图7E)、红血球细胞比容(图7F)及平均红血球细胞血红蛋白(图7G)。

表1、超过300天的追踪期间所有小鼠(n＝14)的存活及嵌合状态^a

a)在第318天或第381天牺牲小鼠以进一步分析内部器官。

b)在移植后30-50天进行嵌合或血红蛋白电泳的第一次FACS分析。

c)嵌合体的最终FACS分析，或血红蛋白电泳在第300天后进行。

*，小鼠可能因所述嵌合体分析的眼部出血而死亡

#，老鼠排斥了所述移植物

NA＝不适用

范例4

嵌合小鼠内脏病理检查

在上述两个独立实验结束后，将小鼠安乐死并收集不同器官用于组织病理学评估。脾肿大在SCD患者中很常见，并归因于反复感染。已发现脾肿大是SCD患者众多并发症的原因。许多这些患者在儿童早期发生急性脾隔离症，并且与高死亡率相关。在本研究中，还观察到SCD小鼠出现脾肿大。值得注意的是，在所有嵌合小鼠中，脾脏的总重量及大小都显着降低(图8A至图8B)。因此，嵌合小鼠的平均脾重为118.33±18.58mg(n＝9)，而SCD对照小鼠(n＝6)为893.16±162.03mg(p<0.001；图8A)。此外，血液涂片显示嵌合小鼠外周血中完全没有镰状红血球细胞(图8C至图8D)。

类似地，在包括脾脏、肾脏、肝脏及肺在内的不同器官的嵌合小鼠中观察到正常的组织学，在血窦中没有任何可检测到的镰状红血球细胞(图8E至图8F)。因此，这些结果证实了SCD的长期治愈与转化为供体型血红蛋白一致。

范例5

人类治疗方案

为了评估人类矫正镰状病的治疗方案，考虑了包括抗胸腺细胞球蛋白(Anti-thymocyte globulin，ATG)、氟达拉滨(Fludarabine，Fu)及低剂量全身照射(TBI)的降低强度调节方案。所述方案还包括大剂量T细胞耗尽的骨髓、移植后的环磷酰胺及否决细胞。

所述治疗方案如下：

第-9天，ATG(胸腺球蛋白)每公斤理想体重的2mg

第-8天，ATG(胸腺球蛋白)每公斤理想体重的2mg

第-7天，ATG(胸腺球蛋白)每公斤理想体重的2mg

第-6天，氟达拉滨30mg/m²

第-5天，氟达拉滨30mg/m²

第-4天，氟达拉滨30mg/m²

第-3天，氟达拉滨30mg/m²

第-2天，休息(不治疗)

第-1天，TBI 3Gy，一单次。

(第-1天，任选在TBI后6-16小时首次输注大剂量T细胞耗尽的未成熟造血细胞)

第0天，大剂量T细胞输注耗尽未成熟造血细胞

(即所述受试者的每公斤理想体重至少注射5x10⁶个CD34⁺细胞，一次或两次输注)

第+3天，环磷酰胺(CY)50mg/公斤理想体重/天，IV

第+4天，环磷酰胺(CY)50mg/公斤理想体重/天，IV

第+7天，以每公斤理想体重的5x10⁶个至10x10⁶个CD8⁺细胞的剂量输注抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)。

尽管本发明已经结合其特定实施例进行了描述，但很明显许多替代、修改及变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，旨在涵盖所有落入所述所附权利要求的精神及广泛范围内的替代、修改及变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利案及专利申请案在此通过说明书整体并入，如同每个单独的出版物、专利案或专利申请案被具体地及单独地表示出被并入的程度相同在此通过参考。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。对于章节标题的延伸，它们不应被解释为必然限制。此外，本申请的任何优先权文件在此通过引用的方式整体并入本文。

Claims (57)

1.一种治疗或预防有需要的一受试者的一镰状细胞病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；及

(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，从而治疗所述受试者的所述镰状细胞病。

2.一种未成熟造血细胞移植及一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，用于治疗或预防有需要的一受试者的镰状细胞病。

3.如权利要求1所述的方法、或如权利要求2所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是用于与所述未成熟造血细胞移植同时施用。

4.如权利要求1所述的方法、或如权利要求2所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是用于所述未成熟造血细胞移植后的施用。

5.如权利要求1、3或4中任一项所述的方法、或如权利要求2-4中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是在所述未成熟造血细胞移植后的第1至20天施用。

6.如权利要求1或3至5中任一项所述的方法、或如权利要求2至5中任一项所述的未成熟造血细胞移植物及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是在所述未成熟造血细胞移植后第7天施用。

7.如权利要求1或3至6中任一项所述的方法、或如权利要求2至6中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群以每公斤理想体重的至少0.5x10⁶CD8+细胞的一剂量施用。

8.如权利要求1或3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群用于减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

9.如权利要求2至7中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，使用所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群作为一辅助治疗，以减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

10.如权利要求1或3至8中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群通过一方法产生，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个外周血单核细胞与在缺乏数个细胞因子的一培养物中的一或数个第三方抗原接触，以允许数个抗原反应性细胞的富集；及

(b)在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞，以允许包括所述中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞的增殖，从而产生所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞。

11.如权利要求10所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括在与所述一或数个第三方抗原接触之前从所述数个外周血单核细胞中消耗数个CD4⁺及/或CD56⁺表达细胞。

12.如权利要求10至11中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括选择数个CD45RA⁺表达细胞，以获得表达一CD45RA⁺CD8⁺表型的数个初始T细胞的一族群。

13.如权利要求10至11中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括消耗数个CD45RA⁺表达细胞，以获得富含数个记忆T细胞的一族群，所述数个记忆T细胞表达一CD45RA^-CD8⁺表型。

14.如权利要求10至13中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，步骤(a)中与所述一或数个抗原的所述接触是在IL-21的存在下起作用。

15.如权利要求10至14中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的步骤包括在IL-15的存在下培养所述数个细胞。

16.如权利要求10至15中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的步骤包括在IL-21、IL-15及/或IL-7的存在下培养所述数个细胞。

17.如权利要求10至16中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原选自由一病毒抗原、一细菌抗原、一肿瘤抗原、一自身免疫性疾病相关抗原、一蛋白质提取物、一纯化蛋白质及一合成肽组成的群组。

18.如权利要求10至17中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原由数个同源抗原呈现细胞、数个非同源抗原呈现细胞、数个人工载体或数个人工抗原呈现细胞所呈现。

19.如权利要求10至18中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原由与所述数个外周血单核细胞同源的数个抗原呈现细胞所呈现。

20.如权利要求10至19中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原包括数个刺激细胞，所述数个刺激细胞选自从数个外周血淋巴细胞、脾脏或数个淋巴结、细胞因子动员的数个PBL、体外扩增的数个抗原呈现细胞、体外扩增的数个树突状细胞及数个人工抗原呈现细胞中纯化的数个细胞所组成的群组。

21.如权利要求10至20中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括选择CD3⁺、CD8⁺、CD62L⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺特征。

22.如权利要求1、3至8或10至21中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9至21中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞包括数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞。

23.如权利要求1、3至8或10至22中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9至22中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞。

24.如权利要求1、3至8或10至23中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9至23中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞耗尽了CD3⁺及/或CD19⁺表达细胞。

25.如权利要求1、3至8或10至24中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9至24中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞包括少于所述受试者的每公斤理想体重的5×10⁵个CD3⁺表达细胞。

26.如权利要求1、3至8或10至25中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9至25中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞移植与所述受试者是非同源的。

27.如权利要求1、3至8或10至26中任一项所述的方法、或如权利要求2至7或9至26中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞移植及所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群从相同的供体中获得。

28.如权利要求1、3至8或10至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在非清髓性调节下调节所述受试者。

29.如权利要求2至7或9至27中任一项所述的未成熟造血细胞移植物及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括一非清髓性调节。

30.如权利要求28所述的方法、或如权利要求29所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述非清髓性调节包括全身照射、局部照射、化疗剂、抗体免疫疗法或共刺激阻断中的至少一者。

31.如权利要求30所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述全身照射包括1至6Gy的范围内的一照射剂量。

32.如权利要求30至31中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述全身照射将在所述移植的第-3天至第0天中的任何一天施用。

33.如权利要求30至32中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述全身照射将在所述移植之前的一天或两天施用。

34.如权利要求30至33中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述化疗剂包括依维莫司、氟达拉滨、环磷酰胺、白消安、三磺安、美法仑或噻替帕中的至少一者。

35.如权利要求1、3至8、10至28或30至34中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的雷帕霉素。

36.如权利要求2至7、9至27或29至34中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括一治疗有效量的雷帕霉素。

37.如权利要求35所述的方法、或如权利要求36所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述治疗有效量的雷帕霉素包括所述受试者的每公斤理想体重的每天至少0.1mg雷帕霉素。

38.如权利要求35或37中任一项所述的方法、或如权利要求36至37中任一项所述的未成熟造血细胞移植物及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述雷帕霉素用于在所述移植的第-4天至第+10天向所述受试者施用。

39.如权利要求28或30至34中任一项所述的方法、或如权利要求29至34中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述非清髓性调节包括T细胞减灭。

40.如权利要求39所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述T细胞减灭由数个抗胸腺细胞球蛋白抗体、数个抗CD52抗体或数个抗CD3抗体中的至少一者实现。

41.如权利要求28、30至34或39至40中任一项所述的方法、或如权利要求29至34或39至40中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述非清髓性调节包括一治疗有效量的氟达拉滨。

42.如权利要求1、3至8、10至28、30至34或39至41中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺。

43.如权利要求2至7、9至27、29至34或39至41中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括一治疗有效量的环磷酰胺。

44.如权利要求42所述的方法、或如权利要求43所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述治疗有效量的环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg。

45.如权利要求42或44中任一项所述的方法、或如权利要求43或44中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述环磷酰胺用于在所述移植的第+3天及第+4天向所述受试者施用。

46.如权利要求1、3至8或10至28中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射及一免疫抑制剂，其中所述全身照射及所述免疫抑制剂在移植的第-4天至第+4天施用；

(b)向所述受试者移植一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞；及

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)及步骤(c)同时进行。

48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第1至20天施用。

49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫抑制剂包括雷帕霉素，并且其中所述雷帕霉素在所述移植的第-1天至第+4天施用。

50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其特征在于，所述全身照射在所述移植的第-1天施用。

51.如权利要求1、3至8或10至28中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射及一化疗剂，其中所述全身照射及所述化疗剂在移植的第-6天到第0天施用；

(b)向所述受试者移植一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞；

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺，其中所述治疗有效量的所述环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg环磷酰胺，并且其中在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第+3天及第+4天，将所述治疗有效量的环磷酰胺以两剂施用于所述受试者；及

(d)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，数个非GVHD诱导抗第三方细胞的所述分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，其中数个非GVHD诱导抗第三方细胞的所述分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后第+5天至第+10天施用。

52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述化疗剂包括氟达拉滨，并且其中所述氟达拉滨在所述移植前的第-6天至第-3天施用。

53.如权利要求51至52中任一项所述的方法，其特征在于，所述全身照射在所述移植前的第-1天施用。

54.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在步骤(a)之前进行T细胞减灭。

55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述T细胞减灭通过在所述移植前的第-9天至第-7天施用的抗胸腺细胞球蛋白实现。

56.如权利要求1、3至8、10至28、30至35、37至42或44至55中任一项所述的方法、或如权利要求2至7、9至27、29至34、36至41或43至45中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述镰状细胞病选自由镰状细胞性贫血、HbSC病、血红蛋白Sβ地中海贫血、HbSD病及HbSE病所组成的群组。

57.如权利要求1、3至8、10至28、30至35、37至42或44至56中任一项所述的方法、或如权利要求2至7、9至27、29至34、36至41、43至45或56中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述受试者是一人类受试者。

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