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CN114875100A - 一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法 - Google Patents

一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法 Download PDF

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CN114875100A CN202210734895.6A CN202210734895A CN114875100A CN 114875100 A CN114875100 A CN 114875100A CN 202210734895 A CN202210734895 A CN 202210734895A CN 114875100 A CN114875100 A CN 114875100A
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Abstract

本发明涉及一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法。包括：采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素发酵，在发酵至64～80h后，按照培养基体积的8～12％补加含高氮源母液，继续发酵，得到纳他霉素。本发明先采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素的前中期发酵，然后再向低氮源发酵培养基中添加高氮源母液，依据纳他霉素合成阶段性的特点，有效地提高了纳他霉素的产量，使得摇瓶发酵产量最高为2.95g/L。采取扩大生产后，在1L发酵体系中，纳他霉素产量为7.88g/L，显著高于正常发酵生产的6.03g/L，纳他霉素产量提高达到了20.73％。

Description

一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的 方法
技术领域
本发明涉及一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，属于纳他霉素制备技术领域。
背景技术
临床真菌感染和食品真菌污染是威胁人类健康的两大重要因素。纳他霉素(Natamycin) (又称匹马霉素，Pimaricin)是一种具有还原性的多烯大环内酯类抗真菌剂，其分子式为 C33H47NOl3，分子量为665.75，等电点为6.5。纳他霉素是由内酯环缩合海藻氨基糖行成，其中26个碳原子组成的内酯环骨架结构中存在4个共扼双键形成的多烯发色团。由于其性质稳定、口服毒性非常低、肠道无吸收、无过敏反应、无交叉抗性等特点，不仅在食品原料保鲜、成品防腐方面具有较好的抗菌效果，而且在医药、青储饲料、粮储、家禽养殖等方面被广泛应用。
纳他霉素生物合成基因簇中存在一个胆固醇氧化酶基因(sgnE/pimE/scnE/slnE)，其编码的胆固醇氧化酶并不参与纳他霉素的母核、侧链的合成及缩合反应。但近年来国内外研究证实，胆固醇氧化酶在纳他霉素的生物合成中必不可少，胆固醇氧化酶参与纳他霉素的合成与积累(Mendes MV,et al.Cholesterol oxidases act as signalingproteins for the biosynthesis of the polyene macrolide pimaricin.Chemistryand Biology,2007,14:279-290)。进一步的相关研究说明，发酵初期添加成品的胆固醇氧化酶能够提高纳他霉素的产量(Wang M,et al..Improvement of natamycin productionby cholesterol oxidase overexpression in Streptomyces gilvosporeus, Journalof Microbiology and Biotechnology,2016,26(2):241-247)。中国专利文献公开了CN113481266A一种利用纳他霉素发酵副产物之一的胆固醇氧化酶提高纳他霉素发酵产量的方法，包括胆固醇氧化酶制备和添加的步骤。由该发明方法合成纳他霉素的最高发酵单位可达6.7g/L。但是现有技术中纳他霉素的产量仍可进一步提升。
此外，纳他霉素作为一种次级代谢产物。发酵微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，才能进行生物合成，因此纳他霉素等抗生素的发酵周期中，存在一定时间的生产延滞期，此时期内抗生素不合成或者低速率合成。因此如何克服这一问题是进一步提高纳他霉素发酵产量的关键。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法。本发明人首次发现发酵初期，低氮源含量的培养基(酵母提取物和大豆蛋白胨)，能够促进纳他霉素提前合成，减短其延滞期；发酵中后期，高氮源含量的培养基则有利于纳他霉素的积累。利用此发酵特点，本发明通过发酵初期和中前期降低氮源主要来源的酵母粉和大豆蛋白胨浓度、发酵中后期补加高氮源母液，维持纳他霉素高效合成、实现提升纳他霉素产量的同时，降低了发酵成本。
本发明的技术方案如下：
一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素发酵，在发酵至64～80h后，按照培养基体积的 8～12％补加高氮源母液，继续发酵，得到纳他霉素；
所述低氮源发酵培养基的成分为：大豆蛋白胨1.5～2.5g/L，酵母提取物0.4～0.5g/L，氯化钠1.5～2.5g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖30～50g/L；
所述高氮源母液为酵母提取物和大豆蛋白胨的混合物，添加高氮源母液后酵母提取物的终浓度为0.5～3g/L，大豆蛋白胨的终浓度为2～10g/L。
根据本发明优选的，所述低氮源发酵培养基的成分为：大豆蛋白胨2g/L，酵母提取物0.45 g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖40g/L，pH为7.5。
根据本发明优选的，所述高氮源母液中大豆蛋白胨的浓度为30～50g/L，酵母提取物的浓度为5～10g/L；添加高氮源母液后酵母提取物的终浓度为2.25g/L，大豆蛋白胨的终浓度为 10g/L。
根据本发明优选的，所述纳他霉素发酵生产所用菌株为褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
根据本发明优选的，在纳他霉素发酵生产68h后补加高氮源母液。
根据本发明优选的，所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h；进一步优选为120h。
一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
(1)配制低氮源发酵培养基和高氮源母液，灭菌后备用；
(2)无菌条件下，取纳他霉素生产菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中，培养，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液按5％的接种量接入低氮源发酵培养基中，发酵培养，在发酵64～80h后，向培养基中补加步骤(1)高氮源母液，继续发酵，得纳他霉素。
本发明未详尽之处，均可采用现有技术。
本发明的技术特点：
氮源是链霉菌进行抗生素发酵的重要组分，纳他霉素作为一种链霉菌产生的还原性抗真菌抗生素，其生物合成和产量的积累，呈现典型的次级代谢特征，在发酵菌种生长到一定时期，才开始被激活或启动合成，即存在一定时间的生产延滞期，此时期内抗生素不合成或者低速率合成。而链霉菌中抗生素合成、菌丝发育、细胞程序性死亡(PCD)等生理代谢，与 ROS和氧化胁迫密切相关。基于此，本发明通过将种子液转接至营养相对贫瘠的低氮源培养基中发酵，会引起链霉菌ROS的大量积累并激活氧化应激系统，从而引起纳他霉素合成的激活，ROS还能作为还原性物质，抵御氧化损伤，进而减短了纳他霉素发酵的延滞期，使得纳他霉素尽早被激活合成，达到了提高纳他霉素产量、缩短发酵周期、降低生产成本的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明先采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素的前中期发酵，然后再向低氮源发酵培养基中添加高氮源母液，依据纳他霉素合成阶段性的特点，有效地提高了纳他霉素的产量，使得摇瓶发酵产量最高为2.95g/L。采取扩大生产后，在1L发酵体系中，纳他霉素产量为 7.88g/L，显著高于正常发酵生产的6.03g/L，纳他霉素产量提高达到了20.73％。
2、本发明先采用低氮源发酵培养基，并在培养后期选择准确的时机继续添加高氮源母液成分，达到了提高纳他霉素产量的目的。与以往发酵工艺相比，在提前激活纳他霉素合成、保证提高产量的同时，有效地将纳他霉素合成的延滞期缩短了24h，降低了生产成本，产生了极大的经济效益。
附图说明
图1为低氮源发酵培养基和正常发酵培养基对纳他霉素合成的影响。
图2为不同浓度高氮源母液的添加对纳他霉素合成的影响。
图3为高氮源母液不同添加时间对纳他霉素合成的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
本发明中所涉及材料均为普通市售产品。
种子固体培养基的配制：葡萄糖10g/L，麦芽浸粉3g/L，酵母浸膏3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.0，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
摇瓶种子培养基的配制：葡萄糖20g/L，酵母浸膏5g/L，黄豆饼粉40g/L，pH 7.2，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
发酵罐纳他霉素液体种子培养基的配制：葡萄糖10g/L，酵母提取物3g/L，大豆蛋白胨 5g/L，麦芽浸粉3g/L；消泡剂1.40g/L；pH7.0～7.2，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
低氮源(LS)发酵培养基的配制：大豆蛋白胨2.0g/L，酵母提取物0.45g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖60g/L，pH7.5；121℃×20min灭菌，冷却后备用。
正常(HS)发酵培养基的配制：大豆蛋白胨20g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖60g/L，pH7.5；121℃×20min灭菌，冷却后备用。
高氮源母液的配制：大豆蛋白胨和酵母提取物分别配制为10+2.25g/L、20+4.5g/L、50 +11.25g/L、100+22.5g/L和200+45g/L的母液，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
pH的测定：利用梅特勒pH计进行直接测定。
实施例1
一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
(1)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌于种子固体培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取孢子，接种至摇瓶种子培养基中，在29℃下，以220rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
(2)将种子液按照5％接种量分别转接至低氮源发酵培养基(LS)和正常发酵培养基(HS) 中，发酵培养基盛装于500mL三角摇瓶中，每个500mL三角摇瓶装发酵培养基的体积为 50mL，每个实验组6瓶，220rpm，在29℃下发酵144h，发酵结束，得纳他霉素发酵液。
每24小时测定以上2组的纳他霉素含量，结果如图1所示。纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
从图1的结果可以看出，LS低氮源发酵培养基组的纳他霉素在发酵前期(<48h)和前中期(48～72h)纳他霉素的产量显著高于HS正常发酵培养基组；而在纳他霉素合成后中期 (>72h～120h)和后期(>120h)，HS正常发酵培养基组的纳他霉素产量明显高于LS低氮源发酵培养基组。表明前期低氮源含量反而有利于纳他霉素合成的激活，而中后期的氮源甾醇则对纳他霉素的合成具有关键作用。根据以上的数据结果可知，纳他霉素的生物合成在低氮源发酵培养基中被提前激活，因此将纳他霉素前中期培养过程中的氮源含量调低可以有效提高纳他霉素前中期的产量，进而提高纳他霉素的整体产量。
实施例2
一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
(1)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌于种子固体培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取孢子，接种至摇瓶种子培养基中，在29℃下，以220rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
(2)将种子液按照5％接种量转接至低氮源发酵培养基(LS)中，发酵培养基盛装于500mL 三角摇瓶中，每个500mL三角摇瓶装发酵培养基的体积为50mL，每个实验组6瓶，220rpm， 29℃发酵培养，在发酵培养72h时添加高氮源母液，继续发酵，发酵总时间为144h，发酵结束，得纳他霉素发酵液；其中高氮源母液添加量按照10％(体积比)添加到培养基中，大豆蛋白胨和酵母提取物的终浓度分别为发酵培养0g/L(等体积灭菌水，对照组)、1.0+0.225g/L (实验组1)、2.0+0.45g/L(实验组2)、5.0+1.125g/L(实验组3)、10+2.25g/L(实验组4) 和20+4.5g/L(实验组5)，详见表1。
测定以上6组的纳他霉素含量，结果如图2所示。纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表1高氮源母液添加浓度
Figure BDA0003714862510000051
从图2的结果可以直观地看出，实验组4与对照组相比，纳他霉素产量有显著提高，在 120h时，纳他霉素产量达到最高，且提高幅度达到了46.6％。实验组2、实验组3和实验组5 在高氮源母液添加后，虽有不同程度的提高，但提高量不显著。根据以上的数据结果，在本发明此后的实施例中高氮源母液添加量终浓度为10g/L大豆蛋白胨+2.25g/L酵母提取物，此浓度为添加后的终浓度。
实施例3
一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
(1)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌于种子固体培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取孢子，接种至摇瓶种子培养基中，在29℃下，以220rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
(2)将种子液按照5％接种量转接至低氮源发酵培养基(LS)中，发酵培养基盛装于500mL 三角摇瓶中，每个500mL三角摇瓶装发酵培养基的体积为50mL，每个实验组6瓶，220rpm， 29℃发酵培养，在发酵培养的过程中添加高氮源母液(终浓度为2.0g/L大豆蛋白胨+0.45g/L 酵母提取物)，添加量为发酵培养基体积的10％，继续发酵，发酵总时间为144h，发酵结束，得纳他霉素发酵液；其中高氮源母液的添加时间分别为发酵培养64h后(实验组1)、68h后 (实验组2)、72h后(实验组3)、76h后(实验组4)和80h后(实验组5)，并以不添加高氮源母液为对照组，详见表2。
测定以上6组的纳他霉素含量，结果如图3所示。纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表2高氮源母液不同添加时间
Figure BDA0003714862510000061
由图3可知，实验组1～5与对照组相比，120h的纳他霉素产量均有提高，提高幅度达到了3.2～60.72％。但是不同时间添加高氮源母液对纳他霉素产量有影响，实验组1相较于对照组纳他霉素产量提高了42.52％，实验组2相较于对照组纳他霉素产量提高了60.72％，实验组4和实验组5相较于实验组2则出现纳他霉素的产量降低，但是相较于对照组纳他霉素产量依然提高了3.2％以上。
实施例4
一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
(1)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌于种子固体培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取孢子，接种至摇瓶种子培养基中，在29℃下，以220rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
2)将种子液按10％的接种量接入低氮源发酵培养基(LS)中，发酵培养基未接种前体积为0.8L，装入1L全自动发酵罐中，在29℃的条件下进行发酵，发酵过程中溶氧DO值控制在30～40％之间，培养初期pH从初始pH值自然降落至6.00±0.10时开始流加20％浓度NaOH并将pH维持在6.00±0.20之间至发酵结束；发酵过程中流加40％质量百分比浓度的葡萄糖溶液，并始终将葡萄糖含量控制在15.00±5.00g/L，在发酵68h后，添加高氮源母液(100g/L大豆蛋白胨+22.5g/L酵母提取物)，添加量为发酵培养基体积的10％，添加后发酵体系中大豆蛋白胨终浓度为10g/L，酵母提取物终浓度为2.25g/L，继续发酵至120h后得纳他霉素；设置对照组，对照组添加等体积无菌水。
测定以上2组的纳他霉素含量，结果如表3所示。纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表3在1L发酵体系中纳他霉素发酵
Figure BDA0003714862510000071
从表3中可以看出，实验组由于在发酵68h后添加了10％体积的高氮源母液，其纳他霉素产量为7.78g/L，显著高于未添加对照组的纳他霉素产量6.23g/L，产量提高达到了24.88％。 1L发酵体系验证结果表明，添加10％体积的高氮源母液可以显著提高纳他霉素的产量。

Claims (8)

1.一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，包括步骤如下：
采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素发酵，在发酵至64～80h后，按照培养基体积的8～12％补加高氮源母液，继续发酵，得到纳他霉素；
所述低氮源发酵培养基的成分为：大豆蛋白胨1.5～2.5g/L，酵母提取物0.4～0.5g/L，氯化钠1.5～2.5g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖30～50g/L；
所述高氮源母液为酵母提取物和大豆蛋白胨的混合物，添加高氮源母液后酵母提取物的终浓度为0.5～3g/L，大豆蛋白胨的终浓度为2～10g/L。
2.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述低氮源发酵培养基的成分为：大豆蛋白胨2g/L，酵母提取物0.45g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖40g/L，pH为7.5。
3.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述高氮源母液中大豆蛋白胨的浓度为30～50g/L，酵母提取物的浓度为5～10g/L；添加高氮源母液后酵母提取物的终浓度为2.25g/L，大豆蛋白胨的终浓度为10g/L。
4.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述纳他霉素发酵生产所用菌株为褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
5.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，在纳他霉素发酵生产68h后补加高氮源母液。
6.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h。
7.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述纳他霉素发酵的总时间为120h。
8.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，具体包括步骤如下：
(1)配制低氮源发酵培养基和高氮源母液，灭菌后备用；
(2)无菌条件下，取纳他霉素生产菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中，培养，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液按5％的接种量接入低氮源发酵培养基中，发酵培养，在发酵64～80h后，向培养基中补加步骤(1)高氮源母液，继续发酵，得纳他霉素。
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