CN114874959A

CN114874959A - 一种利用葡萄糖从头发酵生产l-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用

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Publication number: CN114874959A
Application number: CN202210448905.XA
Authority: CN
Inventors: 范晓光; 季圆清; 温昊妍; 周宇航; 徐庆阳
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Zhejiang Zhenyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN114874959B

Abstract

本发明公开了一种利用葡萄糖从头发酵生产L‑茶氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌株含有用于茶氨酸合成的γ‑谷氨酰甲胺合成酶和编码茶氨酸从头合成途径酶的基因，所述茶氨酸从头合成途径酶包括磷酸解酮酶、转氨酶、乙醛脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。本发明构建出从葡萄糖到茶氨酸的完整合成代谢途径，得到一株不携带质粒、无需添加乙胺、能利用葡萄糖稳定生产茶氨酸的基因工程菌株，该菌株发酵33h后，茶氨酸的产量可达到46g/L，转化率可达0.16g茶氨酸/g葡萄糖，生产强度可达1.4g茶氨酸/L/h，是目前报道的不添加乙胺，直接利用葡萄糖从头发酵生产茶氨酸的最高产量、转化率和生产强度，具有良好的工业应用前景。

Description

一种利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用。

背景技术

L-茶氨酸(以下简称茶氨酸)是存在于茶树植物中的一种特殊氨基酸，对人体健康有许多有益作用，如缓解压力、改善睡眠质量、抗氧化、调节神经递质的传递、抑制高血压、抗肿瘤以及提高记忆力等。茶氨酸作为天然镇静剂、抗抑郁剂在日本、美国的市场认可度较高，已形成上百种的功能食品、饮料以及保健品。2014年，我国批准茶叶茶氨酸(以茶叶为原料，经提取、过滤、浓缩等工艺制成的茶氨酸)作为新食品原料，但通过植物提取法获得的茶叶茶氨酸收率低、成本高，已无法满足日益增长的市场需求。

目前食品级的茶氨酸均采用微生物合成法获得。据报道，可利用纯酶催化法制备茶氨酸，采用γ-谷氨酰甲胺合成酶耦联ATP再生系统实现茶氨酸的生物合成，最高产量可达600mM。但是酶催化法存在许多问题，如催化体系复杂、底物价格昂贵、酶制备和酶反应需要分步进行、设备占用率高等，因此生产成本明显高于化学法。虽然使用固定化方法能够减少酶的使用成本，但对于含有ATP再生系统的酶催化体系进行固定化难度较大，且不易放大到工业规模。因此，与酶催化法相比，微生物发酵法具有路线简单、培养基原料价格低廉、设备占用率低等优点，已广泛用于茶氨酸的工业化生产。据报道，可利用重组大肠杆菌发酵生产茶氨酸，培养过程中不断流加底物乙胺和葡萄糖，发酵20h即可积累75g/L的茶氨酸。

尽管发酵过程中补充足量的乙胺可有效生产茶氨酸，但乙胺本身具有细胞毒性，其沸点为16.6℃，气化后对人体健康不利，对外部环境有害，因此需要特殊设备进行补料。此外，没有完全代谢的乙胺会在胞外大量积累，限制菌体生长，弱化ATP再生，从而抑制茶氨酸的合成。为减少乙胺使用过程中的危险性，直接利用葡萄糖从头发酵制备茶氨酸是有效的解决方案，如何在生产菌中构建乙胺的内源合成途径是目前亟需解决的技术难题。

通过对比，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、一株用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用(CN109777763B)，具体涉及一种新型高效γ-谷氨酰甲胺合成酶以及一株无质粒用于L-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物高效合成L-茶氨酸的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，通过在其基因组上整合三拷贝的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas-Mu；单拷贝谷氨酸脱氢酶基因Cgl2079；单拷贝丙酮酸羧化酶基因Cgl0689；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA获得。通过系统代谢改造后，工程菌能够以葡萄糖为原料通过流加乙胺发酵方式合成L-茶氨酸，发酵产量和糖酸转化率均为现有报道的最高值，5L发酵罐发酵中L-茶氨酸的最高产量可达60g/L，糖酸转化率可达40％。

2、一株大肠杆菌基因工程菌及其发酵生产L-茶氨酸的方法(CN113774075A)，具体涉及一种利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产L-茶氨酸的方法。所述工程菌是以大肠杆菌W3110基因组上单拷贝T7RNAP、双拷贝gmas、敲除xylR、敲除sucCD后获得菌株为出发菌种，在基因组上整合xfp、pta、acs、gltA、ppc，敲除ackA获得。采用OD联动的乙胺补加策略以葡萄糖等廉价碳源为底物高效合成L-茶氨酸，糖酸转化率高、生产性能稳定，20-25h后L-茶氨酸的产量可达75-80g/L，糖酸转化率达到52-55％。发酵液采用膜分离结合阴阳离子树脂串联技术进行纯化，一次结晶收率72.3％，L-茶氨酸成品纯度达到99％。

3、一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法(CN110564789A)，所述方法是在发酵培养过程中，将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时，向发酵罐中添加D～木糖使D～木糖的浓度为5～20g/L并调温至28～35℃诱导4～5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100～300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80％的乙胺溶液，继续在pH6.5～7.5、温度35～40℃、溶氧10～40％的条件下发酵培养20-30h，合成L-茶氨酸。发酵周期短、产酸效率高、菌体密度高；底物转化率高；而且工艺简单，环境污染低，降低了L～茶氨酸的生产成本，有利于工业化生产的推广和应用。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌株含有用于茶氨酸合成的γ-谷氨酰甲胺合成酶和编码茶氨酸从头合成途径酶的基因，所述茶氨酸从头合成途径酶包括磷酸解酮酶、转氨酶、乙醛脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。

进一步地，所述基因工程菌株以大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌为出发菌株；

或者，编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因来源于噬氨副球菌Paracoccusaminovorans；

或者，所述编码磷酸解酮酶、转氨酶、乙醛脱氢酶、丙氨酸脱氢酶的基因分别来源于双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、大肠杆菌E.coli、球形芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus；

或者，所述编码茶氨酸从头合成途径酶的基因由P_T7或P_trc启动子启动；

或者，所述编码茶氨酸从头合成途径酶的基因分别整合于大肠杆菌的ycgH、ycnI、fhiA、ygaY基因位点。

进一步地，所述基因工程菌株以E.coli ATCC27325或者C.glutamicum ATCC13032为出发菌株；

所述编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因由P_T7启动子启动；

或者，所述编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因整合于大肠杆菌的yeeP基因位点。

进一步地，所述基因工程菌株含有gmas、xfp、spuC、eutE和alD基因。

进一步地，所述gmas、xfp、spuC、eutE和alD基因为野生型基因，或者为编码相应蛋白的突变体或者经人工修饰的基因，包括一个或多个位点的取代、缺失或者插入一个或多个氨基酸残基，该突变体或经人工修饰的基因所编码的蛋白具有相应的活性，没有功能缺陷。

如上所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)出发菌株的基因组中整合gmas基因；

在一个实施方案中，所述构建方法还包括任选地如下一个或多个步骤：

(2)整合茶氨酸从头合成途径酶基因，包括gmas、xfp、spuC、eutE和alD；

在一个实施方案中，所述构建方法包括如下步骤：

(1)整合编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因gmas，并由P_T7启动子启动；

(2)整合编码磷酸解酮酶的基因xfp，并由P_T7启动子启动；

(3)整合编码转氨酶的基因spuC，并由P_trc启动子启动；

(4)整合编码乙醛脱氢酶的基因eutE，并由P_trc启动子启动；

(5)整合编码丙氨酸脱氢酶的基因alD，并由P_trc启动子启动；

对上述构建方法中的步骤(1)至(5)的操作顺序并不限制，能够以本领域技术人员可实施的任何顺序进行。优选地采用如步骤(1)至(5)依次进行的方式。

采用本领域已知的任何方法实现基因的整合，例如同源重组，重叠PCR，诱变筛选或者基因编辑等技术。

进一步地，所述构建方法包括采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术进行基因整合；

或者，所述构建方法包括构建重组片段和pGRB质粒，将pGRB质粒和所述重组片段同时转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中，以及质粒消除的步骤，获得重组的基因工程菌株。

进一步地，所述pGRB质粒的构建包括：设计靶序列，制备包含靶序列的DNA片段，将包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组；较优地，所述靶序列为5’-NGG-3’。

所述构建重组片段包括构建基因整合的重组片段或者构建基因敲除的重组片段；其中，构建基因整合的重组片段的步骤包括：以出发菌株的基因组为模板，根据目的基因拟插入位点的上下游序列设计上下游同源臂引物，并根据目的基因组设计引物，扩增目的基因片段，再通过PCR重叠技术获得重组片段。

如上所述的基因工程菌在发酵生产茶氨酸方面中的应用。

利用如上所述的基因工程菌的发酵生产茶氨酸的方法，包括如下步骤：将基因工程菌株与发酵培养基接触，进行发酵培养，制备得到茶氨酸。

进一步地，所述发酵培养包括摇瓶发酵或者发酵罐发酵；

摇瓶发酵时，基因工程菌株的接种量为15-20％，发酵条件为37℃，220r/min振荡培养，发酵过程中维持pH在6.7-7.2，通过补加氨水调节pH，发酵26-30h，即得。在发酵过程中还可以补加葡萄糖溶液维持发酵进行，优选所述葡萄糖溶液的质量体积浓度为60％(m/v)。本发明中对于葡萄糖溶液的补加量没有特别的限定，可维持发酵液中葡萄糖浓度在5g/L以下。

所述摇瓶发酵用500mL三角瓶进行发酵。当摇瓶发酵26-30h，发酵液中茶氨酸的浓度可以达到6-10g/L。

当发酵罐发酵时，基因工程菌株的接种量为15-20％，发酵温度为37℃，溶氧在35-45％之间，发酵过程中控制pH稳定在7.0-7.2，通过补加氨水调节pH；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加质量体积浓度为80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在1g/L以下，发酵30-33h，即得。

所述发酵罐发酵采用5L发酵罐进行发酵。在5L发酵罐中发酵30-33h后，茶氨酸的产量达到40-46g/L，转化率达到0.14-0.16g茶氨酸/g葡萄糖，生产强度达到1.3-1.4g茶氨酸/L/h。

本发明可以采用本领域已知的大肠杆菌发酵培养基进行发酵。

或者，摇瓶发酵时的发酵培养基组成为：葡萄糖10-40g/L，酵母粉3-4g/L，蛋白胨4-6g/L，柠檬酸钠1-2g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，硫酸镁1-2g/L，硫酸亚铁15-20mg/L，硫酸锰15-20mg/L，VB₁、VB₃、VB₅、VB₁₂、V_H各1-3mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2；

或者，发酵罐发酵时的发酵培养基组成为：葡萄糖10-40g/L，酵母粉2-8g/L，柠檬酸0.2-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-3.2g/L，磷酸氢二钾0.5-2.4g/L，硫酸镁0.2-1.2g/L，蛋氨酸0.1-1.0g/L，硫酸亚铁0.2-20mg/L，硫酸锰1-10mg/L，玉米浆2-20ml/L，其余为水，pH7.0-7.2。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明可以选用遗传背景清晰的野生型大肠杆菌为出发菌株，通过合理代谢工程策略构建出从葡萄糖到茶氨酸的完整合成代谢途径，得到一株不携带质粒、无需添加乙胺、能利用葡萄糖稳定生产茶氨酸的基因工程菌株。

2、本发明使用乙醛脱氢酶和转氨酶构建出乙酰辅酶A到乙胺的代谢途径。由于转氨酶需要以丙氨酸作为氨基供体，因此使用丙氨酸脱氢酶实现丙氨酸的循环利用(图1)。乙胺合成途径的成功构建使得工程菌株能够在不外源添加乙胺的条件下直接利用葡萄糖发酵生产茶氨酸，避免了发酵过程中乙胺对人体的损害和对环境的污染，降低了设备占有率，简化了发酵工艺，节约了原料成本。

3、乙酰辅酶A是乙胺和谷氨酸形成的共同前体，提高乙酰CoA供应有助于平衡乙胺和谷氨酸的代谢通量，进而提高茶氨酸的合成。大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶系催化丙酮酸形成乙酰辅酶A，同时伴随CO₂产生，这是乙酰辅酶A合成的主要途径。本发明使用异源的磷酸解酮酶催化6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖的解酮反应，促进了乙酰磷酸的形成，乙酰磷酸进一步代谢形成乙酰辅酶A，从而构建出乙酰辅酶A合成的另一途径(图1)，该途径没有CO₂产生，从而避免了碳损失。

4、本发明生产茶氨酸的基因工程菌，在5L发酵罐中发酵33h后，茶氨酸的产量可达到46g/L，转化率可达0.16g茶氨酸/g葡萄糖，生产强度可达1.4g茶氨酸/L/h，是目前报道的不添加乙胺，直接利用葡萄糖从头发酵生产茶氨酸的最高产量、转化率和生产强度，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明中基因工程菌E.coli E5的代谢改造策略图；

图2为本发明中gmas基因整合片段构建及验证电泳图；其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：目的片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段；

图3为本发明中xfp基因整合片段构建及验证电泳图；其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：目的片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段；

图4为本发明中spuC基因整合片段的构建及验证电泳图；其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：目的片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段；

图5为本发明中eutE基因整合片段构建及验证电泳图；其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：目的片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段；

图6为本发明中alD基因整合片段构建及验证电泳图；其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：目的片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段；

图7为本发明中菌株E.coli E5在5L发酵罐中分批补料的发酵过程曲线图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

较优地，所述基因工程菌株以大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌为出发菌株；

较优地，所述基因工程菌株以E.coli ATCC27325或者C.glutamicum ATCC13032为出发菌株；

所述编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因由P_T7启动子启动；

较优地，所述基因工程菌株含有gmas、xfp、spuC、eutE和alD基因，其基因序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5。

较优地，所述gmas、xfp、spuC、eutE和alD基因为野生型基因，或者为编码相应蛋白的突变体或者经人工修饰的基因，包括一个或多个位点的取代、缺失或者插入一个或多个氨基酸残基，该突变体或经人工修饰的基因所编码的蛋白具有相应的活性，没有功能缺陷。

这些基因均已在GenBank有登记，本领域技术人员可通过PCR获得这些基因。作为示例，gmas基因为GenBank:SFH87749，xfp基因为GenBank:MN081868，spuC基因为GenBank:AAN70747，eutE基因为GenBank:UJY49218，alD基因为GenBank:AAA22210。

如上所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(3)出发菌株的基因组中整合gmas基因；

(4)整合茶氨酸从头合成途径酶基因，包括gmas、xfp、spuC、eutE和alD；

在一个实施方案中，所述构建方法包括如下步骤：

(6)整合编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因gmas，并由P_T7启动子启动；

(7)整合编码磷酸解酮酶的基因xfp，并由P_T7启动子启动；

(8)整合编码转氨酶的基因spuC，并由P_trc启动子启动；

(9)整合编码乙醛脱氢酶的基因eutE，并由P_trc启动子启动；

(10)整合编码丙氨酸脱氢酶的基因alD，并由P_trc启动子启动；

对上述构建方法中的步骤(1)至(5)的操作顺序并不限制，能够以本领域技术人员可实施的任何顺序进行。优选地采用如步骤(1)至(5)依次进行的方式。可以如图1所示。

较优地，所述构建方法包括采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术进行基因整合；

较优地，所述pGRB质粒的构建包括：设计靶序列，制备包含靶序列的DNA片段，将包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组；较优地，所述靶序列为5’-NGG-3’。

如上所述的基因工程菌在发酵生产茶氨酸方面中的应用。

较优地，所述发酵培养包括摇瓶发酵或者发酵罐发酵；

具体地，相关制备及检测实施例如下：

实施例1：基因工程菌E.coli E5的构建

1.基因编辑的方法

本发明中采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑方法参照文献(MetabolicEngineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒分别为pGRB与pREDCas9。其中pREDCas9携带gRNA质粒消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB质粒，以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。

该方法的具体步骤如下：

1.1 pGRB质粒构建

构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。

1.1.1靶序列设计

使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)，具体如下：

yeeP靶序列：ACTGCAGGACGAGCTGCGCACGG

ycgH靶序列：AGTGTCAGAGGCTATAGCGCAGG

ycnI靶序列：GAACGAAAATGGTGTTGTACTGG

fhiA靶序列：TACTTTCATGGCTGGCGATCTGG

ygaY靶序列：CTCAACTACCCACAGTTGTTGGG

1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备

设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物(pGRB鉴定引物：pGRB-Test-S：GTCTCATGAGCGGATACATATTTG；pGRB-Test-A：ATGAGAAAGCGCCACGCT)，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火50℃，1min；保温4℃。退火体系如下表1：

表1退火体系

1.1.3线性载体的制备

载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。

1.1.4重组反应

重组体系如下表2。所用重组酶均为II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。

表2重组体系

1.1.5质粒的转化

取20μL上述反应液即质粒重组反应后的液体，加入到100mLDH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激42s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右，将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。

1.2重组DNA片段的制备

用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件Oligo 7，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约300-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR的体系和方法如下表3：

表3 PCR扩增体系

重叠PCR的体系如下表4：

表4重叠PCR扩增体系

PCR反应条件(宝日医生物PrimeSTAR HS DNA Polymerase)：预变性(95℃)5min；变性(98℃)10s，退火(60℃)15s，72℃延伸，循环30次；72℃继续延伸10min；保温(4℃)。

1.3质粒和重组DNA片段的转化

1.3.1 pREDCas9的转化

利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至W3110的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。

1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备

32℃培养至OD₆₀₀为0.1时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至OD₆₀₀为0.2-0.3时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。

1.3.3 pGRB和重组DNA片段的转化

将pGRB和重组DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。

1.4质粒的消除

1.4.1 pGRB的消除

将阳性重组子置于含有20mmol/L阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有100μg/mL奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。分别转接单菌落到含有100μg/mL氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。

1.4.2 pREDCas9质粒的消除

将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。

2.菌株E.coli E5构建的具体过程

2.1将P_T7-gmas(含有T7启动子和gmas基因的片段)整合在假基因yeeP位点处

以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其yeeP基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(SEQ ID NO.1)、UP-yeeP-A(SEQ ID NO.2)和下游同源臂引物DN-yeeP-S(SEQ ID NO.3)、DN-yeeP-A(SEQ ID NO.4)，并扩增yeeP基因的上、下游同源臂；根据gmas基因设计引物gmas-S(SEQ ID NO.5)、gmas-A(SEQ ID NO.6)，并扩增gmas基因片段。启动子P_T7则设计在yeeP基因上游同源臂的下游引物和gmas基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得gmas基因的整合片段(yeeP基因上游同源臂-P_T7-gmas-yeeP基因下游同源臂)，构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yeeP-S(SEQ ID NO.7)和gRNA-yeeP-A(SEQ ID NO.8)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9载体的大肠杆菌出发菌株感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP，获得菌株E.coli E1。阳性重组子验证图如图2所示。

2.2将P_T7-xfp(含有T7启动子和xfp基因的片段)整合在假基因ycgH位点处

以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其ycgH基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-ycgH-S(SEQ ID NO.9)、UP-ycgH-A(SEQ ID NO.10)和下游同源臂引物DN-ycgH-S(SEQ ID NO.11)、DN-ycgH-A(SEQ ID NO.12)，并扩增ycgH基因的上、下游同源臂；根据xfp基因设计引物xfp-S(SEQ ID NO.13)、xfp-A(SEQ ID NO.14)，并扩增xfp基因片段。启动子P_T7则设计在ycgH基因上游同源臂的下游引物和xfp基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得xfp基因的整合片段(ycgH基因上游同源臂-P_T7-xfp-ycgH基因下游同源臂)，构建pGRB-ycgH使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ycgH-S(SEQ ID NO.15)和gRNA-ycgH-A(SEQ ID NO.16)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ycgH。将整合片段和pGRB-ycgH电转化至含有pREDCas9载体的E.coli E1感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ycgH，获得菌株E.coli E2。阳性重组子验证图如图3所示。

2.3将P_trc-spuC(含有trc启动子和spuC基因的片段)整合在假基因ycnI位点处

以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其ycnI基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-ycnI-S(SEQ ID NO.17)、UP-ycnI-A(SEQ ID NO.18)和下游同源臂引物DN-ycnI-S(SEQ ID NO.19)、DN-ycnI-A(SEQ ID NO.20)，并扩增ycnI基因的上、下游同源臂；根据spuC基因设计引物spuC-S(SEQ ID NO.21)、spuC-A(SEQ ID NO.22)，并扩增spuC基因片段。启动子P_trc则设计在ycnI基因上游同源臂的下游引物和PpTA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得spuC基因的整合片段(ycnI基因上游同源臂-P_trc-spuC-ycnI基因下游同源臂)，构建pGRB-ycnI使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ycnI-S(SEQ IDNO.23)和gRNA-ycnI-A(SEQ ID NO.24)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ycnI。将整合片段和pGRB-ycnI电转化至含有pREDCas9载体的E.coli E2感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ycnI，获得菌株E.coli E3。阳性重组子验证图如图4所示。

2.4将P_trc-eutE(含有trc启动子和eutE基因的片段)整合在假基因fhiA位点处

以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其fhiA基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-fhiA-S(SEQ ID NO.25)、UP-fhiA-A(SEQ ID NO.26)和下游同源臂引物DN-fhiA-S(SEQ ID NO.27)、DN-fhiA-A(SEQ ID NO.28)，并扩增fhiA基因的上、下游同源臂；根据eutE基因设计引物eutE-S(SEQ ID NO.29)、eutE-A(SEQ ID NO.30)，并扩增eutE基因片段。启动子P_trc则设计在fhiA基因上游同源臂的下游引物和eutE基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得eutE基因的整合片段(fhiA基因上游同源臂-P_trc-eutE-fhiA基因下游同源臂)，构建pGRB-fhiA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-fhiA-S(SEQ IDNO.31)和gRNA-fhiA-A(SEQ ID NO.32)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-fhiA。将整合片段和pGRB-fhiA电转化至含有pREDCas9载体的E.coli E3感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-fhiA，获得菌株E.coli E4。阳性重组子验证图如图5所示。

2.5将P_trc-alD(含有trc启动子和alD基因的片段)整合在假基因ygaY位点处

以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其ygaY基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-ygaY-S(SEQ ID NO.33)、UP-ygaY-A(SEQ ID NO.34)和下游同源臂引物DN-ygaY-S(SEQ ID NO.35)、DN-ygaY-A(SEQ ID NO.36)，并扩增ygaY基因的上、下游同源臂；根据alD基因设计引物alD-S(SEQ ID NO.37)、alD-A(SEQ ID NO.38)，并扩增alD基因片段。启动子P_trc则设计在ygaY基因上游同源臂的下游引物和alD基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得alD基因的整合片段(ygaY基因上游同源臂-P_trc-alD-ygaY基因下游同源臂)，构建pGRB-ygaY使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ygaY-S(SEQ ID NO.39)和gRNA-ygaY-A(SEQ ID NO.40)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ygaY。将整合片段和pGRB-ygaY电转化至含有pREDCas9载体的E.coli E4感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ygaY，获得菌株E.coli E5。阳性重组子验证图如图6所示。

3.菌株E.coli E5构建过程中用到的引物见表5

表5菌株E.coli E5构建过程中所涉及的引物：

实施例2：利用基因工程菌E.coli E5发酵生产茶氨酸

(1)摇瓶发酵：

摇瓶发酵的发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸钠1g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁15mg/L，硫酸锰15mg/L，VB₁、VB₃、VB₅、VB₁₂、V_H各1mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵工艺：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，220rpm培养10h。按种子培养液体积15％的接种量接种到装有发酵培养基的500ml三角瓶中(终体积为30ml)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行。经过26h摇瓶发酵，发酵液中茶氨酸的产量为6g/L。

(2)发酵罐发酵：

发酵罐发酵的发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，柠檬酸0.2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，蛋氨酸0.1g/L，硫酸亚铁0.2mg/L，硫酸锰1mg/L，玉米浆2ml/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵工艺：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养10h，转接茄形瓶继续培养10h。取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧30％，培养至细胞干重达到5g/L。按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在35％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在1g/L以下。在5L发酵罐中培养30h后，茶氨酸的产量达到40g/L，转化率达到0.14g茶氨酸/g葡萄糖，生产强度达到1.3g茶氨酸/L/h。

实施例3：利用基因工程菌E.coli E5发酵生产茶氨酸

(1)摇瓶发酵：

摇瓶发酵的发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨6g/L，柠檬酸钠2g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁2g/L，硫酸铁20mg/L，硫酸锰20mg/L，VB₁、VB₃、VB₅、VB₁₂、V_H各3mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵工艺：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，220rpm培养10h。按种子培养液体积20％的接种量接种到装有发酵培养基的500ml三角瓶中(终体积为30ml)，九层纱布封口，37℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行。经过30h摇瓶发酵，发酵液中茶氨酸的产量为10g/L。

(2)发酵罐发酵：

发酵罐发酵的发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，酵母粉8g/L，柠檬酸2.0g/L，磷酸二氢钾3.2g/L，磷酸氢二钾2.4g/L，硫酸镁1.2g/L，蛋氨酸1.0g/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰10mg/L，玉米浆20ml/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵工艺：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养10h，转接茄形瓶继续培养10h。取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧30％，培养至细胞干重达到5g/L。按照20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在45％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在1g/L以下。在5L发酵罐中培养33h后，茶氨酸的产量达到46g/L，转化率达到0.16g茶氨酸/g葡萄糖，生产强度达到1.4g茶氨酸/L/h。发酵进程曲线见图7。

本发明中使用的序列如下：

SEQ ID NO.1γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas：

atgaccgatctggccgaatttgcccgcgaaaaaggcgtgaaatattttatggtgagctataccgatttagtgggcgcccagcgcgcaaaactggttccgacctacatgatcaacaacgttgtgagcggcggcgccggttttgccggctttgctggtggctttgttttaaccccggcacatccggatatgttaggtatgccggatgccgataccgttatccaactgccgtggaaaccggaagttgcatgggtggcagccaacccggcaatgtatgatagcccgctgccgcaagctccgcgtaatgtgctgcgtaatgtgattgcagagatggaaaaggaaggtttacgcatcaaaaccggcgttgaaccggagttcttctttctgactccggaaggcgatcgtattgccgatacccgcgataccgccgccaaaccgtgctacgatcagcaagctattatgcgtcgttacgatgtgatcagcgaggtgagcgactacatgattgaactgggctgggaaccgtatcagagtgaccatgaagacgccaacggtcagttcgagatgaactggaagtatgatgattctttagcaaccgccgataagctggccttttttaaatttatgatgaaaagcgttgccgaaaagcatggtctgcgcgtgaccttcatgccgaaaccgttcttagagctgaccggtagcggcatgcatgcccacattagcggctggagtctggatggcaaaaccaacgccttctacgatggcaacgatgagctgggtctgagcgaagtgggtcaccattttctgggcggcattatgaagcatgccagcgcactggccgccattaccaatccgaccatcaatagctataaacgcattaacgcaccgcgtagcagtagcggtgcaacttgggccccgaatagcgtgacttggagcggcgacaaccgcacccatctggtgcgtgttccgggcaagggtcgtattgaactgcgtttaccggatggtgccagcaacccgtatctgttacacgccgtgatcatggccgctggtctggatggtattcgccacaagtgtgatccgggcaagcgtctggacattgatatgtacgccgacggccatatggtgaaagatgccccgaagctgccgctgaatttactggatgccattcgtgcctttgatcagaacaccgagctgaaagccgctttaggtgaagaatttagcgccagcttcatcgagatgaaaatgaaagagtggaatgcctacgcaagccatctgacccagtgggaacgcgatcacactttagatatttaa

SEQ ID NO.2磷酸解酮酶基因xfp：

atgacctctccggttatcggtaccccgtggaaaaaactgaacgcgccggtttctgaagaagcgatcgaaggtgttgacaaatactggcgtgcggcgaactacctgtctatcggtcagatctacctgcgttctaacccgctgatgaaagaaccgttcacccgtgaagacgttagacaccgtctggttggtcactggggtaccaccccgggtctgaacttcctgatcggtcacatcaaccgtctgatcgcggaccaccagcagaacaccgttatcatcatgggtccgggtcacggtggtccggcgggtaccgcgcagtcttacctggacggtacctacaccgaatacttcccgaacatcaccaaagacgaagcgggtctgcagaaattcttccgtcagttctcttacccgggtggtatcccgtctcactacgcgccggaaaccccgggttctatccacgaaggtggtgaactgggttacgcgctgtctcacgcgtacggtgcggttatgaacaacccgtctctgttcgttccggcgatcgttggtgacggtgaagcggaaaccggtccgctggcgaccggttggcagtctaacaaactgatcaacccgcgtaccgacggtatcgttctgccgatcctgcacctgaacggttacaaaatcgcgaacccgaccatcctgtctcgtatctctgacgaagaactgcacgagttcttccacggtatgggttacgaaccgtacgagttcgttgcgggtttcgacaacgaagaccacctgtctatccaccgtcgtttcgcggaactgttcgaaaccgttttcgacgaaatctgcgacatcaaagcggcggcgcagaccgacgacatgacccgtccgttctacccgatgatcatcttccgtaccccgaaaggttggacctgcccgaaattcatcgacggtaaaaaaaccgaaggttcttggcgttctcaccaggttccgctggcgtctgcgcgtgacaccgaagcgcacttcgaagttctgaaaaactggctggaatcttacaaaccggaaaaactgttcgacgaaaacggtgcggttaaaccggaagttaccgcgttcatgccgaccggtgaactgcgtatcggtgaaaacccgaacgcgaacggtggtcgtatccgtgaagaactgaaactgccgaaactggaagactacgaagttaaagaagttgcggaatacggtcacggttggggtcagctggaagcgacccgtcgtctgggtgtttacacccgtgacatcatcaaaaacaacccggactctttccgtatcttcggtccggacgaaaccgcgtctaaccgtctgcaggcggcgtacgacgttaccaacaaacagtgggacgcgggttacctgtctgcgcaggttgacgaacacatggcggttaccggtcaggttaccgaacagctgtctgaacaccagatggaaggtttcctggaaggttacctgctgaccggtcgtcacggtatctggtcttcttacgaatctttcgttcacgttatcgactctatgctgaaccagcacgcgaaatggctggaagcgaccgttcgtgaaatcccgtggcgtaaaccgatctcttctatgaacctgctggtttcttctcacgtttggcgtcaggaccacaacggtttctctcaccaggacccgggtgttacctctgttctgctgaacaaatgcttcaacaacgaccacgttatcggtatctacttcccggttgactctaacatgctgctggcggttgcggaaaaatgctacaaatctaccaacaaaatcaacgcgatcatcgcgggtaaacagccggcggcgacctggctgaccctggacgaagcgcgtgcggaactggaaaaaggtgcggcggaatggaaatgggcgtctaacgttaaatctaacgacgaagcgcagatcgttctggcggcgaccggtgacgttccgacccaggaaatcatggcggcggcggacaaactggacgcgatgggtatcaaattcaaagttgttaacgttgttgacctggttaaactgcagtctgcgaaagaaaacaacgaagcgctgtctgacgaagagttcgcggaactgttcaccgaagacaaaccggttctgttcgcgtaccactcttacgcgcgtgacgttcgtggtctgatctacgaccgtccgaaccacgacaacttcaacgttcacggttacgaagaacagggttctaccaccaccccgtacgacatggttcgtgttaacaacatcgaccgttacgaactgcaggcggaagcgctgcgtatgatcgacgcggacaaatacgcggacaaaatcaacgaactggaagcgttccgtcaggaagcgttccagttcgcggttgacaacggttacgaccacccggactacaccgactgggtttactctggtgttaacaccaacaaacagggtgcgatctctgcgaccgcggcgaccgcgggtgacaacgaatga

SEQ ID NO.3转氨酶基因spuC：

atgagcgtcaacaacccgcaaacccgtgaatggcaaaccctgagcggggagcatcacctcgcacctttcagtgactacaagcagctgaaggagaaggggccgcgcatcatcaccaaggcccagggtgtgcatttgtgggatagcgaggggcacaagatcctcgacggcatggccggtctatggtgcgtggcggtcggctacggacgtgaagagctggtgcaggcggcggaaaaacagatgcgcgagctgccgtactacaacctgttcttccagaccgctcacccgcctgcgctcgagctggccaaggcgatcaccgacgtggcgccgaaaggtatgacccatgtgttcttcaccggctccggctccgaaggcaacgacactgtgctgcgcatggtgcgtcactactgggcgctgaagggcaaaccgcacaagcagaccatcatcggccgcatcaacggttaccacggctccaccttcgccggtgcatgcctgggcggtatgagcggcatgcacgagcagggtggcctgccgatcccgggcatcgtgcacatccctcagccgtactggttcggcgagggaggcgacatgacccctgacgaattcggtgtctgggccgccgagcagttggagaagaagatcctcgaagtcggcgaagacaacgtcgcggccttcatcgccgagccgatccagggcgctggtggcgtgatcatcccgccggaaacctactggccgaaggtgaaggagatcctcgccaggtacgacatcctgttcgtcgccgacgaggtgatctgcggcttcggccgtaccggcgagtggttcggctcggactactacgacctcaagcccgacctgatgaccatcgcgaaaggcctgacctccggttacatccccatgggcggtgtgatcgtgcgtgacaccgtggccaaggtgatcagcgaaggcggcgacttcaaccacggtttcacctactccggccacccggtggcggccgcggtgggcctggaaaacctgcgcattctgcgtgacgagaaaattgtcgagaaggcgcgcacggaagcggcaccgtatttgcaaaagcgtttgcgcgagctgcaagaccatccactggtgggtgaagtgcgcggcctgggcatgctgggagcgatcgagctggtcaaggacaaggcaacccgcagccgttacgagggcaagggcgttggcatgatctgtcgcaccttctgcttcgagaacggcctgatcatgcgtgcggtgggtgacaccatgatcatcgcgccgccgctggtaatcagccatgcggagatcgacgaactggtggaaaaggcgcgcaagtgcctggacctgacccttgaggcgattcaataa

SEQ ID NO.4乙醛脱氢酶基因eutE：

atgaatcaacaggatattgaacaggtggtgaaagcggtactgctgaaaatgcaaagcagtgacacgccgtccgccgccgttcatgagatgggcgttttcgcgtccctggatgacgccgttgcggcagccaaagtcgcccagcaagggttaaaaagcgtggcaatgcgccagttagccattgctgccattcgtgaagcaggcgaaaaacacgccagagatttagcggaacttgccgtcagtgaaaccggcatggggcgcgttgaagataaatttgcaaaaaacgtcgctcaggcgcgcggcacaccaggcgttgagtgcctctctccgcaagtgctgactggcgacaacggcctgaccctaattgaaaacgcaccctggggcgtggtggcttcggtgacgccttccactaacccggcggcaaccgtaattaacaacgccatcagcctgattgccgcgggcaacagcgtcatttttgccccgcatccggcggcgaaaaaagtctcccagcgggcgattacgctgctcaaccaggcgattgttgccgcaggtgggccggaaaacttactggttactgtggcaaatccggatatcgaaaccgcgcaacgcttgttcaagtttccgggtatcggcctgctggtggtaaccggcggcgaagcggtagtagaagcggcgcgtaaacacaccaataaacgtctgattgccgcaggcgctggcaacccgccggtagtggtggatgaaaccgccgacctcgcccgtgccgctcagtccatcgtcaaaggcgcttctttcgataacaacatcatttgtgccgacgaaaaggtactgattgttgttgatagcgtagccgatgaactgatgcgtctgatggaaggccagcacgcggtgaaactgaccgcagaacaggcgcagcagctgcaaccggtgttgctgaaaaatatcgacgagcgcggaaaaggcaccgtcagccgtgactgggttggtcgcgacgcaggcaaaatcgcggcggcaatcggccttaaagttccgcaagaaacgcgcctgctgtttgtggaaaccaccgcagaacatccgtttgccgtgactgaactgatgatgccggtgttgcccgtcgtgcgcgtcgccaacgtggcggatgccattgcgctagcggtgaaactggaaggcggttgccaccacacggcggcaatgcactcgcgcaacatcgaaaacatgaaccagatggcgaatgctattgataccagcattttcgttaagaacggaccgtgcattgccgggctggggctgggcggggaaggctggaccaccatgaccatcaccacgccaaccggtgaaggggtaaccagcgcgcgtacgtttgtccgtctgcgtcgctgtgtattagtcgatgcgtttcgcattgtttaa

SEQ ID NO.5丙氨酸脱氢酶基因alD：

gtgtacattgaaactggagcaggcttaggatcaagctttacggatgctgattatattgcagctggtgctcatattgtgaatactgctaaggaagcttggtcacaagagatgattatgaaggtgaaagagcctgtagcttctgagtataattacttttatgaaggtcaaatcctattcacttacttacacttagcgccagaagttgaattgactcaggcacttttaaataaaaaagttgtagggattgcctacgaaaccgttcaattagcaaatggttcactaccgttattaacaccaatgagtgaagtagcaggtaaaatggctacacaaattggtgcacagttcttagagagaaatcatgctggtaaagggattttacttggcggtgtatcaggtgtacaacgcggtaaagtgacagtcatcggtggtggtatcgcgggaacgaacgctgcgaaaatcgctgttggcatgggagcagacgtaacagttatcgatttaagtcctgagcgtttacgccaattagaagatatgtttggccgtgatgttcaaactttgatttctaatccttataatattgcagaatctgtgaaaacttccgatttagtaattggtgccgtgttaattccaggcgcaaaagcaccgaagcttgtgtctgaagaaatgattcaatcaatgcaagctggctctgtagtagtggatatcgctattgaccaaggtggtatttttgcttcttcagatcgtgtcacaacacatgatgatccaacttacgtaaaacacggcgttgtccattatgcagttgcgaatatgccgggagctgtaccacgtacatcaacaattgctttaacaaataatacaattccttacgcacttcaaattgcaaataaaggctataaacaagcttgcctagacaatgctgcactaaaaaaaggtgtgaatacattagatggacaactagtatataaagctgtagcagattcacaaggaattccatatgtcaatgtggatgagcttattcaataa

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas(Unknown)

<400> 1

atgaccgatc tggccgaatt tgcccgcgaa aaaggcgtga aatattttat ggtgagctat 60

accgatttag tgggcgccca gcgcgcaaaa ctggttccga cctacatgat caacaacgtt 120

gtgagcggcg gcgccggttt tgccggcttt gctggtggct ttgttttaac cccggcacat 180

ccggatatgt taggtatgcc ggatgccgat accgttatcc aactgccgtg gaaaccggaa 240

gttgcatggg tggcagccaa cccggcaatg tatgatagcc cgctgccgca agctccgcgt 300

aatgtgctgc gtaatgtgat tgcagagatg gaaaaggaag gtttacgcat caaaaccggc 360

gttgaaccgg agttcttctt tctgactccg gaaggcgatc gtattgccga tacccgcgat 420

accgccgcca aaccgtgcta cgatcagcaa gctattatgc gtcgttacga tgtgatcagc 480

gaggtgagcg actacatgat tgaactgggc tgggaaccgt atcagagtga ccatgaagac 540

gccaacggtc agttcgagat gaactggaag tatgatgatt ctttagcaac cgccgataag 600

ctggcctttt ttaaatttat gatgaaaagc gttgccgaaa agcatggtct gcgcgtgacc 660

ttcatgccga aaccgttctt agagctgacc ggtagcggca tgcatgccca cattagcggc 720

tggagtctgg atggcaaaac caacgccttc tacgatggca acgatgagct gggtctgagc 780

gaagtgggtc accattttct gggcggcatt atgaagcatg ccagcgcact ggccgccatt 840

accaatccga ccatcaatag ctataaacgc attaacgcac cgcgtagcag tagcggtgca 900

acttgggccc cgaatagcgt gacttggagc ggcgacaacc gcacccatct ggtgcgtgtt 960

ccgggcaagg gtcgtattga actgcgttta ccggatggtg ccagcaaccc gtatctgtta 1020

cacgccgtga tcatggccgc tggtctggat ggtattcgcc acaagtgtga tccgggcaag 1080

cgtctggaca ttgatatgta cgccgacggc catatggtga aagatgcccc gaagctgccg 1140

ctgaatttac tggatgccat tcgtgccttt gatcagaaca ccgagctgaa agccgcttta 1200

ggtgaagaat ttagcgccag cttcatcgag atgaaaatga aagagtggaa tgcctacgca 1260

agccatctga cccagtggga acgcgatcac actttagata tttaa 1305

<210> 2

<211> 2478

<212> DNA

<213> 磷酸解酮酶基因xfp(Unknown)

<400> 2

atgacctctc cggttatcgg taccccgtgg aaaaaactga acgcgccggt ttctgaagaa 60

gcgatcgaag gtgttgacaa atactggcgt gcggcgaact acctgtctat cggtcagatc 120

tacctgcgtt ctaacccgct gatgaaagaa ccgttcaccc gtgaagacgt tagacaccgt 180

ctggttggtc actggggtac caccccgggt ctgaacttcc tgatcggtca catcaaccgt 240

ctgatcgcgg accaccagca gaacaccgtt atcatcatgg gtccgggtca cggtggtccg 300

gcgggtaccg cgcagtctta cctggacggt acctacaccg aatacttccc gaacatcacc 360

aaagacgaag cgggtctgca gaaattcttc cgtcagttct cttacccggg tggtatcccg 420

tctcactacg cgccggaaac cccgggttct atccacgaag gtggtgaact gggttacgcg 480

ctgtctcacg cgtacggtgc ggttatgaac aacccgtctc tgttcgttcc ggcgatcgtt 540

ggtgacggtg aagcggaaac cggtccgctg gcgaccggtt ggcagtctaa caaactgatc 600

aacccgcgta ccgacggtat cgttctgccg atcctgcacc tgaacggtta caaaatcgcg 660

aacccgacca tcctgtctcg tatctctgac gaagaactgc acgagttctt ccacggtatg 720

ggttacgaac cgtacgagtt cgttgcgggt ttcgacaacg aagaccacct gtctatccac 780

cgtcgtttcg cggaactgtt cgaaaccgtt ttcgacgaaa tctgcgacat caaagcggcg 840

gcgcagaccg acgacatgac ccgtccgttc tacccgatga tcatcttccg taccccgaaa 900

ggttggacct gcccgaaatt catcgacggt aaaaaaaccg aaggttcttg gcgttctcac 960

caggttccgc tggcgtctgc gcgtgacacc gaagcgcact tcgaagttct gaaaaactgg 1020

ctggaatctt acaaaccgga aaaactgttc gacgaaaacg gtgcggttaa accggaagtt 1080

accgcgttca tgccgaccgg tgaactgcgt atcggtgaaa acccgaacgc gaacggtggt 1140

cgtatccgtg aagaactgaa actgccgaaa ctggaagact acgaagttaa agaagttgcg 1200

gaatacggtc acggttgggg tcagctggaa gcgacccgtc gtctgggtgt ttacacccgt 1260

gacatcatca aaaacaaccc ggactctttc cgtatcttcg gtccggacga aaccgcgtct 1320

aaccgtctgc aggcggcgta cgacgttacc aacaaacagt gggacgcggg ttacctgtct 1380

gcgcaggttg acgaacacat ggcggttacc ggtcaggtta ccgaacagct gtctgaacac 1440

cagatggaag gtttcctgga aggttacctg ctgaccggtc gtcacggtat ctggtcttct 1500

tacgaatctt tcgttcacgt tatcgactct atgctgaacc agcacgcgaa atggctggaa 1560

gcgaccgttc gtgaaatccc gtggcgtaaa ccgatctctt ctatgaacct gctggtttct 1620

tctcacgttt ggcgtcagga ccacaacggt ttctctcacc aggacccggg tgttacctct 1680

gttctgctga acaaatgctt caacaacgac cacgttatcg gtatctactt cccggttgac 1740

tctaacatgc tgctggcggt tgcggaaaaa tgctacaaat ctaccaacaa aatcaacgcg 1800

atcatcgcgg gtaaacagcc ggcggcgacc tggctgaccc tggacgaagc gcgtgcggaa 1860

ctggaaaaag gtgcggcgga atggaaatgg gcgtctaacg ttaaatctaa cgacgaagcg 1920

cagatcgttc tggcggcgac cggtgacgtt ccgacccagg aaatcatggc ggcggcggac 1980

aaactggacg cgatgggtat caaattcaaa gttgttaacg ttgttgacct ggttaaactg 2040

cagtctgcga aagaaaacaa cgaagcgctg tctgacgaag agttcgcgga actgttcacc 2100

gaagacaaac cggttctgtt cgcgtaccac tcttacgcgc gtgacgttcg tggtctgatc 2160

tacgaccgtc cgaaccacga caacttcaac gttcacggtt acgaagaaca gggttctacc 2220

accaccccgt acgacatggt tcgtgttaac aacatcgacc gttacgaact gcaggcggaa 2280

gcgctgcgta tgatcgacgc ggacaaatac gcggacaaaa tcaacgaact ggaagcgttc 2340

cgtcaggaag cgttccagtt cgcggttgac aacggttacg accacccgga ctacaccgac 2400

tgggtttact ctggtgttaa caccaacaaa cagggtgcga tctctgcgac cgcggcgacc 2460

gcgggtgaca acgaatga 2478

<210> 3

<211> 1362

<212> DNA

<213> 转氨酶基因spuC(Unknown)

<400> 3

atgagcgtca acaacccgca aacccgtgaa tggcaaaccc tgagcgggga gcatcacctc 60

gcacctttca gtgactacaa gcagctgaag gagaaggggc cgcgcatcat caccaaggcc 120

cagggtgtgc atttgtggga tagcgagggg cacaagatcc tcgacggcat ggccggtcta 180

tggtgcgtgg cggtcggcta cggacgtgaa gagctggtgc aggcggcgga aaaacagatg 240

cgcgagctgc cgtactacaa cctgttcttc cagaccgctc acccgcctgc gctcgagctg 300

gccaaggcga tcaccgacgt ggcgccgaaa ggtatgaccc atgtgttctt caccggctcc 360

ggctccgaag gcaacgacac tgtgctgcgc atggtgcgtc actactgggc gctgaagggc 420

aaaccgcaca agcagaccat catcggccgc atcaacggtt accacggctc caccttcgcc 480

ggtgcatgcc tgggcggtat gagcggcatg cacgagcagg gtggcctgcc gatcccgggc 540

atcgtgcaca tccctcagcc gtactggttc ggcgagggag gcgacatgac ccctgacgaa 600

ttcggtgtct gggccgccga gcagttggag aagaagatcc tcgaagtcgg cgaagacaac 660

gtcgcggcct tcatcgccga gccgatccag ggcgctggtg gcgtgatcat cccgccggaa 720

acctactggc cgaaggtgaa ggagatcctc gccaggtacg acatcctgtt cgtcgccgac 780

gaggtgatct gcggcttcgg ccgtaccggc gagtggttcg gctcggacta ctacgacctc 840

aagcccgacc tgatgaccat cgcgaaaggc ctgacctccg gttacatccc catgggcggt 900

gtgatcgtgc gtgacaccgt ggccaaggtg atcagcgaag gcggcgactt caaccacggt 960

ttcacctact ccggccaccc ggtggcggcc gcggtgggcc tggaaaacct gcgcattctg 1020

cgtgacgaga aaattgtcga gaaggcgcgc acggaagcgg caccgtattt gcaaaagcgt 1080

ttgcgcgagc tgcaagacca tccactggtg ggtgaagtgc gcggcctggg catgctggga 1140

gcgatcgagc tggtcaagga caaggcaacc cgcagccgtt acgagggcaa gggcgttggc 1200

atgatctgtc gcaccttctg cttcgagaac ggcctgatca tgcgtgcggt gggtgacacc 1260

atgatcatcg cgccgccgct ggtaatcagc catgcggaga tcgacgaact ggtggaaaag 1320

gcgcgcaagt gcctggacct gacccttgag gcgattcaat aa 1362

<210> 4

<211> 1404

<212> DNA

<213> 乙醛脱氢酶基因eutE(Unknown)

<400> 4

atgaatcaac aggatattga acaggtggtg aaagcggtac tgctgaaaat gcaaagcagt 60

gacacgccgt ccgccgccgt tcatgagatg ggcgttttcg cgtccctgga tgacgccgtt 120

gcggcagcca aagtcgccca gcaagggtta aaaagcgtgg caatgcgcca gttagccatt 180

gctgccattc gtgaagcagg cgaaaaacac gccagagatt tagcggaact tgccgtcagt 240

gaaaccggca tggggcgcgt tgaagataaa tttgcaaaaa acgtcgctca ggcgcgcggc 300

acaccaggcg ttgagtgcct ctctccgcaa gtgctgactg gcgacaacgg cctgacccta 360

attgaaaacg caccctgggg cgtggtggct tcggtgacgc cttccactaa cccggcggca 420

accgtaatta acaacgccat cagcctgatt gccgcgggca acagcgtcat ttttgccccg 480

catccggcgg cgaaaaaagt ctcccagcgg gcgattacgc tgctcaacca ggcgattgtt 540

gccgcaggtg ggccggaaaa cttactggtt actgtggcaa atccggatat cgaaaccgcg 600

caacgcttgt tcaagtttcc gggtatcggc ctgctggtgg taaccggcgg cgaagcggta 660

gtagaagcgg cgcgtaaaca caccaataaa cgtctgattg ccgcaggcgc tggcaacccg 720

ccggtagtgg tggatgaaac cgccgacctc gcccgtgccg ctcagtccat cgtcaaaggc 780

gcttctttcg ataacaacat catttgtgcc gacgaaaagg tactgattgt tgttgatagc 840

gtagccgatg aactgatgcg tctgatggaa ggccagcacg cggtgaaact gaccgcagaa 900

caggcgcagc agctgcaacc ggtgttgctg aaaaatatcg acgagcgcgg aaaaggcacc 960

gtcagccgtg actgggttgg tcgcgacgca ggcaaaatcg cggcggcaat cggccttaaa 1020

gttccgcaag aaacgcgcct gctgtttgtg gaaaccaccg cagaacatcc gtttgccgtg 1080

actgaactga tgatgccggt gttgcccgtc gtgcgcgtcg ccaacgtggc ggatgccatt 1140

gcgctagcgg tgaaactgga aggcggttgc caccacacgg cggcaatgca ctcgcgcaac 1200

atcgaaaaca tgaaccagat ggcgaatgct attgatacca gcattttcgt taagaacgga 1260

ccgtgcattg ccgggctggg gctgggcggg gaaggctgga ccaccatgac catcaccacg 1320

ccaaccggtg aaggggtaac cagcgcgcgt acgtttgtcc gtctgcgtcg ctgtgtatta 1380

gtcgatgcgt ttcgcattgt ttaa 1404

<210> 5

<211> 1020

<212> DNA

<213> 丙氨酸脱氢酶基因alD(Unknown)

<400> 5

gtgtacattg aaactggagc aggcttagga tcaagcttta cggatgctga ttatattgca 60

gctggtgctc atattgtgaa tactgctaag gaagcttggt cacaagagat gattatgaag 120

gtgaaagagc ctgtagcttc tgagtataat tacttttatg aaggtcaaat cctattcact 180

tacttacact tagcgccaga agttgaattg actcaggcac ttttaaataa aaaagttgta 240

gggattgcct acgaaaccgt tcaattagca aatggttcac taccgttatt aacaccaatg 300

agtgaagtag caggtaaaat ggctacacaa attggtgcac agttcttaga gagaaatcat 360

gctggtaaag ggattttact tggcggtgta tcaggtgtac aacgcggtaa agtgacagtc 420

atcggtggtg gtatcgcggg aacgaacgct gcgaaaatcg ctgttggcat gggagcagac 480

gtaacagtta tcgatttaag tcctgagcgt ttacgccaat tagaagatat gtttggccgt 540

gatgttcaaa ctttgatttc taatccttat aatattgcag aatctgtgaa aacttccgat 600

ttagtaattg gtgccgtgtt aattccaggc gcaaaagcac cgaagcttgt gtctgaagaa 660

atgattcaat caatgcaagc tggctctgta gtagtggata tcgctattga ccaaggtggt 720

atttttgctt cttcagatcg tgtcacaaca catgatgatc caacttacgt aaaacacggc 780

gttgtccatt atgcagttgc gaatatgccg ggagctgtac cacgtacatc aacaattgct 840

ttaacaaata atacaattcc ttacgcactt caaattgcaa ataaaggcta taaacaagct 900

tgcctagaca atgctgcact aaaaaaaggt gtgaatacat tagatggaca actagtatat 960

aaagctgtag cagattcaca aggaattcca tatgtcaatg tggatgagct tattcaataa 1020

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> yeeP靶序列(Unknown)

<400> 6

actgcaggac gagctgcgca cgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> ycgH靶序列(Unknown)

<400> 7

agtgtcagag gctatagcgc agg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> ycnI靶序列(Unknown)

<400> 8

gaacgaaaat ggtgttgtac tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> fhiA靶序列(Unknown)

<400> 9

tactttcatg gctggcgatc tgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> ygaY靶序列(Unknown)

<400> 10

ctcaactacc cacagttgtt ggg 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> pGRB-Test-S(Unknown)

<400> 11

gtctcatgag cggatacata tttg 24

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> pGRB-Test-A(Unknown)

<400> 12

atgagaaagc gccacgct 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> UP-yeeP-S(Unknown)

<400> 13

gctggagcgt gttgaggtag t 21

<210> 14

<211> 67

<212> DNA

<213> UP-yeeP-A(Unknown)

<400> 14

taaagttaaa caaaattatt tctagaccct atagtgagtc gtattactga ccagcgtatc 60

cagttcc 67

<210> 15

<211> 53

<212> DNA

<213> DN-yeeP-S(Unknown)

<400> 15

tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgagcgtc tgtattgcct ctg 53

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> DN-yeeP-A(Unknown)

<400> 16

gttctgttgt tccctgaatg tctt 24

<210> 17

<211> 65

<212> DNA

<213> gmas-S(Unknown)

<400> 17

tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatga ccgatctggc 60

cgaat 65

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> gmas-A(Unknown)

<400> 18

agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttaaat atctaaagtg tgatcgcgtt 60

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> gRNA-yeeP-S(Unknown)

<400> 19

actgcaggac gagctgcgca cgg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> gRNA-yeeP-A(Unknown)

<400> 20

ccgtgcgcag ctcgtcctgc agt 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> UP-ycgH-S(Unknown)

<400> 21

taaactcgtc agcggcacaa 20

<210> 22

<211> 67

<212> DNA

<213> UP-ycgH-A(Unknown)

<400> 22

taaagttaaa caaaattatt tctagaccct atagtgagtc gtattagggt aggcgtttct 60

gttgatt 67

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> DN-ycgH-S(Unknown)

<400> 23

tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgccctga ataaatcctt tggtct 56

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> DN-ycgH-A(Unknown)

<400> 24

gattcaggtt gccatttacg c 21

<210> 25

<211> 69

<212> DNA

<213> xfp-S(Unknown)

<400> 25

tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatgg cgagtcctgt 60

tactggcac 69

<210> 26

<211> 56

<212> DNA

<213> xfp-A(Unknown)

<400> 26

agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagtcactc gttatcgcca gcggtt 56

<210> 27

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ycgH-S(Unknown)

<400> 27

agtcctaggt ataatactag tagtgtcaga ggctatagcg cgttttagag ctagaa 56

<210> 28

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ycgH-A(Unknown)

<400> 28

ttctagctct aaaacgcgct atagcctctg acactactag tattatacct aggact 56

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> UP-ycnI-S(Unknown)

<400> 29

gggcaactct tcgggttaga t 21

<210> 30

<211> 80

<212> DNA

<213> UP-ycnI-A(Unknown)

<400> 30

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaatgta 60

ggcgttaaag caaagatgaa 80

<210> 31

<211> 89

<212> DNA

<213> DN-ycnI-S(Unknown)

<400> 31

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatttgggtg ttagatgtaa aaatgaatg 89

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> DN-ycnI-A(Unknown)

<400> 32

gcaatgacgt ctttatcatc tgaag 25

<210> 33

<211> 79

<212> DNA

<213> spuC-S(Unknown)

<400> 33

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgagcgtca acaacccgc 79

<210> 34

<211> 84

<212> DNA

<213> spuC-A(Unknown)

<400> 34

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttattga atcgcctcaa gggt 84

<210> 35

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ycnI-S(Unknown)

<400> 35

agtcctaggt ataatactag tgaacgaaaa tggtgttgta cgttttagag ctagaa 56

<210> 36

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ycnI-A(Unknown)

<400> 36

ttctagctct aaaacgtaca acaccatttt cgttcactag tattatacct aggact 56

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> UP-fhiA-S(Unknown)

<400> 37

gggcaatggt gttgatactg g 21

<210> 38

<211> 76

<212> DNA

<213> UP-fhiA-A(Unknown)

<400> 38

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaatcg 60

ccagaatcat catccc 76

<210> 39

<211> 83

<212> DNA

<213> DN-fhiA-S(Unknown)

<400> 39

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatcaagcag gagctgacgg tgt 83

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> DN-fhiA-A(Unknown)

<400> 40

tgcaccaatg ctggatactt aca 23

<210> 41

<211> 85

<212> DNA

<213> eutE-S(Unknown)

<400> 41

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgaatcaac aggatattga acagg 85

<210> 42

<211> 84

<212> DNA

<213> eutE-A(Unknown)

<400> 42

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttaaaca atgcgaaacg catc 84

<210> 43

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-fhiA-S(Unknown)

<400> 43

agtcctaggt ataatactag tgtaggtttc gctggagggc agttttagag ctagaa 56

<210> 44

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-fhiA-A(Unknown)

<400> 44

ttctagctct aaaactgccc tccagcgaaa cctacactag tattatacct aggact 56

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> UP-ygaY-S(Unknown)

<400> 45

cctacaaacc acatcgcaca t 21

<210> 46

<211> 74

<212> DNA

<213> UP-ygaY-A(Unknown)

<400> 46

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacacc 60

gaagcaaccc aaaa 74

<210> 47

<211> 86

<212> DNA

<213> DN-ygaY-S(Unknown)

<400> 47

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatttttaac tacagcgatg gtgtca 86

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> DN-ygaY-A(Unknown)

<400> 48

ggagtagggc tttccataga gtg 23

<210> 49

<211> 85

<212> DNA

<213> alD-S(Unknown)

<400> 49

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgaagattg gtattccaaa ggaaa 85

<210> 50

<211> 90

<212> DNA

<213> alD-A(Unknown)

<400> 50

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttattgg attaattcat ccacattcac 90

<210> 51

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ygaY-S(Unknown)

<400> 51

agtcctaggt ataatactag taaacggaac ccaacaactg tgttttagag ctagaa 56

<210> 52

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ygaY-A(Unknown)

<400> 52

ttctagctct aaaacacagt tgttgggttc cgtttactag tattatacct aggact 56

Claims

1.一种利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌株含有用于茶氨酸合成的γ-谷氨酰甲胺合成酶和编码茶氨酸从头合成途径酶的基因，所述茶氨酸从头合成途径酶包括磷酸解酮酶、转氨酶、乙醛脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌株以大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌为出发菌株；

或者，编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因来源于噬氨副球菌Paracoccus aminovorans；

3.根据权利要求2所述的利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌株以E.coli ATCC27325或者C.glutamicum ATCC13032为出发菌株；

所述编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因由P_T7启动子启动；

4.根据权利要求1至3任一项所述的利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌株含有gmas、xfp、spuC、eutE和alD基因，其基因序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5。

5.根据权利要求4所述的利用葡萄糖从头发酵生产L-茶氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述gmas、xfp、spuC、eutE和alD基因为野生型基因，或者为编码相应蛋白的突变体或者经人工修饰的基因，包括一个或多个位点的取代、缺失或者插入一个或多个氨基酸残基，该突变体或经人工修饰的基因所编码的蛋白具有相应的活性，没有功能缺陷。

6.如权利要求4或5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(2)整合编码磷酸解酮酶的基因xfp，并由P_T7启动子启动；

(3)整合编码转氨酶的基因spuC，并由P_trc启动子启动；

(4)整合编码乙醛脱氢酶的基因eutE，并由P_trc启动子启动；

(5)整合编码丙氨酸脱氢酶的基因alD，并由P_trc启动子启动；

对上述构建方法中的步骤(1)至(5)的操作顺序并不限制，能够以可实施的任何顺序进行。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术进行基因整合；

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述pGRB质粒的构建包括：设计靶序列，制备包含靶序列的DNA片段，将包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组；

9.如权利要求1至5任一项所述的基因工程菌在发酵生产茶氨酸方面中的应用。

10.利用如权利要求1至5任一项所述的基因工程菌的发酵生产茶氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将基因工程菌株与发酵培养基接触，进行发酵培养，制备得到茶氨酸；

所述发酵培养包括摇瓶发酵或者发酵罐发酵；

摇瓶发酵时，基因工程菌株的接种量为15-20％，发酵条件为37℃，220r/min振荡培养，发酵过程中维持pH在6.7-7.2，通过补加氨水调节pH，补加葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵26-30h，即得；

或者，发酵罐发酵时的发酵培养基组成为：葡萄糖10-40g/L，酵母粉2-8g/L，柠檬酸0.2-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-3.2g/L，磷酸氢二钾0.5-2.4g/L，硫酸镁0.2-1.2g/L，蛋氨酸0.1-1.0g/L，硫酸亚铁0.2-20mg/L，硫酸锰1-10mg/L，玉米浆2-20ml/L，其余为水，pH 7.0-7.2。