CN114832041A - 具有护肝效果的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有护肝效果的组合物，其含有320～520μg/mL的橙皮苷以及160～230μg/mL的橙皮素。本发明还公开了具有护肝效果的组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)、将柠檬压榨成柠檬汁；(2)、将步骤(1)得到的柠檬汁进行发酵，完成后即得到具有护肝效果的组合物。本发明公开的组合物具有良好的护肝效果。

Description

具有护肝效果的组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种组合物及其制备方法，特别涉及一种具有护肝效 果的组合物及其制备方法。

背景技术

橙皮苷为柑橘类水果中的一种黄酮类化合物，其主要储存于柑橘 类水果的果皮中。

近年来有不少研究指出服用橙皮苷萃取物对于人体具有降血压、 降胆固醇、护肝和预防动脉硬化的效果，但却未见有人采用发酵的方 式使柑橘类水果中的橙皮苷含量增加，并使其功效不亚于橙皮苷萃取 物。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种具有护肝效果的组合物及其制 备方法。

技术方案：具有护肝效果的组合物，其系含有320～520μg/mL 的橙皮苷以及160～230μg/mL的橙皮素。

具有护肝效果的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将柠檬压榨成柠檬汁；

(2)、将步骤(1)得到的柠檬汁进行发酵，完成后即得到具有 护肝效果的组合物。

进一步地，步骤(1)中该柠檬的压榨是将整颗柠檬连同果皮和 种子压榨成柠檬汁。

进一步地，步骤(2)中直接将益生菌加入步骤(1)得到的柠檬 汁内进行发酵，且发酵的过程中需将温度控制在22℃～30℃之间并 持续搅拌10到22天，而在搅拌的过程中会不间断的透过搅拌设备将 空气打入柠檬汁内，使柠檬汁、益生菌以及空气三者能充分的混合。

更进一步地，该益生菌由胚芽乳酸杆菌以及季也蒙有孢汉逊酵母 菌以混合比例介于(2～4):(3～5)之间。

更进一步地，该柠檬汁和益生菌的混合比例介于(1～2):(0.03～ 0.3)之间。

附图说明

图1A-图1F：大鼠肝脏以苏木素-伊红染色(H.E.Stain)的组织 图；

图2A-图2F：大鼠肝脏以天狼星红染色(Sirius Red stain)的组 织图；

图3：本发明的橙皮苷检测图谱；

图4：橙皮素的标准图谱；

图5：本发明稀释10倍后的橙皮素检测图谱。

具体实施方式：

为了让本发明的目的、功效、特征及结构能够有更为详尽的了解， 下面借助较佳实施例并配合图式说明如后。

在一个实施例中，具有护肝效果的组合物，其含有橙皮苷和橙皮 素，其中：

橙皮苷的含量为320μg/mL；

橙皮素的含量为160μg/mL。

另一个实施例中，具有护肝效果的组合物，其含有橙皮苷和橙皮 素，其中：

橙皮苷的含量为520μg/mL；

橙皮素的含量为230μg/mL。

在又一个实施例中，具有护肝效果的组合物，其含有橙皮苷和橙 皮素，其中：

橙皮苷的含量为402μg/mL；

橙皮素的含量为205μg/mL。

在一个实施例中，具有护肝效果的组合物的制备方法，包括以下 步骤：

(1)、将柠檬压榨(裂解)成柠檬汁；

(2)、再将柠檬汁进行发酵，最后得到具有护肝效果的组合物。

进一步地，步骤(1)中该柠檬的压榨(裂解)是将整颗柠檬连 同果皮和种子压榨(裂解成柠檬汁)。

进一步地，步骤(2)中将益生菌加入步骤(1)得到的柠檬汁内 进行发酵，且发酵的过程中需将温度控制在22℃并持续搅拌22天， 而在搅拌的过程中会不间断的透过搅拌设备将空气打入柠檬汁内，使 柠檬汁、益生菌以及空气三者能充分的混合。

其中，该益生菌系由胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum) 以及季也蒙有孢汉逊酵母菌(Hanseniaspora guilliermondii)以混 合比例为2:3所组成。

该柠檬汁和益生菌的混合比例为1:0.03，该胚芽乳酸杆菌 (Lactobacillusplantarum)寄存于德国菌种中心，寄存编号为DSM 32004，该季蒙也有孢汉逊酵母菌(Hanseniaspora guilliermondii) 寄存于德国菌种中心，寄存编号为DSM 32005。

在另一个实施例中，具有护肝效果的组合物的制备方法，包括以 下步骤：

(1)、将柠檬压榨(裂解)成柠檬汁；

(2)、再将柠檬汁进行发酵，最后得到具有护肝效果的组合物。

进一步地，步骤(1)中该柠檬的压榨(裂解)是将整颗柠檬连 同果皮和种子压榨(裂解成柠檬汁)。

进一步地，步骤(2)中将益生菌加入步骤(1)得到的柠檬汁内 进行发酵，且发酵的过程中需将温度控制在30℃并持续搅拌10天， 而在搅拌的过程中会不间断的透过搅拌设备将空气打入柠檬汁内，使 柠檬汁、益生菌以及空气三者能充分的混合。

其中，该益生菌系由胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum) 以及季也蒙有孢汉逊酵母菌(Hanseniaspora guilliermondii)以混 合比例为4:5所组成。

该柠檬汁和益生菌的混合比例为2:0.3之间，该胚芽乳酸杆菌 (Lactobacillusplantarum)寄存于德国菌种中心，寄存编号为DSM 32004，该季蒙也有孢汉逊酵母菌(Hanseniaspora guilliermondii) 寄存于德国菌种中心，寄存编号为DSM 32005。

在又一个实施例中，具有护肝效果的组合物的制备方法，包括以 下步骤：

(1)、将柠檬压榨(裂解)成柠檬汁；

(2)、再将柠檬汁进行发酵，最后得到具有护肝效果的组合物。

进一步地，步骤(1)中该柠檬的压榨(裂解)是将整颗柠檬连 同果皮和种子压榨(裂解成柠檬汁)。

进一步地，步骤(2)中将益生菌加入步骤(1)得到的柠檬汁内 进行发酵，且发酵的过程中需将温度控制在25℃并持续搅拌14天， 而在搅拌的过程中会不间断的透过搅拌设备将空气打入柠檬汁内，使 柠檬汁、益生菌以及空气三者能充分的混合。

其中，该益生菌系由胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum) 以及季也蒙有孢汉逊酵母菌(Hanseniaspora guilliermondii)以混 合比例为3:4所组成。

该柠檬汁和益生菌的混合比例为1.5:0.15，该胚芽乳酸杆菌 (Lactobacillusplantarum)寄存于德国菌种中心，寄存编号为DSM 32004，该季蒙也有孢汉逊酵母菌(Hanseniaspora guilliermondi i) 寄存于德国菌种中心，寄存编号为DSM 32005。

本实施例以动物实验作验证，借此来证实服用本发明的组合物确 实具有护肝的功效，有关动物实验的相关方法以及检测结果如下所 示。

试验动物：选用来自乐斯科生物科技股份有限公司的雄性大鼠 (Wistar)。

饲育管理：实验用的大鼠饲养于某动物室，动物室的温度为22 ±2℃，并控制光照期为早上八点到晚上八点，黑暗期则为晚上八点 到翌日早上八点，光照期与黑暗期各十二小时，最后经一周适应期后 才开始试验。

饮食配方：大鼠的饲料使用进口饲料(Prolab RMH 2500)，饮用 水则经逆渗透高压灭菌处理。

试验设计：将大鼠分为控制组、负对照组、低剂量对照组、中剂 量对照组、高剂量对照组以及水飞蓟素(Silymarin)对照组，各对照 组于每周投予四氯化碳(CCl₄)溶液两次，投予的时间为早上8:00到 8:40之间，投予的量依照大鼠体重决定(每100g投予0.2mL四氯化 碳溶液)，并于四氯化碳(CCl₄)溶液投予的前一天将不同剂量的本发 明投予各对照组；

接着于四氯化碳(CCl₄)溶液投满一、三、六周时，将大鼠在异氟 醚(Isoflurane)麻醉下从尾动脉抽血，并于第八周将大鼠麻醉牺牲后 由腹动脉采血，并同时将大鼠的肝脏及脾脏取下，接着以冰冷生理食 盐水洗净并吸干水分后进行秤重，再根据体重算出相对重量，最后将 最大叶肝脏分成两部分，其中一部分浸泡于10％中性福尔马林溶液中 提供给病理切片使用，另外一部分则在秤重后于100℃的环境下完全 烘干，并用于测定胶原蛋白含量，而其余的肝脏则分装成四袋并储存 于-80℃的保存室中备用。

试验剂量的配制：本发明的成人建议剂量为一天50mL，再依照 人与大鼠间代谢换算比例6.2计算，低剂量对照组大鼠投予50/60× 6.2＝5.2mL/kg的本发明、中剂量对照组大鼠投予50/60×6.2×2＝10 mL/kg的本发明、高剂量对照组大鼠投予50/60×6.2×5＝26mL/kg 的本发明。

临床症状观察：试验期间每日进行临床观察，并记录大鼠是否有 异常临床症状或死亡，并每周定时量测大鼠体重变化。

血浆生化学检验：将取得的血液以4700rpm离心15分钟后取出 血浆，再使用市售检验试剂(Roche)以及血清生化自动分析仪(COBAS MIRA)测定，而第一、三、六周所取得的血液只进行丙胺酸转胺酶(ALT) 和天门冬胺酸转胺酶(AST)的检验，最后于第八周增加白蛋白 (albumin)的测定。

肝组织谷胱甘肽(glutathione)含量测定：依据希辛和希夫 (Hissin and Hilf)的方法，将0.5公克的肝脏组织加入5ml的1.15％ 氯化钾(KCL)溶液后，以均质机均质化后取1mL的均浆与1mL的三氯 乙酸(trichloroacetic acid)混合均匀，再以3000×G离心15分钟 后收集0.01mL的上清液，最后再加入0.18mL的磷酸-伸乙二胺四乙 酸(phosphate-EDTA)缓冲液以及新鲜配制的0.01mLσ-邻苯二甲醛 (σ-phthaldehyde)溶液混合均匀后，以420奈米的波长的荧光、激 发光波长350奈米进行侦测。

肝脏组织脂质过氧化(lipid peroxidation)的测定：依据大川 (Ohkawa)等人的方法，以1.15％氯化钾(KCL)溶液制备10％肝组织 均质液，经4000rpm、4℃离心5分钟。取上清液和硫巴比妥酸 (thiobarbituric acid)溶液加热反应，以正丁醇(n-butanol)、吡啶(pyridine)混合液(混合比例15:1)萃取，在532nm测吸光度，脂质 过氧化的程度以nmol丙二醛(malondialdehyde(MDA))/mg蛋白 (protein)表示之。

肝脏组织蛋白质含量测定：使用脂质过氧化测定的肝组织均质液 上清液，以市售蛋白质测定试剂Coomassie Blue(Kenlor Indus.Inc.； USA)呈色，于540nm测吸光值，并以牛血清白蛋白为标准品，而蛋白 质量以mg/g组织表示之。

肝脏组织胶原蛋白(hydroxyproline)含量及肝脏含水量的测定： 依照纽曼和洛根(1950)(Neuman and Logan(1950))的方法，将肝 脏干组织水解后加双氧水(H₂O₂)氧化，再以对-二甲基胺基苯甲醛 (p-dimethylaminobenzoaldehyde)呈色，于540nm测吸光值，胶原蛋 白(hydroxyproline)量以μg/g组织表示之。

肝脏组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧 化氢酶(catalase)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性测定：

SOD活性测定依据Xia et al.的方法，活性的测定使用市售SOD 活性检验试剂Ransod(RANDOX Lab.Ltd.UK)，SOD活性定义为抑制 2-(-碘苯基)-3-(4-硝基苯酚)-5-苯基四唑氯化物(2-(-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride)还原反应速率50％所需酵素的量为一个单位(U)，以U/mg 蛋白表示之。

过氧化氢酶(Catalase)活性测定依据埃比(Aebi)的方法，其 活性定义以K(一级反应的速率常数min-1)为一个单位(U)，以U/mg 蛋白表示之，K的计算方法为K＝(2.3/t2-t1)(logA1/A2)，其中A1 为t1＝0秒时的吸光值，A2为t2＝25秒时的吸光值。

GSH-Px活性测定使用市售GSH-Px活性检验试剂Ransel(RANDOX Lab.Ltd.UK)，GSH-Px活性定义为每分钟氧化1μmol NADPH所需 酵素的量为为一个单位(U)，肝组织的GSH-Px活性以mU/mg蛋白 表示之。

病理检验：肝脏组织经福尔马林固定后进行石腊包埋及切片制 作，并使用两种染色法，一种为一般的H.E.染色(苏木精和伊红染 色)(H.E.stain(Hematoxylin and eosinstain))，另一种为胶 原蛋白的特殊染色即天狼星红染色(Sirius red stain)，再依护肝功能评估办法将肝脏的损伤分为四个等级并加以评分。

在本实施例中在本次动物试验中，主要系探讨本发明对于保护肝 脏的功效，并将试验分为正常组(给予灭菌水)、负对照组(给予四氯 化碳以及灭菌水)、低剂量对照组(给予四氯化碳以及1倍相对人体剂 量的本发明)、中剂量对照组(给予四氯化碳及2倍相对人体剂量的本 发明)、高剂量对照组(给予四氯化碳以及5倍相对人体剂量的本发 明)、水飞蓟素对照组(给予四氯化碳以及200mg/kg市售水飞蓟素)， 且每组均为10只试验动物，经8周后进行血液、肝脏之相关检测， 而实验所得数据均以单尾变异数分析(one-wayanalysis of variance)，并进行邓肯多重差距检定(Duncan's multiple range test)，当p<0.05时表示组间具有显著性差异，其结果如下列所示：

首先，就各组大鼠的每周平均体重变化的纪录如下表(一)所示：

表(一)

表(一)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示，以英文字母 a及b表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计上差异 (p>0.05)。

由表(一)可看出大鼠投予四氯化碳后，负对照组于第一至第八周 平均体重较控制组，而低、中、高剂量以及水飞蓟素对照组的大鼠体 重与负对照组相比没有明显差异。

接着，就各组大鼠于第一、三、六、八周中血浆内丙胺酸转胺酶 (ALT)、天门冬胺酸转胺酶(AST)以及白蛋白(albumin)的纪录如下表 (二)至表(五)所示：

第一周	剂量	AST(U/L)	ALT(U/L)
				控制组	无	72.7±6.2<sup>a</sup>	44.4±4.1<sup>a</sup>
负对照组	无	329.0±98.6<sup>c</sup>	163.8±59.2<sup>c</sup>
				低剂量对照组	5(mL/kg)	184.2±71.5<sup>b</sup>	93.6±13.4<sup>b</sup>
中剂量对照组	10(mL/kg)	160.5±41.0<sup>b</sup>	83.8±24.9<sup>b</sup>
				高剂量对照组	26(mL/kg)	319.1±82.1<sup>c</sup>	158.3±46.2<sup>c</sup>
水飞蓟素对照组	200(mg/kg)	224.3±100.6<sup>b</sup>	111.6±67.2<sup>b</sup>

表(二)

表(三)

第六周	剂量	AST(U/L)	ALT(U/L)
				控制组	无	68.7±9.1<sup>a</sup>	44.2±4.0<sup>a</sup>
负对照组	无	2195.5±1348.6<sup>c</sup>	1793.3±878.6<sup>c</sup>
				低剂量对照组	5(mL/kg)	1270.5±442.1<sup>b</sup>	1055.7±274.9<sup>b</sup>
中剂量对照组	10(mL/kg)	897.3±306.8<sup>b</sup>	798.6±274.9<sup>b</sup>
				高剂量对照组	26(mL/kg)	1307.5±555.9<sup>b</sup>	1063.0±449.5<sup>b</sup>
水飞蓟素对照组	200(mg/kg)	1328.5±738.8<sup>b</sup>	1030.0±648.6<sup>b</sup>

表(四)

表(五)

表(二)至表(五)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示，以英 文字母a、b、c、d表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计 上差异(p>0.05)。

由表(二)至表(五)可看出大鼠在投予四氯化碳后，负对照组于第 一、三、六、八周血浆中的丙胺酸转胺酶(ALT)、天门冬胺酸转胺酶 (AST)值均显著高于控制组。

由表(二)可知，第一周的低剂量对照组、中剂量对照组及水飞蓟 素对照组血浆中的丙胺酸转胺酶(ALT)、天门冬胺酸转胺酶(AST)值均 显著低于负对照组，而高剂量对照组血浆中的丙胺酸转胺酶(ALT)、 天门冬胺酸转胺酶(AST)值则与负对照组并无明显差异。

由表(三)可知，第三周的低剂量对照组、中剂量对照组、高剂量 对照组及水飞蓟素对照组血浆中的天门冬胺酸转胺酶(AST)值显著低 于负对照组，而低剂量对照组及水飞蓟素对照组血浆中的丙胺酸转胺 酶(ALT)显著低于负对照组，但中剂量对照组、高剂量对照组血浆中 的丙胺酸转胺酶(ALT)与负对照组比较没有差异。

由表(四)、表(五)可知，低剂量对照组、中剂量对照组、高剂量 对照组及水飞蓟素对照组的大鼠血浆中丙胺酸转胺酶(ALT)、天门冬 胺酸转胺酶(AST)值均显著低于负对照组。

由表(五)可知，负对照组大鼠血浆中的白蛋白浓度显著低于控制 组，而低剂量对照组、中剂量对照组、高剂量对照组及水飞蓟素对照 组血浆中的白蛋白浓度高于负对照组。

接着，就各组大鼠肝脏和脾脏的纪录如下表(六)及(七)所示：

表(六)

表(七)

表(六)、表(七)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示，以英 文字母a、b、c、d表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计 上差异(p>0.05)。

由表(六)可知，负对照组的肝脏绝对重量及相对重量较控制组 高，而中剂量对照组、高剂量对照组及水飞蓟素对照组的肝脏绝对重 量及相对重量低于负对照组，另外低剂量对照组的肝脏绝对重量及相 对重量则和负对照组没有显著差异。

由表(六)可知，负对照组的肝脏含水量百分比高于控制组，而低 剂量对照组、中剂量对照组、高剂量对照组的肝脏含水量百分比显著 低于负对照组，但水飞蓟素对照组的肝脏含水量百分比和负对照组没 有差异。

由表(七)可知，负对照组的脾脏绝对重量及相对重量较控制组 高，而低量对照组、中剂量对照组、高剂量对照组及水飞蓟素对照组 的脾脏绝对重量及相对重量显著低于负对照组。

接续，就各组大鼠肝脏谷胱甘肽(glutathione)含量、脂质过氧 化程度的影响如下表(八)所示：

表(八)

表(八)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示，以英文字母a、 b、c表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计上差异(p>0.05)。

由表(八)可知，负对照组肝脏中的脏谷胱甘肽(glutathione)含 量减少，而低量对照组、中剂量对照组、高剂量对照组及水飞蓟素对 照组的脏谷胱甘肽(glutathione)含量高于负对照组，且其含量和控 制组没有明显差异。

由表(八)可知，负对照组肝脏中丙二醛(Malondialdehyde)的含 量增加，即代表脂质过氧化程度明显提升，而低量对照组、中剂量对 照组、高剂量对照组及水飞蓟素对照组的丙二醛(Malondialdehyde) 明显低于负对照组。

接续，就各组大鼠肝脏蛋白质和胶原蛋白(hydroxyproline)含量 的影响如下表(九)所示：

表(九)

表(九)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示，以英文字母a、 b、c表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计上差异(p>0.05)。

由表(九)可知，负对照组的肝脏蛋白质显著低于对照组，而高剂 量对照组的肝脏蛋白质含量高于负对照组，而低剂量对照组、中剂量 对照组及水飞蓟素对照组的肝脏蛋白质含量与负对照组比较没有差 异。

由表(九)可知，负对照组肝脏胶原蛋白(hydroxyproline)的含量 增加，而低剂量对照组、中剂量对照组、高剂量对照组及水飞蓟素对 照组的肝脏胶原蛋白(hydroxyproline)含量明显较负对照组低。

接续，就各组大鼠肝脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase)、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase,GSH-Px)活性的影响如下表(十)所示：

表(十)

表(十)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示，以英文字母a、 b、c表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计上差异(p>0.05)。

由表(十)可知，负对照组肝脏中的三种抗氧化酵素(超氧化物歧 化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)活性明显低于控制组，而 低剂量对照组、中剂量对照组、高剂量对照组及水飞蓟素对照组的超 氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(catalase)活性与负对照组比较没 有差异性，另外就甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的部分，低剂量对照 组、中剂量对照组、高剂量对照组的甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性与 负对照组比较没有差异，而水飞蓟素对照组的甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活性则高于负对照组。

再来，就各组大鼠肝脏组织的病理变化如下表(十一)、表(十二) 所示：

表(十一)

表(十二)

表(十一)、表(十二)中所有数据均以Mean±SD(n＝10-12)表示， 以英文字母a、b、c表示统计的结果，而相同字母表示组间不具统计 上差异(p>0.05)，另外，表(十一)、表(十二)中的(0)代表的是正常， (1)代表非常轻微，(2)代表轻微，(3)代表中度，(4)代表为严重。

由表(十一)、表(十二)再搭配图1A-图1F，1A-图1F中的肝脏 组织别对应控制组(图1A)、负对照组(图1B)、低剂量对照组(图1C)、 中剂量对照组(图1D)、高剂量对照组(图1E)及水飞蓟素对照组(图 1F)，因此从染色中可明显看出负对照组(图1B)肝脏组织空泡化和坏 死的情形，而低剂量对照组(图1C)、中剂量对照组(图1D)及水飞蓟 素对照组(图1F)的肝脏组织空泡化的情形与负对照组(图1B)相比较 没有差异，且高剂量对照组(图1E)组肝脏组织空泡化程度显著高于 负对照组(图1B)，又低剂量对照组(图1C)、中剂量对照组(图1D)、 高剂量对照组(图1E)及水飞蓟素对照组(图1F)肝脏组织坏死的情形 与负对照组(图1B)相比较没有差异。

如图2A-图2F所示，图2A-图2F 2中的肝脏组织分别对应控制 组(图2A)、负对照组(图2B)、低剂量对照组(图2C)、中剂量对照组(图2D)、高剂量对照组(图2E)及水飞蓟素对照组(图2F)，可明确看 出负对照组(图2B)组织纤维化情形，而低剂量对照组(图2C)、中剂 量对照组(图2D)、高剂量对照组(图2E)及水飞蓟素对照组(图2F)的 肝脏组织纤维化程度显著低于负对照组(图2B)。

续请参阅表(十三)以及图3，表(十三)为本发明的橙皮苷含 量检测结果，图3为本发明的橙皮苷检测图谱。

橙皮苷含量检测结果

表(十三)

再来，本发明更进一步的将组合物的成分进行分析，并以此来检 测本发明中的橙皮苷以及橙皮素含量和其图谱分析。

接着，将取任意三组利用相同配比和制程所制造出的本发明进行 橙皮苷含量检测，而其结果如表(十三)所示，由表(十三)中可看 出橙皮苷含量分别为491.39±2.89、485.96±2.23、489.01±2.25 μg/mL。

再来如图3所示，图3由上而下分别为标准的橙皮苷图谱以及三 组本发明的图谱，且从图谱中可看出三组送验的本发明在显示橙皮苷 的区段有产生峰值，且该峰值与标准的橙皮苷峰值有所重叠，因此本 发明中确实是含有橙皮苷。

续请参阅图4以及图5，图4为橙皮素的标准图谱，图5为本发 明稀释10倍后的橙皮素检测图谱。

接着，将图3所示的图谱与表(十三)所示的图谱相比，可发现 本发明在显示橙皮素的区段有产生峰值，且该峰值与标准的橙皮素峰 值有所重叠，因此本发明中确实是含有橙皮素。

综合上述的检测结果，可将本发明的效果整理如下列所示：

1.本试验使用四氯化碳诱发肝损伤来使血浆中丙胺酸转胺酶 (ALT)、天门冬胺酸转胺酶(AST)的活性明显上升，且结果显示服用不 同剂量的对照组血清中的丙胺酸转胺酶(ALT)、天门冬胺酸转胺酶 (AST)活性明显降低，显示服用本发明能减轻四氯化碳对肝脏的伤害。

2.血浆中的白蛋白主要来自于肝脏的合成，因此在慢性肝炎引起 肝脏纤维化时血浆白蛋白含量会逐渐下降，而服用不同剂量的对照组 织白蛋白含量均大于负对照组，显示服用本发明能改善四氯化碳所引 起的肝脏蛋白质合成功能减退。

3.当肝脏纤维化后会使血流进入肝脏受到阻力，进而引起门脉高 压并连带影响到脾脏的血流并使得脾脏肿大，而上述检测中显示显示 服用本发明能改善脾脏肿大的情形并有减缓门脉高压的作用。

4.当肝脏受到损伤时会有发炎的情形，也同时会启动其再生的功 能并使肝脏重量增加，而本实验中的中、高剂量对照组对增加的肝脏 重量显现减轻作用，同时对肝脏含水量也有减少作用，由此可知服用 本发明能舒缓肝脏发炎的症状。

5.慢性肝炎会引起肝脏纤维化即结缔组织增生，而结缔组织主要 由胶原蛋白构成，且胶原蛋白(hydroxyproline)是胶原蛋白特有的 成分，因此测定胶原蛋白的可以反应出胶原蛋白的量，并可用来表示 纤维化的程度，而各剂量对照组检测出的胶原蛋白含量均低于负对照 组，显示服用本发明可以减轻肝脏纤维化的作用。

6.已知由四氯化碳诱发的肝脏纤维化与自由基的伤害造成脂质 过氧化有关，在本试验中负对照组的肝脏组织脂质过氧化程度明显上 升，而服用本发明的各对照组具有减少脂质过氧化程度。

7.谷胱甘肽(glutathione)参与很多肝脏细胞功能，诸如解毒、 清除自由基及调节细胞周期等，在本试验中负对照组降低肝脏谷胱 甘肽(glutathione)含量，而服用本发明的各剂量对照组能提升肝脏 谷胱甘肽(glutathione)含量。

以上所述技术方案仅系本发明的较佳实施例而已，凡是应用本发 明说明书及申请专利范围所为的其它等效结构变化的技术方案，理应 包含在本发明的申请专利范围内。

Claims (6)

1.具有护肝效果的组合物，其特征在于，其含有320～520μg/mL的橙皮苷以及160～230μg/mL的橙皮素。

2.具有护肝效果的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将柠檬压榨成柠檬汁；

(2)、将步骤(1)得到的柠檬汁进行发酵，完成后即得到具有护肝效果的组合物。

3.如权利要求2所述的具有护肝效果的组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中该柠檬的压榨是将整颗柠檬连同果皮和种子压榨成柠檬汁。

4.如权利要求2所述的具有护肝效果的组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中直接将益生菌加入步骤(1)得到的柠檬汁内进行发酵，且发酵的过程中需将温度控制在22℃～30℃之间并持续搅拌10到22天，而在搅拌的过程中会不间断的透过搅拌设备将空气打入柠檬汁内，使柠檬汁、益生菌以及空气三者能充分的混合。

5.如权利要求4所述的具有护肝效果的组合物的制备方法，其特征在于，该益生菌由胚芽乳酸杆菌以及季也蒙有孢汉逊酵母菌以混合比例介于(2～4):(3～5)之间。

6.如权利要求4所述的具有护肝效果的组合物的制备方法，其特征在于，该柠檬汁和益生菌的混合比例介于(1～2):(0.03～0.3)之间。

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