CN114806976A - 一种短乳杆菌及其抑菌物质制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短乳杆菌CGMCC No.19407及其抑菌物质制备方法，涉及微生物发酵及提取领域。本发明提供的短乳杆菌属于益生菌，是公认GRAS菌株。其发酵产物对多种真菌、细菌，如黑曲霉、酵母菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等均有良好的抑菌活性。本发明还提供一种所述抑菌物质的提取制备方法，包括以下步骤：（1）菌株接种于发酵培养基进行发酵培养；（2）发酵结束后除菌，得澄清发酵液；（3）澄清发酵液经阴离子交换树脂进行吸附；（4）吸附后树脂加解析液进行解析；（5）解析液干燥得最终产品。本发明提供的菌株及所得产品安全可靠，抑菌谱广泛，在食品、饲料、农业等领域有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种短乳杆菌和其生物防腐剂的制备方法及应用，属于微生物领域。
背景技术
根据《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》的部署，自2020年起，农业部废止了金霉素、土霉素等13个药物饲料添加剂，寻找合适的替抗产品是目前饲料行业面临的挑战。同时随着抗生素滥用、食品安全等问题日益严重，健康安全成为消费者对食品选择的更高要求。如何实现饲料禁抗、养殖减抗、食品无抗成为饲料、食品行业共同面临的重要难题。
乳酸菌作为GRAS菌株，可以产生多种抑菌物质，应用乳酸菌及其代谢产物来解决食品和饲料安全问题是目前研究的热点，比如Nisin，已广泛应用于食品行业。但Nisin抑菌普较窄，仅对部分革兰氏阳性细菌抑制效果较好，对霉菌、酵母等真菌无抑制效果。本专利所述短乳杆菌代谢产物对多种真菌、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，如黑曲霉、美琪酵母、镰刀菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等均有良好的抑菌活性，抑菌普广泛。
现阶段乳酸菌抑菌产品多以活菌发酵液或微生态制剂为主，但乳酸菌活菌很难直接添加到食品中，无法直接作为防腐剂使用。乳酸菌发酵液可以作为饲料直接添加到动物饲料中，但活菌微生态制剂活性容易降低且不易保存。对发酵液的抑菌成分进行分离提取，将方便保藏、运输及添加使用。
发明内容
本发明为解决上述现有技术中所存在的技术缺陷，提供了一种短乳杆菌及其物防腐剂的制备方法，因而提供一种抑菌普广泛的生物防腐剂，解决食品饲料的安全问题。
为实现上述发明目的，采取的技术方案为：
本发明提供一种有广泛抑菌活性的短乳杆菌菌株，该菌株保藏号为CGMCC No.19407。
还提供所述的有广泛抑菌活性短乳杆菌菌株在制备生物防腐剂中的应用。
进一步提供利用所述的短乳杆菌菌株生产生物防腐剂的方法。具体包括以下步骤：发酵培养所述的短乳杆菌菌株，从发酵的培养液进行干燥获得生物防腐剂。
优选地，所述发酵培养条件为30-37℃，50-100 rpm，培养24-48 h;其中所述发酵培养基为MRS液体培养基。
一个实施方式中，在发酵培养前进行下述培养：
（1）斜面培养：将所述短乳杆菌菌株在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，30-37℃培养24-48h,其中所述的固体斜面培养基为脱脂乳培养基；
（2）种子培养：将步骤（1）所培养的短乳杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，30-37℃静置培养12 h；其中所述的种子培养基为液体MRS培养基。
优选地，所述干燥为喷雾干燥法。更具体地，喷雾干燥的条件是进口温度为120-210℃，出口温度60-100℃，干燥后添加其重量计为5%-20%改性淀粉、麦芽糊精和/或环糊精。
在另一个实施方式中，包括以下步骤：将发酵液澄清，收集清液；用阴离子交换树脂处理澄清后发酵液；使用解析液对阴离子交换树脂进行洗脱，收集洗脱液；洗脱液干燥得生物防腐剂。
优选地，所述澄清的方法选自管式离心机离心、碟片式离心机离心、陶瓷膜过滤、中空纤维膜过滤。
另外优选地，所述阴离子交换树脂为强碱性离子交换树脂或弱碱性离子交换树脂。
再一优选方式中，所述的解析液为0.5-5%盐酸、0.5-5%氯化钠或0.5-5%氢氧化钠溶液的一种或两种混合。
所述洗脱液干燥的方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
本发明还提供所述的方法制备得到的生物防腐剂。
本发明也提供所述的短乳杆菌菌株，所述的生物防腐剂在食品、饲料中作为防腐剂的应用。
本发明还提供一种广谱抑菌物质的制备方法，包括以下步骤：
（1）所述菌株接种于发酵培养基进行发酵培养；
（2）发酵液澄清，收集清液；
（3）用阴离子交换树脂处理澄清后发酵液；
（4）使用解析液对阴离子交换树脂进行洗脱，收集洗脱液；
（5）洗脱液干燥得最终产品。
优选项，所述步骤2中MRS培养基中葡萄糖浓度为30g/L。
优选项，所述步骤3中所述培养温度为33℃。
优选项，所述步骤4中进口温度为190℃，出口温度为90℃。
优选项，所述步骤4中添加剂为10%麦芽糊精。
优选项，所述步骤5中澄清方式选用50-200nm陶瓷膜过滤，操作压力0.3MPa。
优选项，所述步骤5中所述阴离子交换树脂型号为D301。
优选项，所述步骤5中所述干燥方法为喷雾干燥法。
本发明提供短乳杆菌菌株所产抑菌物质对多种真菌、细菌，如黑曲霉、镰刀菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等均有良好的抑菌活性，抑菌普广泛。同时其产生的抑菌物质可采用专利所述方法有效提取纯化，方便添加使用。在食品、饲料及农业领域有广泛的应用价值。
附图说明
图1为实施例二中短乳杆菌zczx-1对金黄色葡萄球菌抑制效果。
图2为实施例二中短乳杆菌zczx-1对大肠杆菌抑制效果。
图3为实施例二中短乳杆菌zczx-1对二尖梅奇酵母抑制效果。
图4为实施例二中短乳杆菌zczx-1对黑曲霉抑制效果。
图5 为实施例三中以平板扩散法检测短乳杆菌zczx-1的发酵液、吸附后发酵液、洗脱液的抑菌活性（指示菌为金黄色葡萄球菌）。
图6 为实施例四中以平板扩散法检测短乳杆菌zczx-1的发酵液、吸附后发酵液、洗脱液的抑菌活性（指示菌为黑曲霉）。
图7 为实施例四中以精制生物防腐剂通过平板扩散法检测抑菌活性（指示菌为黑曲霉）。
生物保藏
本发明涉及的菌株zczx-1，分类命名为：短乳杆菌（Lactobacillus brevis），于2020年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No. 19407。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做具体说明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
将高盐腌制生辣椒粉碎后，加入到灭菌后的MRS液体培养基中，37℃，50rpm振动培养2h，取培养后的MRS培养基进行梯度稀释，并涂布于MRS固体培养基上，置于33℃培养箱中静置培养48h，待长出单菌落后，挑取白色圆形单菌落接种至含有1.5mlMRS培养基的2ml EP管中继续静置培养48h。培养结束后12000rpm离心取上清，采用平板扩散法检测发酵液上清的抑菌活性，指示菌采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌和黑曲霉，筛选对四种菌均有抑菌活性的菌株进行鉴定保藏。
获得一种对四种指示菌均有抑菌活性的菌株zczx-1，接种于MRS液体培养基中，33℃静置培养24h，离心收集菌体，用缓冲液稀释至一定浓度，接种于Biolog自动微生物鉴定分析系统，使用GEN 三型板进行菌种鉴定，鉴定结果为Lactobacillus brevis；该菌株zczx-1筛选于低温高盐腌制泡菜中，耐低温、耐高盐，菌株及其发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌和霉菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌等真菌均有良好的抑菌效果，有广泛的抑菌活性。
实施例二
甘油管保藏短乳杆菌zczx-1在无菌条件下接种于固体脱脂乳培养基上， 37℃培养48h,挑取较大菌落接种于50ml液体MRS培养基，33℃培养24h制成种子液。种子液在无菌条件下接种于发酵培养基中，接种量为5%，37℃，50 rpm，培养48 h。发酵结束后平板扩散法检测发酵液抑菌活性，指示菌采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，见图1和图2。
向100ml发酵液中加入10g麦芽糊精，设置入口温度190℃，出口温度90℃，进行喷雾干燥，制备微生态制剂。取微生态制剂5g加入50ml无菌水复溶，平板扩散法检测活性，指示菌采用二尖梅奇酵母和黑曲霉，图3和图4。特别的二尖梅奇酵母是导致螃蟹养殖过程中，水产牛奶病发生的直接致病菌，本发明所述菌株有耐低温、耐盐特性，可在10%以上的氯化钠溶液中生长，在海水水产养殖中有较高的应用价值。
实施例三
甘油管保藏短乳杆菌zczx-1在无菌条件下接种于固体脱脂乳培养基上， 37℃培养48h,挑取较大菌落接种于50ml液体MRS培养基，37℃培养24h制成种子液。种子液在无菌条件下接种于发酵培养基中，接种量为5%，37℃，50 rpm，培养48 h。发酵结束后平板扩散法检测发酵液抑菌活性，指示菌采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，活性较好。
取1000ml发酵液，采用中空纤维膜过滤除菌，得无菌发酵液。取100ml无菌发酵液加入10g D301阴离子交换树脂，50 rpm振动2h，结束后过滤。以等体积去离子水清洗树脂并过滤。向清洗后树脂中加入100ml浓度为1mol/L盐酸溶液，50 rpm振动2h进行洗脱，洗脱结束后调节洗脱液pH至4-5，平板扩散法检测发酵液、吸附后发酵液、洗脱液抑菌活性，指示菌采用金黄色葡萄球菌，并以pH=4盐酸作对照。结果显示，发酵液、洗脱液抑菌效果无差异，抑菌圈直径可达1.2-1.5cm。吸附后发酵液和pH=4盐酸无抑菌活性，见图5。
实施例四
甘油管保藏短乳杆菌zczx-1在无菌条件下接种于固体脱脂乳培养基上， 33℃培养48h,挑取较大菌落接种于50ml液体MRS培养基，33℃培养24h制成种子液。种子液在无菌条件下接种于发酵培养基中，接种量为8%，33℃，50 rpm，培养24 h。发酵结束后平板扩散法检测发酵液抑菌活性，指示菌采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，活性较好。
取5000ml发酵液，采用100nm陶瓷膜过滤除菌，得无菌发酵液。取500ml无菌发酵液加入50g D380阴离子交换树脂，50 rpm振动2h，结束后过滤。以100ml去离子水清洗树脂并过滤。向清洗后树脂中加入200ml浓度为1mol/L氢氧化钠溶液，50 rpm振动2h进行洗脱，洗脱结束后调节洗脱液pH至4-5，平板扩散法检测发酵液、吸附后发酵液、洗脱液抑菌活性，指示菌采用黑曲霉。结果显示，发酵液、洗脱液抑菌效果无差异，均较好，抑菌圈直径可达1.8-2.0cm，见图6。吸附后发酵液无抑菌活性。
取30ml洗脱液加入15%改性淀粉。设置入口温度180℃，出口温度85℃，进行喷雾干燥，制备精制生物防腐剂，喷干结束后取1g固体防腐剂加入50ml水复溶，平板扩散法检测活性，指示菌采用黑曲霉，复溶发酵液抑菌圈可达2.5cm，而相同质量浓度淀粉溶液没有抑菌活性，见图7。
Claims (15)
1.一种有广泛抑菌活性的短乳杆菌菌株，该菌株保藏号为CGMCC No. 19407。
2.权利要求1所述的有广泛抑菌活性短乳杆菌菌株在制备生物防腐剂中的应用。
3.利用如权利要求1所述的短乳杆菌菌株生产生物防腐剂的方法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵培养所述的短乳杆菌菌株，从发酵的培养液进行干燥获得生物防腐剂。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为30-37℃，50-100rpm，培养24-48 h;其中所述发酵培养基为MRS液体培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在发酵培养前进行下述培养：
（1）斜面培养：将所述短乳杆菌菌株在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，30-37℃培养24-48h,其中所述的固体斜面培养基为脱脂乳培养基；
（2）种子培养：将步骤（1）所培养的短乳杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，30-37℃静置培养12 h；其中所述的种子培养基为液体MRS培养基。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述干燥为喷雾干燥法。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，喷雾干燥的条件是进口温度为120-210℃，出口温度60-100℃，干燥后添加其重量计为5%-20%改性淀粉、麦芽糊精和/或环糊精。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将发酵液澄清，收集清液；用阴离子交换树脂处理澄清后发酵液；使用解析液对阴离子交换树脂进行洗脱，收集洗脱液；洗脱液干燥得生物防腐剂。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于：所述澄清的方法选自管式离心机离心、碟片式离心机离心、陶瓷膜过滤、中空纤维膜过滤。
11.权利要求9所述的方法，其特征在于：所述阴离子交换树脂为强碱性离子交换树脂或弱碱性离子交换树脂。
12.权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的解析液为0.5-5%盐酸、0.5-5%氯化钠或0.5-5%氢氧化钠溶液的一种或两种混合。
13.权利要求9所述的方法，其特征在于：所述洗脱液干燥的方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
14.如权利要求3-13任一项所述的方法制备得到的生物防腐剂。
15.如权利要求1所述的短乳杆菌菌株，如权利要求14所述的生物防腐剂在食品、饲料中作为防腐剂的应用。
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