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CN114806929A - 一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌lr4009及其应用 - Google Patents

一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌lr4009及其应用 Download PDF

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CN114806929A CN202210322275.1A CN202210322275A CN114806929A CN 114806929 A CN114806929 A CN 114806929A CN 202210322275 A CN202210322275 A CN 202210322275A CN 114806929 A CN114806929 A CN 114806929A
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Abstract

本发明公开了一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR4009及其应用，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020701，保藏日期为2020年11月9日。所述菌株转化生产罗伊氏菌素的能力高达632mmol/L，显著高于现有菌株；将其制备成冻干粉，所述冻干粉中活菌数高达2300亿/g，将所述冻干粉单独使用或与载体混匀后制备成食品或保健品食用有助于增强机体免疫力；本发明所述罗伊氏乳杆菌还具有高耐酸活性及耐胆盐活性，能够确保菌株有效通过胃液和胆盐到达肠道，在复杂的肠道环境中增殖。

Description

一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌LR4009及其应用
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌LR4009及其应用。
【背景技术】
罗伊氏乳杆菌是由卫计委公布的食品中可用的乳酸杆菌，国际上公认的益生乳酸菌，具有很高的理论研究和生产应用价值，天然存在于人和动物的肠道系统中。
罗伊氏乳杆菌能代谢甘油产生一种非蛋白类的广谱抗菌物质罗伊氏细菌素，研究表明，罗伊氏菌素是以3-羟基丙醛(3-HPA)为代谢中心的复杂的动态混合体系，其成分主要包括三羟基丙醛、三羟基丙醛的水合物和三羟基丙醛二聚体。罗伊氏菌素能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等病原菌的生长，同时，罗伊氏菌素对病毒的复制同样具有有效的抑制作用。此外，由于其结构的独特性，它的抑菌活性不会被蛋白酶破坏，具有较强的稳定性。
目前利用罗伊氏乳杆菌生产罗伊氏菌素的产量普遍小于150mmol/L；由于罗伊氏菌素对细胞有毒害作用，限制了体外高浓度的积累。本研究旨在筛选出一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌，并优化罗伊氏乳杆菌生产罗伊氏菌素的条件，提高罗伊氏细菌素的生产效率和产量，并形成同时含有罗伊氏乳杆菌及罗伊氏菌素的相关产品。
【发明内容】
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一株罗伊氏菌素产量高，且具有高耐酸、耐胆盐能力的罗伊氏乳杆菌LR4009，并研究其在增强机体免疫力方面的应用。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR4009，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR4009来源于天然发酵食品内蒙古奶豆腐，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020701，保藏日期为2020年11月9日。
本发明的第二目的在于，提供所述罗伊氏乳杆菌LR4009转化生产罗伊氏菌素的方法，具体地，包括如下步骤：
(1)菌种活化：选择罗伊氏乳杆菌LR4009菌种，并将其接种于固体斜面培养基上进行活化；
(2)一级种子培养：取活化后的固体培养基斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，于30-37℃条件下静置培养12-16h，制得一级种子液；
(3)二级种子培养：取1～5％的一级种子液接种于种子液体培养基中，于30-37℃条件下静置培养12-16h，制得二级种子液；
(4)发酵罐发酵：取1～5％的述二级种子液接于发酵罐液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，静置培养。
(5)发酵菌泥收集：收集发酵罐中发酵12小时后的发酵液并离心，获得发酵菌泥；
(6)菌泥处理：将所述发酵菌泥中加入含辅酶B12的甘油溶液中反应，得到菌泥反应体系，检测罗伊氏菌素含量备用。
优选地，步骤(2)中所述的种子液体培养基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L和酵母膏5g/L，调节pH至5.5-6.5，115℃条件下灭菌20min。
优选地，步骤(1)中所述的固体斜面培养基为在步骤(2)所述种子液体培养基的基础上添加1.5～2.0％的琼脂粉，菌种活化条件为30～37℃培养20～30小时。
优选地，步骤(4)所述的发酵罐液体发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L和吐温-80 1mL/L，使用时，调节pH至5.5-6.5。
优选地，步骤(6)所述的菌泥处理具体为，将所述发酵菌泥置于含有20μmol/L辅酶B12、pH为6.5的300mmol/L甘油溶液中混匀，反应1h后得到菌泥反应体系，检测罗伊氏菌素含量备用。
本发明的第三目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌LR4009冻干粉的制备方法，具体为：向上述制备的菌泥反应体系中加入冻干保护剂后进行冷冻干燥，粉碎后得冻干粉成品。
优选地，所述冻干保护剂为脱脂奶粉，其添加质量占菌泥反应体系的15～25％。
本发明的第四目的在于，提供一种按照上述方法制备的冻干粉。
优选地，所述冻干粉中罗伊氏乳杆菌LR4009的活菌数为2300亿/g，罗伊氏菌素的质量百分含量为12.5％。
本发明的第五目的在于，提供一种组合物，所述组合物包含上述含罗伊氏乳杆菌LR4009的冻干粉。
优选地，所述组合物为食品、保健品或药品。
优选地，所述组合物的剂型为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂。
本发明还提供了所述组合物在增强机体免疫力中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR4009来源于天然发酵食品内蒙古奶豆腐，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020701，保藏日期为2020年11月9日。
本发明所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR4009产罗伊氏菌素能力高，罗伊氏菌素产量最高可达632mmol/L；将其制备成冻干粉，所述冻干粉中活菌数高达2300亿/g，将所述冻干粉单独使用或与载体混匀后制备成食品或保健品食用有助于增强机体免疫力；
本发明所述罗伊氏乳杆菌还具有高耐酸活性及耐胆盐活性，能够确保菌株有效通过胃液和胆盐到达肠道，在复杂的肠道环境中增殖。
【附图说明】
图1为现有罗伊氏乳杆菌菌株发酵液中罗伊氏菌素含量对比的柱状图；
图2为本发明所述罗伊氏乳杆菌LR4009发酵过程中菌体细胞数量及甘油脱水酶活性分析；
图3为甘油浓度对菌株LR4009产罗伊氏菌素的影响结果；
图4为发酵体系pH对菌株LR4009产罗伊氏菌素的影响；
图5为反应时间对菌株LR4009产罗伊氏菌素的影响；
图6为辅酶B12添加量对菌株LR4009产罗伊氏菌素的影响。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中用到的培养基成分如下：
种子液体培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L和酵母膏5g/L，调节pH至5.5-6.5，115℃条件下灭菌20min。
固体斜面培养基为在所述种子液体培养基的基础上添加1.5～2.0％的琼脂粉，菌种活化条件为30～37℃培养20～30小时。
发酵罐液体发酵培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L和吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5.5-6.5。
MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温-80 1g/L，使用时，调节pH至6.0。
改良的MRS培养基：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏7g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.15g/L和吐温-80 1g/L，使用时，调节pH至6.0。
实施例1
将本发明所述罗伊氏乳杆菌LR4009与现有的几株罗伊氏乳杆菌发酵液中罗伊氏菌素的含量进行对比：
(1)选取现有的9株罗伊氏乳杆菌及本发明所述罗伊氏乳杆菌LR4009(编号J8)，于无菌操作台中，分别用无菌接种环从实验室斜面挑取一环待活化菌株，转接至MRS培养基中，37℃发酵20h后备用；
(2)将活化好的10株罗伊氏乳杆菌分别用改良MRS培养基进行发酵，发酵14h后测定发酵液中罗伊氏菌素的含量，结果如图1所示。
根据图1可以看出，10株菌中编号J8(罗伊氏乳杆菌LR4009)所产生的罗伊氏菌素的含量最高(80mmol/L)，明显高于其他现有菌株。
实施例2耐酸、耐胆盐特性检测
1、耐酸特性检测
用HCl将改良MRS培养基的pH值调至2.4，115℃，灭菌30min，按1％接菌量无菌接入菌株在改良MRS培养基中发酵24h得发酵液，发酵液在37℃条件下分别于0.5h、1h、2h取样测定活菌数，以现有菌株(实施例1中编号J5)作为对照，结果如表1所示。
2、耐胆盐特性检测
菌液按1％(v/v)接种于胆盐浓度为0.3％(w/v)的改良MRS培养基中，在37℃条件下培养1h、2h后，取样测定活菌数，以现有菌株(实施例1中编号J5)作为对照，结果如表1所示：
表1菌株耐酸、耐胆盐活性检测
Figure BDA0003570446260000041
由表2中数据可知，本发明所述罗伊氏乳杆菌LR4009菌株在pH2.4环境下处理2h活菌存活率仍高达74％；菌株在0.3％胆盐浓度下2h存活率仍高达85％，明显高于对照罗伊氏乳杆菌菌株，说明本发明所述罗伊氏乳杆菌LR4009菌株具有高耐酸活性及高耐胆盐能力；能确保菌株有效通过胃液和胆盐到达肠道，在肠道的复杂环境中增殖。
实施例3菌株转化生产罗伊氏菌素的条件优化
首先按照如下步骤制备发酵菌泥：
(1)菌种活化：选择罗伊氏乳杆菌LR4009菌种，并将其接种于固体斜面培养基上进行活化；
(2)一级种子培养：取活化后的固体培养基斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中于30～37℃中静置培养12～16小时，制得一级种子液；
(3)二级种子培养：取1～5％一级种子液接种于种子液体培养基中于30～37℃中静置培养12～16小时，制得二级种子液；
(4)发酵罐发酵：取1～5％二级种子液接于发酵罐液体发酵培养基中，于30～37℃中静置培养10～24小时；
(5)发酵菌泥收集：待所述发酵罐发酵一定时间后，收集发酵液并离心，获得发酵菌泥。
然后，将所述发酵菌泥依次进行如下处理，从而筛选出罗伊氏菌素产量最高的条件：
1、发酵过程酶活变化
罗伊氏乳杆菌在发酵过程中，胞内所产甘油脱水酶的活性也随之变化，进而会影响罗伊氏菌素的产量；通过测定发酵过程中菌体细胞数量及甘油脱水酶活性，确定获得菌体细胞最佳时间，结果如图2所示。
由图2可知，在发酵早期，菌体细胞内甘油脱水酶酶活性较低，随着发酵时间的延长，甘油脱水酶酶活性增加，在发酵12h时，酶活性达到最大为4.9U/mg，此时，菌株发酵对数期结束，开始进入稳定期，此时发酵液中活菌数为24亿/ml；发酵12h之后，菌体内甘油脱水酶酶活基本稳定，活性不再增加。因此，菌株发酵12h后收集细胞，此时胞内甘油脱水酶酶活性最大，用于后续试验进行甘油转化，有助于提高罗伊氏菌素产量。
2、甘油浓度对罗伊氏菌素产量的影响
甘油浓度影响罗伊氏菌素的产量，但同时甘油又是罗伊氏乳杆菌的自杀底物，影响罗伊氏乳杆菌的活性；因此，合适的甘油浓度有助于增加罗伊氏菌素产量，同时又能保证菌体活性；收集菌株发酵12h后的细胞，分别加入到已灭菌的甘油溶液(浓度为100～500mmol/L)中，设体系最初pH为5.5，辅酶B12浓度为10μmol/L，静置培养1小时后，分别测定罗伊氏菌素的产量，测定结果如图3所示；
由图3可知，当甘油添加浓度为300mmol/L时，体系中产生的罗伊氏菌素产量为241mmol/L，此时的产量最高。
3、反应pH对罗伊氏菌素产量的影响
体系内不同pH条件下，罗伊氏菌素的产量不同，体系偏酸性或偏碱性都不利于甘油转化生成罗伊氏菌素；当体系中甘油浓度为300mmol/L，辅酶B12浓度为10μmol/L，反应时间为1小时时，测定不同pH下体系内罗伊氏菌素的含量，测定结果如图4所示；
由图4可知，当体系PH值为6.5时，体系中产生的罗伊氏菌素产量为328mmol/L，此时产量最高；因此，选择体系的反应pH为6.5。
4、反应时间对罗伊氏菌素产量的影响
体系反应时间在一定程度影响罗伊氏菌素产量，因为随着反应的进行，由于体系内甘油脱水酶活性、体系内甘油含量及罗伊氏菌素自身的转化等因素的影响，罗伊氏菌素产量会随之发生改变；当体系甘油浓度为300mmol/L、辅酶B12浓度为10μmol/L、pH为6.5时，测定不同反应时间下体系内罗伊氏菌素的含量，结果如图5所示；
由图5可知，随着时间延长，体系内罗伊氏菌素的产量先增加后略微下降保持稳定，在反应时间1h时，罗伊氏菌素产量达到最高，为461mmol/L，之后体系内反应基本停止，可能后期部分罗伊氏菌素转化为其他成分，导致罗伊氏菌素产量有少许下降；因此，体系反应时间选为1h较合适。
5、辅酶B12添加量对罗伊氏菌素产量的影响
辅酶B12能调节甘油脱水酶的酶活，促进甘油转化。当体系甘油浓度为300mmol/L、pH为6.5，反应1h时，测定辅酶B12不同添加浓度(5～25μmol/L)下体系内罗伊氏菌素的含量，结果如图6所示；
由图6可知，添加辅酶B12后罗伊氏菌素的产量有所增加，而且在一定范围内，随着辅酶B12的添加量的增加，罗伊氏菌素的产量随着增加。当辅酶B12添加量为20μmol/L时，罗伊氏菌素的产量最高为632mmol/L。
因此，确定所述罗伊氏乳杆菌LR4009转化生产罗伊氏菌素的最优条件为：收集菌株发酵12小时后的发酵菌泥，于含有20μmol/L辅酶B12、pH为6.5的300mmol/L甘油溶液中混匀，反应1h。
实施例4高含量罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌冻干粉的制备
按照实施例3所述的方法收集发酵12小时后的发酵菌泥，并将所述发酵菌泥加入含有20μmol/L辅酶B12、pH为6.5的300mmol/L甘油溶液中混匀，反应1h后得到菌泥反应体系；然后向菌泥反应体系中加入20％～25％的脱脂奶粉后进行冷冻干燥，粉碎后得罗伊氏乳杆菌冻干粉。
对所得冻干粉进行罗伊氏乳杆菌的活菌数及罗伊氏菌素含量进行检测，结果如表2所示：
表2罗伊氏乳杆菌冻干粉中活菌数及罗伊氏菌素含量
Figure BDA0003570446260000073
采用本发明所述罗伊氏乳杆菌LR4009，按照此工艺制备的冻干粉中不仅含有高活菌数的罗伊氏乳杆菌，而且还含有较高含量的罗伊氏菌素。
实施例5所述罗伊氏乳杆菌冻干粉增强机体免疫力的功能评价
将所得罗伊氏乳杆菌冻干粉添加辅料乳粉或糊精调配成含活菌数200亿/袋的冻干粉冲剂，食用方法是每天1次，每次1袋；按照此人体服用剂量进行小鼠喂养实验，评价其增强免疫力功能。
选用SPF级昆明种雌性小白鼠40只，体重18-22g。将小鼠分成4组，每组10只，分别设对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，对照组灌胃蒸馏水，低、中、高剂量组分别按人体服用剂量的5、10、30倍灌胃罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂，连续喂养30d。喂养结束后，测定小鼠体重、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验、小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法)、NK细胞活性。
表3罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂对小鼠体重的影响
Figure BDA0003570446260000071
表4罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂对小鼠胸腺/体重和脾脏/体重比值的影响
Figure BDA0003570446260000072
由表3和表4可以看出，各剂量组小鼠体重、胸腺/体重比值和脾脏/体重比值与对照组相比无差异，这表明，罗伊氏乳酸菌冻干粉冲剂对小鼠体重、胸腺和脾脏质量无影响。
表5罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂对小鼠细胞免疫功能的影响
Figure BDA0003570446260000081
由表5可以看出，高剂量组小鼠淋巴细胞转化能力显著高于对照组，中剂量组和高剂量组小鼠足趾增厚显著高于对照组，表明受试样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验及小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法)为阳性，即说明罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂具有增强小鼠细胞免疫功能的作用。
表6罗伊氏乳杆冻干粉冲剂对小鼠NK细胞活性影响
Figure BDA0003570446260000082
由表6可以看出，中高剂量组小鼠的NK细胞活性显著高于对照组，结果为阳性，表明罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂具有增强NK细胞活性的作用。
依据《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》中有助于增强免疫力功能评价标准判断，该罗伊氏乳杆菌冻干粉冲剂具有增强免疫力的作用。
实施例6
将实施例4制备的冻干粉制备成食品、保健品或药品等形式的组合物，所述组合物可以为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂等常见的制剂形式；所述组合物直接服用或饮用能够增强机体免疫力。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一株高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR4009，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020701，保藏日期为2020年11月9日。
2.权利要求1所述罗伊氏乳杆菌LR4009转化生产罗伊氏菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：选择罗伊氏乳杆菌LR4009菌种，并将其接种于固体斜面培养基上于30～37℃条件下活化培养20～30小时；
(2)一级种子培养：取活化后的固体培养基斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，于30～37℃条件下静置培养12～16h，制得一级种子液；
(3)二级种子培养：取1～5％的一级种子液接种于种子液体培养基中，于30～37℃条件下静置培养12～16h，制得二级种子液；
(4)发酵罐发酵：取1～5％的二级种子液接于发酵罐液体发酵培养基中，于30～37℃条件下，静置培养。
(5)发酵菌泥收集：收集发酵罐中发酵12小时后的发酵液并离心，获得发酵菌泥；
(6)菌泥处理：将所述发酵菌泥加入含辅酶B12的甘油溶液中反应，得到菌泥反应体系，检测罗伊氏菌素含量备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的菌泥处理具体为，将所述发酵菌泥置于含有20μmol/L辅酶B12、pH为6.5的300mmol/L甘油溶液中混匀，反应1h后得到菌泥反应体系，检测罗伊氏菌素含量备用。
4.一种罗伊氏乳杆菌LR4009的冻干粉的制备方法，其特征在于，向权利要求3制备的菌泥反应体系中加入冻干保护剂进行冷冻干燥，粉碎后得冻干粉成品。
5.根据权利要求4所述冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为脱脂奶粉，其添加质量占菌泥反应体系的15～25％。
6.一种含罗伊氏乳杆菌LR4009的冻干粉，其特征在于，所述冻干粉采用权利要求5所述制备方法制得。
7.一种组合物，其特征在于，包含权利要求6所述的冻干粉。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物选自食品、保健品或药品。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂。
10.权利要求9所述的组合物在增强机体免疫力中的应用。
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