CN114786703A - 群体感应抑制剂和/或后生元代谢物及相关方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了一种包括群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素的协同组合。通常，所述后生元代谢物包括至少一种肽。还描述了相关的组合物、用途和方法，包括使抗药菌对抗生素重新敏感的方法，以及治疗抗生素耐药性感染(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的方法。

Description

群体感应抑制剂和/或后生元代谢物及相关方法

技术领域

本发明涉及群体感应抑制剂和/或后生元代谢物。更具体地，在一些方面，本发明涉及作为抗生素替代物的群体感应抑制剂和/或后生元代谢物，群体感应抑制剂和/或后生元代谢物与抗生素的组合，以及相关的组合物和方法。

背景技术

2014年4月发布的世界卫生组织(WHO)报告指出，“这一严重威胁不再是对未来的预测，现在它正发生在世界的每个地区，并且有可能影响任何国家的任何年龄的任何人。当细菌发生变化，抗生素不再对需要它们治疗感染的人起作用时，抗生素耐药性现在是对公共健康的主要威胁。”欧洲疾病预防和控制中心计算，在2015年，在欧盟和欧洲经济区有671,689例由抗生素耐药性细菌引起的感染，导致33,110例死亡。大多数是在医疗保健环境中获得的。

世界卫生组织得出结论，在畜牧业中不适当使用抗生素是抗生素耐药性细菌出现和传播的根本原因，并且应该限制抗生素在动物饲料中作为生长促进剂的使用。世界动物卫生组织已经在《陆生动物卫生法典》中增加了一系列指南，其中向其成员建议创建和协调国家抗菌药物耐药性监督和监控程序，监测畜牧业中使用的抗生素的量，并建议确保适当和谨慎地使用抗生素物质。另一个指南是实施有助于建立相关风险因素和评估抗生素耐药性风险的方法。

自从发现抗生素以来，研发工作及时提供了新的药物来治疗对旧抗生素变得耐药的细菌，但在二十一世纪前十年，人们担心开发速度已经减缓到足以使重症患者可能失去治疗选择。另一个问题是医生可能由于有害感染的风险增加而不愿意进行常规手术。

国际专利申请公开号WO2009/155711、WO2015/021530、2018/165764和WO2018/165765描述了在益生菌培养物的无细胞废培养基(CFSM)中发现的某些后生元代谢物。已经显示这些后生元代谢物在治疗许多不同的感染中是有效的，包括许多不同来源和不同物种中的细菌和病毒感染。

尽管如此，仍然需要传统抗生素的替代物和用于治疗感染的方法。

附图说明

从以下参考附图的描述中将进一步理解本发明，其中：

图1(a，b)为通过β-内酰胺类抗生素头孢西丁(0-100μg/mL)和DSM13241生物活性代谢物(5、30和60mg/mL)的组合测试，两种相应临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的最小抑制浓度(MIC)生长抑制百分比的热图：a)MRSA 81M(n＝3)的MIC热图和b)MRSALA(n＝3)的MIC热图。通过头孢西丁测试(MIC≥8μg/mL)证明两种MRSA菌株均具有甲氧西林耐药性。所有生物学重复用技术重复进行。(c)用于分析生物活性代谢物和头孢西丁的组合效应的部分抑菌浓度(FIC)指数值的柱状图。生物活性材料的协同作用是明显的，因为MRSA81M和MRSA LA的单独MIC分别为100μg/mL和60μg/mL，并且所有浓度的生物活性材料(5、30和60mg/mL)引发累加(FIC>0.5-1.0)或协同(FIC≤0.5)效应，以降低引发针对相应MRSA菌株的生长抑制MIC结果所需的头孢西丁浓度。显示了生物学重复的平均值(n＝3)。

图2为通过β-内酰胺类抗生素头孢西丁(0-100μg/mL)和生物活性代谢物(30mg/mL)截留分子量(MWCO)3000的滤液(即≤3,000Da)和截留物(即>3,000Da)的组合测试(n＝3)，MRSA 81M的MIC生长抑制百分比的热图。所有生物学重复以技术重复进行。仅选择MRSA81M进行测试，因为它对生物活性材料显示出更高的敏感性，并在所有测试浓度下显示出协同的FIC值；选择30mg/mL生物活性材料的浓度，因为它是FIC值远低于0.5的最低浓度。

图3为通过β-内酰胺类抗生素头孢西丁(0-100μg/mL)和DSM13241生物活性代谢物(30mg/mL)MWCO 3000的滤液(即≤3,000Da)、截留物沉淀的两次洗涤和仅截留物(即>3,000Da)的组合测试(n＝3)，MRSA 81M的MIC生长抑制百分比的热图。所有生物学重复以技术重复进行。选择30mg/mL生物活性材料浓度用于分级测试，因为它是导致MRSA临床菌株的协同FIC指数值的最低测试浓度。进行的截留物的两次洗涤也显示出一些残留的生物活性。

图4(a，b，c)为用生物活性材料(30mg/mL)在37℃±1℃下孵育24小时后的MRSA81M和MRSA LA的细胞沉淀的比较(将细胞以4,000rpm离心15分钟沉淀)：(a)从左到右：未处理的MRSA 81M、生物活性处理的MRSA 81M、未处理的MRSA LA和生物活性处理的MRSA LA。(b)从左到右：未处理的MRSA 81M和生物活性处理的MRSA 81M。(c)从左到右：未处理的MRSALA和生物活性处理的MRSA LA。有趣的是，应当注意，所有细胞沉淀在24小时孵育后具有几乎相同的最终CFU/mL浓度(图5)，即使未处理的MRSA沉淀尺寸在视觉上比其生物活性处理的对应物小得多并且在离心后更致密地压实。(d)为晶须盒图，其显示从针对两种菌株描述的两种处理中的每一种提取的类胡萝卜素在450nm处的吸光度测量(A₄₅₀)。中心黑色条表示中值，并且上晶须帽和下晶须帽分别显示最大值和最小值(n＝3)。所有生物学重复以技术重复进行。在用30mg/mL的DSM13241生物活性代谢物处理后，MRSA 81M(U＝0；p<0.05；Mann-Whitney)和MRSA LA(U＝0；p<0.05；Mann-Whitney)的抗氧化剂类胡萝卜素显示的金色色素显著减少。值得注意的是，尽管野生型(即未处理的)MRSALA最初具有非常少的橙色色素沉着，但用生物活性材料处理导致MRSA LA失去其大部分颜色，导致几乎纯白色沉淀(中值A₄₅₀＝0.0435)(U＝0；p<0.05；Mann-Whitney)。

图5(a，b)为柱状图，其显示了有和没有生物活性处理(30mg/mL)在37℃±1℃下在PBS溶液中孵育1小时之前和之后，(a)MRSA81M(n＝3)和(b)MRSA LA(n＝3)在1.5％v/v过氧化氢下的葡萄球菌存活率的平均降低。显示了(a)MRSA 81M和(b)MRSA LA的起始细胞浓度(T＝0h)和最终存活细胞浓度(T＝1h)。所有生物学重复以技术重复进行。显示了平均CFU/mL。误差条显示标准偏差。在用1.5％v/v过氧化氢孵育后，生物活性处理的MRSA 81M(W＝0；p<0.05；威氏符号秩次检验)和MRSA LA(W＝0；p<0.05；威氏符号秩次检验)均显著降低细胞死亡，分别>99.99％和99.67％。未处理的MRSA 81M(W＝0；p<0.05；威氏符号秩次检验)在过氧化氢孵育后也显示出细胞死亡的轻微但具有统计学意义的减少(19.70％)；MRSA LA也显示细胞死亡有所减少(16.67％)，但这并不显著(W＝5；p>0.05；威氏符号秩次检验)。

图6为晶须盒图，其描绘了有和没有生物活性处理(30mg/mL)在37℃±1℃下在PBS溶液中孵育1小时后，MRSA 81M(n＝3)和MRSALA(n＝3)在1.5％v/v过氧化氢下的葡萄球菌存活率的降低百分比。所有生物学重复以技术重复进行。中心黑色条表示中值，并且上晶须帽和下晶须帽分别显示最大值和最小值。在用1.5％v/v过氧化氢孵育后，生物活性处理的MRSA 81M(W＝0；p<0.05；威氏符号秩次检验)和MRSA LA(W＝0；p<0.05；威氏符号秩次检验)均显著降低细胞死亡，分别>99.99％和99.67％。未处理的MRSA 81M(W＝0；p<0.05；威氏符号秩次检验)在过氧化氢孵育后也显示出细胞死亡的轻微但具有统计学意义的减少(19.70％)；MRSA LA也显示细胞死亡有所减少(16.67％)，但这并不显著(W＝5；p>0.05；威氏符号秩次检验)。

图7为指示伪中间型葡萄球菌C260 22-2011dtqa的FIC指数的柱状图。以0-120mg/mL添加屎肠球菌无细胞上清液，并测量头孢西丁的MIC。数据表明无细胞上清液和头孢西丁具有协同效应。

图8通过β-内酰胺类抗生素头孢西丁(0-250μg/mL)和生物活性代谢物(0-120mg/mL)的组合测试(n＝2)的耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌(MRSP)C260 22-2011dtqa的MIC生长抑制百分比的热图。所有生物学重复以技术重复进行。

发明内容

根据一个方面，提供了一种协同组合，其包括群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物包括肽、小分子、脂质、糖或其组合。

在一个方面，所述肽包括或由以下氨基酸序列中的一个或多个组成：XX[L或I]PPK，其中X表示疏水性氨基酸；X₁X₂[L或I]PPK，其中，X₁选自N、C、Q、M、S和T，并且其中，X₂选自A、I、L和V；MALPPK；CVLPPK；HLLPLP；LKPTPEGD；YPVEPF；YPPGGP；YPPG；NQPY；LPVPK；ALPK；EVLNCLALPK；LPLP；HLLPLPL；YVPEPF；KYVPEPF；EMPFKPYPVEPF；及其通过缺失、取代或插入而改变得到的变体且其中分子的活性没有显著降低，包括具有翻译后修饰的肽和/或其变体，所述翻译后修饰包括糖基化。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物为肽，并且包括或由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基组成，例如包括或由2、3、4、5、6、7、8或9至约3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物的大小小于约4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如大小小于约3000、2000或1000Da。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物在益生菌培养组分中，例如在上清液中。

在一个方面，所述益生菌培养组分为无细胞废培养基(CSFM)，其任选地以液体或干燥形式浓缩(例如通过冻干和/或喷雾干燥)。

在一个方面，所述CSFM的截留分子量大小约为4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如约3000、2000或1000Da。

在一个方面，所述抗生素为氨基糖苷、杆菌肽、β-内酰胺类抗生素、头孢菌素、氯霉素、糖肽、大环内酯类、林可酰胺、青霉素、喹诺酮、利福平、糖肽、四环素、甲氧苄啶、磺胺类或其组合。

在一个方面，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，例如头孢西丁。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于以下属的益生菌的培养基或上清液：气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于肠球菌属，例如屎肠球菌。

在一个方面，所述组合还包括益生菌。

在一个方面，所述益生菌属于气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

在一个方面，所述益生菌为乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或肠球菌属，例如屎肠球菌。

在一个方面，所述益生菌是活的。

在一个方面，所述益生菌以每剂量约1亿至约5亿CFU的量存在，例如以每剂量约2亿CFU的量存在。

根据一个方面，提供了一种包括本文所述的协同组合的组合物。

根据一个方面，提供了一种方法，用于：

(a)使抗生素耐药性感染对抗生素重新敏感，所述方法包括向患有所述感染的受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物；

(b)降低细菌感染对过氧化氢细胞毒性的抵抗，所述方法包括向患有所述感染的受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物；

(c)治疗和/或预防受试者的腹泻，所述方法包括向所述受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素；

(d)治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌(MRSP)，所述方法包括向患有MRSA或MRSP的受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素；

(e)减少细菌中的类胡萝卜素合成，所述方法包括向所述细菌施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物；和/或

(f)使细菌对氧化剂杀灭敏感，所述方法包括向所述细菌施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物。

在一个方面，所述抗生素为氨基糖苷、杆菌肽、β-内酰胺类抗生素、头孢菌素、氯霉素、糖肽、大环内酯类、林可酰胺、青霉素、喹诺酮、利福平、糖肽、四环素、甲氧苄啶、磺胺类或其组合。

在一个方面，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，例如头孢西丁。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物包括肽、小分子、脂质、糖或其组合。

在一个方面，所述肽包括或由以下氨基酸序列中的一个或多个组成：XX[L或I]PPK，其中X表示疏水性氨基酸；X₁X₂[L或I]PPK，其中，X₁选自N、C、Q、M、S和T，并且其中，X₂选自A、I、L和V；MALPPK；CVLPPK；HLLPLP；LKPTPEGD；YPVEPF；YPPGGP；YPPG；NQPY；LPVPK；ALPK；EVLNCLALPK；LPLP；HLLPLPL；YVPEPF；KYVPEPF；EMPFKPYPVEPF；及其通过缺失、取代或插入而改变得到的变体且其中分子的活性没有显著降低，包括具有翻译后修饰的肽和/或其变体，所述翻译后修饰包括糖基化。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物为肽，并且包括或由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基组成，例如包括或由2、3、4、5、6、7、8或9至约3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物的大小小于约4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如大小小于约3000、2000或1000Da。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物在益生菌培养组分中，例如在上清液中。

在一个方面，所述益生菌培养组分为无细胞废培养基(CSFM)，其任选地以液体或干燥形式浓缩(例如通过冻干和/或喷雾干燥)。

在一个方面，所述CSFM的截留分子量大小约为4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如约3000、2000或1000Da。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于以下属的益生菌的培养基或上清液：气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于肠球菌属，例如屎肠球菌。

在一个方面，所述方法还包括向所述受试者施用益生菌。

在一个方面，所述益生菌属于气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

在一个方面，所述益生菌为乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于肠球菌属，例如屎肠球菌。

在一个方面，所述益生菌是活的。

在一个方面，所述益生菌以每剂量约1亿至约5亿CFU的量存在，例如以每剂量约2亿CFU的量存在。

在一个方面，所述受试者为宠物，例如狗。

在一个方面，所述受试者为农场动物，例如猪或家禽。

在一个方面，所述受试者为人。

在一个方面，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和所述抗生素协同作用。

根据一个方面，提供了一种包括本文所述的协同组合或组合物的片剂或胶囊。

根据一个方面，提供了本文所述的协同组合或组合物在本文所述的方法中的用途。

在一个方面，本文所述的协同组合或组合物用于本文所述的方法中。

根据以下详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实施例在指示本发明的实施方式时仅以说明的方式给出，因为根据详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

具体实施方式

在国际专利申请公开号WO2009/155711、WO2015/021530、2018/165764和WO2018/165765中已经描述了用于治疗各种类型的感染的后生元代谢物。这些参考文献中的每一篇通过引用整体并入本文，至少引用关于特定的后生元代谢物、它们的鉴定方法、它们的细菌来源和它们用于治疗的感染的教导。

现已发现，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物在与抗生素组合时协同治疗感染和/或能够影响抗生素耐药性。此外，益生菌无细胞废培养基(CSFM)，其包括MWCO 3000过滤的CSFM，含有群体感应抑制剂，包括后生元代谢物，以及群体感应抑制剂和后生元代谢物本身在与抗生素组合时协同治疗感染。此外，在一些方面，CSFM、群体感应抑制剂和/或后生元代谢物能够克服抗生素耐药性，并且可以使抗生素耐药细菌对常规抗生素重新敏感。在其他方面，本文所述的CSFM、群体感应抑制分子和/或后生元代谢物能够降低细菌感染对过氧化氢细胞毒性的抵抗。

此外，已经在特定群体中测试了许多组合物，并且已经确定了有效剂量和组合。特别地，本文描述了兽医给药和时间表。

定义

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见例如Singleton等人，微生物学和分子生物学词典第2版，约翰·威利父子出版公司(纽约，N.Y.1994)；Sambrook等人，分子克隆，实验手册，冷泉港出版社(冷泉港，NY 1989)，其各自通过引用并入本文。出于本发明的目的，以下术语定义如下。

“源于”是指分子由益生菌直接或间接产生。例如，益生菌可以将分子直接分泌到培养基中。在其他方面，分子可以在培养基内间接形成，例如通过从较长的肽切割，或者可以是分泌到益生菌培养基中或在益生菌培养基中发现/产生的小分子、糖、脂质等。

“分离的”是指已经从其来源纯化或已经通过重组或合成方法制备并纯化的分子。纯化的蛋白质基本上不含其他氨基酸。“基本上不含”在本文中意指少于约5％、通常少于约2％、更通常少于约1％、甚至更通常少于约0.5％、最通常少于约0.1％被其他来源氨基酸污染。

“基本上纯的”组合物是指基于该组合物的总重量，包括至少约90重量％的所讨论的分子的组合物，基于该组合物的总重量，包括通常至少约95重量％，更通常至少约90重量％，甚至更通常至少约95重量％，甚至更通常至少约99重量％的所讨论的分子的组合物。

如本文所用，“治疗”或“疗法”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本文所述的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”和“疗法”还可以意指与如果不接受治疗或疗法的预期存活相比延长存活。因此，“治疗”或“疗法”是为了改变病症的病理学而进行的干预。具体地，治疗或疗法可以直接预防、减缓或以其他方式减少疾病或病症(例如感染)的病理学，或者可以使感染更易受其他治疗剂的治疗或疗法的影响。

术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”是指当施用于受试者(包括哺乳动物，例如人)时，足以实现所需结果的量，例如有效治疗感染的量。本文所述分子的有效量可根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。如本领域技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳治疗反应。

此外，具有治疗有效量的受试者的治疗方案可由单次施用组成，或者可选地包括一系列应用。治疗期的长度取决于多种因素，如疾病的严重程度和/或部位、受试者的年龄、药剂的浓度、患者对药剂的反应性或其组合。还应当理解，用于治疗的药剂的有效剂量可在特定治疗方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定法，剂量的变化可能导致并变得显而易见。在一些方面，本文所述的分子可以在用所讨论的疾病或病症(如感染)的常规疗法治疗之前、期间或之后施用。

如本文所用的术语“受试者”是指动物界的任何成员，包括禽类、鱼类、无脊椎动物、两栖动物、哺乳动物和爬行动物。通常，受试者是人或非人脊椎动物。非人脊椎动物包括家畜动物、伴侣动物和实验室动物。非人受试者还具体包括非人灵长类动物以及啮齿动物。非人受试者还具体包括但不限于家禽、鸡、马、牛、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、仓鼠、水貂、兔、甲壳类动物和软体动物。通常，受试者是家禽或哺乳动物。术语“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、其他高等灵长类动物、家畜和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。通常，哺乳动物是人。

与一种或多种另外的药剂“组合”施用包括同时(并行)和以任何顺序连续施用。

术语“药学上可接受的”是指化合物或化合物的组合与用于药物用途的制剂的其余成分相容，并且根据既定的政府标准，包括由美国食品和药物管理局颁布的那些标准，其通常对人给药是安全的。

在理解本申请的范围时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个元件。另外，如本文所使用的术语“包括(comprising)”及其派生词旨在是开放式术语，其指定所述特征、元件、部件、组、整数和/或步骤的存在，但不排除其他未陈述的特征、元件、部件、组、整数和/或步骤的存在。前述内容也适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括(including)”、“具有”及其派生词。

应当理解，描述为“包括”某些组分的任何方面也可以“由......组成”或“基本上由......组成”，其中“由......组成”具有封闭式或限制性含义，并且“基本上由......组成”意指包括指定的组分但排除除了作为杂质存在的材料、由于用于提供组分的方法而存在的不可避免的材料、以及为了实现本发明的技术效果之外的目的而添加的组分之外的其他组分。例如，使用短语“基本上由……组成”定义的组合物涵盖任何已知的药学上可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常，基本上由一组组分组成的组合物将包括小于5重量％的未指定组分，通常小于3重量％，更通常小于1重量％。

应当理解，本文定义为包括的任何组分可以通过附带条件或否定限制的方式明确地从要求保护的发明中排除。例如，在一些方面，本文所述的分子不是细菌素。

另外，本文中给出的所有范围包括范围的末端以及任何中间范围点，无论是否明确说明。

最后，如本文所用的诸如“基本上”、“约”和“大约”的程度术语意指修饰的术语的合理偏差量，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包括修饰术语的至少±5％的偏差，如果该偏差不会否定其修饰的词语的含义。

群体感应抑制剂和包括群体感应抑制剂的组合物

本发明提供了群体感应抑制剂和后生元代谢物以及培养组分，例如来源于益生菌的无细胞废培养基(CSFM)。本文在一些方面中描述的分子可以最小化、抑制、治疗和/或预防受试者中的感染，可以使抗生素耐药细菌对其先前耐药的抗生素重新敏感，或者可以与抗生素协同作用以最小化、抑制、治疗和/或预防感染。在可选或另外的方面，分子可以起到降低细菌感染对过氧化氢细胞毒性的抵抗的作用。还考虑了这些分子的组合，例如其中一种这样的分子可以是肽，一种可以是另一种类型的分子，例如脂质、糖、小分子等。在本文所述的组合物中也考虑了肽分子的组合。

在一些方面，分子是小分子，通常是蛋白质的，其是耐热的(可以被加热、冷冻和解冻并且仍然表现出活性)，长期冷冻稳定(超过两年)，可以容易地大量生产(例如约2mg/L)，可以浓缩，和/或可以通过诸如冻干和/或喷雾干燥的方法干燥。在一些方面，分子可以是蛋白质、小肽、小分子、脂质、糖等。可以存在这样的分子的组合，其协同工作以实现本文所述的效果。所述分子通常存在于如本文所述的益生菌培养物的上清液中，并且所述上清液可以作为CSFM或作为具有特定截留分子量大小约为4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da(诸如约3000、2000或1000Da)的CSFM组分提供，这意味着所述分子大小小于约4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如大小小于约3000Da、2000Da或1000Da。

通常，分子是肽，并且肽的长度通常约为2至10个氨基酸残基。本文所述的分子通常作为来自益生菌培养物的浓缩的CFSM施用。应当理解，国际专利申请公开号WO2009/155711、WO2015/021530、2018/165764和WO2018/165765中描述的任何特定分子通过引用并入本文。

简言之，分子包括例如包含或由以下氨基酸序列中的一个或多个组成的肽：MALPPK、CVLPPK、HLLPLP和LKPTPEGD。本领域技术人员应理解，这些序列可以通过缺失、取代或插入来改变，只要分子的活性没有显著降低即可。例如，序列可以包括或由XX[L或I]PPK组成，其中X表示疏水性氨基酸。另外，该序列可包括或由X₁X₂[L或I]PPK组成，其中X₁选自N、C、Q、M、S和T，并且其中，X₂选自A、I、L和V。此外，该分子包括，例如，包含或由以下氨基酸序列中的一个或多个组成的肽：YPVEPF、YPPGGP、YPPG、NQPY、LPVPK、ALPK、EVLNCLALPK、LPLP、HLLPLPL、YVPEPF、KYVPEPF和EMPFKPYPVEPF。通常，肽包括或由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基组成，通常包括或由2、3、4、5、6、7、8、或9至约3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成。应当理解，分子可以以任何组合使用，单独或共同分离，或由培养基中的益生菌产生。培养基(例如CFSM)可以例如浓缩液体或粉末的形式提供。

分子还可以具有一个或多个氨基酸残基的插入、取代或缺失。此外，本文所述的分子可以进一步用糖基化、非糖基化、有机和无机盐改变并共价修饰。还涵盖经修饰以增加体内半衰期的分子，例如聚乙二醇化。对本文所述分子的可能但非限制性的修饰包括包含氨基酸取代与一个或多个氨基酸的缺失或一个或多个氨基酸的添加的组合的修饰。

特别地，任何益生菌物种可以用作本文所述分子的来源，包括例如气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

具体的益生活性乳酸菌物种包括，例如，粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、食品乳杆菌、干酪乳杆菌代田菌、干酪乳杆菌副干酪亚种、干酪乳杆菌干酪亚种、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、德氏乳杆菌保加利亚亚种、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌副干酪亚种、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、粪链球菌、屎链球菌、唾液链球菌和嗜热链球菌。另外的示例包括益生活性双歧杆菌物种，包括婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌及其组合。

其他益生菌物种包括例如益生活性灿烂类芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、变异微球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜盐片球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌，以及在EP公开号0576780中描述的干酪乳杆菌亚种鼠李糖菌株LC-705，DSM 7061以及在US5908646中描述为鼠李糖乳杆菌LC-705，DSM 7061的微生物，单独或与丙酸杆菌属的细菌或干酪乳杆菌的另一种菌株组合。

可以产生本文所述分子的特定益生菌菌株包括例如动物双歧杆菌菌株DSM15954、长双歧杆菌婴儿亚种菌株DSM15953、长双歧杆菌长亚种菌株DSM15955、屎肠球菌菌株DSM15958、嗜酸乳杆菌菌株DSM13241(也称为La-5或La-21)、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM15956、瑞士乳杆菌菌株DSM14998、瑞士乳杆菌DSM14997、乳酸乳球菌菌株DSM14797、嗜热链球菌菌株DSM15957、发酵乳杆菌菌株ATCC55845、鼠李糖乳杆菌菌株ATCC55826及其组合。

在典型的方面，分子来源于例如嗜酸乳杆菌(包括菌株DSM13241)、片球菌属菌株、双歧杆菌属菌株(例如但不限于长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和粗乳酸双歧杆菌)、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌及其组合。

同样，任何已知的抗生素可以在施用分子之前、之后和/或期间与本文所述的分子组合使用。抗生素的一般类别包括例如氨基糖苷类、杆菌肽、β-内酰胺类抗生素、头孢菌素、氯霉素、糖肽类、大环内酯类、林可酰胺类、青霉素类、喹诺酮类、利福平、糖肽、四环素类、甲氧苄啶和磺胺类。在一些方面，分子和抗生素的组合的施用间隔足够近，使得实现协同效应。

上述类别内的示例性抗生素提供如下。这些中的任何一种可以单独使用或以各种组合使用。示例性氨基糖苷类包括链霉素、新霉素、弗拉霉素、帕普霉素、核糖霉素、卡那霉素、阿米卡星、地贝卡星、妥布霉素、潮霉素B、壮观霉素、庆大霉素、奈替米星、西索米星、异帕米星、威大霉素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素和巴龙霉素。示例性碳头孢烯类包括氯碳头孢(Loracarbef)(氯碳头孢(Lorabid))。示例性碳青霉烯类包括厄他培南(Ertapenem)、厄他培南(Invanz)、多利培南、多尼培南、亚胺培南/西司他丁(Cilastatin)、西司他丁(Primaxin)、美罗培南(Meropenem)和美罗培南(Merrem)。示例性头孢菌素类包括头孢羟氨苄(Cefadroxil)、头孢羟氨苄(Durisef)、头孢唑啉(Cefazolin)、头孢唑啉(Ancef)、头孢噻吩(Cefalotin)、头孢噻吩(Cefalothin)、头孢噻吩(Keflin)、头孢氨苄(Cefalexin)、头孢氨苄(Keflex)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢克洛(Ceclor)、头孢孟多(Cefamandole)、头孢孟多(Mandole)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢西丁(Mefoxin)、头孢丙烯(Cefprozill)、头孢丙烯(Cefzil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢呋辛(Ceftin)、新菌灵、头孢克肟(Cefixime)、头孢克肟(Suprax)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢地尼(Omnicef)、头孢托仑(Cefditoren)、头孢托仑(Spectracef)、头孢哌酮、先锋必、头孢噻肟、凯福隆、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢布坦、头孢唑肟、头孢曲松、菌必治、头孢吡肟、马斯平以及头孢吡普。示例性糖肽包括达巴万星、奥利万星、替考拉宁、万古霉素(Vancomycin)和万古霉素(Vancocin)。示例性的大环内酯类包括阿奇霉素(Azithromycin)、希舒美、舒美特、阿奇霉素(Zitrocin)、克拉霉素(Clarithromycin)、克拉霉素(Biaxin)、地红霉素、红霉素(Erythromycin)、红霉素(Erythocin)、琥乙红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、肯立克和壮观霉素。示例性的单内酰环类包括氨曲南。示例性青霉素类包括阿莫西林(Amoxicillin)、阿莫西林(Novamox)、阿莫西林(Amoxil)、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林(Flucloxacillin)、氟氯西林(Floxapen)、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素和替卡西林。示例性的多肽包括杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B。示例性的喹诺酮类包括环丙沙星(Ciprofloxacin)、环丙沙星(Cipro)、环丙沙星(Ciproxin)、环丙沙星(Ciprobay)、依诺沙星、加替沙星(Gatifloxacin)、加替沙星(Tequin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、左氧氟沙星(Levaquin)、洛美沙星、莫西沙星(Moxifloxacin)、莫西沙星(Avelox)、诺氟沙星(Norfloxacin)、诺氟沙星(Noroxin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、氧氟沙星(Ocuflox)、曲伐沙星和特洛芬。示例性的磺胺类包括磺胺米隆、百浪多息、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明(co-trimoxazole))和复方新诺明(Bactrim)。示例性的四环素类包括地美环素、多西环素(Doxycycline)、多西环素(Vibramycin)、米诺环素(Minocycline)、米诺霉素(Minocin)、土霉素(oxytetracycline)、土霉素(Terramycin)、四环素(Tetracycline)和四环素(Sumycin)。其他示例性的抗生素包括撒尔佛散、氯霉素(Chloramphenicol)、氯霉素(Chloromycetin)、克林霉素(Clindamycin)、克林霉素(Cleocin)、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、夫西地酸、立思丁、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑胺(Linezolid)、利奈唑胺(Zyvox)、甲硝唑、灭滴灵、莫匹罗星、百多邦、呋喃妥因(Nitrofurantion)、呋喃妥因(Macrodantin)、呋喃妥因(Macrobid)、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀(Sycerid)、利福平(Rifampin)(利福平(rifampicin))和替硝唑。在一些方面，示例性的抗生素包括木糖醇、过氧化氢(无论是来源于免疫细胞还是其他来源)、氯己定、地莫匹醇(delmopinol)、地莫匹醇(decapinol)、次氯酸盐、二氧化氯和氯化十六烷基吡啶。

可以将分子掺入多种物质中以施用于受试者，例如任何类型的动物和人。例如，可以将分子掺入任何类型的食物产品、营养补充剂或饮料中用于动物或人类消费，包括动物饲料或饮料。

作为治疗剂，本文所述的分子可以以某种方式施用于动物或人以有效治疗感染，包括使感染重新敏感以通过常规抗生素治疗和/或降低细菌感染对过氧化氢细胞毒性的抵抗。作为治疗或预防药，治疗可以根据需要与其他疗法结合。在另一个实施方式中，除了使用全益生菌之外，本文所述的分子还可用于组合物和方法中。或者，可以单独使用全益生菌，条件是培养和/或使用细菌，使得在培养基中以治疗有效量产生分子。

在广义方面，本文所述的分子可以单独或在组合物内以治疗有效量提供，并且其量可以根据诸如接受者的感染状态/健康、年龄、性别和体重等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应，并且剂量方案可以由主治医师或兽医酌情决定。例如，可以每天或以周期性间隔施用几个分开的剂量，和/或可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。用于施用的分子的量将取决于施用途径、施用时间，并且可以根据个体受试者反应而变化。合适的施用途径是例如经由局部、口服、直肠或肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)途径。此外，可以将分子掺入聚合物中以允许缓释，将聚合物植入期望递送的位置附近，例如在感染部位，或者聚合物可例如皮下或肌肉内植入或静脉内或腹膜内递送，以导致本文所述分子的全身递送。

本文所述的分子可以以例如片剂、胶囊、锭剂、扁囊剂、溶液、悬浮液、乳液、粉末、气溶胶、栓剂、喷雾剂、软锭剂、软膏、乳膏、糊剂、泡沫、凝胶、卫生栓、子宫托、颗粒、大丸剂、漱口剂或透皮贴剂的形式施用。所述分子可以作为无细胞上清液施用，在一些方面，所述无细胞上清液是无细胞上清液浓缩物。该浓缩物可以是液体或粉末形式。

制剂包括适于口服、直肠、经鼻、吸入、局部(包括皮肤、透皮、口腔和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、眼内、气管内和硬膜外)、乳房内或吸入施用的那些制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过常规制药技术制备。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或精细分碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产品成形来制备制剂。

适于口服给药的制剂可以作为离散单位存在，例如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂；作为粉末或颗粒存在；作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液存在；或作为水包油液体乳液或油包水乳液等存在。

片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分一起压缩或模制来制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂和/或分散剂混合的呈自由流动形式(诸如粉末或颗粒)的本文所述的分子来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以便提供其中的活性成分的缓释或控释。

适于在口中局部给药的制剂包括锭剂，其包括在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中的成分；软锭剂，其包括在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分；和漱口剂，其包括在合适的液体载体中的待施用成分。

适于局部施用于皮肤的制剂可以作为软膏、乳膏、凝胶或糊剂存在，其包括在药学上可接受的载体中的待施用的成分。在一个实施方式中，局部递送系统是含有待施用成分的透皮贴剂。

用于直肠给药的制剂可以作为具有合适基质的栓剂存在，所述基质包含如可可脂或水杨酸酯。

其中载体是固体的适于经鼻给药的制剂包括粒度例如在20至500微米范围内的粗粉末，其通过经鼻通道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入来给药。用于施用的合适的制剂(其中载体是液体，例如鼻喷雾剂或滴鼻剂)包括活性成分的水性或油性溶液。

适用于阴道给药的制剂可以作为阴道栓剂、卫生栓、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂存在，其除了活性成分之外还含有本领域已知的合适的成分，例如载体。

适用于吸入给药的制剂可以作为雾、粉剂、粉末或喷雾剂存在，其除了含有活性成分外还含有本领域已知的合适的成分，例如载体。

适于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。适用于肠胃外给药的制剂包括抗血管生成剂的颗粒制剂，包括但不限于低微米或纳米(例如平均横截面小于2000纳米，通常小于1000纳米，最通常小于500纳米)尺寸的颗粒，这些颗粒由本文所述的分子单独或与辅助成分组合或在用于缓释的聚合物中组成。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由先前描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

包括本文所述分子的组合物可包括约0.00001重量％至约99重量％以及其间的任何范围的活性物质。例如，典型的剂量可以包括每300mg剂量约0.1μg至约100μg的本文所述的分子，例如每300mg剂量约0.5μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约25μg、约50μg或约75μg，例如每300mg剂量约0.1μg至约10μg或约1μg至约5μg或约1μg至约2μg(以及所有相关的增量和重量百分比)。

所述分子可以在数小时、数天、数周或数月的时间内施用，这取决于几个因素，包括所治疗的感染的严重程度、是否认为感染的复发可能、或预防感染等。所述施用可以是恒定的，如在数小时、数天、数周、数月等的时间内恒定输注。或者，所述施用可以是间歇性的，如所述分子可以在数天的时间内每天施用一次，在数小时的时间内每小时施用一次，或认为合适的任何其他这样的时间表。

本文所述的组合物可以通过本身已知的用于制备药学上可接受的组合物的方法来制备，所述组合物可以施用于受试者，使得有效量的活性物质与药学上可接受的载体组合成混合物。例如在“药物添加剂手册”(由迈克尔和艾琳·阿什编写，高尔出版公司，奥尔德肖特，英国(1995))中描述了合适的载体。在此基础上，组合物包括但不限于物质与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂的溶液，并且可以包含在具有合适pH的缓冲溶液中和/或与生理流体等渗。在这方面，可以参考美国专利号5,843,456(其全部内容通过引用并入本文)。

药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的，并且包括例如无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。此外，药物组合物可以包括一种或多种稳定剂，例如碳水化合物，包括山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖，蛋白质如白蛋白或酪蛋白，以及缓冲剂如碱性磷酸盐。

在另一个非限制性方面，分子的施用可以通过可能将分子引入消化道的任何方法来完成，例如口服或直肠，之后分子进入血流和/或直接作用于肠道微生物。产生分子和/或分离的分子的细菌可以与载体混合并应用于液体或固体饲料或饮用水。载体材料应对动物无毒。产生分子和/或分离的分子的细菌也可以配制成作为接种糊剂提供的组合物，以直接注射到动物的口中。制剂可包括添加的成分以改善适口性、改善保质期、赋予营养益处等。如果需要可重复和测量的剂量，则可以通过瘤胃插管施用分子，如本文所述。待施用的分子的量由影响功效的因素决定。通过在施用分子之前、期间和之后监测感染，本领域技术人员可以容易地确定例如减少动物携带的感染量和/或使抗生素耐药性细菌感染对抗生素重新敏感和/或降低细菌感染对过氧化氢细胞毒性的抵抗所需的剂量水平。来自一种或多种益生菌菌株的分子可以一起施用。菌株的组合可以是有利的，因为个体动物在最有效的菌株方面可能不同。

无论用于预防还是治疗，用于施用分子的方法基本上是相同的。因此，消除了首先确定病原性感染是否由动物携带的需要。通过常规地向畜群的所有动物施用有效剂量，可以通过预防和治疗的组合显著降低或消除病原性感染污染的风险。

本领域技术人员应理解，所述分子和含有所述分子的培养组分可以与用于预防和/或治疗受试者中的感染的已知疗法结合使用。还应理解，本文所述分子的组合物，无论是分离的还是在培养组分中或与益生菌和/或抗生素结合的，也可以与糖源(例如葡萄糖)结合(配制)使用，所述糖源的量为组合物重量的至多约0.01％至约0.1％或更多。

还应当理解，尽管本文所述的组合物可以直接摄入或作为添加剂与食品结合使用，但是应当理解，它们可以掺入各种食品和饮料中，包括但不限于酸奶、冰淇淋、奶酪、烘焙产品如面包、饼干和蛋糕、乳制品和乳制品替代食品、糖食产品、食用油组合物、涂抹食品、早餐谷物、果汁、肉类、农产品等。在术语“食物”的范围内，包括可能被归类为功能性食物的特定食物，即“外观上类似于常规食物并且旨在作为正常饮食的一部分食用，但是已经改变为除了提供简单营养之外的生理作用的食物”。类似地，本文所述的组合物可以以剂型存在，例如胶囊或干燥和压制的片剂或直肠或阴道栓剂，或作为气溶胶或吸入器存在。同样，活性分子的量将根据特定的食品或饮料而变化，并且可以含有高达约100％的产品的任何量，特别是当配制成可摄取的胶囊/片剂时。

本领域技术人员还理解，本文所述的分子，无论是分离的还是作为培养组分提供的，都可以与益生菌在治疗方法中或用于营养补充的用途组合。在特定方面，本文所述的分子可以与衍生该分子的物种的活益生菌组合。在其他方面，这些细菌物种可以从组合物中排除。在其他方面，本文所述的分子可以与不产生分子的物种的活益生菌组合。

使用方法

出乎意料的是，已经发现本文所述的分子，无论是以分离的形式还是以可衍生分子的细菌的形式施用，都可用于治疗感染，在肠道或非肠道感染的方面，下文具体描述了许多感染。

在特定方面，本文所述的分子彼此协同作用和/或与抗生素或其他抗感染剂协同作用以治疗和/或预防肠道或非肠道感染和/或降低肠道或非肠道感染的毒力，包括降低抗生素耐药性和/或增加特定病原微生物对常规治疗如抗生素的敏感性。

从上文显而易见的是，本文所述的分子可用于治疗多种病原体，包括细菌、病毒、酵母、真菌和寄生虫。在一些方面，该病原体是肠道或非肠道的和/或感染是在肠道或非肠道部位。

例如，本文所述的分子可用于治疗来自选自由以下组成的组的属的细菌感染：营养缺陷菌属、无色杆菌属、氨基酸球菌属、食酸菌属、不动杆菌属、放线杆菌属、放线棒菌属、马杜拉放线菌属、放线菌属、气球菌属、气单胞菌属、阿菲波菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、差异球菌属、交替单胞菌属、无枝酸菌属、拟无枝酸菌属、厌氧螺菌属、棍状厌氧菌属、结肠菌毛样螺旋体(Anguillina)、蛛网菌属、隐秘杆菌属、弓形杆菌属、节杆菌属、奇异菌属、金杆菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、浴者菌属、巴尔通氏体属、伯杰菌属、双歧杆菌属、嗜胆菌属、布兰汉氏球菌属、包柔氏螺旋体、博代氏杆菌属、短螺旋体属、短芽孢杆菌属、短杆菌属、短波单胞菌属、布鲁氏菌属、伯克氏菌属、布丘氏菌属、丁酸弧菌属、鞘杆菌属、弯曲菌属、二氧化碳噬纤维菌、心杆菌属、卡氏菌属、西地西菌属、纤维单胞菌属、石胡荽属、衣原体属、嗜衣原体属、色杆菌属、金黄杆菌属、金色单胞菌属、柠檬酸杆菌属、梭菌属、柯林斯氏菌属、丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、柯克斯氏体属、神秘杆菌属、戴尔福特菌属、皮杆菌属、嗜皮菌属、脱硫单胞菌属、脱硫弧菌属、小类杆菌属、腐蹄杆菌属、狡诈球菌属、狡诈菌属、爱德华菌属、埃格特菌属、埃立克体属、艾肯菌属、稳杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、丹毒丝菌属、埃希氏杆菌属、真杆菌属、爱文菌属、微小杆菌属、费克蓝姆氏菌属、产线菌属、黄单胞菌属、黄杆菌属、Flexispira、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、加德纳氏菌属、孪生球菌属、球链菌属、戈登氏菌属、嗜血杆菌属、哈夫尼菌属、螺杆菌属、赫罗球菌属、霍尔德曼氏菌属、不活动粒菌属、约翰森氏菌属、金氏菌属、克雷白氏杆菌属、考克氏菌属、科泽氏菌属、库特氏菌属、盖球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、劳特罗普氏菌属、勒克氏菌属、军团菌属、勒米诺菌属、钩端螺旋体属、纤毛菌属、明串珠菌属、李斯特菌属、利斯顿氏菌属、巨球形菌属、甲基杆菌属、微杆菌属、细球菌属、光岗菌属、动弯杆菌属、米勒氏菌属、莫拉氏菌属、摩根氏菌属、分枝杆菌属、支原体属、香味菌属、奈瑟氏菌属、诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属、苍白杆菌属、厄氏菌属、寡源菌属、东方体属、类芽胞杆菌属、泛菌属、副衣原体属、巴氏杆菌属、片球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、发光杆菌属、发光杆菌属、邻单胞菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、假单胞菌、假诺卡氏菌属、假支杆菌属、嗜冷杆菌属、拉恩氏菌属、劳尔氏菌属、红球菌属、立克次体属、罗沙利马体属、玫瑰单胞菌属、罗氏菌属、瘤胃球菌属、沙门氏菌，新月形单胞菌属、小蛇菌属、沙雷氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、芯卡体属、史雷克氏菌属、鞘脂杆菌属、鞘脂单胞菌属、螺旋菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属、口腔球菌属、链杆菌属、链球菌属、链霉菌属、琥珀酸弧菌属、萨特氏菌属、萨顿氏菌属、塔特姆菌属、泰氏菌属、特布尔西菌属、密螺旋体属、养障体属、冢村氏菌属、苏黎世菌属、脲原体属、漫游球菌属、韦荣球菌属、弧菌属、威克斯氏菌属、沃林氏菌属、黄单胞菌属、嗜线虫致病杆菌、耶尔森氏鼠疫杆菌以及预研菌属。

例如，细菌感染可以由选自以下的细菌引起：欧洲放线菌、乔治亚放线菌、戈氏放线菌、墓地放线菌、伊氏放线菌、麦氏放线菌、内氏放线菌、纽氏放线菌纽氏亚种、纽氏放线菌无硝亚种、龋齿放线菌、瑞丁放线菌、苏黎世放线菌、粘放线菌、解肌节杆菌、卡明斯节杆菌、沃尔沃节杆菌、炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、日本疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、高加索疏螺旋体、麝鼩疏螺旋体、回归热疏螺旋体、达顿线螺旋体、格氏疏螺旋体、赫姆斯疏螺旋体、西班牙疏螺旋体、拉氏疏螺旋体、马氏疏螺旋体、帕克疏螺旋体、波斯疏螺旋体、回归热疏螺旋体、墨西哥疏螺旋体、委内瑞拉疏螺旋体、支气管炎博德特菌、博代氏杆菌、霍氏博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、创口博德特菌、不同梭菌、阿根廷梭菌、巴氏梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、尸毒梭菌、肉毒梭菌、隐藏梭菌、梭状梭菌、匙形梭菌、耳蜗形梭菌、艰难梭菌、谲诈梭菌、戈氏梭菌、乙二醇梭菌、溶血梭状芽胞杆菌、矛形梭菌、溶组织梭菌、吲哚梭菌、无害芽胞梭菌、释义不规则梭菌、柔嫩梭菌、泥渣梭菌、坏死梭菌、诺氏梭菌、乳清酸梭菌、类腐败梭菌、产气荚膜梭菌、梭状杆菌、腐败梭菌、多枝梭菌、败毒梭菌、索氏梭菌、楔状杆菌、生孢梭菌、近端梭菌、共生梭菌、第三梭菌、大肠杆菌、费格森埃希菌、赫氏埃希菌、伤口埃希菌、鸟肠球菌、铅黄肠球菌、盲肠肠球菌、殊异肠球菌、耐久肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、黄色肠球菌、鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌、病臭肠球菌、蒙氏肠球菌、类鸟肠球菌、棉子糖肠球菌、孤立肠球菌、埃及嗜血菌、嗜沫嗜血菌、副嗜沫嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、惰性嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、解鸟氨酸克雷伯菌、产酸克雷伯菌、植生克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、土生克雷伯菌、伊氏李斯特菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、脓肿分枝杆菌、非洲分枝杆菌、蜂房分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、金色分枝杆菌、鸟分枝杆菌、波希米亚分枝杆菌、牛分枝杆菌、布氏分枝杆菌、冬天分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、龟分支杆菌、楚布分枝杆菌、汇合分枝杆菌、出众分枝杆菌、库克分枝杆菌、黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、加的斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、戈登分枝杆菌、古地分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、哈氏分枝杆菌、胞内分枝杆菌、中庸分枝杆菌、海德堡分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、麻风分枝杆菌、莫尔门分枝杆菌、海洋分支杆菌、微小分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、黏液分枝杆菌、新金色分枝杆菌、无色分枝杆菌、外来分枝杆菌、草分支杆菌、瘰疬分枝杆菌、石氏分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、楚尔盖分枝杆菌、土壤分支杆菌、耐热分枝杆菌、三重分枝杆菌、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、沃林斯基分枝杆菌、蟾分枝杆菌、口颊支原体、咽支原体、发酵支原体、生殖支原体、人型支原体、嗜脂支原体、口腔支原体、穿透支原体、及梨支原体、肺炎支原体、类人猿支原体、唾液支原体、嗜精支原体、铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、绿针假单胞菌、荧光假单胞菌、浅黄假单胞菌、门多萨假单胞菌、蒙氏假单胞菌、栖稻假单胞菌、穿孔假单胞菌、类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、非洲立克次体、由小株立克次体、澳洲立克次体、康氏立克次体、猫立克次体、弗诺立克次体、日本立克次体、蒙古立克次体、普氏立克次体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、斯洛伐克立克次体、斑疹伤寒立克次氏体、猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种、猪霍乱沙门氏菌邦戈尔亚种、猪霍乱沙门氏菌双相亚利桑那亚种、猪霍乱沙门氏菌豪顿亚种、猪霍乱沙门氏菌印度亚种、猪霍乱沙门氏菌萨拉姆亚种、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、头葡萄球菌头亚种、头葡萄球菌解脲亚种、山羊葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、科氏葡萄球菌科氏亚种、科氏葡萄球菌解脲亚种、表皮葡萄球菌、假中间葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌人亚种、人葡萄球菌抗新霉素败血症亚种、猪葡萄球菌、中间葡萄球菌、路邓葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、解糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、施氏葡萄球菌施氏亚种、施氏葡萄球菌凝集亚种、松鼠葡萄球菌、模仿葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、无乳链球菌、狗链球菌、停乳链球菌停乳亚种、停乳链球菌似马亚种、马链球菌马亚种、马链球菌兽瘟亚种、海豚链球菌、豕链球菌、产脓链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌星座亚种、星座链球菌咽炎亚种、中间链球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、血链球菌、嵴链球菌、戈登链球菌、副血链球菌、唾液链球菌、前庭链球菌、仓鼠链球菌、变形链球菌、鼠链球菌、表兄链球菌、少酸链球菌、牛链球菌、马链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、溶藻弧菌、鲨鱼弧菌、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌、海鱼弧菌、河流孤菌、弗氏弧菌、霍氏弧菌、梅氏弧菌、拟态弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、鼠疫耶尔森菌、阿氏耶尔森菌、伯氏耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弗氏耶尔森菌、中间耶尔森菌、克氏耶尔森菌、莫氏耶尔森菌、假结核耶尔森菌以及罗氏耶尔森菌。

或者，本文所述的分子可用于治疗选自以下科的病毒：星状病毒科、杯状病毒科、小核糖核酸病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、呼肠孤病毒科、博尔纳病毒科、逆转录病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、乳多空病毒科、细小病毒科、嗜肝DNA病毒科(例如，选自柯萨奇A-24病毒、腺病毒11、腺病毒21、柯萨奇B病毒、博尔纳病病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、加利福利亚脑炎病毒、人乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、科罗拉多蜱传热病病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、登革病毒、埃博拉病毒、细小病毒B19、柯萨奇A-16病毒、HSV-1、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人体免疫缺损病毒、柯萨奇B1-B5、甲型、乙型或丙型流感病毒、拉克罗斯病毒、拉沙病毒、风疹病毒、柯萨奇A或B组病毒、埃可病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、HSV-2、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、小儿麻痹病毒、肠道病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、天花病毒、西部马脑脊髓炎病毒、黄热病毒以及水痘带状疱疹病毒的病毒)。

或者，本文所述的分子可用于治疗酵母或真菌。例如，感染宿主的真菌或酵母选自曲霉属、皮肤癣菌、皮炎芽生菌、念珠菌属、荚膜组织胞浆菌、申克孢子丝菌、荚膜组织胞浆菌和暗色真菌。

如本文所用，术语“寄生虫”或“寄生虫学感染”应被认为是指能够感染另一种生物体(例如人)的除病毒、细菌、真菌或酵母之外的生物体，无论是单细胞的还是多细胞的。此类寄生虫的实例包括例如选自由以下组成的组的寄生虫：锡兰钩虫、十二指肠钩虫、人蛔虫、结肠小袋虫、人芽囊原虫、华支睾吸虫、环孢子虫、脆弱双核阿米巴、阔节裂头绦虫、犬复孔绦虫、肠脑炎微孢子虫、溶组织内阿米巴、蠕形住肠蛲虫、肝片形吸虫、蠕形住肠蛲虫、肝片形吸虫、布氏姜片吸虫、肠贾第鞭毛虫(同义词蓝氏贾第鞭毛虫)、异形异形吸虫、缩小膜壳绦虫、微小膜壳绦虫、氏等孢球虫、横川吸虫、美洲钩虫、猫后睾吸虫、卫氏并殖吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫、日本吸血虫、曼氏血吸虫、牛带绦虫、毛首鞭形线虫、分歧焦虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫、巴西利什曼原虫以及杜氏利什曼原虫。

在一些方面，所述分子通常可用于减少生物膜形成或破坏已经形成的生物膜。所述分子还可用于下调毒力基因，通常是与T3SS相关的毒力基因，以及用于减少病原体与组织和/或表面的附着。还考虑了使用本文所述的分子治疗伤口和治疗和/或预防伤口中的感染。

在某些方面，考虑了特定肠道感染的治疗。例如，鸟分枝杆菌副结核亚种是牛中约翰氏病的原因。美国乳品工业已经报告，由于该疾病，每年损失15亿美元，并且美国22％的乳牛群被感染。它具有T3SS，因此其预期通过使用本文所述的分子来治疗和/或预防。

在更一般的方面，所述分子可以用作常规抗生素疗法的替代或辅助手段，从而减少抗生素使用并减轻抗生素耐药性的发展。

在一些方面，本文所述的分子可以例如通过肠胃外、静脉内、皮下、皮内、肌肉内、颅内、眶内、眼内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、直肠内、阴道内、气溶胶或口服给药来给药。通常，将组合物口服或直接施用于感染部位。

在一些方面，本文所述的分子可以与用于感染的常规治疗(包括例如抗生素)组合、同时或顺序施用。当适当时，本文所述的分子可以与此类常规治疗一起配制。

本文所述的分子可以以任何合适的量使用，但通常以包括约1至约10000ng/kg的剂量提供，例如以约1至约1000ng/kg、约1至约500ng/kg、约10至约250ng/kg或约50至约100ng/kg的剂量提供，例如以约1ng/kg、约10ng/kg、约25ng/kg、约50ng/kg、约75ng/kg、约100ng/kg、约150ng/kg、约200ng/kg、约250ng/kg、约300ng/kg或约500ng/kg的剂量提供。

以上公开内容一般性地描述了本发明。通过参考以下具体实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。根据情况可能建议或呈现的权宜之计，考虑形式上的改变和等同物的替换。尽管本文已经采用了特定术语，但是这些术语旨在描述性意义，而不是为了限制的目的。

实施例

实施例1：后生元代谢物减少感染产气荚膜梭菌的肉鸡的坏死性肠炎症状

摘要

由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎是可影响在无抗生素生产市场的情况下饲养的肉鸡的主要疾病。正在为这个不断增长的市场开发抗生素替代物。后生元代谢物来源于益生菌发酵的无细胞上清液，且它们中断包括产气荚膜梭菌在内的病原菌中的细胞间通讯。本研究的目的是确定后生元代谢物是否可以减少饲料中经口攻击感染产气荚膜梭菌的肉鸡的坏死性肠炎症状。将肉鸡分成5个不同治疗组：(1)空白对照(NTC)；(2)后生元代谢物12mg/kg体重(N-12)；(3)后生元代谢物6mg/kg体重(N-6)；(4)后生元代谢物3mg/kg体重(N-3)；(5)饲料中的0.042％盐霉素(SF)。在第17天用产气荚膜梭菌经口攻击感染禽类，并在第21天评估每个围栏5只随机禽类的病变评分。每天评估总死亡率和坏死性肠炎相关死亡率，同时在第0、17、28和35天记录生长和表现。与NTC处理相比，N-12治疗显著减少了在第21天评估的坏死病变。与NTC处理相比，N-12治疗显著降低了第17-28天之间的坏死性肠炎相关死亡率，导致收获的总围栏重量增加。此外，与NTC和SF治疗相比，N-12、N-6和N-3治疗降低了围栏中结块的褥草的百分比，潜在地导致生产成本的额外益处。

引言

坏死性肠炎(NE)是由产气荚膜梭菌引起的家禽疾病。产气荚膜梭菌是在家禽的盲肠中发现的共生细菌，并且高达37％的肉鸡可受NE影响(Annett等人，2002)。环境条件可导致这种共生细菌变得致病，导致肠和肝中的病变，从而导致饲料转化率降低和死亡率增加。然而，为何共生产气荚膜梭菌转化为致病细菌的病因是多因素的，并且可能与饮食应激的变化、微生物群的破坏、免疫抑制和NetB⁺菌株的存在相关(Moore 2016)。临床症状与坏死性病变和高禽群死亡率相关，而亚临床症状与较差的饲料转化率和生长性能相关。由于高死亡率和差的性能，临床和亚临床症状都可能对工业产生很高的经济影响。先前，NE已通过饲料内抗生素控制，但对这些实践的改变导致NE的发生率增加，从而使家禽生产者寻找替代控制方法。

抗生素在家禽工业中广泛使用，并且在2014年，有27种抗生素在加拿大注册用于鸡，15种注册用于球虫病，4种注册用于NE(Diarra和Malouin，2014)。一些注册用于球虫病的抗生素也有效对抗革兰氏阳性细菌，包括产气荚膜梭菌，其间接增加注册用于NE的抗生素的数量(Williams，2005)。此外，消费者需求和政府政策的变化正在影响家禽工业中抗生素的使用，并将影响肠道疾病，包括球虫病和NE(Cervantes，2015)。已经开发了用于球虫病的活疫苗，然而，由于肠损伤，它们可以使禽类易患NE(Cervantes，2015)。总之，所有这些因素影响开发NE的有效抗生素替代物的需要。已经针对NE测试的抗生素替代物包括：疫苗、益生菌、益生元、有机酸、精油、植物药和铋(Kulkarni等人，2007；Caly等人，2015；Timbermont等人，2010；Diarra和Malouin，2014；Stringfellow等人，2009)。这些抗生素替代物中的大多数表现出强的体外功效，然而体内功效取决于限制产气荚膜梭菌的生长和增殖，这可导致试验重复之间的可变性(Timbermont等人，2010；Stringfellow等人，2009)。这种可变性是研究多因素病原体如产气荚膜梭菌的问题的一部分。此外，菌株之间的毒力因子也可能不同，使得难以开发靶向疫苗(Kulkarni等人，2007)。本文描述了开发有效抗生素替代物的可替代方法，其靶向调节其毒力的细菌通讯系统，产生不依赖于产气荚膜梭菌菌株也不依赖于胃肠道不同区室中的群体的产物。

后生元代谢物是来自乳酸菌的特异性代谢物，其天然地干扰细菌细胞间通信，也称为群体感应。群体感应调节细菌的毒力因子，包括粘附、侵袭和毒素产生，利用后生元代谢物抑制群体感应可减弱毒力因子的表达。本研究的目的是确定特定的后生元代谢物组合物Nuvio是否可以减轻肉鸡中由产气荚膜梭菌经口攻击感染引起的NE症状。

方法

禽类的放置：本研究中的禽类来自商业孵化场，并圈养在科罗拉多质量研究设施(CQR)。在本研究中使用健康雄性Cobb 500，并在孵化场对其进行马立克病疫苗接种，并且在到达CQR时，对禽类进行新城疫和传染性支气管炎疫苗接种，并将禽类随机分成五个治疗组。在放置时，将24只禽类放入每个围栏中，每个治疗组重复11次。在第8天，根据需要剔除或替换禽类，使每个围栏有22只禽类，其中围栏是统计单位。将治疗分配到区组中并在区组内随机化治疗。将该实验中的所有禽类丢弃在现场。所有数据由科罗拉多质量研究(CQR)工作人员收集。方案MS-18-1经CQR IACUC委员会批准。

基础和实验日粮：使用CQR配制日粮在CQR饲料厂制造育雏日粮、育成日粮和基础日粮，并将其在表1中描述。批量制备并储存饲料。使用500磅容量的立式混合器(斯堡罗，黄金谷，明尼苏达州)、4000磅容量的立式混合器(Prater，博林布鲁克，伊利诺伊州)和/或14,000磅水平混合器(H&S制造，马什菲尔德，WI)和加利福尼亚制粒机(CPM公司，克劳福兹维尔，印第安纳州)在CQR进行最终的实验日粮混合、造粒和粉碎。将饲料储存在50磅饲料袋中直至需要。

表1试验期间三阶段日粮的饲料时间表

日粮	形式	期间	每个治疗组混合饲料磅数
				育雏日粮	碎屑	第0-17天	约550
育成日粮	颗粒	第17-28天	约815
				育肥日粮	颗粒	第28-35天	约650

生长条件：将禽类圈养在具有混凝土地面围栏的环境受控设施中(约4'×4'减2.25平方英尺的饲养器)。D0时的禽类密度约为0.573平方英尺/禽，D7时约为0.625平方英尺/禽，D21时约为0.809平方英尺/禽。将禽类用木屑圈养并随意饮水和食物，将使用补充照明，如表2所示。

表2试验期间使用的照明方案和强度

近似禽龄(天)	每24小时持续光照的大致小时数	～光强度(尺烛光)
			0-5	24	1.0-1.3
5-11	12	1.0-1.3
			11-19	12	0.2-0.3
19-30	16	0.2-0.3
			30-35	18	0.2-0.3

实验处理和试验观察：实验处理描述于表3中。未处理的对照NTC禽类不给予饲料或水中的药物。治疗组N-12、N-6和N-3从第12天至第28天在饮用水中分别以12mg/kg体重/天、6mg/kg体重/天和3mg/kg体重/天施用Nuvio(MicroSintesis公司，夏洛特敦，PE)。

表3实验设计

¹在试验开始时放置的禽数(在第8天重新计数后的禽数)

每天新鲜制备产品，并使用液体涂药器(Farmer Boy有限公司，迈尔斯敦，PA)将其在水中施用。为每次处理制备不同的储备溶液，并且每天称重储备溶液以确定消耗的产品的量。相应地调整储备溶液以确保基于水消耗施用正确的剂量。在整个实验期间，向抗生素对照SF禽类以0.042％施用饲料中的盐霉素(赛可喜60，菲布罗动物健康公司，蒂内克市，新泽西)。每天至少两次观察测试设施、围栏和禽类的一般群状况、照明、水、饲料、通风和意外事件。如果在任何一天两次的观察中注意到异常状况或异常行为，则将其记录并添加到研究记录中。每天记录最高和最低温度。每天从每个围栏收集死亡的禽类并计数。在笔纸上记录死亡率并记录死亡原因。基于总死亡率并以百分比计算围栏死亡率和NE相关死亡率。基于第8天重新计数的禽数计算百分比。在第0、17、28和35天称重禽类，并计算这些时间段中的每一个的平均日增重。还测量了最终的围栏重量。从育雏饲料(D0-17)、育成饲料(D18-28)、育肥饲料(D29-35)和整个时期(D0-35)计算饲料消耗量。计算饲料效率和调整的饲料效率以比较不同的生长期。在第21天，使用第一捕获方法从每个围栏随机选择5只禽类。将禽类处死并评估肠病变，以使用表4中的量表对病变评分的严重程度进行评分。

表4用于评估病变评分的量表

产气荚膜梭菌培养液的制备和施用。产气荚膜梭菌培养物获自微生物研究公司。产气荚膜梭菌(CL-15，α毒素和β2毒素)通过饲料给药。CL-15是来自科罗拉多肉鸡疾病爆发的产气荚膜梭菌野生株。将培养物在含有淀粉的流体巯基乙酸盐培养基中于37℃生长约5小时。在研究第17天将产气荚膜梭菌CL-15培养物与饲料混合。从禽类中取出来自每个围栏的饲养器的饲料4-8小时。对于每个围栏，将2.5ml/禽的肉汤培养物与饲养器托盘中的每只禽25g饲料混合。在施用1-2小时内食用饲料。

褥草评分的评估。在试验的第28天评估来自每个围栏的褥草。基于围栏中结块的褥草的百分比评估褥草。百分比分组为0-19、20-39、40-59、60-79、和80-100％。来自百分比范围的中值用于计算平均围栏褥草评分。

结果

死亡率和坏死性肠炎相关死亡率

在整个试验中收集禽类死亡率，并记录死亡原因。基于日粮，将试验设置为三个时期：D0-17育雏(攻击感染前)、D17-28育成(攻击感染后后)和D28-35育肥(攻击感染后)。表5中的数据指示在这些时期中的每一个期间NE相关死亡率和总死亡率。在育雏期期间没有NE相关的死亡，在此期间的死亡问题主要是由于猝死综合征、肌肉-骨骼问题和细菌感染。对于所有治疗组，在此期间的死亡率范围为0.41-3.7％。

表5不同生长期的总死亡率和坏死性肠炎相关死亡率

括号表示在重新计数后第8天每个治疗组的禽类的百分比表示的死亡率

^*与对照处理相比，基于坏死性肠炎相关死亡率的围栏分级比较的显著性水平

在试验的第17天，用饲料中的产气荚膜梭菌攻击感染禽类。在经口攻击感染之后，在所有治疗组中NE相关死亡率增加。SF组具有1.7％的最小死亡率，其次是N-12组具有9.9％的死亡率。当基于围栏严重程度的差异比较死亡率时，与NTC的禽类相比，这两个治疗组在统计学上是不同的(p＝0.0001)。另外两组N-6和N-3具有14.9％和20.3％的NE相关死亡率，但与对照组15.3％的NE相关死亡率没有统计学差异。在此期间的总死亡率显示相似的趋势，表明所有组之间的其他死亡率相似。围栏排序比较基于严重性评估差异，因为并非对照组中的所有围栏都显示相同水平的临床症状，尽管它们被给予相同剂量的产气荚膜梭菌。这种类型的分析可用于基于攻击感染水平来评估治疗可执行的程度。

对于所有治疗组，育肥期期间的死亡率降低。在此期间NE相关死亡率范围为0-1.7％，并且总死亡率范围为0.8-2.1％。表5中的数据表明，大多数死亡率与NE相关，并且在育成期期间最普遍。在35天期间，最低NE相关死亡率在SF组中为2.1％(P＝0.0001)，其次是N-12组中为11.2％(P＝0.0067)。N-6组与阴性对照没有统计学差异，表明N-12是降低NE相关死亡率的最低有效剂量。在整个实验期间，在阴性对照中有41只因NE死亡的禽类，而在N-12组中仅有27只死亡，这使总NE相关死亡率降低了34％。

肠道病变评分

在第21天评估禽类的小肠中的坏死病变。从每个围栏中随机捕获五只禽类并实施安乐死。进行尸体解剖并打开小肠以使用表4中所述的标准对NE相关病变的严重程度进行评分。将来自5只禽类的病变评分取平均值以计算围栏病变评分。治疗平均值示于表6中，并且基于围栏分级比较计算统计学显著性。NTC组中的平均病变评分为1.62和N-12中的平均病变评分为1.38，病变评分降低了14.8％。这两个治疗组在统计学上是不同的P＝0.039。然而，基于围栏等级差异，N-6和N-3与NTC组没有统计学差异。SF治疗将平均病变评分统计学上降低至0.80，这与NTC的禽类相比降低了50.6％。由于其他两个治疗组N-6和N-3与NTC相比没有显示统计学差异，N-12是减少这种产气荚膜梭菌CL-15菌株的坏死病变的最低有效剂量。

表6在第21天评估坏死性肠炎病变评分

治疗	平均病变评分	显著性水平<sup>*</sup>
			NTC	1.62	-
N-12	1.38	p＝0.039
			N-6	1.64	p＝0.875
N-3	1.93	p＝0.094
			SF	0.80	P＝0.0006

^*围栏等级差异的比较

生长性能和饲料效率

表7中的数据表明，Nuvio和盐霉素在任何时间段期间均未在统计学上改善增重或平均日增重。然而，与阴性对照相比，N-12和N-6两者在育成攻击感染后期(D17-28)期间的增重和平均日增重存在数值改善。与NTC相比，N-12组每只禽类生长额外5克(+0.53％)，并且N-6组每只禽类生长7克(+0.75％)。相反，SF组在同一时期比NTC组生长少2克(-0.21％)。

表7不同生育期的平均增重和平均日增重

无统计学差异

饲料转化率(FCR)和调整的FCR示于表8中。数据表明，Nuvio治疗和盐霉素没有在统计学上改善这些生长参数。然而，在攻击感染期(D17-28)期间，N-12中的FCR与阴性对照相比有14.6％的改善，N-6中的FCR有11.5％的改善，N-3治疗中的FCR有0.5％的改善。在攻击感染期期间，FCR和施用的Nuvio的量的改善似乎存在剂量反应。对于N-6和N-12剂量，对于调整的FCR观察到类似的趋势。此外，在整个0-35天期间，N-6和N-12剂量的FCR和调整的FCR都优于阴性对照，尽管百分比差异较低。N-12剂量的FCR具有2.4％的改善，并且N-6剂量具有0.82％的改善，并且类似地，N-12剂量的调整的FCR具有0.34％的改善，并且N-6剂量具有0.14％的改善。在攻击感染期期间饲料转化率的改善表明Nuvio可以允许禽类更有效地消化食物，尽管具有坏死病变。这对于N-6剂量甚至更明显，其中病变评分1.62与1.64相比或NE死亡率46至39没有统计学差异，但与NTC相比FCR有11.5％的改善。这种改善可能与亚临床NE病例相关，其中死亡率低但对饲料效率有很大影响。

表8在不同生长期期间的饲料增重比和调整的饲料增益比

无统计学差异

尽管对于任何治疗，任何禽类重量没有统计学差异，但最终围栏重量之间存在统计学差异，因为最终围栏重量考虑了禽类死亡率的差异。表9中的数据表明，最重的围栏与SF治疗相关，平均围栏重量为34.59kg。N-12和N-6剂量与其他三个治疗组在统计学上不同，但这两种剂量之间没有统计学差异，分别为30.87kg和30.14kg。N-3和NTC没有统计学差异，分别为29.22和29.26kg。显然，死亡率对最终围栏重量具有很大影响，导致与NTC相比，N-12的收获重量增加5.5％，并且N-6剂量的收获重量增加3.0％。如预期的，由于死亡率大幅降低，SF的收获重量增加18.2％。

表9第35天的围栏活重

治疗	围栏平均重量(kg)
		NTC	29.26c
N-12	30.87b
		N-6	30.14b
N-3	29.22c
		SF	34.59a

字母表示统计学显著性LSD p<0.05单尾检验

褥草的评估

在试验的第28天评估来自每个围栏的褥草。使用20％增量的百分比范围评估结块的褥草的百分比。结块的褥草是褥草水分的指标。SF治疗具有79％的平均百分比，并且在统计学上高于NTC的72％。Nuvio治疗具有更干燥的褥草，其中N-12具有59％的最干燥的褥草，N-6具有63％的最干燥的褥草和N-3具有65％的最干燥的褥草。N-12和N-6治疗在统计学上低于NTC处理。这表明与NTC和SF治疗相比，接受Nuvio的禽类具有更干燥的褥草。

讨论

Nuvio含有后生元代谢物，其是在益生菌如屎肠球菌的发酵期间产生的代谢物。使肉鸡在小围栏中生长，并在饲料中用产气荚膜梭菌经口攻击感染肉鸡。坏死性肠炎的症状由死亡率、小肠的坏死性病变和饲料效率表示。将三种不同剂量的Nuvio与盐霉素(商业上用于预防坏死性肠炎的离子载体)以及NTC进行比较。数据表明N-12是降低死亡率和坏死病变的最小有效剂量。与NTC相比，该剂量能够将坏死性肠炎相关的死亡率降低34％。死亡率的降低在统计学上是不同的，并且表明Nuvio是有效的抗生素替代物。

当考虑到对生产者的经济影响时，死亡率的降低是重要的，因为NE通常影响具有较高强饲量的年老的禽类。不幸的是，没有记录NE相关死亡率，因使用了低毒力菌株或实验设计不允许统计比较(Stringfellow等人，2009；Timbermont等人，2010)。相反，坏死性病变的评估通常是肉鸡研究的一部分。在该研究中，N-12剂量将病变评分从1.62降低至1.38，其降低了14.8％。通常，病变评分与产气荚膜梭菌CFU/g正相关(Timbermont等人，2009；McReynolds等人，2009)，然而，产气荚膜梭菌CFU/g和病变评分通常存在很大差异，如，具有相同菌株的阳性对照产生1.33和1.28的病变评分，而CFU/g分别为2630和61659(McReynolds等人，2009)。此外，比较来自两个不同研究的两种菌株，一个阳性对照具有2.34的病变评分，产气荚膜梭菌CFU/g为1737，而来自另一研究的其他阳性对照具有来自不同试验的1.33、1.28和2.15的病变，并且产气荚膜梭菌CFU/g值分别为2630、61659和91201(Timbermont等人，2009；McReynolds等人，2009)。产气荚膜梭菌群体的这种大变化和病变评分的小差异表明病原体的毒力以及影响毒力的环境因素是重要的。

病变评分的降低允许禽类改善其FCR，在攻击感染期间，与对照相比，接受N-12的禽类具有14.6％的改善。尽管数据与对照没有统计学差异，但这种积极改善表明Nuvio可以改善饲料效率，同时用产气荚膜梭菌攻击感染并从产气荚膜梭菌中回收禽类。尽管事实上，最终禽重量与任何其他治疗没有差异，N-12能够将最终围栏重量增加5.5％，这可以在大规模生产中显著改善生产者的利润。总之，数据表明N-12剂量可有效治疗产气荚膜梭菌的中毒性至高毒性菌株，因为其作用模式取决于减弱病原体的毒力而不是抑制其生长。

N-6剂量不能降低坏死性肠炎相关的死亡率或病变评分，但在攻击感染期间FCR有数值改善，并且最终围栏重量有统计学改善。该数据表明，该剂量可有效减少与生长和性能相关的坏死性肠炎的亚临床体征。该剂量能够将FCR提高11.5％并将最终围栏重量增加3％。坏死性肠炎的亚临床病例在肉鸡行业中频繁发生，并且由于较低的最终禽重和饲料浪费，可能对生产者利润产生很大影响(M'Sadeq等人，2015)。该剂量可有效治疗亚临床坏死性肠炎或在非攻击感染情况下改善禽群健康。总之，该数据表明，来自乳杆菌培养物的无细胞上清液可以积极地影响微生物组并改善微生物组屏障功能，从而改善家畜健康和性能。

有许多因素可以影响褥草干燥度，包括禽群密度、通风、褥草深度、日粮和细菌感染(Williams，2005；Cervantes，2015)。表10中的数据表明，接受Nuvio的禽类比NTC和SF治疗的禽类具有更干燥的褥草评分。假设所有治疗组之间的禽群密度、通风、褥草深度和日粮相同，则Nuvio可能影响肠道细菌感染或改善禽类的微生物组，导致更干燥的粪便。由于高达6.3％的禽类饲料可来自褥草(Malone等人，1983)，并且湿褥草可以是来自粪便的病原体生长的来源，因此较干燥的褥草可以减少将来口服摄取褥草引起的感染。主成分分析表明，褥草水分是影响褥草中微生物种群的主要因素(Lovanh等人，2007)。在褥草中发现的细菌群体也类似于在回肠和盲肠中发现的群体，其可以由葡萄球菌属物种主导(Lovanh等人，2007；Pedroso等人，2013)。湿褥草还可以增加氨的挥发和产氨细菌的量(Rothrock等人，2008)。褥草和大气中增加的氨也可导致增加的肘关节灼伤和脚垫炎(Shepherd和Fairchild，2010)以及禽类和工人的呼吸系统疾病(Ritz等人，2004)。Nuvio对褥草水分的积极影响表明，这是微生物组变化的结果，以及Nuvio通过潜在地减少氨、改善禽类福利和减少病原菌的传播来改善禽群健康的潜在用途。

表10在第28天每个治疗组的结块的褥草平均百分比

治疗	值(％)	p值
			NTC	72	N/A
N-12	59	0.0019
			N-6	63	0.0162
N-3	65	0.1039
			SF	79	0.0379

本文提供的数据表明，Nuvio可用作降低NE的有效抗生素替代物。Nuvio有许多积极的属性，包括死亡率和病变评分的降低以及最终围栏重量和FCR的改善。Nuvio的独特作用模式允许其与依赖于抑制细菌生长或改变局部环境以抑制生长的其他抗生素替代物区分开。NE是一种多因素疾病，并且产气荚膜梭菌的毒力取决于菌株和触发毒力因子表达的环境因素。然而，Nuvio可以通过干扰群体感应(其是细菌毒力的主要调节因子)来减弱许多致病菌(包括产气荚膜梭菌)的毒力。

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实施例2：评估犬中单独和与益生菌组合的来自屎肠球菌的后生元代谢物的安全 性的初步研究

摘要

本研究评估了当施用于比格犬时，来自屎肠球菌的后生元代谢物及其与微生物活细胞(益生菌)的组合的安全性和剂量耐受性。本研究采用设盲、随机、对照、平行设计。将二十只健康比格犬随机分成五组，每组四只犬：对照组(T0)、接受1×、3×和5×预期剂量的后生元代谢物的三组(分别为T1/T3/T5)和接受5×剂量活细胞的组(T5c)。安全性评估包括体格检查和临床检查。异常临床体征包括呕吐、眼睑痉挛、结膜充血、泪溢、眼睛中的脓性粘液溢和少量蛋白尿，但在所有情况下，这些症状是轻度、短暂的，不需要兽医干预，并且与供试品无关。没有剂量组效应、毒理学效应或严重的不良事件。后生元代谢物(单独或与益生菌组合)是安全的，且本研究中被犬良好耐受。

引言

益生菌已长期用于家畜的营养，因为它们维持或稳定犬肠道菌群的组成和代谢活性并改变犬的免疫功能(1-3)。营养方面的最新进展已经导致了后生元代谢物的出现，其是在专有发酵过程中由选定的微生物菌株产生的特定代谢物。已显示它们中断致病菌中的细胞间通讯，导致毒力的抑制。后生元代谢物下调多种细菌中的毒力基因，并对宿主发挥免疫调节作用(4-6)。

在一些情况下，益生菌微生物可引起感染发作，如真菌血症、脓毒症和菌血症，特别是在脆弱和免疫受损的患者中(12)。本研究旨在确定健康成年比格犬中称为后生元代谢物的专有细菌肽及其与益生菌屎肠球菌的组合的安全性和剂量耐受性。

方法

本研究采用设盲、随机、对照、平行设计。本研究由五组犬组成，每组四只犬，根据标准设施实践将它们单独圈养。所有犬均接受经认证的犬

这种食物符合或超过了国家研究委员会对能量、蛋白质、维生素和矿物质的最新要求，适用于不同物种和龄级。将二十只健康比格犬随机分成五组(T0、T1、T3、T5和T5c)，每组四只犬。T0组为对照，T1、T3、T5组分别接受1×(132.13mg/kg)、3×(132.13mg/kg)、5×(132.13mg/kg)剂量的后生元代谢物，T5c组接受5×(132.13mg/kg)剂量的后生元代谢物以及400亿CFU/天的屎肠球菌活细胞。如表11中所述，犬每天给药一次。测试设施符合管理实验室动物的护理和使用的所有规定。根据《安大略省动物研究法》(RSO 1990，第A.22章)的原则；《美国动物福利法》和修正案(《美国法典》第7卷及其修正案)；以及加拿大动物护理委员会的指南设计程序以避免或最小化犬的不适、痛苦和疼痛。

表11组和剂量在犬中的分布

组	N	途径	剂量	持续时间
					T0	4	口服	对照	28天
T1	4	口服	1×(12.13mg/kg)	28天
					T3	4	口服	3×(396.39mg/kg)	28天
T5	4	口服	5×(660.65mg/kg)	28天
					T5c	4	口服	5×(660.65mg/kg)<sup>a</sup>	28天

^a与400亿CFU/天的乳杆菌细胞培养物组合。

进行临床观察、实验室分析或可能影响研究变量的程序的测试设施人员对所施用的治疗的身份不知情。在研究的活体阶段完成(包括完成所有实验室分析)之前，没有发生设盲人员的非设盲。在第1天，选择进入给药期的犬按研究动物ID以升序排列，并使用Microsoft

(微软公司，雷德蒙德，华盛顿)随机分配到五个剂量组中的一个。犬的年龄范围为646至819天。

纳入标准包括良好的生理健康，在给药开始时年龄大于6月龄(182日龄)的未去势雄性比格犬基于研究前体格检查、临床病理学(血液学和血清化学)和尿液分析没有临床上显著的健康异常，并且适合于研究程序。如果犬不满足纳入标准，则将它们排除在研究之外，它们是无食欲的；它们有研究前并发疾病的证据，其可能干扰或阻止本研究中使用的评估和分析；或者它们在第0天之前的28天内已经用可能影响研究终点的任何药物治疗。

从第0天至第27天，犬每天给药一次。在喂食之前进行任何给定日的给药。从第0天至第6天，向犬给药包装在明胶胶囊中的供试品。由于大量呕吐，修改了供试品制备和给药程序。在研究第7至27天，向犬给药每日使用1:1比例的供试品和天然泉水制备的液体制剂。

在驯化(第7天)和治疗(第14天和第28天)期间从每只犬收集血液用于临床化学和血液学分析。在驯化期间(第7天)以及在治疗的第14天和第27天，还对每只犬进行尿液分析。每天进行至少一次临床观察，并且包括眼睛、粘膜、呼吸、粪便稠度评分、粪便外观和精神状态评分的观察。每只犬在驯化期间(第7天)以及在治疗的第14天和第28天接受完整的兽医检查。在第6天和第1天的驯化期间以及在治疗期间(第6、13、20和28天)，使用校准的量表测量每只犬的体重两次，精确至0.1kg。从第-7天开始每天测量提供和未食用的食物的重量，并持续直至研究完成。不良事件和严重不良事件在观察到时记录在研究记录上。

观察和统计分析的单位是个体犬。所有动物都包括在分析中。视情况使用描述性统计、表和图比较数据。

结果和讨论

在驯化期间(第6天)，犬的体重范围为10kg至13.8kg。在胶囊给药的七天期间记录了八只犬中的十次呕吐情况，在T3、T5和T5c组中最普遍(表12)。在使用液体制剂的情况下，呕吐的患病率显著降低。这表明呕吐的主要原因是多个胶囊的给药。然而，考虑到在T0组中也注意到呕吐，这表明呕吐与供试品施用无关。所有犬都愿意接受供试品的液体制剂。

表12异常临床观察总结

NA，不可用

仅在眼睛中报告异常观察，包括眼睑痉挛(1例，1只犬受影响)、结膜充血(26例，3只犬受影响)、泪溢(28例，5只犬受影响)、脓性粘液溢(3例，2只犬受影响)、肿胀(1例，1只犬受影响)。报告了粪便中的粘液(1只犬受影响)和粪便评分为7(1只犬受影响)中的每一个的一个实例(表12)。

这些观察结果中的一些在整个研究中反复出现，包括驯化。所有记录的异常观察结果都是轻度、短暂的，并且不需要兽医干预。没有严重的不良事件。在这些观察期间，剂量组对注意到的任何异常没有影响。

在第28天，在组T1和T5c中各1只犬中报告了轻度氮质血症蛋白尿。犬有轻度氮质血症(尿素、肌酸酐增加)和轻度蛋白尿，其中尿比重正常。没有值得注意的血液学发现。

在这些观察期间，剂量组对注意到的任何异常没有影响。发现是偶然的、病因已知的、反映预先存在的过程或可归因于与给药无关的临床程序。

总体而言，没有结果提示供试品具有临床或毒理学意义的效果。没有注意到临床上显著的异常，这保证从研究中排除。随后在第14、15和28天的体格检查揭示了典型的皮肤病学、耳部和牙科发现，其中没有一个与在驯化期间进行的体格检查显著不同。

剂量组对体重没有影响；因此，供试品对该变量没有临床或毒理学相关的影响。剂量组对食物消耗没有影响。所有剂量组中的饲料消耗与正常健康犬的饲料消耗一致。

结果显示在本研究中，在犬中口服施用供试品后没有临床上显著的异常。报告了犬中很少的呕吐情况，这可能是由于胶囊制剂，因为随着制剂的变化，呕吐的患病率得以解决。报告了眼睛中的异常临床观察，包括泪溢、结膜充血和脓性粘液溢。通常在犬中报道这些眼部疾病(17-19)。这些眼部观察是轻度、短暂的，并且不需要兽医干预。此外，这些观察结果不是剂量依赖性的，这进一步证明了它们不太可能与供试品的施用相关。

报告了2只犬中的轻度氮质血症蛋白尿。这两种情况都可以被认为是虚假的。在没有其他临床或泌尿体征的情况下，肾受累是非常不可能的。此外，蛋白尿的两种情况都可能是错误的，并且是由导管插入术期间的轻微创伤引起的。与其他情况一样，该观察结果也不是剂量依赖性的，因此，它不可能与供试品相关联。

在关于血液学、身体、体重或食物摄入的观察中没有报告异常。这些结果与其他益生菌在犬中的安全性结果一致(13,20)。具有良好耐受的安全性特征，具有其天然的、高度靶向的能力及其与益生菌的组合提供潜在的附加益处的屎肠球菌后生元代谢物可以是伴侣动物的稳健产品。

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实施例3：Ygia¹⁴改善犬的粪便质量并可以消退腹泻

引言

腹泻是伴侣动物中报道的常见胃肠道疾病，其可定义为粪便水含量增加；通常导致粪便体积、流动性和排便频率的变化(Hall，2009)。对于有效的替代治疗选择存在未满足的需求，所述替代治疗选择不仅应预防腹泻，而且还应改善胃肠道生态失调。由于独特的作用模式，益生菌补充可用于解决胃肠道问题。然而，益生菌的作用模式是菌株依赖性的。Ygia¹⁴是活的屎肠球菌(2亿CFU/剂量)和在相同菌株的专有发酵过程中产生的后生元代谢物的组合。由于后生元代谢物的体外和体内功效以及益生菌重新平衡胃肠道微生物区系的能力，Ygia¹⁴可用作有效的非抗生素抗感染剂以管理犬的腹泻症状。在此，我们报告了在患有急性或慢性腹泻的犬中施用Ygia¹⁴的结果。

病例说明

MicroSintesis与安大略省南部的兽医联系以分发Ygia¹⁴，并参与26个兽医实践。兽医被给予Ygia¹⁴以自行决定尝试个别病例，并且没有尝试限制其与其他产品的组合。兽医通过随访电话联系主人，并询问与粪便评分、粪便质量改善前的治疗次数和粪便恢复正常前的治疗次数相关的问题。使用7分量表粪便评分评估粪便质量，范围从非常硬且干燥(评分为1)到没有质地的水样(评分为7)。基于Ygia¹⁴给药前的粪便评分评估粪便评分的改善，如果粪便评分达到个体犬的正常粪便评分，则认为腹泻得到消退。分析了92只犬的数据，包括58只患有急性腹泻(每天突然发作3次或更多次稀便)的犬和34只患有慢性腹泻(腹泻持续至少4周)的犬，如兽医记录所示。犬的年龄范围为2个月至16岁，中间年龄为5岁，平均年龄为5.6岁。它们的重量范围为2至88kg，中间重量为12kg，平均重量为19kg。基于体重施用Ygia¹⁴；其中38只犬接受较低剂量(1cc)，26只犬接受大剂量(2.5cc)，28只犬每天施用2个2.5cc剂量，持续14天。

最常见的犬种是猎犬、混合品种和工作犬，占犬的54％。总共有30个不同的品种。在8个记录中，在初诊之前在粪便中发现血液，而其他84个表现出从轻度到重度的不同严重程度的腹泻。在随访讨论期间，宠物主人指出见到粪便评分改善所需的Ygia¹⁴剂量数。在作出反应的54名主人中，81.1％表明粪便评分在72小时内改善。主人还指出直到腹泻症状完全消退的天数，并且75.4％表明粪便评分在72小时内恢复正常。

记录用于腹泻或胃肠不适的先前药物，53只犬先前未接受任何药物，而39只犬接受了抗生素、益生菌或两者的组合，没有消退腹泻。表13中的数据表明Ygia¹⁴最常给予先前未给予抗生素的患有急性腹泻的犬。所治疗的92只犬中的50只属于该类别，并且这50只犬中的34只(68％)的腹泻症状得到改善或消退。下一个最高类别是仅给予Ygia¹⁴的犬。在这一类别中有35只犬，其中23只犬的腹泻症状得到改善或消退。在两组中，Ygia¹⁴分别在68％和66％的病例中改善或消退了腹泻发生率。在这些病例中腹泻的原因是未知的，并且它们可能不是细菌感染的结果，细菌感染是Ygia¹⁴的主要靶标。下一个最大的类别由其中Ygia¹⁴与抗生素同时给药的犬组成。使用的最常见的抗生素是甲硝唑和泰乐菌素(一种广谱抗生素)，甲硝唑也用于治疗贾第鞭毛虫(一种常见的寄生虫)。在23个病例中的19个病例中，Ygia¹⁴改善或消退了腹泻症状，然而，在该组中，不清楚抗生素或Ygia¹⁴是否改善或消退了腹泻症状。在最后一类中，其可论证地是最有趣的，当先前施用的抗生素无效时，使用Ygia¹⁴。尽管这是一个小组，通过Ygia¹⁴改善或消退了8只犬中的6只的症状。这些病例表明，当抗生素无效时，Ygia¹⁴是有用的，可能是由抗生素耐药性细菌引起的腹泻的结果。

表13 Ygia¹⁴在治疗使用和不使用抗生素的犬急性腹泻中的功效

	以前的抗生素	以前的抗生素	并发抗生素	并发抗生素	所有急性病例
						治疗	是	否	是	否	-
改善或消退的次数	6	34	19	23	42
						病例总数	8	50	23	35	58
改善/消退的百分比	75	68	83	66	72

表14中数据表明，对于慢性腹泻病例，当先前使用抗生素时，Ygia¹⁴是最常使用的。在22例慢性病例中的20例(91％)中，当先前抗生素无效时，Ygia¹⁴能够改善或消退腹泻症状。然而，在先前未使用抗生素的12个病例中，Ygia¹⁴能够改善或消退9个(75％)病例中的腹泻症状。在Ygia¹⁴不与抗生素同时使用的情况下，Ygia¹⁴能够改善或消退21只犬中的16只(75％)的腹泻症状。当Ygia¹⁴与抗生素同时使用时，它能够改善或消退13个病例中的12例(92％)的慢性腹泻症状。

表14 Ygia¹⁴在治疗使用和不使用抗生素的犬慢性腹泻中的功效

	以前的抗生素	以前的抗生素	并发抗生素	并发抗生素	所有急性病例
						治疗	是	否	是	否	-
改善或消退的次数	20	9	12	16	28
						病例总数	22	12	13	21	34
改善/消退的百分比	91	75	92	76	82

通常，Ygia¹⁴在治疗慢性(82％)和急性(72％)腹泻中都是有效的。另外，在一些病例中，当先前的抗生素疗法无效时，Ygia¹⁴能够改善或消退腹泻症状。另外，Ygia¹⁴大多数是良好耐受的，并且没有安全性问题，除了1例当吉娃娃犬经历腹痛腹胀时，最可能是由于潜在的乳清敏感性。

讨论

屎肠球菌产生的后生元代谢产物可降低致病菌的毒力。毒力因子参与细菌附着、侵袭和毒素产生，并且是细菌感染机制的一部分。在本病例研究中，患有慢性或急性腹泻的犬被给予Ygia¹⁴，数据表明Ygia¹⁴可以改善或消退72.4％的急性病例和82.4％的慢性病例的腹泻症状。在每个病例中，腹泻的原因都是未知的，并且可能由例如应激、病毒、细菌或寄生虫感染引起。由于开发了有效对抗细菌的后生元代谢物，在某些情况下观察到的低功效可能是不是由细菌感染引起的腹泻的结果。

表13和14中呈现的数据表明Ygia¹⁴在慢性和急性腹泻中都是有效的，然而，与急性腹泻相比，在慢性病例中的结果似乎更好，这可能是由非菌剂如寄生虫或一些外部应激因素引起的急性腹泻的结果。此外，当先前使用抗生素时，Ygia¹⁴似乎在慢性病例中更有效，但不能完全治疗腹泻，在这些病例中，Ygia¹⁴在22个病例中的20例中是有效的。尽管这些病例中腹泻症状的根本原因是未知的，但它们通常是胃肠道微生物组变化的结果(Suchodolski等人，2012)。然而，即使当抗生素不完全有效时，Ygia¹⁴也能够减轻症状。很难推测Ygia¹⁴比抗生素功效更好的实际原因，但这可能是由于存在抗生素耐药性病原体或抗生素的选择不当。

兽医使用抗生素，因为他们认为他们将快速有效地起作用，因此他们预期抗生素替代物也是如此。来自这些病例研究的数据表明，在81.1％的犬中，Ygia¹⁴在72小时内改善了粪便评分，并且在75.4％的病例中，腹泻被完全消退。还存在一些病例，其中在一次剂量后症状得到改善；然而，这些可能是例外情况。这些病例研究支持使用Ygia¹⁴作为抗生素治疗的有效替代物，特别是当抗生素耐药性可能是一个问题时。使用有效的抗生素替代物如后生元代谢物有助于减少抗生素的整体使用，并使抗生素耐药性对动物和人类健康的整体影响最小化。

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实施例4：群体感应的益生菌破坏减少了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的类胡萝 卜素产生并增加了头孢西丁敏感性

摘要

抗菌药物耐药性是对食品安全、医疗进步和全球整体健康的日益增长的威胁。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通常是共生物种，其在有机会建立感染的情况下转化为具有高死亡率和发病率的强大病原体。因此，全球认识到迫切需要对抗这种特定病原体的新疗法。对抗MRSA耐药性和感染的潜在策略是开发干扰参与细胞间通信的细菌群体感应(QS)系统的替代治疗剂。QS系统在MRSA的许多毒力性状的调节中是至关重要的，例如甲氧西林耐药性、外毒素和表面蛋白表达、抗氧化剂产生和免疫细胞逃避。基于我们先前的研究，其中我们已经证明益生菌生物活性代谢物充当新的QS破坏化合物，我们在本文中提出相同的益生菌化合物可以与抗生素(例如β-内酰胺类抗生素头孢西丁)串联用作佐剂，以使MRSA临床分离株对头孢西丁“再敏感”。此外，我们表明这些益生菌化合物能够减少MRSA活性培养物中类胡萝卜素的产生，导致对过氧化氢细胞毒性的抵抗降低。

引言

最近作为对抗病原菌的竞争者出现的一种这样的新替代物是使用益生菌及其作为QS破坏剂的代谢物⁸。尽管支持益生菌对人类和动物健康的益处的主张的科学证据很少，但最近的工作已阐明了益生菌直接干扰病原体毒力的几种机制。由嗜酸乳杆菌产生的代谢肽已被证明通过减少致病性细菌菌株在其环境中使用QS来感知和沟通而降低其毒力：病原体产生毒素、侵入宿主细胞、逃避免疫细胞和形成生物膜的能力的重要贡献者^11,12。从双歧杆菌培养物的无细胞废培养基(CFSM)中分离的代谢物也被证明下调控制肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型和肠出血性大肠杆菌O157:H7中附着和粘附所必需的毒力因子的主要调节基因^13,14。值得注意的是，已在体内表明益生菌枯草芽孢杆菌产生群体猝灭代谢物，其显著有助于排除泰国农村人口肠道中的共生病原体金黄色葡萄球菌¹⁵。

金黄色葡萄球菌是一种受到严重关注的病原体。革兰氏阳性细菌在细胞间QS控制的基因表达系统中利用自诱导寡肽，并且通过这些不可渗透的自诱导物的通信由专门的转运蛋白介导。附属基因调节子(agr)QS系统是包括金黄色葡萄球菌中的双组分系统的最充分描述的通信系统之一¹⁶。Agr在很大程度上受细胞群体密度的影响，并且在感染的各个阶段调节金黄色葡萄球菌所需的毒力表达¹⁷。还已经表明，agr系统的反应调节剂(agrA)具有氧化感测能力，这在金黄色葡萄球菌防御氧化应激和免疫细胞逃避中是关键的¹⁸，并且agr系统在外毒素和细胞表面蛋白表达的密度依赖性调节中是必需的^19,20。先前的研究还表明，agr系统对mecA基因显示出显著的调节作用，所述mecA基因控制高毒力社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的甲氧西林耐药性^21,22,23。因此，已经提出agr系统应该被认为是金黄色葡萄球菌中QS破坏和新治疗干预的重要候选物⁹；此外，一个有趣的想法是将QS破坏剂作为非抗生素佐剂与已建立的抗生素组合疗法的组合。

方法

益生菌菌株：从加拿大食品安全研究所(圭尔夫大学，安大略省，加拿大)的-80℃储存中获得屎肠球菌的冷冻甘油储用培养物；该储用培养物最初是从来自Difco^TM MRS肉汤培养物(BD公司，斯帕克斯，马里兰州，美国)的对数生长后期制备的。该储用益生菌菌株用于生产本研究中使用的含有益生菌代谢物的所有生物活性材料。

葡萄球菌菌株：金黄色葡萄球菌细菌的两种临床分离株获自爱德华王子岛大学(夏洛特敦，爱德华王子岛省，加拿大)的大西洋兽医学院(AVC)。通过AVC工作人员进行的苯唑西林纸片扩散法以及通过使用β-内酰胺类抗生素头孢西丁的单独最小抑制测试证实了两种菌株中经由SCC mecA基因途径的甲氧西林耐药性的存在，其中如果MIC≥8μg/mL，则金黄色葡萄球菌菌株被认为是甲氧西林耐药性阳性。通过用以下引物对(5'至3')的阳性qPCR测试最终证实了mecA基因的存在：正向引物AACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAG和反向引物ATTGCTGTTAATATTTTTTGAGTTGAA²⁹。第一菌株别名被指定为MRSA家畜相关(LA)414M SPAt034(“MRSA LA”)，并且第二菌株别名被指定为MRSA 81M SPA t008(“MRSA 81M”)。将临床分离株维持在绵羊血琼脂斜面上，并且由从多个菌落生长的对数后期培养物制备每种菌株的甘油储备液并储存在-80℃。然后将来自每种相应MRSA菌株的甘油储备液的循环培养物用于在BBL^TM阳离子调节的Mueller-Hinton培养基(BD公司，斯帕克斯，马里兰州，美国)中接种过夜培养物，在18-20h孵育后由其制备LB划线平板；这些划线平板用于接种用于所有测定的起始培养物。对于所有实验测定，MRSA的培养物在阳离子调节的Mueller-Hinton培养基中生长。

益生菌生物活性材料的制备：将屎肠球菌原液小瓶的内容物解冻，并将循环培养物接种在200mL的0.22μm过滤灭菌的改良MRS培养基(VWR国际公司，密西沙加，安大略省，加拿大)中。将该瓶培养物密封并在37℃±1℃下不振荡孵育18小时。孵育后，将该培养物用于接种具有200g乳清蛋白分离物和25g乳糖的4L化学成分确定的培养基(CDM)。然后将容器培养物在37℃±1℃下静态孵育48小时。孵育后，通过在4℃下以12,000×g离心30min(AvantiJ-20XPI，贝克曼库尔特公司，加拿大)从液相中分离细胞。然后将含有益生菌代谢物的无细胞上清液在-80℃下冷冻并冷冻干燥。将干燥的无细胞上清液以粉末形式在-20℃下长期储存直至需要。

益生菌生物活性材料的再悬浮：干燥的无细胞上清液的再悬浮仅在每个实验之前进行，以维持代谢物的最佳活性。方法如下。称出干燥的上清液并以所需浓度(5、30和60mg/mL)重悬于阳离子调节的Mueller-Hinton培养基中。用

AE150pH计(飞世尔科技)检查重悬材料的pH，并根据需要用1.0N氢氧化钠溶液调节以在7.3±0.1的pH下保持稳定的测试条件。然后用离心机5804(艾本德)在室温下以5,000×g将重悬的溶液离心15分钟。将剩余的液体与碎片沉淀分离，并通过具有40/35欣维尔真空过滤装置(美国开泰)的

0.45μm膜滤器(颇尔公司)过滤以除去剩余的胶体材料。然后使用Basix^TM 25mm 0.2μm注射器过滤器(赛默飞世尔科技)过滤灭菌滤液。将样品等分成更小的5-10mL体积，以使液体生物活性样品的冻融操作最小化，因为它们在-20℃下储存在无菌锥形管中直至实验需要。

截留分子量(MWCO 3000)组分的制备：为了更好地理解代谢物生物活性物质的大小，使用截留分子量(MWCO)为3000Da的

Ultra 15mL离心过滤器(密理博-西格玛)超滤重悬的益生菌无细胞上清液。在0.2μm过滤以除去剩余碎片后，将10mL重悬的上清液加入MWCO 3000离心过滤管中，并以5,000rpm离心1小时。收集MWCO 3000的滤液；通过每次冲洗用10mL阳离子调节的Mueller-Hinton培养基冲洗过滤器头两次来收集剩余的截留物组分。在两次冲洗后，使用另外的10mL培养基重悬并收集截留物。然后将所有收集的组分用0.2μm注射器过滤器过滤灭菌以除去任何污染物。将MWCO 3000的液体截留物和滤液溶液在-20℃下储存在无菌离心管中。

用于MIC测试的头孢西丁的制备：在两种MRSA菌株中选择用于最小抑制浓度(MIC)测试的抗生素是头孢西丁，如临床和实验室标准协会(CLSI)葡萄球菌物种的MIC测试指南中所概述的³⁰。头孢西丁已被证明强烈上调MRSA菌株中抗生素耐药性的SSC mecA途径³¹，因此是本研究的优秀抗生素候选物。用分析天平(梅特勒-托利多)称重粉末形式的头孢西丁(阿法埃莎)并以10mg/mL重悬于甲醇中，并储存在-20℃直至用于MIC和FIC测试测定。

最小抑制浓度(MIC)测试：根据临床和实验室标准协会(CLSI)关于葡萄球菌物种的MIC测试的指南进行MIC测试³⁰。将每种相应的临床MRSA菌株的过夜培养物稀释1000倍以获得约10⁶CFU/mL作为起始接种物。头孢西丁的稀释范围为5μg/mL至100μg/mL。通过在

透明96孔标准平底微孔板

中在阳离子调节的Mueller-Hinton培养基中用头孢西丁进行肉汤微量稀释来测定具有头孢西丁的临床MRSA菌株MICs。添加仅培养基的等分试样作为无菌检查，并且也用作背景对照；从浊度测量值中减去背景对照以解释培养基背景。所有测试样品体积为每孔200μL，技术上重复。在样品制备和等分后，将MIC测试板用石蜡膜密封，并在

孵育微型振荡器中在35℃±1℃和200rpm下振荡孵育24小时，并用Fisherbrand^TM数字温度计(飞世尔科技)监测温度。孵育后，将板冷却至室温，并使用SpectraMax M2酶标仪(美谷分子)在600nm的波长下测量浊度。将与相应的阳性生长对照相比导致浊度降低90％或更大的头孢西丁的最低浓度定义为MIC。以三个生物学重复进行所有MIC测试。

部分抑菌浓度(FIC)测试：FIC是用于描述两种或更多种抗生素的组合或抗生素和非抗生素化合物的组合的效果的数学表达式；如FIC指数³²所定义的，作用可以描述为拮抗的、无差别的、相加的或协同的。对三种预定的益生菌生物活性材料浓度进行棋盘MIC分析，以确定头孢西丁对临床MRSA菌株的协同、相加或拮抗组合作用。生物活性材料的稀释范围为5、30和60mg/mL的冷冻干燥的无细胞上清液。头孢西丁的稀释范围为5μg/ml至100μg/ml。与上述MIC测试方法相同地进行FIC测试。

FIC指数测定：对于每种相应的临床MRSA菌株，测定每种相应浓度的生物活性材料与头孢西丁的稀释范围的组合的FIC值。如EUCAST³²所述观察FIC指数。等式1和2用于确定头孢西丁和生物活性材料的FIC值，等式3用于计算FIC指数以确定两种组分的组合效果：

FIC_i＝∑FIC＝FIC_A+FIC_B 等式3

其中FIC_A和FIC_B分别是药物A和药物B的FIC值。MIC_A和MIC_B是单独的药物A和药物B各自的MIC。MIC_C是药物A和药物B组合的MIC。FIC指数(FIC_i)是FIC_A和FIC_B的总和。用于确定药物A和B之间的FIC_i计算结果的标准指数如下：协同结果定义为两种抗生素或抗生素和非抗生素化合物的组合超过观察到的各个组分的累加效应(≤0.5)，累加结果是各个组分的效应的总和(>0.5-1.0)，无差别结果等于从最具活性的组分观察到的效应(>1.0-2.0)，并且当两种化合物的组合与最具活性的单个组分相比具有降低的作用(>2.0)时，观察到拮抗结果³²。

MWCO 3000组分MIC测试：在MIC棋盘测试之后，作为具有高MIC的临床菌株，选择MRSA 81M用于测试生物活性材料的超滤组分，以更好地阐明生物活性物质的大小。仅选择MRSA 81M进行测试，因为它似乎对生物活性材料具有更大的敏感性，并且在所有测试浓度下显示出协同的FIC值，而MRSA LA不表达类似的模式；选择30mg/mL生物活性材料的浓度，因为它是FIC值远低于0.5的最低浓度。MWCO 3000MIC测试与上文概述的MIC测试方法相同地进行。

类胡萝卜素测量：使用先前建立的甲醇提取方案提取葡萄球菌类胡萝卜素浓度²⁴。将每种相应的MRSA菌株接种到10mL阳离子调节的Mueller-Hinton培养基和10mL补充有30mg/mL益生菌生物活性材料的阳离子调节的Mueller-Hinton培养基中。使样品在37℃±1℃和200rpm振荡下生长24小时。孵育后，将样品以4,000rpm离心15分钟，在1×Dulbecco'sPBS溶液(VWR Life Science)中洗涤，转移到干净的1.5mL离心管中，然后重悬于500μL甲醇中。将样品在加热块中在40℃下温育45分钟。然后将样品以10,000rpm离心5分钟以沉淀剩余的细胞碎片。将上清液以200μL(一式两份)移液到标准96孔板中，并用SpectraMax M2酶标仪(美谷分子)测量450nm波长下的吸光度(A₄₅₀)。

氧化剂敏感性测定：使用先前建立的方案²⁴分析临床MRSA菌株耐受氧化剂杀灭的能力。在1×PBS溶液中进行氧化剂敏感性测定。将每种相应的MRSA菌株接种到10mL阳离子调节的Mueller-Hinton培养基和10mL补充有30mg/mL益生菌生物活性材料的阳离子调节的Mueller-Hinton培养基中。使样品在37℃±1℃和200rpm振荡下生长24小时。孵育后，将样品以4,000rpm离心15分钟，在1×Dulbecco PBS溶液(VWR Life Science)中洗涤，并以约10⁹-10¹⁰CFU/mL重悬于6mL补充有1.5％v/v过氧化氢的1×PBS中。将起始接种物浓度铺板在标准LB琼脂平板上。然后将培养物在37℃±1℃下不振荡孵育1小时。进行相应样品的稀释，铺板在标准LB琼脂平板上，并在37℃下孵育15-20小时以计数MRSA培养物的存活CFU/ml。

统计方法：如下进行所有统计分析。以生长抑制百分比计，MIC数据表示为平均值。细胞毒性和吸光度数据表示为中值，其中晶须盒图描绘最小值和最大值。所有重复(n)是生物学的(每个重复具有技术重复)。使用统计假设检验进行配对统计检验的威氏符号秩次检验和两个样品之间的Mann-Whitney U检验。

结果和讨论

本文描述了由益生菌产生的QS破坏剂可用于通过帮助无效抗生素恢复到抗某些MRSA菌株的更有效状态来对抗抗菌药物耐药性。另外，提出了由于MRSA中agr系统的总体调节存在，也可以通过这些益生菌代谢物并行实现对极大有助于MRSA毒力(例如氧化剂存活)的QS调节因子的破坏。为了分析某些益生菌化合物在毒力降低中的潜在能力，选择益生菌屎肠球菌的CFSM。此外，选择MRSA的两种临床分离菌株用于比较减少MRSA群体中充分描述的几种关键毒力因子²⁰：葡萄球菌黄素和类胡萝卜素合成²⁴、增加的过氧化氢存活和对氧化剂杀灭的抵抗^24,25、拥有含有抗生素耐药性机制的基因的可移动遗传元件葡萄球菌盒式染色体(SCC)以及位于SCC上的mecA基因的调控和表达^{9,17,21,22,23}。

为了探测该益生菌空间，首先针对β-内酰胺类抗生素头孢西丁(一种β-内酰胺酶的强诱导剂)测定两种临床MRSA菌株，菌株81M(“MRSA 81M”)和菌株LA414M(“MRSA LA”)的个体最小抑制浓度(MIC)(对于每种菌株，MIC分别为100μg/mL和60μg/mL)。将三种浓度的过滤灭菌的无细胞上清液代谢物以棋盘方式添加至一定范围的头孢西丁浓度(0-100μg/mL)，其中每种相应MRSA菌株的起始接种物相同。结果表明，当在35℃±1℃下与生物活性代谢物一起孵育24小时时，使MRSA细胞密度降低超过90％所需的头孢西丁的最小浓度呈浓度依赖性降低(图1a,b)。部分抑菌浓度(FIC)指数用于评估非抗微生物化合物与头孢西丁组合的效力²⁶。用于确定头孢西丁和生物活性材料之间的FIC计算结果的标准指数如下实施：在FIC值≤0.5时观察到协同结果，在FIC值>0.5-1.0时观察到相加结果，在FIC值>1.0-2.0时，无差别结果等于从最具活性的组分观察到的效果，并且在FIC值>2.0时观察到拮抗结果。对于MRSA LA和MRSA 81M获得的FIC显示FIC值与生物活性代谢物浓度增加的反比关系(图1c)。

MRSA 81M的FIC值表明所有三种CFSM浓度的协同组合效应，而MRSA LA的FIC值仅在最高浓度的生物活性代谢物下显示协同效应(FIC＝0.5、60mg/mL)。这表明菌株特异性效应，并且MRSA LA菌株可能对生物活性不太敏感，这是由于可能存在agr缺陷型突变体或“群体螯合剂”，其已经显示出相对于具有典型agr QS系统的MRSA细胞确保适应度益处^6,27。仅生物活性对照孔显示对两种菌株的MRSA生长没有负面影响，表明生物活性代谢物的作用机制不是固有地抗MRSA的抗微生物剂，并且仅当与头孢西丁组合时才观察到MRSA生长抑制。

在确定FIC值后，选择一种MRSA菌株和一种生物活性代谢物浓度(30mg/ml)。仅研究了MRSA 81M，因为它似乎对生物活性材料具有更大的敏感性，并且在所有测试浓度下显示出协同的FIC值。使用MWCO 3000离心过滤器将生物活性材料分成两个组分，其中第一组分仅含有滤液(<3000Da)且第一组分仅含有洗涤和再悬浮的截留物(>3000Da)。再次使用棋盘方法使用相同的头孢西丁浓度组合(0-100μg/mL)和相同的起始接种物来确定MRSA 81M菌株的MIC(图2)。

生物活性组分的MIC结果清楚地表明，滤液含有最大的生物活性并降低头孢西丁的MIC；然而，在截留物中检测到一些残留活性，这导致MIC略低于未处理的对照。此外，进行的截留物的两次洗涤也显示出一些残留的生物活性(图3)。这些结果表明，大多数含有抗所测试的两种MRSA临床菌株的生物活性的化合物的大小约为3000Da或更小。

观察到在37℃±1℃下与生物活性代谢物一起温育24小时后，MRSA细胞沉淀在视觉上变得更浅并且失去大多数MRSA菌株的典型黄橙色着色特征。被称为类胡萝卜素的表面积累的化合物通过提供抗光敏化和干燥的保护以及通过充当淬灭免疫细胞使用的有毒活性氧自由基的有效抗氧化剂而有助于金黄色葡萄球菌的总体毒力。在与生物活性代谢物一起温育后，MRSA 81M菌株的橙色着色减少(图4a、b)。MRSA LA菌株受影响较小，因为该特定临床菌株表现出非常少的类胡萝卜素产生(图4a、c)。尽管处理之间的色差在MRSA 81M菌株中更明显，但用生物活性代谢物处理的MRSA LA细胞丧失了其特征性黄橙色并且看起来几乎是白色。450nm处的吸光度测量(A₄₅₀)证实了视觉观察，因为MRSA 81M细胞处理之间的类胡萝卜素浓度差异超过六倍(如通过吸光度测量)，但MRSA LA细胞处理之间的类胡萝卜素差异小于三倍(图4d)。

与生物活性代谢物孵育24小时后细胞沉淀颜色的变化表明益生菌抑制MRSA复制和破坏适当的细胞壁结构；类胡萝卜素也被认为参与在感染和发病机制期间稳定金黄色葡萄球菌膜并维持细胞抵抗宿主防御的刚度^25,28。俗称的“金黄色葡萄球菌”MRSA的特征性黄-橙色着色的减少可能是由于QS相关的双组分系统的破坏，所述双组分系统据报道对金黄色葡萄球菌中的过氧化氢敏感性是必需的。此外，尽管细胞沉淀在未处理的对照和生物活性处理的MRSA细胞之间的总CFU/ml计数方面几乎相同，但细胞沉淀密度较低并且形成较大的细胞沉淀，这也表明生物活性代谢物影响生物活性处理的MRSA细胞的细胞壁结构的合成。由于类胡萝卜素色素极大地有助于葡萄球菌适应性，特别是在免疫细胞逃避中，因此抑制类胡萝卜素合成可能是金黄色葡萄球菌感染的治疗干预的潜在靶标²³。

在观察到类胡萝卜素合成减少之后，假设生物活性代谢物将增加MRSA菌株对氧化剂杀灭的敏感性，这是嗜中性粒细胞抗抗细菌感染的重要作用机制。将过氧化氢以1.5％v/v加入到每种相应MRSA临床菌株的未处理和生物活性处理的培养物中，并在37℃±1℃下在PBS溶液中孵育1小时。在孵育1小时之前和之后测定细胞计数(CFU/mL)。对于MRSA LA和81M，生物活性处理的细胞分别显示99.67％和>99.99％的细胞死亡；与未处理的MRSA LA和81M细胞相反，其分别仅表现出16.67％和19.70％的细胞死亡(图6)。生物活性处理的MRSA81M的细胞计数比未处理的对照低近7倍，而生物活性处理的MRSA LA的计数仅比未处理的对照低2至3倍。

总之，涉及用后生元代谢物治疗临床MRSA菌株的这些发现支持以下观点：某些后生元代谢物通过阻断作为关键抗氧化剂的类胡萝卜素合成的基于QS的调节来破坏MRSA中典型的细胞壁合成，导致对氧化剂杀灭的敏感性增加。由于MRSA LA似乎具有很少的类胡萝卜素产生(与MRSA 81M相比)，关于来自过氧化氢的较低细胞死亡的可选择的理论是生物活性代谢物也能够破坏负责感知氧化环境的agr系统的固有组分⁸。

总之，我们发现从屎肠球菌的CFSM分离的代谢物有助于增加临床MRSA菌株对头孢西丁的敏感性，头孢西丁是一种在临床上不再适合抵抗MRSA感染的β-内酰胺类抗生素。由于头孢西丁通过阻碍细菌细胞壁内肽聚糖层的交联而起作用，因此益生菌生物活性物质对细胞壁合成的破坏性影响对头孢西丁的作用机制是协同有益的。我们的数据表明，生物活性代谢物可以与抗生素结合作为非抗微生物佐剂，并且关键地，可能具有使MRSA对不再临床相关的抗生素(例如头孢西丁)“再敏感”的潜力。我们的结果还表明，这些屎肠球菌生物活性物质可以阻止支持MRSA感染的毒力性状；对氧物种的抗性、葡萄球菌黄素和类胡萝卜素产生以及由金黄色葡萄球菌中的agr系统介导的细胞壁合成表型也受到这些化合物的极大阻碍，从而导致临床MRSA菌株的氧化剂细胞毒性增加和形态改变。从引发金黄色葡萄球菌QS系统中断的益生菌开发的佐剂技术可能是对抗MRSA感染的严重竞争者。

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实施例5：含有屎肠球菌后生元代谢物的CFSM和头孢西丁协同减少耐甲氧西林伪 中间型葡萄球菌(MRSP)的生长

该实施例使用如上文实施例4中所述的方法进行。如图7所示，头孢西丁和来自DSM13241的含有后生元代谢物的无细胞上清液协同作用以治疗伪中间型葡萄球菌。通过β-内酰胺类抗生素头孢西丁和屎肠球菌生物活性代谢物的组合测试的MRSP的MIC生长抑制百分比的热图显示在图8中。

以上公开内容一般性地描述了本发明。尽管本文已经采用了特定术语，但是这些术语旨在描述性意义，而不是为了限制的目的。

以上引用的所有出版物、专利和专利申请全部通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用整体并入。

尽管本文已经详细描述了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其进行变化。

Claims (42)

1.一种协同组合，其包括群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素。

2.根据权利要求1所述的协同组合，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物包括肽、小分子、脂质、糖或其组合。

3.根据权利要求2所述的协同组合，其中，所述肽包括或由以下氨基酸序列中的一个或多个组成：XX[L或I]PPK，其中X表示疏水性氨基酸；X₁X₂[L或I]PPK，其中，X₁选自N、C、Q、M、S和T，并且其中，X₂选自A、I、L和V；MALPPK；CVLPPK；HLLPLP；LKPTPEGD；YPVEPF；YPPGGP；YPPG；NQPY；LPVPK；ALPK；EVLNCLALPK；LPLP；HLLPLPL；YVPEPF；KYVPEPF；EMPFKPYPVEPF；及其通过缺失、取代或插入而改变得到的变体且其中分子的活性没有显著降低，包括具有翻译后修饰的肽和/或其变体，所述翻译后修饰包括糖基化。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的协同组合，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物为肽，并且包括或由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基组成，例如包括或由2、3、4、5、6、7、8或9至约3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的协同组合，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物的大小小于约4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如大小小于约3000、2000或1000Da。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的协同组合，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物在益生菌培养组分中，例如在上清液中。

7.根据权利要求6所述的协同组合，其中，所述益生菌培养组分为无细胞废培养基(CSFM)，其任选地以液体或干燥形式浓缩(例如通过冻干和/或喷雾干燥)。

8.根据权利要求7所述的协同组合，其中，所述CSFM的截留分子量大小约为4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如约3000、2000或1000Da。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的协同组合，其中，所述抗生素为氨基糖苷、杆菌肽、β-内酰胺类抗生素、头孢菌素、氯霉素、糖肽、大环内酯类、林可酰胺、青霉素、喹诺酮、利福平、糖肽、四环素、甲氧苄啶、磺胺类或其组合。

10.根据权利要求9所述的协同组合，其中，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，例如头孢西丁。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的协同组合，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于以下属的益生菌的培养基或上清液：气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

12.根据权利要求11所述的协同组合，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于肠球菌属，例如屎肠球菌。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的协同组合，其还包括益生菌。

14.根据权利要求13所述的协同组合，其中，所述益生菌属于气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

15.根据权利要求14所述的协同组合，其中，所述益生菌为乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或肠球菌属，例如屎肠球菌。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的协同组合，其中，所述益生菌是活的。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的协同组合，其中，所述益生菌以每剂量约1亿至约5亿CFU的量存在，例如以每剂量约2亿CFU的量存在。

18.一种组合物，其包括根据权利要求1-17中任一项所述的协同组合。

19.一种方法，用于：

(a)使抗生素耐药性感染对抗生素重新敏感，所述方法包括向患有所述感染的受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物；

(b)降低细菌感染对过氧化氢细胞毒性的抵抗，所述方法包括向患有所述感染的受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物；

(c)治疗和/或预防受试者的腹泻，所述方法包括向所述受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素；

(d)治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌(MRSP)，所述方法包括向患有MRSA或MRSP的受试者施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和抗生素；

(e)减少细菌中的类胡萝卜素合成，所述方法包括向所述细菌施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物；和/或

(Ff)使细菌对氧化剂杀灭敏感，所述方法包括向所述细菌施用群体感应抑制剂和/或后生元代谢物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述抗生素为氨基糖苷、杆菌肽、β-内酰胺类抗生素、头孢菌素、氯霉素、糖肽、大环内酯类、林可酰胺、青霉素、喹诺酮、利福平、糖肽、四环素、甲氧苄啶、磺胺类或其组合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，例如头孢西丁。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物包括肽、小分子、脂质、糖或其组合。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述肽包括或由以下氨基酸序列中的一个或多个组成：XX[L或I]PPK，其中X表示疏水性氨基酸；X₁X₂[L或I]PPK，其中，X₁选自N、C、Q、M、S和T，并且其中，X₂选自A、I、L和V；MALPPK；CVLPPK；HLLPLP；LKPTPEGD；YPVEPF；YPPGGP；YPPG；NQPY；LPVPK；ALPK；EVLNCLALPK；LPLP；HLLPLPL；YVPEPF；KYVPEPF；EMPFKPYPVEPF；及其通过缺失、取代或插入而改变得到的变体且其中分子的活性没有显著降低，包括具有翻译后修饰的肽和/或其变体，所述翻译后修饰包括糖基化。

24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物为肽，并且包括或由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基组成，例如包括或由2、3、4、5、6、7、8或9至约3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物的大小小于约4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如大小小于约3000、2000或1000Da。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物在益生菌培养组分中，例如在上清液中。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述益生菌培养组分为无细胞废培养基(CSFM)，其任选地以液体或干燥形式浓缩(例如通过冻干和/或喷雾干燥)。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述CSFM的截留分子量大小约为4000、3900、3800、3700、3600、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600或500Da，例如约3000、2000或1000Da。

29.根据权利要求19-28中任一项所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于以下属的益生菌的培养基或上清液：气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于肠球菌属，例如屎肠球菌。

31.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用益生菌。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述益生菌属于气球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、肠球菌属、梭杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、蜜蜂球菌属、微球菌属、片球菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属或其组合。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述益生菌为乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌，例如嗜酸乳杆菌(DSM13241)和/或其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物来源于肠球菌属，例如屎肠球菌。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中，所述益生菌是活的。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中，所述益生菌以每剂量约1亿至约5亿CFU的量存在，例如以每剂量约2亿CFU的量存在。

36.根据权利要求19-35中任一项所述的方法，其中，所述受试者为宠物，例如狗。

37.根据权利要求19-35中任一项所述的方法，其中，所述受试者为农场动物，如猪或家禽。

38.根据权利要求19-35中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。

39.根据权利要求19-38中任一项所述的方法，其中，所述群体感应抑制剂和/或后生元代谢物和所述抗生素协同作用。

40.一种片剂或胶囊，其包括如权利要求1-17中任一项所述的协同组合或如权利要求18所述的组合物。

41.如权利要求1-17中任一项所述的协同组合或如权利要求18所述的组合物在如权利要求19-39中任一项所述的方法中的用途。

42.如权利要求1-17中任一项所述的协同组合或如权利要求18所述的组合物用于如权利要求19-39中任一项所述的方法。

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