CN1147274A

CN1147274A - 新的外-(1→4)-β-D半乳聚糖酶

Info

Publication number: CN1147274A
Application number: CN95192595A
Authority: CN
Inventors: S·程加帕; S·A·赫利耶; J·迪西尔瓦; J·S·C·雷德
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1997-04-09
Also published as: WO1995023228A1; BR9506862A; MX9603290A; GB9403423D0; AU707797B2; EP0746620A1; AU1713795A; US5981831A

Abstract

本发明公开的是一段基本上包含了图1所示序列中核苷酸229到2319的核苷酸序列，或者这段核苷酸序列的功能等价物，所述核苷酸序列编码具有外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶活性的酶或者这种酶的前体或衍生物。本发明还公开了包含本发明的序列的载体和宿主，和由此编码的多肽。本发明还公开了可以从西红柿果实得到的功能等价酶的核苷酸和氨基酸序列。

Description

新的外-(1→4)-β-D半乳聚糖酶

发明领域：

本发明涉及新的核苷酸序列以及包含该序列的载体和宿主。本发明还涉及一种改变植物特性的方法。

发明背景：

果胶是植物细胞壁中一种主要的基质多糖。它由两种不同的区域组成。光滑区包含一些被鼠李糖打断的均一半乳糖醛酸的长分枝，而且分枝相对较少；毛状区富含半乳糖醛酸和鼠李糖残基，并且高度分枝。侧链分枝包含了不同的糖，但主要包含中性糖侧链，阿拉伯聚糖，β(1→4)-半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。这些中性糖组成的多糖侧链的功能还不太清楚。有人推测它们的功能可能是通过调节细胞壁孔的大小来调节蛋白质的流动性，从而可以限制不同的酶接近其底物。另外，这些侧链之间以及它们与其他细胞壁上多聚物的相互作用，也可能影响到细胞壁的结构和它们的衍生物的流变学性质。对含有不同中性糖成分的苹果果胶溶液的体外研究表明：果胶分枝的增加会导致高的零剪切粘度。由此可得出结论：这是果胶侧链相互作用的结果。而且，多分枝果胶比分枝少的果胶表现出更高的弹性或储能模量(G)，说明果胶的侧链对弹性性质有贡献。(黄等(1993)食用水胶体，7，39-53)。

从果胶的半乳聚糖侧链水解下β(1→4)连接的半乳糖的过程已在不同的植物和不同的生理状态下得到了说明。(德文特和胡伯(1990)植物生理学，78，447-454，费舍尔和伯耐特(1991)植物生理和植物分子生物学年鉴，42，675-703)在果实成熟过程中，中性糖-半乳糖-的丢失是许多果实细胞壁唯一的最基本的变化。费舍尔和伯耐特(1991)在果实成熟过程中的半乳糖的移动已在几种果实中进行了研究。包括西红柿、辣椒、草莓、苹果、咖啡、香瓜、几维果、油桃等。在康乃馨花瓣的衰老期，细胞壁产量下降主要(45％)归因于中性半乳糖的丢失。(德文特和胡伯，1990)。在发芽的羽扇豆子叶中，高达80％的半乳糖从鼠李半乳糖醛骨架的β(1→4)相连的半乳聚糖和细胞壁中得到，从而适应于贮藏的功能。一种β-半乳糖苷酶(外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶)被预言具有使半乳糖从果胶半乳聚糖侧链迁移的活性。

植物中β-半乳糖苷酶活性(包括外-半乳聚糖酶活性)在现有技术中已有所描述(迪克等(1990)植物生理学89，369-375；伯恩斯(1990)植物化学，29，2425-2429；辛格和诺克斯(1985)植物化学，24，1639-1643：坎杜等(1980)植物化学，29，2079-2082)。一些β-半乳糖苷酶的纯化也有所描述，虽然在很多情况下测酶特性时使用的是合成底物而不是内生底物。(Ogawa等(1990)Nippon Shokuin Kogyo Gakkaishi37，298-305；Giannakouros等(1991)植物生理学，82，413-418)。有证据表明植物的β-半乳糖苷酶可能与需要胞壁更新的发展过程，比如羊角鹰嘴豆胚轴伸长有关。在这种组织中，β-半乳糖苷酶已被证实与自溶相关，而这个自溶反应的天然底物是细胞壁的果胶部分(杜皮克等(1989)植物生理学，75，458-464；瓦里奥和拉布瓦多(1993)植物生理学，89，199-203)一种β-半乳糖苷酶已从胡萝卜细胞培养物匀浆的可溶部分中被高度纯化出来(Konno等(1986)植物生理学，68，46-52)。这种酶对于从离体柑桔果胶中制备的β(1→4)半乳聚糖有活性。在软化过程中细胞壁失去半乳糖这一现象已被广泛报道。(巴特立(1974)植物化学，13，2107-2111；李奇维尔等(1992)植物生理学，98，71-81：维格里金和麦科里(1992)园艺科学，27，900-902).在西红柿中发现，果实成熟过程中单体状态半乳糖的增加是由于半乳糖从细胞壁溶解速率的增加，而不是由于代谢中对溶化了的半乳糖的利用增加。(基米等(1991)收获后生物技术，1，67-80).这显示了在果实成熟中β-半乳糖苷酶在体内的作用。有一些报道指出：在果实成熟过程中β-半乳糖苷酶的活性增加了(巴特立，1974；普莱塞(1983)植物生理学，71，132-235；罗斯等(1993)Planta1889，499-506)。从几维果中纯化的β-半乳糖苷酶有切割末端半乳糖的活性，无论这个半乳糖连在2，3，4位还是连在6位(罗斯等，1993)。格罗斯和沃纳尔(1979，植物生理学，63，117-120)指出在西红柿果实中，细胞壁半乳聚糖的减少发生在可溶性多聚糖醛增加之前或者与之相伴。普莱塞(1983)研究了西红柿成熟过程中三种β-半乳糖苷酶的活性特征，其中一种(β-半乳糖苷酶II)的活性在成熟过程中增加了三倍。这种酶还能够降解从绿西红柿细胞壁提取出来的半乳聚糖，并且普莱塞还指出了它在西红柿软化中的可能作用。从成熟的咖啡豆中纯化出的一种β-半乳糖苷酶，在果实由不成熟到成熟的过程中增加了四倍(戈登等(1993)植物化学，34，355-360)。这种酶对半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖有活性，然而只有当内多聚半乳糖醛酶具有活性时果胶才产生半乳糖。

果实成熟过程中果胶的溶解是一种已被证实的现象(费舍尔和伯耐特，1991)，果胶的溶解被认为是果实软化的原因，而内多聚半乳糖醛酶的作用则被认为是果胶可溶化的最可能的原因。最近对转基因西红柿的研究反驳了PG是引起果实软化的唯一物质的论述(乔凡尼等(1989)植物细胞I，53-63；史密斯等(1990)植物分子生物学，14，369-379)。最近，从一些没有明显内或外多聚半乳糖醛酶活性的果实得到的证据表明了β-半乳糖苷酶作用于半乳聚糖侧链而导致果胶溶解(Cutillas-Iturralde等，(1993)植物生理，89，369-375)。Ranawala等人((1992)植物生理，100，1318-1325)描述了成熟香瓜(Cucumis melo)细胞壁中一种释放NaCl的β-半乳糖苷酶活性，它具有(在体外)把从未成熟的果实中提取出的果胶降解为较小的果胶的功能，就象在成熟果实中的作用一样。另外，在香瓜发育和成熟的任一阶段都没有明显的PG活性。De Veau等人(1993植物生理学，87，279-285)指出，在利用从鳄梨分离出的β-半乳糖苷酶进行体外消化时，成熟的绿西红柿果实的果胶可溶性增加并且果胶的表观分子量明显下降。虽然西红柿果胶中含有至少10％的半乳糖，只有0.2％被鳄梨半乳糖苷酶移去。然而，果胶中半乳糖成分的这种较少的变化是足以改变多聚态果胶的溶解度的。这些结果说明一种外-半乳聚糖酶可能对果实成熟过程中果胶的溶解起重要作用。

对于目前所描述的所有β-半乳糖苷酶活性来说，只有一些迹象说明在细胞壁的大分子成分中哪种是其真正的体内底物。一个例外是从发芽的旱金莲(Tropaeolum majus)子叶中分离的β-半乳糖苷酶。这种酶的活性与木质葡聚糖的迁移一致，而且这种纯化了的酶具有专一的从木质葡聚糖多聚体的半乳糖醛侧链上水解末端β-1，2-半乳糖的能力(爱德华等(1988)生物化学杂志，263，4333-4337)，Buckeridge和Reid最近描述了(第6届细胞壁会议摘要，内伊梅根市，1992年8月25-28日，和苏格兰细胞壁小组会议，1993年4月)一种半乳糖苷酶(外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶)的纯化。这种酶会使羽扇豆子叶细胞壁线性β-(1→4)-半乳聚糖成分发生代谢变化。这种酶被认为在发芽后期半乳聚糖的迁移中起关键作用。这种酶的活性只有在半乳聚糖迁移开始时才能被观测到，在半乳聚糖迁移时，它的活性增加，并随后下降。通过免疫杂交已发现外-半乳聚糖酶活性的变化与这种酶的量有关。这种酶专一性作用于β-(1→4)-半乳聚糖而不水解其他细胞壁多糖，这些多糖含有末端非还原型半乳糖残基，如旱金莲木质葡聚糖(末端(1→2)β-连接半乳糖)和落叶松阿拉伯半乳聚糖(末端非还原型(1→3)和(1→6)半乳糖)残基。

这种外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶(催化(1→4)β-半乳聚糖侧链末端半乳糖残基的水解)，似乎在一些生理过程中起了重要的作用。本发明人得到了该蛋白的部分序列，并从发芽的羽扇豆(Lupus angustifolius)中克隆并分析了外-(1→4)-β-D半乳聚糖酶的全部cDNA序列。

发明概述：

首先，本发明提供了一段基本包含图1(Seq ID No.1)中核苷酸229到2319的核苷酸序列。它编码一种具有外-(1→4)-β-D半乳聚糖酶活性的酶，或其前体或衍生物，或上述核苷酸序列的功能等价物。

在本说明书中，前体应被理解为一种比图1中核苷酸229到2319序列编码的肽链长的一种多肽(无论有活性还是无活性)，它可以通过体外或更优选地，通过体内过程(如蛋白水解)而变成具有活性的酶。衍生物应被理解为通过体外或体内过程获得的一种有酶活性的多肽。它比图1中核苷酸229到2319序列编码的肽链要短。尤其优选的衍生物是那些分子量大约为60KDa和45KDa的多肽(由SDS-PAGE检测)，它们由图1中核苷酸229到2319序列编码的多肽经胞内C-末端裂解产生，或者在提纯此酶的过程中产生。

优选地，本发明的核苷酸序列包含一个5’-ATG起始信号。优选地本序列进一步包含促使基因在合适的宿主细胞中表达的序列，它由合适的5’末端包括启动子的未被翻译部分组成。它还优选地包含一些序列，这些序列包括使在合适宿主细胞中的表达达到最优化的信号，如，真核生物中促使最优表达的3’端多聚腺苷酸信号。本发明的序列也可以包含一段编码信号肽的序列。尤其优选的实施方案是基本包含那些与图1中一些核苷酸片段相对应的序列，这些片段包括核苷酸163到228，151到228或130到228序列。

这里使用的“功能等价物”一词是指那些与图1中核苷酸序列不完全相同的序列。这里尤其是指：那些与图1中序列编码完全相同的氨基酸序列的核苷酸序列，其仅仅是因为同种氨基酸的密码子的简并性而导致了核苷酸序列的不同；也是指这样一些序列，它们编码的多肽链与图1中的基本相同，仅有一个或几个氨基酸残基发生了保守性替代(也就是一种氨基酸残基被另一个与其性质相近的残基所替代)。一个功能等价的序列一般来说所编码的氨基酸序列与图1中核苷酸229-2319编码的序列至少具有70％氨基酸同源性，优选的是，至少75％同源性，更优选的则至少有85％的同源性。相应地，优选的功能等价序列在标准杂交条件下，能够和图1中序列的互补链进行杂交(例如在萨姆布鲁克等人描述的条件下，1989)但是在更严格的条件下会杂交得更好。

功能等价序列的一个特殊例子是那些与图1中核苷酸229到2319序列基本上反义等价的序列。这样的序列可以与图1中的序列进行杂交，优选地这些反义等价物可以在DNA和/或mRNA水平上干扰正链序列的表达。

本发明序列的一个功能等价物是基本包含图5所示序列(Seq IDNo.18)中核苷酸117到2555的序列。它编码了从西红柿果实中可以得到的一种成熟的外-半乳聚糖酶。另外，本发明也包括那些编码成熟酶的前体的核苷酸序列，如基本包含图5中核苷酸42到2555的序列。很明显，本领域的技术人员也可制出这样的序列，它们编码的氨基酸序列与图5中序列编码的多肽基本相同，但仅仅因为遗传密码的简并性而使它与图5中的核苷酸序列有所不同。这样明显的改变也被认为是属于本发明范围之内的功能等价序列。

第二个方面，本发明提供了一种多肽，它具有外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶活性并且与图1中核苷酸229到2319序列编码的氨基酸序列基本相同。这个多肽也可以是上述多肽的前体或衍生物，或功能等价物。

一种特别的功能等价多肽是由图5中核苷酸117到2555序列编码的多肽链，或其前体、衍生物。例如，一个这样的前体包括图5中核苷酸42到2555序列编码的多肽。

第三个方面，本发明提供了基本包含图1中核苷酸229到2319序列的载体，或者其功能等价物。优选地，这种载体指导在合适的宿主中表达出具有外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶活性的多肽，或者可以(直接或间接地)参与这样多肽的表达。

把本发明序列引入不同宿主的转化技术在本领域是众所周知的。相应地，在第四方面，本发明也提供了人为引入本发明序列(或它的功能等价物)的宿主或宿主细胞。优选地，宿主或宿主细胞可以是植物或植物细胞。虽然也可使用其它宿主，例如，如果想大量表达这种酶，可以把本发明序列引入酵母细胞。这样纯化的重组酶的应用可以包括以下几方面：植物材料的修饰、降解或液化。这些处理有以下目的：(a)影响食用组织的机械性质，(b)影响果汁或蔬菜汁等的浊度，(c)影响颜料、香料或维生素的提取性。

本领域的技术人员将会知道，由于外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶具有裂解植物细胞壁中的多聚物的功能，改变(提高或降低)这种酶在植物中表达水平或表达方式，可能会影响植物的某些特性。尤其可以预见到的改变有：植物或植物一部分的生长，结构和成熟状况。

第五个方面，本发明提供了改变植物全部或部分特性的方法，包括向植物引入本发明序列或其功能等价物，从而改变植物中外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶活性的水平或方式。

如果引入植物的序列位于启动子正方向，它会使表达水平增加。相反地，如果在启动子负方向引入这样的序列可能会导致表达水平下降。引入这种序列的植物优选的是一些具有明显商业价值的植物，在这些植物中，包含(1→4)-β-D-半乳聚糖残基的分子起着维持结构的作用。这类植物有：苜蓿、苹果、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、菜花、芹菜、大酸果蔓、木瓜、茄子、亚麻、葡萄、辣根、几维果、莴苣、芒果、甜瓜、油菜、番木瓜、豌豆、桃、梨、胡椒、李子、土豆、木莓、大豆、草莓、甘蔗、甘薯、烟草、西红柿、胡桃。

根据这里公开的序列数据，本领域的技术人员会认为应当可以从其他植物中克隆出功能等价的序列(定义同上)。相应地，在本发明下一方面中给出了一个分离功能等价序列的方法，包括从所感兴趣的植物中分离mRNA，并用一个核酸序列探针(通过杂交或PCR法)筛选从mRNA得到的cDNA，该探针与图1所示序列的至少一部分基本互补。

下面将用实施例并参照附图来描述本发明，附图如下：

图1：给出了发明的核苷酸序列(Seq ID No.1)和此序列编码的多肽的氨基酸序列(Seq ID No.2)。

图2：给出了酶纯化过程中同时纯化出的羽扇豆多肽的N-末端氨基酸序列数据，这些多肽分子量分别为60，45和15KDa(Seq ID No.3-5)。

图3：给出了60KDa的羽扇豆外半乳聚糖酶的N-末端氨基酸序列数据，同时给出了用于筛选cDNA文库的探针EX01(Seq ID No.6)的核苷酸序列。

图4：给出了cDNA编码的羽扇豆外-半乳聚糖酶多肽序列与康乃馨中编码一种未知功能蛋白的序列的比较(后者的序列可以共用数据库中得到)。

图5：给出了西红柿中功能等价酶的cDNA序列(Seq ID No.18)，同时给出了它编码的多肽链的氨基酸序列(Seq ID No.19)。

图6：比较了羽扇豆和西红柿中酶的氨基酸序列：西红柿多肽序列用方框表示，而与其相同的羽扇豆中的序列也用方框标了出来。

实施例N-末端序列的SDS-PAGE和电子印迹分析：

羽扇豆外-半乳聚糖酶从种植(槽刻法)18天后的羽扇豆子叶中(如Buckeridge和Reid，1993所述)，纯化并由J.S.Grant Reid博士(斯特林大学)提供。当用SDS凝胶分析时，蛋白样品包含一种较大蛋白(60KDa)和两种较小蛋白(45KDa和15KDa)。SDS-PAGE是用10％聚丙烯酰胺平板凝在BioRad电泳槽上用Laemmli方法进行的(1970，自然，227，680～685)。蛋白被用下列方法电子印迹在PROBLOTT^TM膜上。凝胶在加有50M谷光甘肽(Sigma公司)的阳极电极槽液中预走，然后在新的阳极液中加入巯基乙酸钠(0.01mM，Sigma公司)，电泳。蛋白样品按生物应用系统公司提供的方法进行考马斯亮兰染色。内蛋白酶Lys～C的降解：

把大约含50g纯化了的酶(800pmols天然外-半乳聚糖酶的样本用pH8.5的Tris/HCl缓冲液调到pH值8.5，用pH试纸测定。煮沸15分钟使蛋白变性。以1∶50w/w的比例加入内蛋白酶Lys-C，在37℃条件下保温过夜，然后贮藏在-20℃冰箱中，再进行反相层析。肽的HPLC分离：

反相层析是在30℃条件下在应用生物系统公司提供的130A HPLC分离系统上进行的。通过500μl环把蛋白样品加到预先用0.1％(v/v)TFA平衡的Brownlee RP300-C8微孔柱(250×1mm内径：7μ)上。多肽用0-70％的buffer B(90％乙腈，0.085％TFA)梯度洗脱70分钟。检测214nm处吸收峰并在一段时延后用Eppendoff管收集。这一段时延是为了除去检测器与流出口之间的死空间。收集到的组分保存在-20℃冰箱中。在样品上HPLC柱之前，应用乙腈梯度洗柱直到基线达到可再生的水平。蛋白序列分析：

这一工作是在应用生物系统公司的475型蛋白序列分析仪上进行的。在蛋白纯化这一阶段中(18d.a.p)，外-半乳聚糖酶是作为一种60KDa的蛋白进行纯化的，同时还纯化了一种45KDa的蛋白和一种15KDa的蛋白。这三种多肽的N-末端氨基酸序列(Seq ID No.3-5)在图2中进行了说明。图2指出，60KDa和45 KDa的蛋白具有相同的N-末端序列，这说明它们是从同一母分子通过C-末端裂而衍生来的。通过60KDa的蛋白的抗血清识别出种子发芽早期的更大的蛋白(～80KDa)。我们纯化的60KDa的酶很有可能是由大的前体衍生而来的。目前发现的证据是：由纯化了的cDNA推导出它所编码的蛋白具有约77KDa的分子量。C-末端裂解可能发生在体内，也可能发生在蛋白纯化过程中。60KDa的多肽很明显地具有活性，因而被视作本发明序列的功能等价的衍生物。45KDa多肽可能有活性(尚未证实)，如果这样，它也会被视为本发明序列的功能等价的衍生物。

mRNA的分离及cDNA文库的合成：

12d.a.p的羽扇豆子叶由Reid博士提供(斯特林大学)，总RNA是用Qiagen柱并按厂家推荐的方法稍加修改后进行提取的。总RNA是分两份提取的。在每一份提取中，把1.5g 12d.a.p的羽扇豆子叶在液氮中磨成细粉并分装在6个试管中，每一管中加3ml冷的抽提缓冲液(4M硫代氰酸胍，100mM Tris/Hcl pH7.5，25mM EDTA)向上述管中加入31β-硫基乙醇，240 1 25％的Triton X-100，把混合液在冰上放置15分钟，再加入3ml 3M的乙酸钠，pH6，在冰上再放置15分钟。然后把此均浆在4℃，15,000xg下离心30分钟。在上清中加入5ml冷的异丙醇，在冰上放置5分钟。通过4℃，15,000xg离心30分钟把沉淀收集起来，用8ml冷的TE缓冲液(20mM Tris/HCl pH8.0，1mM EDTA)溶解，4℃下，20,000xg离心15分钟除去不溶部分。向上清中加入2mlS1(2M NaCl和250mM MOPS pH7)，然后把它加到预先用3ml QAT缓冲液(0.4M NaCl，50mM MOPS pH7.0，15％乙醇，0.15％Triton X-100)平衡好的Qiagen-tip100柱上。每个柱用15ml QA缓冲液(0.9MNaCl，50mM MOPS pH7.0，15％乙醇，6M脲)洗脱总RNA，在冰上用等体积的异丙醇沉淀10分钟，4℃下，15,000xg离心30分钟。沉淀用80％乙醇洗一次，风干，并溶成总共1.5ml。在这一步中，所有组分都被汇集，而总RNA产量用QD260吸收值来测定。

信使RNA是从1.2mg的羽扇豆总RNFA通过在寡聚纤维素上亲和层析制备，这里使用了从Stratagene公司得来的多腺苷Quik柱，并按厂家指示进行操作，使用ZAP cDNA合成试剂盒(Stratagene公司)用5μg多腺苷RNA来合成定向的cDNA文库，并按厂家指示使用Gigapack IIGold^TM包装组分进行包装。包装了的文库在用4.8×10⁴pfu进行复制筛选时具有大约1×10⁶pfu的效价。设计寡聚核苷酸探针：

成熟羽扇豆外-半乳聚糖酶的N-末端序列中的一个含8个氨基酸的小肽(图3中用粗体并用下划线标出)被用来设计筛选cDNA文库的寡聚核苷酸探针(EX01，图36中给出，Seq ID No.6)。这个寡聚核苷酸是简并度为48的长达23个核苷酸的片段，并且在变偶碱基位置掺入了一个次黄嘌呤核苷。寡聚核苷酸探针被设计与编码羽扇豆外-半乳聚糖酶的mRNA互补。cDNA文库的筛选：

cDNA文库的筛选基本上是按照ZAPcDNA合成和克隆的方案(Stratagene公司)进行的。使用Sure^TM大肠杆菌菌株一共4.8×10⁴个空斑形成单位(pfu)被铺在4块LB平板上，39℃培养16小时。然后把平板在4℃下冷藏2小时，然后空斑提起物被复制到150mm硝酸纤维素滤膜上(SS)(萨姆布鲁克等(1989)分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版)。变性和中和之后，把滤膜80℃烘2小时；然后将其放在30ml的预杂交溶液中(6×SSC，5×Denhards，100μg/ml鲑鱼睾丸DNA，0.5％SDS)42℃缓慢振动4小时，把15pmol的寡聚核苷酸通过多聚核苷酸激酶用γ-³²P ATP标记、(萨姆布鲁克等，1989)，标记了的寡聚核苷酸通过一个P-50柱与未掺入的放射性核苷酸分离，然后以2×10⁵cpm/ml的浓度加入到预杂交溶液中。在42℃下轻轻摇动18小时进行杂交之后，用6×SSC简单地洗滤膜两次(约1～2分钟)，用莎纶纸把滤膜包起来，暴露在x射线胶卷下，在装有增感屏的盒中-80℃放置16小时，进行放射自显影。通过放射自显影把阳性杂交斑筛选出来，挑放到SM中。通过又一轮的筛选挑出12个阳性克隆。由于使用的探针(设计用于N-末端测序)的原因，根据这一结果还不能评价编码羽扇豆外-半乳聚糖酶的丰度，它只能用来检测全长cDNA，第二轮筛选后，6个纯的阳性杂交斑被分离出来，并进行体内切割。体内切割：

阳性克隆用Bluescript^TM噬菌粒从Uni-Zap.XR^TM载体上通过厂家(Stratagene公司)提供的方案在体内切割，分离克隆中的质粒样本可通过厂家推荐的Qiagen P-100tip柱来获得。克隆可用PCR和限制性位点分析来进一步研究。6个分离克隆中的5个被成功地用EX01和以载体为基础的引物通过PCR法扩增。五个克隆都具有小的插入片段(约2,600bp)，通过琼脂糖凝胶电泳可知，它们是在用限内酶EcoRI和XhoI消化Bluescript质粒时释放出来的。序列的确定：

通过用寡聚核苷酸EX01筛选从羽扇豆cDNA文库分离得到的cDNA用下述方法进行分析：通过-Taq Dye-Deoxy^TM终止化学法用适当的引物测出双链质粒的序列并用ABI 373A DNA自动序列仪分析。序列分析：

分离的cDNA克隆(Seq ID No.1，图1)长2628bp，包含一个30bp的多聚腺苷酸尾部。最长的开放阅读框架(2190bp，大写字母)编码了一个730个氨基酸残基的多肽(Seq ID No.2，81.6KDa，在核苷酸序列中用小写字母表示)，并包含了一个含33个氨基酸的假定的信号肽。然而，在第一个启始密码子ATG与成熟蛋白N-末端之间还有另外三个可能的启始位点，它们可以把信号肽分别减少记者到26、22和15个氨基酸，前三个起始位点都位于信号肽的疏水核心之前。被编码的成熟酶含697个氨基酸，分子量约为77KDa。正如前面提到的那样，60KDa蛋白的抗体可以和一个更大的80KDa的蛋白发生交叉反应，这个大蛋白可能是60KDa蛋白的前体，它通过C-末端裂解而产生了60KDa蛋白，而60KDa蛋白与成熟酶的N-末端序列是相同的。34位的丝氨酸(下划线)标志了成熟酶氨基酸序列的起始。这个推测的序列的C-末端与由蛋白测序得到的实际序列相一致。约15KDa的小肽的N-末端被定位在cDNA推测的氨基酸范围内，而且在这一位点裂解会放出12.5KDa的蛋白，证明了这个分子是由合成蛋白在C-末端裂解而产生的。所有的由蛋白酶消化和酶测序得到的序列(得到的肽序列包括VAKKQPLAWYKTT，FSAPAGNDPL，GEVWVNGQSIG，和GNCGNCNYAGTYTDTK。分别为Seq ID No.S7～10)都被定位在cDNA推导的氨基酸序列之内，进一步证明了cDNA确实编码了羽扇豆外-半乳聚糖酶。无论合成酶是在体内特异切割的还是在纯化过程中发生了切割，结果都是可以想象到的。与其他序列的同源性：

羽扇豆外-半乳聚糖酶与至少一种其他序列有高度的同源性。在氨基酸水平上，它与一个肽序列的717个氨基酸重迭部分有66.5％的同源性，这一多肽序列是从衰老的康乃馨花瓣中提取的，功能未知但高效表达的乙烯调节基因推断出来的。(Raghothama等，(1991)植物分子生物学，17，61-71)这样的氨基酸水平的同源性还不足以让人认为此序列与羽扇豆外-半乳聚糖酶具有功能等价性。在图4中比较了这两个多肽的序列，康乃馨的序列(CARS 12pro)在羽扇豆序列(LEGll CON、pro)的上方。比较这两个序列显示出在这一类型酶中许多肽(用方框表示)都具有保守性。它指出比康乃馨有更高同源性的羽扇豆外-半乳聚糖酶的功能等价物可能也包含这些或者类似的多肽。从其他植物中分离外-半乳聚糖酶cDNA：

根据羽扇豆外-半乳聚糖酶的序列，应当可以证明，对于本领域的技术人员来说，从其他植物中分离出功能等价的cDNA是完全可能的。下面描述了可用于此目的的一种方法。

编码羽扇豆外-半乳聚糖酶的cDNA序列将被用于分离其他植物如西红柿中的功能类似物。羽扇豆cDNA将被放射性标记，并可作为探针用于筛选cDNA文库，该文库由从人们感兴趣的植物中分离的mRNA构建而成。大约3×1000⁴pfu被铺在LB平板上(如前所述)，滤膜要用放射性标记的全长的羽扇豆外-半乳聚糖酶cDNA作为探针来筛选。杂交溶液不变，但杂交温度将变为50℃左右。因为使用了非同源探针(即羽扇豆cDNA)来筛选cDNA文库，所以较低的温度是必要的。杂交了的滤膜要在室温下用2×SSC洗20分钟，暴露于x-射线敏感底片上。假定的阳性克隆将被空斑纯化并且进行与羽扇豆外-半乳聚糖酶cDNA的同源性序列分析。下面的例子说明了这些步骤如何被用于分离编码西红柿果实外-半乳聚糖酶的cDNA克隆，这种酶与羽扇豆中的酶具有功能等价性。从蕃茄中提纯具有外-半乳聚糖酶活性的多肽：第一步：外半乳聚糖酶活性的分析

在不同的西红柿提取物中外-半乳聚糖酶活性是通过检测从羽扇豆种子半乳聚糖中释放的游离半乳糖来进行的。每种分析物都包含了下面的成份：301的1％半乳糖溶液，15μl含有0.1％叠氮化钠的1M乙酸铵(pH5.0)，视酶活力情况最多取30μl西红柿提取物。分析物在30℃下被保温17-24小时，然后马上煮沸2分钟，然后基本上按Kurz和Wallenfels描述的方法，每一份都可以通过β-D-半乳糖脱氢酶来确定半乳糖(1974，“酶学方法”，pp1279-1282，Verlag，Chemie，Weinheim)。第二步：从西红柿果皮中提取外-半乳聚糖酶

人们发现用0.2M磷酸钠缓冲液pH7.2可以有效地从西红柿果皮中提取出有活性的外-半乳聚糖酶。第三步：选择纯化的开始材料

粗提物从不同生长及成熟阶段的西红柿果皮(Lycopersicumesculentum.var.Moneymaker)组织中提取出来(在0.2M磷酸钠缓冲液中，pH7.2)。人们发现不论是以总活力还是比活力衡量，粉红色和红色果实具有最高的外半乳聚糖酶活性，所以红色果实的果皮被用作纯化的起始材料。第四步：硫铵沉淀

准备500g红果实的果皮组织，在液氮中冷冻后保存于-20℃冰箱中，这些组织在1g：1.5vol的含有1.0％(v/v)不溶的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的0.2M磷酸钠缓冲液pH7.2中混合匀浆。把匀浆液在4℃下搅动放置1小时使细胞壁中的酶扩散到抽提缓冲液中、在4℃下Sorvall RC5B离心机的SS34转子上20,000xg离心10min，弃去沉淀。用玻璃纱过滤上清。加入固体硫酸铵使其达到30％饱和度(16.4g/100ml)混合液在4℃下搅动40分钟，离心(30,000×g，20分钟，4℃)除去蛋白沉淀。再加硫酸铵至70％饱和度(24.9g/100ml)，在4℃下混合40分钟，离心(30,000xg，20分钟4℃)收集沉淀蛋白。不经重悬存放在-20℃冰箱中。第5步：DE52层析

把上一步硫铵沉淀下来的蛋白溶于48ml 20mM Tris/HCl pH7.8(A液)中，然后在4.5LA液中透析过夜，4℃下30,000xg离心10分钟，去沉淀，把一清加到预先以0.5ml/min A液平衡好的40ml DE52柱上，用A液以1.0ml/min速度洗柱，直至除去所有的非结合蛋白。结合蛋白0～100％的B液梯度洗脱6个柱体积(B液与A液相比只多了1M的NaCl)收集2ml并分析外-半乳聚糖酶活性。具有高度活性的部分或者马上透析，或保存在-20℃冰箱中。第6步：Mono P层析

通过DE52层析柱收集到的溶液在4.5L 0.025M三乙醇胺/亚氨基二乙酸pH8.3(C液)中透析过夜。把透析后的样品过滤，上清加到通过50ml超环以1ml/mm速率预先用C液平衡好的Mono P柱上(PharmaciaHR5/20)，用C液洗柱直至未结合蛋白全部洗掉。用50ml10％(v/v)多缓冲液7/4，pH4.8/亚氨基二乙酸洗脱结合的蛋白，流速为1ml/min。检测部分收集的每一管(0.5ml)收集液外-半乳聚糖酶活性。pH梯度(约pH8.0)洗脱中较早洗下来的具有酶活性的收集液合在一起并用50mM的醋酸铵pH5.0(D液)透析过夜。第7步：乳糖琼脂糖层析

透析后的样品以0.13ml/min的流速加到预先用D液平衡好的5ml乳糖琼脂糖柱(Sigma公司)上。用(D液)洗去全部未结合的蛋白，用0.1MTri/HCl pH8.6/0.2M NaCl洗脱结合蛋白，检测每管收集液(0.5ml)的酶活性。第8步：N-末端氨基酸序列测定

把从乳糖琼脂糖柱上洗脱下来的具有高的酶活性的收集液合并，用centricon10(Amicon)浓缩16倍，然后根据12.5％SDS-PAGE电泳得出的分子量分离。电泳后，蛋白被转移到Pro Blott膜上(转移缓冲液为10mM CAPS pH11，10％甲醇)。Pro Blott膜用0.1％的考马斯亮兰R250，1％乙酸，40％甲醇染色并用50％甲醇脱色。可以看见几条蛋白带，其中与具有酶活性相对应的两条带分子量为40KDa和80KDa，把这两条带切下来，并用ABI 475型蛋白序列仪测它们的N端氨基酸序列。

西红柿的80KDa多肽通过其与羽扇豆的酶的同源性而被确定为外-半乳聚糖酶。

80KDa西红柿多肽：SVSYDDRAI^**NG^*R(Seq ID No.11)

羽扇豆外-半乳聚糖酶：SVTYDHKAIMINGQR…etc.

(^*＝未确定的氨基酸)

40KDa蛋白没有被确认：

40KDa西红柿多肽：FSNNNFVATDGTHFALNGKS(Seq ID No.12)

外-半乳聚糖酶活性的保持高度依赖于离子强度，如果层析缓冲液中的离子强度小于100mM，酶活性可能会丧失。在改进的纯化过程中，所有的层析缓冲液中(至少)含100mM的NaCl。为了实现同样的纯化，并得到更多的外-半乳聚糖酶蛋白和活力，需要重新评价和优化上述方案。编码西红柿外-半乳聚糖酶的部分cDNA克隆的分离

用编码羽扇豆外-半乳聚糖酶的异源cDNA探针(2628bp)和55℃的杂交温度，2个部分cDNA克隆，TEG13(1082bp)和TEG6(415bp)，从Clontech实验室公司提供的商品西红柿果实破裂阶段)cDNA文库中分离出来。[用从成熟的(破裂阶段)果实(Ailsa Craigcultivar VFN8)提取的mRNA制备，用寡聚脱氧胸腺嘧啶和随机引物来引发，克隆到λgt11中]。利用美国生物化学公司提供的试剂盒(序列酶V2.0)使用³²P-dCTP放射标记探针从这一文库中筛选出大约300,000个cDNA克隆。通过一个Sephadex G-50层析柱除去未掺入的核苷酸。把TEG13和TEG6克隆用TAQ多聚酶和λgt11特殊引物进行PCR扩增(引物：GT115’B：ACTCCTGGATCCCGTCAGTAT.Seq ID No.13和GT113’K：TAATGGTACCGACCGGCGCTCT，SeqID.No.14)。克隆到pT7蓝色PCR克隆载体上(AMS生物技术有限公司)并根据厂家的建议转化到感受态的大肠杆菌中。含有重组质粒的克隆被接种到含100μg/μl羧苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜后，用Qiagen质粒DNA抽提试剂盒纯化出质粒DNA，用聚乙二醇沉淀并用70％乙醇清洗。

DNA序列由ABI自动序列分析仪测得并用Apple Mac计算机和DNA Star软件进行分析。TEG13与羽扇豆外-半乳聚糖酶序列的核苷酸678到1760片段有64.2％同源性，TEG6与羽扇豆外-半乳聚糖酶序列的核苷酸2014到2428片段有62.7％同源性。分离重迭(overlapping)cDNA片段：

因为cDNA克隆TEG13和TEG6在羽扇豆外-半乳聚糖酶cDNA上分散排列，为了得到重迭的cxDNA(TEG6的5’延伸)片段，进行了一个RACE过程(根据Frohman M的定义，cDNA末端快速扩增(RACE)：用户友好cDNA克隆、扩增：PCR用户讨论会，pp11-14)利用含MuMLV-RT西红柿果实(破裂阶段)总RNA逆转录和随机六核苷酸引物人们制备了一定的5’cDNA。然后在存在dATP的条件下，用末端脱氧-转移酶(BRL)加上尾巴。在5’cDNA的第一轮PCR扩增中，引物6A1(TEG6的第84-64位，图5中1844-1824)与另外一个退火至cDNA5’末端尾部外源媒介引物(Ro：AAGGATCCGTCGACATC，Seq ID No.15)和(dT)₁₇-Ri-R0：AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGATTTTTTTTTTTTTTTTT，Seq ID No.16)联合使用。在PCR扩增的第二轮，引物6A3(TEG6的第42-22位，图5中1802-1782)与也退火至cDNA5’末端的相邻的内源媒介引物(Ri：GACATCGATAATACGAC，Seq ID.No.17)联合使用，得到了一个511bp的RACE产物，它与TEG6相比，向5’端延伸了469个bp，这一片段克隆到pT7中并测序。测序结果显示RACE产物的5’端209bp与TEG13的3’端是100％的同源，这说明TEG13和TEG6是同一基因(TEG1)的两个部分cDNA克隆。人们还发现这个重迭RACE产物(TEG7)和羽扇豆子叶核苷酸1544-2054片段有59.2％的同源性。

利用DNA Star Megalign程序计算了所有DNA的排列(利用Clustal方法进行多重排列，缺口补偿：10，缺口长度补偿：10)。

通过重迭TEG13，TEG7和TEG6的序列，得到一段含有连续开放阅读框架的长度为1757bp的杂交cDNA分子，它编码的多肽与羽扇豆外-半乳聚糖酶135-717的氨基酸序列有68.1％的同源性。

为了获得这个克隆的5’端序列信息，对西红柿cDNA(5μl)进行了以下三个连续的RACE实验。第一个5’RACE：

在第一轮PCR扩增中，引物13A2(TEG13的106-86片段和图5中524-504片段)和外源媒介引物(Ro)联合使用来扩增5’cDNA的序列。在第二轮扩增中，引物13A5(TEG13的62-42片段和图5中480-460片段)和内源媒介引物(Ri)联合使用，用DEAE纸从0.8％的琼脂糖凝胶上回收到一个214bp的特殊片段，克隆到质粒pT7中，转化到感受态的大肠杆菌中，生成的克隆被称为5’TEG1.1，它与杂交cDNA分子有62bp重迭，并延伸到1909bp.第二个5’RACE：

为了做第二个RACE实验，我们设计了两个新的引物：1A1(5’TEG1.1的28-8片段，图5中294-274)和1A2(5’TEG1.1中63-43片段。图5中329-309)。引物1A2和引物1A1分别与Ro和Ri结合，并分别用于第一轮和第二轮PCR扩增实验中。象上面描述的一样，得到了一个206bp的片段并进行纯化、克隆和测序。这一克隆被称作5’TEG1、2，它与延伸的杂交cDNA分子有26bp的重迭，并进一步延伸到2089bp。这个延伸序列的5’端编码了一个信号肽的C末端的10个氨基酸，后面接着是西红柿外-半乳聚糖酶的成熟的N-末端。(12个氨基酸中有11个与纯化出来的西红柿外-半乳聚糖酶N-末端序列相同)。第三个5’RACE

为了获得编码完整信号肽的序列，又合成了两个引物1A6(5’TEG1、2的52-32片段，图5中138-118)和1A7(5’TEG1、2的32-12片段，图5中118-98)。引物1A6和1A7分别用于第一轮和第二轮扩增。象上面所描述的那样得到了一个117bp的cDNA产物，并进行纯化、克隆和测序。此克隆被称为5’TEG1、3，它与延伸的杂交cDNA分子有32bp的重迭，并进一步延伸到2175bp。这一延伸序列编码了一个完整的25个氨基酸的信号肽。3’RACE

为了获得与TEG1基因3’末端相对应的cDNA分子，利用MuMLV-RT反转录西红柿果实(破裂阶段)总RNA反转录得到的3’cDNA和(dT)₁₇-Ri-Ro引物进行RACE实验。第一个PCR反应中同时使用了引物6S2(TEG6中340-360片段，图5中2100-2120片段)和引物R。在第二轮PCR反应中同时使用了引物6S3(TEG 6中373～393片段，图5中2133-2153)和引物Ri。RACE反应产物有812bp，与延伸的cDNA分子有43bp重迭，并进一步延伸到2944bp，其中包括3’端23个“A”(“T”)。

图5中完整的TEG1 cDNA序列(Seq ID No.18)被发现含有一个2514bp长的开放的阅读框架(核苷酸42到2555)，它编码一个含838个氨基酸的多肽，信号序列裂解位点用箭头标出。TEG1编码的成熟的外-半乳聚糖酶蛋白(减掉一个含25个氨基酸的信号肽)长为813个氨基酸，分子量为90623 Da，与羽扇豆cDNA编码的的成熟的外-半乳聚糖酶有70％的同源性(Lipman-Pearson算法，缺口补偿：4，K tuple：2，长度：12)，所以可以认为它是羽扇豆酶的功能等价物。

图5中，1445位核苷酸为Y(IUPAC码)，而Seq ID.No.18中此位置为T。这只是为了方便：因为核苷酸的精确确定是很困难的。这使人懂得：当一个核苷酸位于密码子第三位时，它的精确性并不关键。还可进一步地注意到，由TEG1推断出来的它编码的多肽的氨基酸序列与多肽测序得到的纯化了的多肽的N末端序列有少量不同。人们设想在西红柿中有多种(至少两种)编码具有轻微不同的氨基酸序列的同功酶的基因。

图6比较了羽扇豆酶(LEG11 CON.pro)和西红柿酶(CONTIG.TEGl.PRO)的氨基酸序列。西红柿的序列用框标出，这些框中包括了与西红柿序列一致的羽扇豆酶部分。可以看到有一些具有高度同源性的部分。它们可能对这些分子的催化功能有重要作用。反义实验植物转化载体的构建

为了评价转基因植物中TEG1的表达的下游调节所产生的表现型，构建了植物转化载体来做反义实验。这种载体被转入根癌脓杆菌LBA4404中，并用这种携带此载体的根癌脓杆菌感染西红柿子叶(“Moneymaker”变种)。

在组成型35S启动子和pKan 35S的nos多聚腺苷酸信号之间，反向插入TEG1的一个1082bp有SstI/XbaI片段(419-1500)，构建成载体p35S/TEGlA。

在组成型35S启动子和pKan 35S的nos多聚腺苷酸位点之间，反向插入一个511bp SstI/XbaI片段(1292-1802)，构建成载体p35S/TEG1B.

载体pKan35S是通过插入一个0.8Kb Hind III-Xba片段构建的。它在pGPTV-Kan(Becker等，1992，植物分子生物学，20.1195-1197)的nos多聚腺苷酸位点之后包含一个35S的菜花花叶病毒的组成型启动子(由Toepfer等人描述的载体pc TAK得来1987 NAR15.5890 et Seq.)

在果实专一性(-942到+33)PG启动子(Bird等，1988植物分子生物学，11.651-662)和pGPTV-Kan的nos多聚腺苷酸位点之间反向插入TEG1的一段1082bp PstI/Blunt/SstI)片段(419-1500)，构建得到载体pPG/TEG1A。

序列表(1) 一般资料：

(i)申请人：

(A)姓名： Unilever PLC

(B)街道： Unilever House.Blackfriars

(C)城市： London

(E)国家： United Kingdom

(F)邮编： (ZIP)：EC4P 4BQ

(A)姓名： Unilever NV

(B)街道： 455 Weena

(C)城市： Rotterdam

(E)国家： Netherlands

(F)邮编： (ZIP)：3013AL

(ii)发明名称：新的外-(1→4)-β-D半乳聚糖酶

(iii)序列数：19

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0.Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2628个碱对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(ix)特性：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：130..2322

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CAACACTCTT ATACAATAAG AGACTCTCAA AAAGTAGCAA AATAAAAAGA CACTATATAC 60AAAACAGAAA ATATTTCTTC TTCTATAGAA AGACAACATT GCTTATATAG AAACATAGCA 120TTTTTTGTT ATG TTT GGT TCA AGA ATT GTG ATG GAG AGT TTA ATG TCT 168

Met Phe Gly Ser Arg Ile Val Met Glu Ser Leu Met Ser

1 5 10AGG AGA AAT TTT CAT ATG GTG TTG CTG TTA TTG TTT TTT TGG GTT TGT 216Arg Arg Asn Phe His Met Val Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Val Cys

15 20 25TAT GTC ACA GCC TCT GTT ACT TAT GAT CAT AAA GCC ATT ATG ATT AAT 264Tyr Val Thr Ala Ser Val Thr Tyr Asp His Lys Ala Ile Met Ile Asn30 35 40 45GGG CAG AGA AGA ATT TTG ATC TCT GGT TCC ATT CAC TAT CCA AGA AGC 312Gly Gln Arg Arg Ile Leu Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Pro Arg Ser

50 55 60ACA CCT CAG ATG TGG CCA GAC CTT ATT CAA AAG GCC AAA GAT GGA GGG 360Thr Pro Gln Met Trp Pro Asp Leu Ile Gln Lys Ala Lys Asp Gly Gly

65 70 75CTT GAT GTT ATA GAG ACT TAT GTG TTC TGG AAT GGA CAT GAA CCT TCT 408Leu Asp Val Ile Glu Thr Tyr Val Phe Trp Asn Gly His Glu Pro Ser

80 85 90CCT GGA AAA TAT TAT TTT GAG GAT AGG TTT GAC CTT GTT GGG TTC ATA 456Pro Gly Lys Tyr Tyr Phe Glu Asp Arg Phe Asp Leu Val Gly Phe Ile

95 100 105AAG TTG GTT CAG CAA GCT GGT CTA TTT GTT CAT CTC AGG ATT GGT CCT 504Lys Leu Val Gln Gln Ala Gly Leu Phe Val His Leu Arg Ile Gly Pro110 115 120 125TTC ATA TGT GCT GAA TGG AAC TTT GGA GGA TTT CCT GTT TGG CTC AAA 552Phe Ile Cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp Leu Lys

130 135 140TAT GTT CCT GGT ATT GCT TTC AGA ACA GAC AAT GAG CCT TTC AAG GAG 600Tyr Val Pro Gly Ile Ala Phe Arg Thr Asp Ash Glu Pro Phe Lys Glu

145 150 155GCA ATG CAA AAA TTC ACT GAG AAG ATT GTA AAT ATA ATG AAA GCA GAG 648Ala Met Gln Lys Phe Thr Glu Lys Ile Val Ash Ile Met Lys Ala Glu

160 165 170AAG TTG TTT CAA TCC CAG GGA GGT CCA ATA ATT CTG TCT CAG ATA GAG 696Lys Leu Phe Gln Ser Gln Gly Gly Pro Ile Ile Leu Ser Gln Ile Glu

175 180 185AAT GAG TAT GGA CCA GTG GAA TGG GAA ATT GGT GCT CCT GGA AAA GCT 744Asn Glu Tyr Gly Pro Val Glu Trp Glu Ile Gly Ala Pro Gly Lys Ala190 195 200 205TAT ACC AAA TGG GCT GCT CAA ATG GCT GTA GGT CTA GAT ACT GGT GTC 792Tyr Thr Lys Trp Ala Ala Gln Met Ala Val Gly Leu Asp Thr Gly Val

210 215 220CCA TGG GTT ATG TGC AAG CAA GAA GAT GCA CTT GAT CCT ATT ATT GAT 840Pro Trp Val Met Cys Lys Gln Glu Asp Ala Leu Asp Pro Ile Ile Asp

225 230 235ACC TGC AAT GGA TTT TAC TGT GAA AAC TTC ACT CCA AAC AAG AAC TAC 888Thr Cys Asn Gly Phe Tyr Cys Glu Asn Phe Thr Pro Asn Lys Asn Tyr

240 245 250AAA CCC AAA TTG TGG ACA GAA AAT TGG ACT GGC TGG TAC ACT GCT TTT 936Lys Pro Lys Leu Trp Thr Glu Asn Trp Thr Gly Trp Tyr Thr Ala Phe

255 260 265GGT GGT GCA ACC CCT TAT AGA CCA GCA GAA GAT ATA GCA TTT TCA GTT 984Gly Gly Ala Thr Pro Tyr Arg Pro Ala Glu Asp Ile Ala Phe Ser Val270 275 280 285GCC AGA TTC ATT CAG AAT CGC GGC TCA CTC TTT AAC TAC TAT ATG TAT 1032Ala Arg Phe Ile Gln Asn Arg Gly Ser Leu Phe Asn Tyr Tyr Met Tyr

290 295 300CAT GGA GGA ACT AAC TTT GGC CGG ACA TCG AAT GGC CTC TTC GTT GCC 1080His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ser Asn Gly Leu Phe Val Ala

305 310 315ACA AGT TAT GAC TAT GAT GCT CCC ATT GAT GAA TAT GGA CTT CTA AAT 1128Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Ile Asp Glu Tyr Gly Leu Leu Asn

320 325 330GAA CCA AAA TGG GGG CAT CTG AGA GAA TTA CAT AGA GCA ATA AAA CAA 1176Glu Pro Lys Trp Gly His Leu Arg Glu Leu His Arg Ala Ile Lys Gln

335 340 345TGC GAG TCG GCT TTA GTG TCG GTG GAT CCC ACA GTG TCA TGG CCT GGA 1224Cys Glu Ser Ala Leu Val Ser Val Asp Pro Thr Val Ser Trp Pro Gly350 355 360 365AAA AAC CTT GAG GTA CAT TTG TAC AAG ACA GAG TCT GCC TGT GCT GCA 1272Lys Asn Leu Glu Val His Leu Tyr Lys Thr Glu Ser Ala Cys Ala Ala

370 375 380TTT CTT GCA AAT TAT AAC ACC GAC TAT TCA ACG CAA GTT AAA TTC GGA 1320Phe Leu Ala Asn Tyr Asn Thr Asp Tyr Ser Thr Gln Val Lys Phe Gly

385 390 395AAT GGA CAA TAT GAT CTA CCA CCT TGG TCT ATC AGT ATT CTT CCT GAC 1368Asn Gly Gln Tyr Asp Leu Pro Pro Trp Ser Ile Ser Ile Leu Pro Asp

400 405 410TGC AAA ACT GAA GTT TTC AAC ACT GCA AAG GTT AAT TCC CCG AGA TTA 1416Cys Lys Thr Glu Val Phe Asn Thr Ala Lys Val Asn Ser Pro Arg Leu

415 420 425CAT AGG AAA ATG ACT CCA GTA AAC AGT GCA TTT GCT TGG CAG TCA TAC 1464His Arg Lys Met Thr Pro Val Asn Ser Ala Phe Ala Trp Gln Ser Tyr430 435 440 445AAT GAA GAA CCT GCA TCA TCA AGC GAA AAT GAT CCC GTC ACA GGA TAT 1512Asn Glu Glu Pro Ala Ser Ser Ser Glu Asn Asp Pro Val Thr Gly Tyr

450 455 460GCA CTA TGG GAG CAG GTT GGC GTG ACC CGC GAT TCT TCC GAT TAT TTG 1560Ala Leu Trp Glu Gln Val Gly Val Thr Arg Asp Ser Ser Asp Tyr Leu

465 470 475TGG TAC CTG ACA GAT GTC AAC ATT GGT CCT AAT GAT ATA AAG GAT GGG 1608Trp Tyr Leu Thr Asp Val Asn Ile Gly Pro Asn Asp Ile Lys Asp Gly

480 485 490AAA TGG CCT GTT CTG ACA GCA ATG TCA GCA GGT CAT GTT CTG AAT GTT 1656Lys Trp Pro Val Leu Thr Ala Met Ser Ala Gly His Val Leu Asn Val

495 500 505TTC ATC AAT GGT CAA TAT GCA GGA ACT GCA TAT GGG AGT CTA GAT GAT 1704Phe Ile Asn Gly Gln Tyr Ala Gly Thr Ala Tyr Gly Ser Leu Asp Asp510 515 520 525CCT AGA TTA ACA TTT AGT CAA AGT GTG AAT CTG AGA GTT GGC AAT AAC 1752Pro Arg Leu Thr Phe Ser Gln Ser Val Asn Leu Arg Val Gly Asn Asn

530 535 540AAG ATT TCT TTA CTT AGT GTT TCC GTT GGT CTC GCG AAT GTT GGT ACT 1800Lys Ile Ser Leu Leu Ser Val Ser Val Gly Leu Ala Asn Val Gly Thr

545 550 555CAC TTT GAG ACA TGG AAT ACT GGA GTG CTT GGT CCA GTC ACA CTG ACA 1848His Phe Glu Thr Trp Asn Thr Gly Val Leu Gly Pro Val Thr Leu Thr

560 565 570GGT CTA AGT AGC GGA ACA TGG GAT CTT TCG AAG CAA AAA TGG TCT TAC 1896Gly Leu Ser Ser Gly Thr Trp Asp Leu Ser Lys Gln Lys Trp Ser Tyr

575 580 585AAG ATT GGT CTG AAA GGT GAA AGC TTG AGC CTT CAT ACT GAA GCT GGG 1944Lys Ile Gly Leu Lys Gly Glu Ser Leu Ser Leu His Thr Glu Ala Gly590 595 600 605AGT AAC TCT GTT GAA TGG GTA CAA GGA TCT TTA GTG GCT AAA AAA CAA 1992Ser Asn Ser Val Glu Trp Val Gln Gly Ser Leu Val Ala Lys Lys Gln

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625 630 635CCG TTG GCT CTG GAT TTA GGT AGC ATG GGT AAG GGT GAA GTA TGG GTA 2088Pro Leu Ala Leu Asp Leu Gly Ser Met Gly Lys Gly Glu Val Trp Val

640 645 650AAT GGT CAA AGC ATT GGA CGC CAT TGG CCT GGA AAT AAA GCT CGT GGT 2136Asn Gly Gln Ser Ile Gly Arg His Trp Pro Gly Asn Lys Ala Arg Gly

655 660 665AAT TGC GGC AAT TGT AAT TAC GCT GGA ACT TAT ACC GAT ACA AAA TGC 2184Asn Cys Gly Asn Cys Asn Tyr Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Lys Cys670 675 680 685TTA GCA AAC TGT GGA CAA CCC TCC CAA AGA TGG TAT CAT GTT CCT CGG 2232Leu Ala Asn Cys Gly Gln Pro Ser Gln Arg Trp Tyr His Val Pro Arg

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720 725 730AGTGTATTCA TGTGATACCA AATGTACATG TTATGTACAT AGTGAAACTA TTATGCTGAA 2382TATTGTTCCA TATACTACAT TACAGGGTTT GTGTCACAAT GAACATTGAG TCCTTAAACA 2442TTGGTATAGA AGGGAAAGAG TTGAATACCC AAAATGGGTC AAAATACTAC ATTGTCCTAG 2502AAATAGATTT CTTTCATTTT CTATATCAAC TATTATGTAA GAACAAATTG AAAGTAATAC 2562TAATAAATAG TGATGCATTT GGATTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2622AAAAAA 2628(2)SEQ ID NO：2资料：(i)序列特征：

(A)长度：731个氨基酸

(B)类型：氨基酸

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100 105 110Gln Gln Ala Gly Leu Phe Val His Leu Arg Ile Gly Pro Phe Ile Cys

115 120 125Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp Leu Lys Tyr Val Pro

130 135 140Gly Ile Ala Phe Arg Thr Asp Asn Glu Pro Phe Lys Glu Ala Met Gln145 150 155 160Lys Phe Thr Glu Lys Ile Val Asn Ile Met Lys Ala Glu Lys Leu Phe

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325 330 335Trp Gly His Leu Arg Glu Leu His Arg Ala Ile Lys Gln Cys Glu Ser

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435 440 445Pro Ala Ser Ser Ser Glu Asn Asp Pro Val Thr Gly Tyr Ala Leu Trp

450 455 460Glu Gln Val Gly Val Thr Arg Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Trp Tyr Leu465 470 475 480Thr Asp Val Ash Ile Gly Pro Asn Asp Ile Lys Asp Gly Lys Trp Pro

485 490 495Val Leu Thr Ala Met Ser Ala Gly His Val Leu Asn Val Phe Ile Asn

500 505 510Gly Gln Tyr Ala Gly Thr Ala Tyr Gly Ser Leu Asp Asp Pro Arg Leu

515 520 525Thr Phe Ser Gln Ser Val Asn Leu Arg Val Gly Asn Asn Lys Ile Ser

530 535 540Leu Leu Ser Val Ser Val Gly Leu Ala Asn Val Gly Thr His Phe Glu545 550 555 560Thr Trp Asn Thr Gly Val Leu Gly Pro Val Thr Leu Thr Gly Leu Ser

565 570 575Ser Gly Thr Trp Asp Leu Ser Lys Gln Lys Trp Ser Tyr Lys Ile Gly

580 585 590Leu Lys Gly Glu Ser Leu Ser Leu His Thr Glu Ala Gly Ser Asn Ser

595 600 605Val Glu Trp Val Gln Gly Ser Leu Val Ala Lys Lys Gln Pro Leu Ala

610 615 620Trp Tyr Lys Thr Thr Phe Ser Ala Pro Ala Gly Asn Asp Pro Leu Ala625 630 635 640Leu Asp Leu Gly Ser Met Gly Lys Gly Glu Val Trp Val Asn Gly Gln

645 650 655Ser Ile Gly Arg His Trp Pro Gly Asn Lys Ala Arg Gly Asn Cys Gly

660 665 670Asn Cys Asn Tyr Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Lys Cys Leu Ala Asn

675 680 685Cys Gly Gln Pro Ser Gln Arg Trp Tyr His Val Pro Arg Ser Trp Leu

690 695 700Arg Ser Gly Gly Asn Tyr Leu Val Val Leu Glu Glu Trp Gly Gly Asp705 710 715 720Pro Asn Gly Ile Ala Leu Val Glu Arg Thr *

725 730(2)SEQ ID NO：3资料：(i)序列特征：

(A)长度：19个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(i)序列特征：

(A)长度：12个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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Ser Val Thr Tyr Asp His Lys Ala Ile Met Ile Asn

1 5 10(2)SEQ ID NO：5资料：(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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Val Ala Lys Lys Gln Pro Leu Ala Trp Tyr

1 5 10(2)SEQ ID NO：6资料：(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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ATCATDATNG CYTTRTGRTC RTA 23(2)SEQ ID NO：7资料：(i)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑性质：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义序列：无(v) 片段类型：N末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Val Ala Lys Lys Gln Pro Leu Ala Trp Tyr Lys Thr Thr

1 5 10(2)SEQ ID NO：8资料：(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑性质：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义序列：无(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Phe Ser Ala pro Ala Gly Asn Asp Pro Leu

1 5 10(2)SEQ ID NO：9资料：(i)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(v) 片段类型：内部

(xi)序列描述： SEQ ID NO：9：

Gly Glu Val Trp Val Asn Gly Gln Ser Ile Gly

1 5 10(2)SEQ ID NO：10资料：(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑性质：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义序列：无(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

Gly Asn Cys Gly Asn Cys Asn Tyr Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Lys

1 5 10 15(2)SEQ ID NO：11资料：(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑性质：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义序列：无(v)片段类型：N末端(xi)序列描述：SEQ ID NO：11

Ser Val Ser Tyr Asp Asp Arg Ala Ile

1 5(2)SEQ ID NO：12资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(v)片段类型：N末端

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Phe Ser Asn Asn Asn Phe Val Ala Thr Asp Gly Thr His Phe Ala Leu1 5 10 15Asn Gly Lys Ser

20(2)SEQ ID NO：13资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：线性

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc＝“合成的寡核苷酸”

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：ACTCCTGGAT CCCGTCAGTA T 21(2)SEQ ID NO：14资料：(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc＝“合成的寡核苷酸”

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：TAATGGTACC GACCGGCGCT CT 22(2) SEQ ID NO：15资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc＝“合成的寡核苷酸”

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15AAGGATCCGT CGACATC 17(2) SEQ ID NO：16资料：

(i)序列特征：

(A)长度：57个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc＝“合成的寡核苷酸”

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：AAGGATCCGT CGACATCGAT AATACGACTC ACTATAGGGA TTTTTTTTTT TTTTTTT 57(2) SEQ ID NO：17资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc＝“合成的寡核苷酸”

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17GACATCGATA ATACGAC 17(2) SEQ ID NO：18资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2944个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义序列：无

(ix)特性：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：42..2555

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TTAAAAAGGC ACAATCTTGA TAGAAAAGGA GATAATTTTA C ATG GGT TGT ACG 53

Met Gly Cys Thr

lCTT ATA CTA ATG TTG AAT GTG TTG TTG GTG TTG TTG GGT TCA TGG GTT 101Leu Ile Leu Met Leu Asn Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Ser Trp Val5 10 15 20TTT TCT GGA ACA GCT TCT GTT TCA TAT GAC CAT AGG GCT ATT ATT GTA 149Phe Ser Gly Thr Ala Ser Val Ser Tyr Asp His Arg Ala Ile Ile Val

25 30 35AAT GGA CAA AGA AGA ATA CTT ATT TCT GGT TCT GTT CAT TAT CCA AGA 197Asn Gly Gln Arg Arg Ile Leu Ile Ser Gly Ser Val His Tyr Pro Arg

40 45 50AGC ACT CCT GAG ATG TGG CCA GGT ATT ATT CAA AAG GCT AAA GAA GGA 245Ser Thr Pro Glu Met Trp Pro Gly Ile Ile Gln Lys Ala Lys Glu Gly

55 60 65GGT GTG GAT GTG ATT CAG ACT TAT GTT TTC TGG AAT GGA CAT GAG CCT 293Gly Val Asp Val Ile Gln Thr Tyr Val Phe Trp Asn Gly His Glu Pro

70 75 80CAA CAA GGG AAA TAT TAT TTT GAA GGG AGA TAT GAT TTA GTG AAG TTT 341Gln Gln Gly Lys Tyr Tyr Phe Glu Gly Arg Tyr Asp Leu Val Lys Phe85 90 95 100ATT AAG CTG GTG CAC CAA GCA GGA CTT TAT GTC CAT CTT AGA GTT GGA 389Ile Lys Leu Val His Gln Ala Gly Leu Tyr Val His Leu Arg Val Gly

105 110 115CCT TAT GCT TGT GCT GAA TGG AAT TTT GGG GGC TTT CCT GlT TGG CTG 437Pro Tyr Ala Cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe Pro Val Trp Leu

120 125 130AAA TAT GTT CCA GGT ATC AGT TTC AGA ACA GAT AAT GGA CCT TTC AAG 485Lys Tyr Val Pro Gly Ile Ser Phe Arg Thr ASp Asn Gly Pro Phe Lys

135 140 145GCT GCA ATG CAA AAA TTT ACT GCC AAG ATT GTC AAT ATG ATG AAA GCG 533Ala Ala Met Gln Lys Phe Thr Ala Lys Ile Val Asn Met Met Lys Ala

150 155 160GAA CGT TTG TAT GAA ACT CAA GGG GGG CCA ATA ATT lTA TCT CAG ATT 581Glu Arg Leu Tyr Glu Thr Gln Gly Gly Pro Ile Ile Leu Ser Gln Ile165 170 175 180GAG AAT GAA TAT GGA CCC ATG GAA TGG GAA CTG GGA GCA CCA GGT AAA 629Glu Asn Glu Tyr Gly Pro Met Glu Trp Glu Leu Gly Ala Pro Gly Lys

185 190 195TCT TAC GCA CAG TGG GCC GCC AAA ATG GCT GTG GGT CTT GAC ACT GGT 677Ser Tyr Ala Gln Trp Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Asp Thr Gly

200 205 210GTC CCA TGG GTT ATG TGC AAG CAA GAC GAT GCC CCT GAT CCT ATT ATA 725Val Pro Trp Val Met Cys Lys Gln Asp Asp Ala Pro Asp Pro Ile Ile

215 220 225AAT GCT TGC AAT GGC TTC TAC TGT GAC TAC TTT TCT CCA AAC AAG GCT 773Asn Ala Cys Asn Gly Phe Tyr Cys Asp Tyr Phe Ser Pro Asn Lys Ala

230 235 240TAT AAA CCA AAG ATA TGG ACT GAA GCC TGG ACT GCA TGG lTT ACT GGT 821Tyr Lys Pro Lys Ile Trp Thr Glu Ala Trp Thn Ala Trp Phe Thr Gly245 250 255 260TTT GGA AAT CCA GTT CCT TAC CGT CCT GCT GAG GAC TTG GCA TTT TCT 869Phe Gly Asn Pro Val Pro Tyr Arg Pro Ala Glu Asp Leu Ala Phe Ser

265 270 275GTT GCA AAA TTT ATA CAG AAG GGA GGT TCC TTC ATC AAT TAT TAC ATG 917Val Ala Lys Phe Ile Gln Lys Gly Gly Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Met

280 285 290TAT CAT GGA GGA ACA AAC TTT GGA CGG ACT GCT GGT GGT CCA TTT ATT 965Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala Gly Gly Pro Phe Ile

295 300 305GCT ACT AGT TAT GAC TAT GAT GCA CCA CTT GAT GAA TAT GGA TTA TTG 1013Ala Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu Tyr Gly Leu Leu

310 315 320CGA CAA CCA AAA TGG GGT CAC CTG AAA GAT CTG CAT AGA GCA ATA AAG 1061Arg Gln Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His Arg Ala Ile Lys325 330 335 340CTT TGT GAA CCA GCT TTA GTC TCT GGA GAT CCA GCT GTG ACA GCA CTT 1109Leu Cys Glu Pro Ala Leu Val Ser Gly Asp Pro Ala Val Thr Ala Leu

345 350 355GGA CAC CAG CAG GAG GCC CAT GTT TTT AGG TCG AAG GCT GGC TCT TGT 1157Gly His Gln Gln Glu Ala His Val Phe Arg Ser Lys Ala Gly Ser Cys

360 365 370GCT GCA TTC CTT GCT AAC TAC GAC CAA CAC TCT TTT GCT ACT GTG TCA 1205Ala Ala Phe Leu Ala Asn Tyr Asp Gln His Ser Phe Ala Thr Val Ser

375 380 385TTT GCA AAC AGG CAT TAC AAC TTG CCA CCA TGG TCA ATC AGC ATT CTT 1253Phe Ala Asn Arg His Tyr Asn Leu Pro Pro Trp Ser Ile Ser Ile Leu

390 395 400CCC GAC TGC AAG AAC ACT GTA TTT AAT ACA GCA CGG ATC GGT GCT CAA 1301Pro Asp Cys Lys Asn Thr Val Phe Asn Thr Ala Arg Ile Gly Ala Gln405 410 415 420AGT GCT CAG ATG AAG ATG ACT CCA GTC AGC AGA GGA TTG CCC TGG CAG 1349Ser Ala Gln Met Lys Met Thr Pro Val Ser Arg Gly Leu Pro Trp Gln

425 430 435TCA TTC AAT GAA GAG ACA TCA TCT TAT GAA GAC AGT AGT TTT ACA GTT 1397Ser Phe Asn Glu Glu Thr Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Phe Thr Val

440 445 450GlT GGG CTA TTG GAA CAG ATA AAT ACA ACA AGA GAC GTG TCT GAT TAT 1445Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Asn Thr Thr Arg Asp Val Ser Asp Tyr

455 460 465TTG TGG TAT TCA ACA GAT GTC AAG ATT GAT TCA AGA GAA AAG TTT TTG 1493Leu Trp Tyr Ser Thr Asp Val Lys Ile Asp Ser Arg Glu Lys Phe Leu

470 475 480AGA GGC GGA AAA TGG CCT TGG CTT ACG ATC ATG TCA GCT GGG CAT GCA 1541Arg Gly Gly Lys Trp Pro Trp Leu Thr Ile Met Ser Ala Gly His Ala485 490 495 500TTG CAT GTT TTT GTG AAT GGT CAA TTA GCA GGA ACT GCA TAT GGA AGT 1589Leu His Val Phe Val Asn Gly Gln Leu Ala Gly Thr Ala Tyr Gly Ser

505 510 515TTA GAA AAA CCG AAA CTA ACT TTC AGT AAA GCC GTA AAT CTG AGA GCA 1637Leu Glu Lys Pro Lys Leu Thr Phe Ser Lys Ala Val Asn Leu Arg Ala

520 525 530GGT GTT AAC AAG ATT TCT CTA CTG AGC ATT GCT GTT GGC CTT CCG AAT 1685Gly Val Asn Lys Ile Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val Gly Leu Pro Asn

535 540 545ATC GGC CCA CAT TTT GAG ACA TGG AAT GCT GGT GTT CTT GGG CCA GTC 1733Ile Gly Pro His Phe Glu Thr Trp Asn Ala Gly Val Leu Gly Pro Val

550 555 560TCA CTA ACT GGT CTT GAC GAG GGG AAA AGA GAT TTA ACA TGG CAG AAA 1781Ser Leu Thr Gly Leu Asp Glu Gly Lys Arg Asp Leu Thr Trp Gln Lys565 570 575 580TGG TTC TAC AAG GTT GGT CTA AAA GGA GAA GCC CTG AGT CTT CAT TCA 1829Trp Phe Tyr Lys Val Gly Leu Lys Gly Glu Ala Leu Ser Leu His Ser

585 590 595CTC AGT GGT AGC CCA TCC GTG GAG TGG GTG GAA GGC TCT TTA GTG GCA 1877Leu Ser Gly Ser Pro Ser Val Glu Trp Val Glu Gly Ser Leu Val Ala

600 605 610CAG AAG CAG CCA CTC AGT TGG TAT AAG ACT ACA TTC AAT GCT CCA GAT 1925Gln Lys Gln Pro Leu Ser Trp Tyr Lys Thr Thr Phe Asn Ala Pro Asp

615 620 625GGA AAT GAA CCT TTG GCT TTA GAT ATG AAT ACC ATG GGC AAA GGT CAA 1973Gly Asn Glu Pro Leu Ala Leu Asp Met Asn Thr Met Gly Lys Gly Gln

630 635 640GTA TGG ATA AAT GGT CAG AGC CTC GGA CGC CAC TGG CCT GCA TAT AAA 2021Val Trp Ile Asn Gly Gln Ser Leu Gly Arg His Trp Pro Ala Tyr Lys645 650 655 660TCA TCT GGA AGT TGT AGT GTC TGT AAC TAT ACT GGC TGG TTT GAT GAG 2069Ser Ser Gly Ser Cys Ser Val Cys Asn Tyr Thr Gly Trp Phe Asp Glu

665 670 675AAA AAG TGC CTA ACT AAC TGT GGT GAG GGC TCA CAA AGA TGG TAC CAC 2117Lys Lys Cys Leu Thr Asn Cys Gly Glu Gly Ser Gln Arg Trp Tyr His

680 685 690GTA CCC CGG TCT TGG CTG TAT CCT ACT GGA AAT TTG TTA GTT GTA TTC 2165Val Pro Arg Ser Trp Leu Tyr Pro Thr Gly Asn Leu Leu Val Val Phe

695 700 705GAG GAA TGG GGA GGA GAT CCT TAT GGA ATC ACT TTA GTC AAA AGA GAA 2213Glu Glu Trp Gly Gly Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Leu Val Lys Arg Glu

710 715 720ATA GGG AGT GTT TGT GCT GAT ATA TAT GAG TGG CAA CCA CAG TTA TTG 2261Ile Gly Ser Val Cys Ala Asp Ile Tyr Glu Trp Gln Pro Gln Leu Leu725 730 735 740AAT TGG CAG AGG CTA GTA TCT GGT AAG TTT GAC AGA CCT CTC AGA CCT 2309Asn Trp Gln Arg Leu Val Ser Gly Lys Phe Asp Arg Pro Leu Arg Pro

745 750 755AAA GCC CAT CTT AAG TGT GCA CCT GGT CAG AAG ATT TCT TCA ATC AAA 2357Lys Ala His Leu Lys Cys Ala Pro Gly Gln Lys Ile Ser Ser Ile Lys

760 765 770TTT GCA AGC TTT GGA ACA CCA GAG GGA GTT TGT GGG AAC TTC CAG CAG 2405Phe Ala Ser Phe Gly Thr Pro Glu Gly Val Cys Gly Asn Phe Gln Gln

775 780 785GGA AGC TGC CAT GCT CCG CGC TCA TAT GAT GCT TTC AAA AAG AAT TGT 2453Gly Ser Cys His Ala Pro Arg Ser Tyr Asp Ala Phe Lys Lys Asn Cys

790 795 800GTT GGG AAA GAG TCT TGC TCA GTA CAG GTA ACA CCA GAG AAT TTT GGA 2501Val Gly Lys Glu Ser Cys Ser Val Gln Val Thr Pro Glu Asn Phe Gly805 810 815 820GGT GAT CCA TGT CGA AAC GTT CTA AAG AAA CTC TCA GTG GAA GCC ATT 2549Gly Asp Pro Cys Arg Asn Val Leu Lys Lys Leu Ser Val Glu Ala Ile

825 830 835TGT AGT TGATAATTCT GAGTATACAA GTGAAAAAAT ACTTGAACCA CTCATATAAA 2605Cys SerCATTTTTCAA ACGAGCTACT AGACATCCAT TAACCCACAC TACCATTTTT TGGCTTTGCT 2665GGGGTTGAAG TTGTACAGTT AAGCAACACA CCTCTTTGAT CAAAGCTCAC CTGATTATGA 2725AGATGATTGA CGAAAGATTC TGTACATGTA AGGTTTCGTC TAATTACACA TACAGATATG 2785ATTCTTGATG AATCGATGTG CAAATTTTGT TTGTGTTAGG GTGAGAGAGA CTTGAAAAGC 2845ATTTTGCTTT CATGATGTTC TACATTATAC AATCATAATG TAAGTAAGCA AGCAATAATT 2905CATTGCTTTG CACATTGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2944(2)SEQ ID NO：19资料：

(i)序列特征：

(A)长度：838个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑性质：线性

(ii)分子类型：蛋白

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：Met Gly Cys Thr Leu Ile Leu Met Leu Asn Val Leu Leu Val Leu Leu1 5 10 15Gly Ser Trp Val Phe Ser Gly Thr Ala Ser Val Ser Tyr Asp His Arg

20 25 30Ala Ile Ile Val Asn Gly Gln Arg Arg Ile Leu Ile Ser Gly Ser Val

35 40 45His Tyr Pro Arg Ser Thr Pro Glu Met Trp Pro Gly Ile Ile Gln Lys

50 55 60Ala Lys Glu Gly Gly Val Asp Val Ile Gln Thr Tyr Val Phe Trp Asn65 70 75 80Gly His Glu Pro Gln Gln Gly Lys Tyr Tyr Phe Glu Gly Arg Tyr Asp

85 90 95Leu Val Lys Phe Ile Lys Leu Val His Gln Ala Gly Leu Tyr Val His

100 105 110Leu Arg Val Gly Pro Tyr Ala Cys Ala Glu Trp Asn Phe Gly Gly Phe

115 120 125Pro Val Trp Leu Lys Tyr Val Pro Gly Ile Ser Phe Arg Thr Asp Asn

130 135 140Gly Pro Phe Lys Ala Ala Met Gln Lys Phe Thr Ala Lys Ile Val Asn145 150 155 160Met Met Lys Ala Glu Arg Leu Tyr Glu Thr Gln Gly Gly Pro Ile Ile

165 170 175Leu Ser Gln Ile Glu Asn Glu Tyr Gly Pro Met Glu Trp Glu Leu Gly

180 185 190Ala Pro Gly Lys Ser Tyr Ala Gln Trp Ala Ala Lys Met Ala Val Gly

195 200 205Leu Asp Thr Gly Val Pro Trp Val Met Cys Lys Gln Asp Asp Ala Pro

210 215 220Asp Pro Ile Ile Asn Ala Cys Asn Gly Phe Tyr Cys Asp Tyr Phe Ser225 230 235 240Pro Asn Lys Ala Tyr Lys Pro Lys Ile Trp Thr Glu Ala Trp Thr Ala

245 250 255Trp Phe Thr Gly Phe Gly Asn Pro Val Pro Tyr Arg Pro Ala Glu Asp

260 265 270Leu Ala Phe Ser Val Ala Lys Phe Ile Gln Lys Gly Gly Ser Phe Ile

275 280 285Asn Tyr Tyr Met Tyr His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Arg Thr Ala Gly

290 295 300Gly Pro Phe Ile Ala Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Asp Glu305 310 315 320Tyr Gly Leu Leu Arg Gln Pro Lys Trp Gly His Leu Lys Asp Leu His

325 330 335Arg Ala Ile Lys Leu Cys Glu Pro Ala Leu Val Ser Gly Asp Pro Ala

340 345 350Val Thr Ala Leu Gly His Gln Gln Glu Ala His Val Phe Arg Ser Lys

355 360 365Ala Gly Ser Cys Ala Ala Phe Leu Ala Asn Tyr Asp Gln His Ser Phe

370 375 380Ala Thr Val Ser Phe Ala Asn Arg His Tyr Asn Leu Pro Pro Trp Ser385 390 395 400Ile Ser Ile Leu Pro Asp Cys Lys Asn Thr Val Phe Asn Thr Ala Arg

405 410 415Ile Gly Ala Gln Ser Ala Gln Met Lys Met Thr Pro Val Ser Arg Gly

420 425 430Leu Pro Trp Gln Ser Phe Asn Glu Glu Thr Ser Ser Tyr Glu Asp Ser

435 440 445Ser Phe Thr Val Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Asn Thr Thr Arg Asp

450 455 460Val Ser Asp Tyr Leu Trp Tyr Ser Thr Asp Val Lys Ile Asp Ser Arg465 470 475 480Glu Lys Phe Leu Arg Gly Gly Lys Trp Pro Trp Leu Thr Ile Met Ser

485 490 495Ala Gly His Ala Leu His Val Phe Val Asn Gly Gln Leu Ala Gly Thr

500 505 510Ala Tyr Gly Ser Leu Glu Lys Pro Lys Leu Thr Phe Ser Lys Ala Val

515 520 525Asn Leu Arg Ala Gly Val Asn Lys Ile Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val

530 535 540Gly Leu Pro Asn Ile Gly Pro His Phe Glu Thr Trp Asn Ala Gly Val545 550 555 560Leu Gly Pro Val Ser Leu Thr Gly Leu Asp Glu Gly Lys Arg Asp Leu

565 570 575Thr Trp Gln Lys Trp Phe Tyr Lys Val Gly Leu Lys Gly Glu Ala Leu

580 585 590Ser Leu His Ser Leu Ser Gly Ser Pro Ser Val Glu Trp Val Glu Gly

595 600 605Ser Leu Val Ala Gln Lys Gln Pro Leu Ser Trp Tyr Lys Thr Thr Phe

610 615 620Asn Ala Pro Asp Gly Asn Glu Pro Leu Ala Leu Asp Met Asn Thr Met625 630 635 640Gly Lys Gly Gln Val Trp Ile Asn Gly Gln Ser Leu Gly Arg His Trp

645 650 655Pro Ala Tyr Lys Ser Ser Gly Ser Cys Ser Val Cys Asn Tyr Thr Gly

660 665 670Trp Phe Asp Glu Lys Lys Cys Leu Thr Asn Cys Gly Glu Gly Ser Gln

675 680 685Arg Trp Tyr His Val Pro Arg Ser Trp Leu Tyr Pro Thr Gly Asn Leu

690 695 700Leu Val Val Phe Glu Glu Trp Gly Gly Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Leu705 710 715 720Val Lys Arg Glu Ile Gly Ser Val Cys Ala Asp Ile Tyr Glu Trp Gln

725 730 735Pro Gln Leu Leu Asn Trp Gln Arg Leu Val Ser Gly Lys Phe Asp Arg

740 745 750Pro Leu Arg Pro Lys Ala His Leu Lys Cys Ala Pro Gly Gln Lys Ile

755 760 765Ser Ser Ile Lys Phe Ala Ser Phe Gly Thr Pro Glu Gly Val Cys Gly

770 775 780Asn Phe Gln Gln Gly Ser Cys His Ala Pro Arg Ser Tyr Asp Ala Phe785 790 795 800Lys Lys Asn Cys Val Gly Lys Glu Ser Cys Ser Val Gln Val Thr Pro

805 810 815Glu Asn Phe Gly Gly Asp Pro Cys Arg Asn Val Leu Lys Lys Leu Ser

820 825 830Val Glu Ala Ile Cys Ser

835

Claims

1.一段基本上包含了图1所示序列中核苷酸229到2319的核苷酸序列，或者这段核苷酸序列的功能等价物，所述核苷酸序列编码具有外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶活性的酶或者这种酶的前体或衍生物。

2.权利要求1的序列，其编码一种由SDS-PAGE测得分子量为45kDa的多肽。

3.权利要求1的序列，其编码一种由SDS-PAGE测得分子量为60kDa的多肽。

4.权利要求1、2或3的序列，其包含起始信号ATG。

5.上述权利要求中任一权项的序列，其包含选自图1所示序列中核苷酸163到228、核苷酸151到228和核苷酸130到228的序列。

6.权利要求1或5的序列，其包含图1所示序列的核苷酸229到2319。

7.权利要求1的序列，其基本上包含了图5所示序列的核苷酸117到2555。

8.权利要求1的序列，其基本上包含了图5所示序列的核苷酸42到2555。

9.上述权利要求中任一权项的序列，其中该序列是反义功能等价物。

10.一种具有外-(1→4)-β-D-半乳聚糖酶活性的多肽，或者这种多肽的前体或衍生物，或其功能等价物，所述多肽基本上包含了由图1所示序列的核苷酸229到2319编码的氨基酸序列。

11.权利要求10的多肽，其基本上由图1所示序列的核苷酸229到2319编码的氨基酸序列组成。

12.权利要求10的多肽，其基本上包含了图5所示序列的核苷酸117到2555编码的氨基酸序列。

13.权利要求12的多肽，其基本上由图5所示序列的核苷酸117到2555编码的氨基酸序列组成。

14.权利要求10到13中任一权项的多肽，其由权利要求1到8中任一权项的核苷酸序列编码。

15.一种载体，其包含权利要求1到9中任一权项的序列。

16.权利要求15的载体，当其被导入合适的宿主中时，能引起权利要求1到9中任一权项的序列的RNA转录。

17.权利要求15或16的载体，当其被导入合适的宿主中时，能产生一种具有外-半乳聚糖酶活性的，权利要求10到14中任一权项的多肽。

18.一种已经被导入了权利要求1到9中任一权项的序列的宿主细胞。

19.一种已经被导入了权利要求1到9中任一权项的序列的宿主植物或其部分。

20.权利要求19的植物或其部分，其由于被导入了权利要求1到9中任一权项的序列而具有改变了的物理特性。

21.一种改变植物或其部分的物理特性的方法，其包括向植物或其部分导入权利要求1到9中任一权项的序列。