CN114703243A - 一种发酵生产腺苷的方法 - Google Patents
一种发酵生产腺苷的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114703243A CN114703243A CN202111661509.7A CN202111661509A CN114703243A CN 114703243 A CN114703243 A CN 114703243A CN 202111661509 A CN202111661509 A CN 202111661509A CN 114703243 A CN114703243 A CN 114703243A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- liquid
- controlled
- glucose
- adenosine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 85
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 title claims abstract description 74
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 31
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 claims description 39
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 22
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 15
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 14
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 11
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 11
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 11
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 11
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 7
- OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;hydrate Chemical compound O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N 0.000 claims 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 claims 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 102000004008 5'-Nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052895 Coronary artery insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000007530 Essential hypertension Diseases 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L IMP(2-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000003734 Supraventricular Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 206010042600 Supraventricular arrhythmias Diseases 0.000 description 1
- ONGZMKPEWCAXFS-UHFFFAOYSA-L [Cl+].[Cl-].[K+].[Cl-] Chemical compound [Cl+].[Cl-].[K+].[Cl-] ONGZMKPEWCAXFS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058516 adenosine phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种发酵生产腺苷的方法，涉及到本株菌生产腺苷的深层液体发酵培养基配方、发酵控制方法以及补料方法等，最终得到的发酵液色纯水平接近90％，有利于提取纯化得到药典标准的腺苷成品。本方法通过使用高浓度葡萄糖为碳源，酵母膏、尿素、硫酸铵等为氮源的配方下进行深层液体发酵，50L发酵罐水平可达11.2g/L，1T发酵罐水平可达10.5g/L。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种发酵生产腺苷的方法。
背景技术
腺苷(Adenosine)，化学名6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，腺苷属于重要的核苷酸衍生物，是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物。作为一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。可用于治疗室上性心动过速，用于和房室有关的室上心律失常及治疗心绞痛、心肌梗塞、冠脉功能不全、动脉硬化、原发性高血压、脑血管障碍、中风后遗症、进行性肌肉萎缩等。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷在生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸(ATP)或腺苷双磷酸(ADP)形式转移能量，或是以环状腺苷单磷酸(cAMP)进行信号传递等。此外，腺苷还是一种抑制性神经传导物，在神经传递中起重要作用。
目前，现有技术用于生产腺苷的方法由RNA水解法、化学法以及发酵法。化学合成法合成腺苷存在着成本偏高，反应繁琐，收率低等一系列问题。RNA水解法同时会得到4种核苷物质，给后续的分离带来了困难。相比较而言，微生物发酵法生产腺苷成本较低，原料易得，产腺苷效率较高，因此在腺苷生产中占据绝对优势。
但在腺苷发酵过程中，也存在着很多问题。其一是腺苷大多采用基因工程菌种或物理、化学诱变后的菌株作为生产菌株，如枯草芽胞杆菌腺苷发酵菌株应具有以下特征：肌苷酸脱氢酶缺失，即黄嘌呤缺陷型；腺苷脱氨酶缺失，切断腺苷酸到肌苷酸的通路。腺苷磷酸化酶缺失，减少腺苷分解；解除单磷酸腺苷类终产物途径酶的反馈抑制。5′-核苷酸酶高活性，使腺苷酸迅速分解为腺苷。但发明人发现营养缺陷型菌株普遍存在遗传性状和产量不稳等问题，菌种退化现象严重，回复突变率较高，产品质量稳定性不佳，不利于工业化生产。且现有技术公开的菌葡萄糖耐受度不高，而葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。其二，腺苷用作注射剂开发，对原料的质量要求非常高，原始菌种通常存在腺苷发酵纯度低的问题，导致下游工艺复杂化，提纯成本高。其三是腺苷发酵需要提供非常丰富的营养(有机氮源)，使得腺苷发酵成本很高。其四是报道可查询的高水平的腺苷产生菌只是存在实验室水平，均没有达到大生产阶段，产业化放大对于基因工程菌是个非常大的难点，因此开发一种稳定产腺苷的发酵方法并且能够稳定产业化放大是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定产腺苷并且能够稳定产业化放大的发酵方法。
一种发酵生产腺苷的方法，所述方法包括如下步骤：以产腺苷的枯草芽孢杆菌为发酵菌株，发酵过程控制发酵液葡萄糖浓度为5-60g/L，例如5-10g/L、10-20g/L、20-30g/L、30-40g/L、40-50g/L、50-60g/L；pH为6.1-7.3，例如6.1，6.2，6.2，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3。
作为一种具体实施方式，所述的葡萄糖浓度为10-60g/L，优选为20-60g/L，进一步优选为30-60g/L，例如30-40g/L、40-50g/L、50-60g/L。
作为一种具体实施方式，所述的葡萄糖的补充方式为脉冲式补充。
进一步，优选的，当所述的葡萄糖浓度低于10-15g/L时，补入葡萄糖使得葡萄糖浓度为80-120g/L。
作为一种具体实施方式，所述的pH优选为6.3-6.4，pH通过流加氨水调节。
作为一种具体实施方式，所述的发酵菌株采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HDCC112-21027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23448，保藏日期为2021年09月18日。
作为一种具体实施方式，所述枯草芽孢杆菌是通过5-20％(V/V)的接种量将种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，温度控制25-40℃，控制溶氧≥10-40％，发酵总时间48-64h。
作为一种具体实施方式，所述液体发酵培养基配方包含以下组分：一水葡萄糖5-240g/L,酵母膏0-50g/L,酵母粉0-50g/L，硫酸铵0-30g/L,磷酸二氢钾0-7g/L，氯化钾0-5g/L，硫酸锰0-0.05g/L，尿素0-14g/L，硫酸镁0-5g/L，氯化钠0-1g/L，所述的组分中涉及到0的不取0。
进一步，优选的所述液体发酵培养基包含以下组分：一水葡萄糖180g/L，酵母膏20g/L，酵母粉30g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L，氨水调pH至7.0。
进一步，作为一种具体实施方式，所述种子液是将枯草芽孢杆菌在种子培养基里进行种子培养得到的；取培养合格的液体种子，以0.1-2.0％(V/W)的比例接种到装有液体发酵培养基，控制温度36±1℃，溶氧控制大于10-40％，培养5-20h，控制种子液OD≥8.0；所述种子培养过程培养基为LB培养基，所述的LB培养基酵母抽提物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖10g/L，调pH至7.0。
本专利提供了一种耐高浓度葡萄糖枯草芽孢杆菌生产腺苷的方法，涉及到本株菌生产腺苷的深层液体发酵培养基配方、发酵控制方法以及补料方法等，最终得到的发酵液色纯水平接近90％，有利于提取纯化得到药典标准的腺苷成品。本方法通过使用高浓度葡萄糖为碳源，酵母膏、尿素、硫酸铵等为氮源的配方下进行深层液体发酵，50L发酵罐水平可达11.2g/L，1T发酵罐水平可达10.5g/L。
本发明采用耐高浓度葡萄糖的枯草芽孢杆菌生产高纯度腺苷的菌株在目前公开的腺苷生产菌株是独一的一株，较其他公开菌株的低浓度糖，发酵液色纯低不利于后续提纯，精细控制工艺对比来看，本株菌具有耐糖浓度范围广、不易染菌、控制工艺简单、最终发酵液色纯高等优点，已经可以实现了工业化生产。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDCC112-21027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23448，保藏日期为2021年09月18日。本发明实施例中得到的发酵液参照《中国药典》2020版二部进行液相色谱分析测定。
实施例1
1、菌种复苏活化：取工作菌种甘油管(CGMCC NO.23448)，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于35℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的单菌落。
2、液体种子制备：取活化复苏的单菌落，用接种铲挑取一颗单菌落，接种到盛有100ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于35℃、250rpm的摇床上振荡培养20h，控制种子液OD值≥0.5。LB液体培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
3、种子罐种子培养：取培养合格的液体种子，以0.5％(V/W)的比例接种到装有20L液体发酵培养基的50L自动控制发酵罐中，控制温度36℃，溶氧控制大于20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。罐上培养9h，控制种子液OD≥8.0，种子罐配方为LB培养基，消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
4、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/L,氨水流加自动控制pH6.3-6.4，培养48h放罐，液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/L,酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L，消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
5、样品处理与检测：发酵结束后，取发酵液2ml，10000rpm高速离心10min去除菌体，然后取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，参照《中国药典》2020版二部进行液相色谱分析测定，最终效价水平达11.2g/L，纯度为90.1％。
实施例2
1、种子液制备同实施例1；
2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。分别过程控制发酵液葡萄糖浓度为5-10g/L、10-20g/L、20-30g/L、30-40g/L、40-50g/L、50-60g/L,氨水流加自动控制pH6.3-6.4。培养48h放罐。
3、液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/L,酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L。消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。最终放罐水平如下表1所示，纯度均为85～91％之间。
表1 不同葡萄糖浓度对应的发酵水平
| 葡萄糖浓度(g/L) | 发酵水平(g/L) |
| 5-10 | 5.4 |
| 10-20 | 5.3 |
| 20-30 | 7.2 |
| 30-40 | 11.2 |
| 40-50 | 10.4 |
| 50-60 | 9.8 |
实施例3
1、种子液制备同实施例1；
2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/L,氨水流加自动控制pH 5.5、5.8、6.1、6.4、6.7、7.0、7.3，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/L,酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L。消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平如下表2所示，纯度均为85～91％之间。
表2 不同pH对应的发酵水平
| pH | 发酵水平(g/L) |
| 5.5 | 0.3 |
| 5.8 | 1.2 |
| 6.1 | 6.8 |
| 6.4 | 10.9 |
| 6.7 | 9.9 |
| 7.0 | 8.4 |
| 7.3 | 5.3 |
实施例4
1、种子液制备同实施例1；
2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/L,30％氢氧化钠溶液流加自动控制pH 6.4，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/L,酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L。消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平7.2g/L，纯度为85.7％。
实施例5
1、种子液制备同实施例1；
2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以2％、5％、10％、15％、20％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/L,氨水溶液流加自动控制pH 6.4。培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/L,酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L。消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。最终放罐水平如下表3所示，纯度均为85～91％之间。
表3 不同移种量对应的发酵水平
| 移种量％ | 发酵水平(g/L) |
| 2 | 1.1 |
| 5 | 7.8 |
| 10 | 10.9 |
| 15 | 10.5 |
| 20 | 9.9 |
实施例6
1、种子液制备同实施例1；
2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度为30-40g/L,氨水溶液流加自动控制pH 6.4，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖浓度作为梯度，酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L。消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平如下表4所示，纯度均为85～91％之间。
表4 不同基础葡萄糖浓度对应的发酵水平
| 基础葡萄糖浓度g/L | 发酵水平(g/L) |
| 60 | 7.8 |
| 100 | 8.1 |
| 140 | 9.9 |
| 180 | 11.0 |
| 220 | 8.8 |
| 260 | 4.4 |
实施例7
1、种子液制备同实施例1。
2、发酵罐培养：取培养合格的种子罐种子，以10％(V/V)的比例接入装有25L的液体发酵培养基的50L自控控制发酵罐中，温度控制36℃，控制溶氧≥20％，过程中调整空气流量和搅拌转速。过程控制发酵液葡萄糖浓度控制方式为：葡萄糖浓度低于10g/L,一次性添加葡萄糖使得发酵液葡萄糖浓度达80-120g/L,待葡萄糖消耗后重复此动作。氨水溶液流加自动控制pH 6.4，培养48h放罐；液体发酵培养基配方组成为：一水葡萄糖180g/L，酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L。消毒后氨水调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min，最终放罐水平为10.5g/L，纯度为92％。
Claims (10)
1.一种发酵生产腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以产腺苷的枯草芽孢杆菌为发酵菌株，发酵过程控制发酵液葡萄糖浓度为5-60g/L，pH为6.1-7.3。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖浓度为10-60g/L，优选为20-60g/L，进一步优选为30-60g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的葡萄糖的补充方式为脉冲式补充。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的pH优选为6.3-6.4，pH通过流加氨水调节。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的发酵菌株采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDCC112-21027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23448，保藏日期为2021年09月18日。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是通过5-20％(V/V)的接种量将种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，温度控制25-40℃，控制溶氧≥10-40％，发酵总时间48-64hr。
7.如权利1～6任一所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基配方包含以下组分：一水葡萄糖5-240g/L,酵母膏0-50g/L,酵母粉0-50g/L硫酸铵0-30g/L,磷酸二氢钾0-7g/L,氯化钾0-5g/L,硫酸锰0-0.05g/L，尿素0-14g/L，硫酸镁0-5g/L，氯化钠0-1g/L。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基包含以下组分：一水葡萄糖180g/L,酵母膏20g/L,酵母粉30g/L硫酸铵10g/L,磷酸二氢钾3.5g/L,氯化钾2g/L,硫酸锰0.02g/L，尿素7g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠0.5g/L，氨水调pH至7.0。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子液是将枯草芽孢杆菌在种子培养基里进行种子培养得到的；取培养合格的液体种子，以0.1-2.0％(V/W)的比例接种到装有液体发酵培养基，控制温度36±2℃，溶氧控制大于10-40％，培养5-20h，控制种子液OD≥8.0。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述种子培养过程培养基为LB培养基，调pH至7.0；所述的LB培养基为酵母抽提物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L,葡萄糖10g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111661509.7A CN114703243B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种发酵生产腺苷的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111661509.7A CN114703243B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种发酵生产腺苷的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114703243A true CN114703243A (zh) | 2022-07-05 |
| CN114703243B CN114703243B (zh) | 2024-12-27 |
Family
ID=82167314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111661509.7A Active CN114703243B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种发酵生产腺苷的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114703243B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117802004A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-04-02 | 天津博创合成生物科技有限公司 | 一种高纯度腺嘌呤核苷的制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101475974A (zh) * | 2009-01-23 | 2009-07-08 | 广东省微生物研究所 | 一种培养基及用该培养基发酵生产腺苷的方法 |
| CN102676409A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-09-19 | 南京工业大学 | 一种酿酒酵母及其补料分批发酵生产s-腺苷甲硫氨酸的工艺 |
| CN103146786A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-06-12 | 天津科技大学 | 一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法 |
| CN110791462A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-14 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用 |
| CN111254172A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-06-09 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种发酵生产腺苷的方法 |
| CN112795607A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-14 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种提高腺苷发酵产量的方法 |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111661509.7A patent/CN114703243B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101475974A (zh) * | 2009-01-23 | 2009-07-08 | 广东省微生物研究所 | 一种培养基及用该培养基发酵生产腺苷的方法 |
| CN102676409A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-09-19 | 南京工业大学 | 一种酿酒酵母及其补料分批发酵生产s-腺苷甲硫氨酸的工艺 |
| CN103146786A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-06-12 | 天津科技大学 | 一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法 |
| CN111254172A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-06-09 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种发酵生产腺苷的方法 |
| CN110791462A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-14 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用 |
| CN112795607A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-14 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种提高腺苷发酵产量的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XIAOCHUN CHEN，等: "Enhancement of adenosine production by Bacillus subtilis CGMCC 4484 through metabolic flux analysis and simplified feeding strategies", 《BIOPROCESS BIOSYST ENG》, no. 36, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 1851 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117802004A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-04-02 | 天津博创合成生物科技有限公司 | 一种高纯度腺嘌呤核苷的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114703243B (zh) | 2024-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10968424B2 (en) | Bacillus subtilis strain, culture method and use thereof | |
| CN109439701B (zh) | 生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基 | |
| CN105112476A (zh) | 一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法 | |
| CN112795607B (zh) | 一种提高腺苷发酵产量的方法 | |
| CN111187739A (zh) | 一种复合微生物制剂及其培养方法与应用 | |
| CN103146786A (zh) | 一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法 | |
| CN104630166A (zh) | 微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法 | |
| CN114134056A (zh) | 酿酒酵母zjs10041及其在发酵产s-腺苷蛋氨酸中的应用 | |
| CN107267422B (zh) | 睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001及采用该菌株生产l-丙氨酸的方法 | |
| CN106929548B (zh) | 一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺 | |
| CN117568179A (zh) | 一种富含烟酰胺单核苷酸的微藻养殖方法 | |
| CN102899372A (zh) | 两阶段溶氧量控制发酵生产环磷酸腺苷的方法 | |
| CN104630167A (zh) | 海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法 | |
| CN114703243A (zh) | 一种发酵生产腺苷的方法 | |
| CN113980930B (zh) | 一种核酸酶p1的制备方法 | |
| CN103409486A (zh) | 一种通过流加次黄嘌呤提高腺苷发酵产量的方法 | |
| CN110283854B (zh) | 一种发酵培养基及其应用和利用三孢布拉霉菌发酵制备番茄红素的方法 | |
| CN102586383B (zh) | 胞磷胆碱的制备方法 | |
| CN112430636B (zh) | 一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法 | |
| CN116218690A (zh) | 一种产布雷非德菌素a的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法 | |
| CN113604390A (zh) | 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-鸟氨酸中的应用 | |
| CN109161570B (zh) | 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液 | |
| CN102618468A (zh) | 一种耐温型产碱杆菌及其在威兰胶生产中的应用 | |
| CN112592945A (zh) | 一种腺苷发酵工艺 | |
| CN114085821A (zh) | 一种酸性磷酸转移酶的生产工艺及其应用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |