CN114703218A - 基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量及促进植物生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量及促进植物生长中的应用。在温室条件下，转基因株系叶中叶酸及前体含量均显著高于野生型，且转基因株系叶中叶酸含量显著高于茎，茎中前体含量高于叶，说明MsGCHI和MsADCS的共表达能够显著提高百脉根中叶酸及前体含量。同时，转基因百脉根株系GA‑3的生长速度明显优于野生型，转基因百脉根株系GA‑11的分枝数和根长均显著优于野生型，说明叶酸生物强化对百脉根生长没有不利影响，且叶酸生物强化合成的内源叶酸还能促进转基因百脉根株系的生长。

Description

基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量及促进植物生长中 的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量及促进植物生长中的应用。

背景技术

叶酸(Folate)是一种水溶性B族维生素(维生素B9)，是动植物生长发育所必需的微量营养素，其作为C1单位的供体或受体，参与嘌呤、泛酸盐和蛋白质等的生物合成、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的生成以及甲硫氨酸循环等生化途径，在动植物机体新陈代谢和生长发育过程中发挥着十分重要的作用，而人类和其他动物普遍存在叶酸摄入不足的问题。植物和微生物在体内可以合成叶酸，但人类与其他哺乳动物由于缺乏完整的生物合成系统，自身无法合成叶酸，必须依靠饮食获取，植物通常是动物主要的叶酸来源。不同食物中的叶酸含量差异较大，在动物肝脏、豆类和绿色组织中含量比较丰富，而四大粮食作物中叶酸的含量却很低，所以叶酸缺乏导致的营养不良是一个广泛而持续的世界性健康问题，叶酸摄入不足会引发各种发育缺陷和疾病，如巨幼细胞贫血症、神经管缺陷和心血管疾病等。

叶酸还被作为一种重要的饲料添加剂广泛应用于集约化和现代化的畜牧业生产中。研究发现饲料中的叶酸含量已不能满足舍饲饲养下优良畜禽品种的快速生长和高产性能的需求，因此必须通过提高牧草自身的叶酸含量或在日粮中添加叶酸辅酶和甲基供体，为动物的生长提供保证。

为解决叶酸匮乏这一问题，人们尝试了多种方法，比如调整饮食结构、添加人工合成的营养剂和食品强化。尽管人工合成的叶酸(Folic acid,FA)在一定程度上能够改善叶酸摄入不足的问题，但其弊端亦不容忽视。当前人工合成的叶酸几乎全部采用化学法生产，副反应多，且废水中含有大量的氨氮及无机盐对环境造成严重污染。此外，近年来研究表明，服用较高剂量人工合成的叶酸对人体具有一定副作用，包括基因突变导致人体叶酸代谢受损、掩盖维生素B12缺乏症状和致癌等不良影响。通过生物强化手段提高作物中的叶酸含量，是解决食物中叶酸普遍缺乏问题的有效策略。大量研究表明，GTP环化水解酶I(GCHI)与氨基脱氧分支酸合酶(ADCS)是植物叶酸合成过程中最主要的两种限速酶，二者编码基因GCHI和ADCS的共表达能够显著提高诸多转基因作物的叶酸含量。

紫花苜蓿(Medicago sativa)被誉为“牧草之王”，其营养价值高，提取物和浓缩物除含有蛋白质、维生素C、铜、锰、叶酸、核黄素、镁、铁等多种成分外，还含有生物碱、氨基酸、香豆素、消化酶和黄酮类等多种次生代谢产物。此外，研究发现目前种植的牧草中，紫花苜蓿是叶酸含量最为丰富的豆科牧草，这为研究牧草叶酸生物合成提供了良好的供体材料，发明人所在的课题组从紫花苜蓿中发现并克隆出了叶酸合成关键酶GCHI和ADCS的编码基因MsGCHI和MsADCS。

在前期研究的基础上，发明人所在的课题组构建了MsGCHI和MsADCS基因的双价植物表达载体，并将其导入优良豆科牧草百脉根(Lotus corniculatus)中，通过分子鉴定筛选出目的基因表达量相对一致、且表达水平较高的转基因百脉根株系；在温室条件下，对上述株系中的叶酸及其组分含量进行分析，并系统评价其生长性状。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供了基因MsGCHI和MsADCS在促进植物生长中的应用，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述的基因MsGCHI的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的基因MsADCS的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的第二目的是提供基因MsGCHI在提高植物叶酸含量的应用，所述的所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第三目的是提供基因MsADCS在提高植物叶酸含量的应用，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的第四目的是提供基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量的应用，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

优选的，所述的促进植物根系生长包括促进根部分支数增多、促进根长变长和促进根体积变大。

本发明的有益效果是：本发明提供了基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量和促进植物生长中的应用，在温室条件下，转基因株系叶中叶酸及前体含量均显著高于野生型，且转基因株系叶中叶酸含量显著高于茎，茎中前体含量普遍高于叶。说明MsGCHI和MsADCS的共表达能够显著提高百脉根中叶酸及前体含量，并且百脉根中前体的转运也是影响叶酸合成的重要因素之一。同时，转基因百脉根株系的生长速度和分枝数均优于野生型。说明叶酸生物强化对百脉根生长没有不利影响，且叶酸生物强化合成的内源叶酸还能促进转基因百脉根株系的生长。

附图说明

图1载体pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG的构建流程

图2载体pBIB-BASTA-Gmubi的构建流程

图3载体pBIB-BASTA-Gmubi-MsADCS-HA的构建流程

图4载体pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG-Gmubi-MsADCS-HA的构建流程

图5pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG-Gmubi-MsADCS-HA菌液PCR

(A)：MsGCHI-FLAG；(B)：Gmubi；(C)：MsADCS-HA；M：DNA Marker；1-3：PCR产物

图6菌液PCR验证

(A)：Bar基因；(B)：Gmubi启动子；(C)：MsGCHI；(D)：MsADCS；M：Marker；泳道1-9：载体菌株

图7百脉根的遗传转化

(A)子叶与工程菌共培养；(B)选择培养基上被侵染的子叶开始分化；(C)选择培养基上未转化的子叶开始发黄；(D)/(E)选择培养基上刚分化出的抗性体芽点；(F)选择培养基上的成熟抗性体胚，图中标尺为2mm；(G)生根培养基上的再生幼苗，图中标尺为2cm；(H)移入蛭石中的抗性植株，图中标尺为5cm

图8转基因百脉根MsADCS、MsGCHI和Bar基因的PCR鉴定

M：2000marker；H₂O：空白对照；WT：野生型；EV：空载体转基因植株；P：质粒(阳性对照)；泳道1-13：阳性植株

图9转基因百脉根的RT-PCR鉴定

WT：野生型；EV：空载体转基因植株；1-13：MsGCHI和MsADCS共转化植株

图10转基因植株qRT-PCR鉴定

WT：野生型植株、2-13：MsGCHI和MsADCS基因共转化植株。图中柱上不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05，n＝6)

图11野生型和转基因百脉根叶(A)和茎(B)中的叶酸及其前体含量

WT：野生型植株；GA-2、GA-3、GA-5、GA-10和GA-11：共表达MsGCHI和MsADCS的转基因株系。

**和***分别表示转基因株系与WT相比在P＜0.01和P＜0.001水平(双侧)上检验达显著水平

图12野生型和转基因百脉根株系中叶酸、蝶呤和p-ABA含量

图13四周龄野生型及转基因百脉根株系的生长表型

WT：野生型植株；GA-3和GA-11：共表达MsGCHI和MsADCS的转基因株系。标尺＝4cm

图14四周龄野生型及转基因百脉根株系的根系生长表型

WT：野生型植株；GA-3和GA-11：共表达MsGCHI和MsADCS的转基因株系。标尺＝2cm

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例所用pBIB-BASTA-GWR-YFP和pCAMBIA1302-Bar为本实验室保存；

以下实施例所用的pCAMBIA1300-pGmUbi由中国农业大学张万军博士赠送；

以下实施例所采用的百脉根品种为Leo；所用农杆菌EHA105，为本实验室保存；

以下实施例的试剂来源如下：

实施例一、基因MsGCHI和MsADCS全序列的合成

1.载体构建的引物设计

表1载体构建引物设计

采用Primer 5.0分别设计MsGCHI、MsADCS和Bar基因以及Gmubi启动子的特异性引物，并在相应序列的5’和3’端分别引入Spe I(P1)与Bst EII(P2)、Xho I(P5)与Xho I(P6)、Hind III(P7)与Kpn I(P8)酶切位点及保护碱基(表1)；另外在MsGCHI基因下游引物5′端加上FLAG标签序列(CATTACAAGGATGACGACGATAAG)，在MsADCS基因的下游引物5′端中加入HA标签序列(TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT)。

以pMD19-T-GCHI，pMD19-T-ADCS质粒为模板，P1、P2，P3、P4为特异引物，进行MsGCHI-FLAG融合基因和MsADCS-HA融合基因的扩增；以pCAMBIA1300-pGmUbi质粒为模板，P7、P8为引物，进行启动子Gmubi的扩增，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并纯化回收目的条带。

1.1 pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG载体的构建

用T4连接酶将MsGCHI-FLAG融合基因的回收产物连接到Spe I/Bst EII双酶切后的pCAMBIA1302-Bar载体，构建流程如图1所示，转化大肠杆菌，进行菌液PCR并测序。

1.2 pBIB-BASTA-Gmubi-MsADCS-HA载体的构建

按照In-Fusion HD Cloning Kit说明将Gmubi启动子回收纯化产物连接到经HindIII与Kpn I双酶切的pBIB-BASTA-GWR-YFP载体，构建流程如图2所示。转化大肠杆菌，通过菌液PCR检测阳性克隆后测序。

对MsADCS-HA融合基因PCR扩增所得目的条带进行纯化回收，分别在上下游引物的5′端加入一段与pBIB-BASTA-Gmubi载体末端15bp大小的序列，引物设计如下：

P1：GAACAGCAGGGCTTGGTACCATGAACCTGTCTTTGCGTCTCA

P2：GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTAT

用MsADCS-HA融合基因回收产物为模板，用Phusion酶扩增目的片段，纯化回收，用Kpn I与Sst I双酶切pBIB-BASTA-Gmubi载体；按照In-Fusion HD Cloning Kit将该片段与pBIB-BASTA-Gmubi载体进行连接，构建流程如图3所示。转化感受态Ecoli DH5α，菌液PCR检测，阳性克隆测序。

1.3 pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG-Gmubi-MsADCS-HA载体的构建

用Hind III与EcoR I双酶切pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG载体和pBIB-BASTA-Gmubi-MsADCS-HA，设计包括Gmubi启动子、MsADCS-HA融合基因、pAnos终止子在内序列的引物，并分别在上下游引物的5′端加入一段与pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG载体末端互补的15bp扩展序列，引物设计如下：

P1：CCATGATTACGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACC

P2：GGCCAGTGCCAAGCTTATCCAACATTTCACTTGAGTTAAC

纯化回收pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG载体大片段和pBIB-BASTA-Gmubi-MsADCS-HA小片段，依据In-Fusion HD Cloning Kit将Nos-Gmubi-MsADCS-HA与pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG载体连接，构建流程如图4所示。转化感受态Ecoli DH5α，挑取阳性克隆，菌液PCR检测后送华大测序。

2.农杆菌介导的遗传转化

2.1外植体的准备

培育百脉根无菌苗子叶(带叶柄)作为研究所用的外植体。

2.2菌液的制备

取10μL农杆菌菌液加入的LB液体培养基中(含有50mg/L Kan、25mg/L Rif)，置于28℃恒温摇床中，200rpm培养16h使溶液呈明显的浑浊，并检测OD₆₀₀(0.6-0.8)；倒入离心管离心(4℃，4000rpm，10min)；结束后倒掉上清液，向离心管中加入适量LB培养基重悬浮菌体，并用液体LB培养基将菌液OD₆₀₀调节至0.5-0.6，以备侵染之用。

2.3遗传转化

(1)预培养：在超净工作台上，将培养7d的百脉根无菌苗子叶切两半置于分化培养基(B5+0.5mg·L^-16-BA+5mg·L^-1Basta)上，黑暗条件下预培养3d(24±2℃)；

(2)菌液的制备：同“2.2”。

(3)侵染：将经过预培养的子叶放入装有重悬液(OD₆₀₀＝0.5)的三角瓶中，用真空泵抽真空(压力)处理10min，超声波处理1min，再抽真空10min；

(4)共培养：将外植体从菌液中取出，吸干外植体表面多余菌液，然后置于分化培养基上，在24±2℃，黑暗条件下共培养3d；

(5)抗性体细胞胚的筛选：在对抗性胚体进行筛选时，采用前期选择的方法，将共培养后的外植体转入5mg·L^-1Basta和400mg·L^-1头孢(Cef)的分化培养基上，在光照强度约为200μmol·m^-2·s^-1、24±2℃，16h·d^-1条件下进行光培养，并进行筛选培养。每2周继代1次，直到大量成熟抗性芽点出现为止；

(6)生根培养：将成熟抗性芽点移到含5mg·L^-1Basta和400mg·L^-1Cef的生根培养基上生根成苗。

2.4转基因百脉根PCR检测

2.4.1百脉根基因组DNA的提取

具体步骤如下：

(1)取组织培养获得的转基因百脉根2片三出复叶于1.5mL无菌离心管中，并将离心管迅速放入液氮中冷冻；

(2)用研磨棒将叶片快速充分研磨成粉末状；

(3)加入350μL SDS提取缓冲液，振荡混匀后离心(10000rpm，10min)，取250μL上清液移至新的离心管中；

(4)加入250μL的异丙醇混匀，室温放置10min(时间越长，DNA越多)后离心(10000rpm，10min)，弃上清，吸出残液，留取沉淀；

(5)加入250μL 75％的乙醇，将沉淀轻轻弹起；

(6)室温12000rpm离心5min，弃上清，12000rpm离心40s，吸出残液；

(7)放置通风橱中使乙醇彻底挥发(10-20min)，向沉淀物中加入35μL ddH₂O溶解10min，测定浓度并保存。

2.4.2 PCR扩增

根据MsGCHI、MsADCS和Bar基因的核酸序列，利用DNAMAN 6.0软件和NCBI数据库中的Primer-Blast工具设计三对特异性引物(表2)，为避免植物自身同源基因的干扰，在该基因的启动子上设计上游引物、基因上选取片段设计下游引物，所有引物均由陕西杨凌奥科公司合成。

表2 PCR扩增引物

PCR扩增时，以H₂O和野生型百脉根DNA为模板的反应为阴性对照，以质粒DNA和空载体转基因百脉根DNA为模板的反应为阳性对照。体系如下：

PCR反应结束后，用1％的琼脂凝胶电泳检测是否扩增出目的条带。

3.转基因百脉根RT-PCR检测

3.1百脉根总RNA的提取及反转录

选取阳性的转基因百脉根株系，参考TaKaRa Mini BEST Plant RNA ExtractionKit试剂盒(TaKaRa，北京)的具体说明书，提取转基因百脉根株系和野生型植株的总RNA。用NANO-DROP1000核酸检测仪(伯乐，美国)检测RNA质量，并将总RNA样品保存在-80℃冰箱备用。

根据PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit和PrimeScript^TM RTMaster Mix(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa，北京)操作说明书反转录获得各株系cDNA。

3.2 RT-PCR扩增

根据MsGCHI和MsADCS基因的核酸序列，利用DNAMAN 6.0软件以及NCBI数据库中的Primer-Blast工具设计两对特异性引物(表3)，并以百脉根Actin基因作为内参基因。

进行百脉根Actin基因RT-PCR扩增时，以野生型百脉根和转化空载体的转基因百脉根cDNA为模板作为阴性对照。根据百脉根Actin基因扩增的结果，对各系列的cDNA量进行调整，直到使各系列Actin基因扩增得到的产物量相对一致。然后根据各系列Actin基因扩增时加入的cDNA量进行MsGCHI和MsADCS基因的RT-PCR扩增，产物检测方法同上。

表3 RT-PCR扩增引物

20μL反应体系：

百脉根Actin RT-PCR反应条件：

MsGCHI和MsADCS基因RT-PCR反应条件：

4.转基因百脉根qRT-PCR检测

4.1 qRT-PCR引物设计与扩增

使用DNAMAN 6.0和NCBI数据库中的Primer-Blast在线工具，分别设计MsGCHI和MsADCS的特异性引物(表4)，以百脉根Actin基因作为内参。

以各样品稀释10倍的cDNA为模板，每个样品3个重复，进行qRT-PCR扩增，扩增体系为20μL：

轻轻混匀，盖膜，12000rpm离心3min，然后于ABI 7500荧光定量PCR仪(ABI，美国)中进行扩增，PCR扩增条件：95℃5s，60℃10s，72℃20s，40个循环。采用2^-△△Ct法计算两个基因的相对表达量。

表4 qRT-PCR扩增引物

5.结果与分析

5.1 MsGCHI-MsADCS双价植物表达载体的构建

采用In-Fusion无缝克隆技术，将MsGCHI-FLAG融合基因，与携带有Bar基因的pCAMBIA1302线性载体相连接。菌液PCR检测，如图5所示，在1350bp左右出现一条清晰的条带，这与MsGCHI-FLAG融合基因1395bp的长度相符合。通过将测序结果与MsGCHI-FLAG融合基因序列比对。进一步证明MsGCHI-FLAG融合基因已构入pCAMBIA1302载体。

同样，采用In-Fusion方法将Gmubi启动子、MsADCS-HA融合基因与携带有Bar标记基因及MsGCHI-FLAG融合基因的pCAMBIA1302载体连接，菌液PCR检测及测序比对结果均正确，证明Gmubi启动子与MsADCS-HA融合基因已成功连接到pCAMBIA1302载体上。

5.2菌液PCR鉴定

将重组质粒转化农杆菌，并做菌液PCR进行检测，凝胶电泳结果如图6所示。可以看出菌液中可以检测出重组质粒中Bar、MsGCHI、MsADCS三个基因和Gmubi启动子，并且条带明亮，故可用作为侵染百脉根的工程菌。

5.3 pCAMBIA1302-Bar-MsGCHI-FLAG-Gmubi-MsADCS-HA对百脉根的遗传转化

实验所用的受体材料为百脉根无菌苗的子叶，将带柄的子叶在分化培养基(B5+0.5mg·L^-16-BA+5mg·L^-1Basta)上预培养3d后，经抽真空10min+超声处理1min+抽真空10min的侵染方式后，置于共培养基上(B₅+0.5mg·L^-16-BA)共培养3d后，可观察到子叶的边缘出现菌圈，如图7A所示。

随后将共培养的百脉根幼苗子叶，置于选择培养基(B₅+0.5mg·L^-16-BA+5mg·L^{- 1}Basta+500mg·L^-1Cef)上选择培养，如图7B/C所示。从图中可以看出大部分百脉根幼苗子叶在5mg·L^-1Basta的作用下开始变成褐色，但是有一小部分子叶边缘开始分化，长出绿色的芽点。

将在选择培养基上长势良好的幼苗，置于分化培养基(B₅+0.5mg·L^-16-BA)上培养30d后发现百脉根幼苗子叶边缘开始有绿色芽点长出，如图7D/E所示。继续培养两周，大部分不定胚趋向成熟，如图7F所示。之后将百脉根幼苗子叶边缘绿色芽点切下后放置生根培养基(1/2MS+0.05mg/L NAA+5mg·L^-1Basta)上。生长状况如图7G所示，炼苗后，移于装满蛭石的花盆中继续培养，如图7H所示。

5.4转基因百脉根PCR鉴定

以SDS法提取的抗性百脉根株系和野生型百脉根植株的叶片总DNA为模板，用目的基因MsADCS、MsGCHI和标记基因Bar的特异性引物进行PCR检测，电泳结果表明转基因百脉根株系中有13个系列目的基因MsADCS、MsGCHI和标记基因Bar的扩增片段大小与阳性质粒对照PCR的扩增片段大小一致(图8)，分别为392bp、519bp和481bp。

5.5转基因百脉根半定量RT-PCR分析

为进一步确定MsGCHI和MsADCS在转基因百脉根株系中的表达水平，以各株系的cDNA为模板，分别用MsGCHI和MsADCS的特异性引物对其进行RT-PCR分析。结果如图9所示，不同株系间MsGCHI和MsADCS的表达丰度存在一定差异；综合来看，2、3、5、9、10、11、12和13号株系中2个目的基因的表达丰度相对较高。

5.6转基因百脉根qRT-PCR分析

为进一步挑选目的基因MsGCHI和MsADCS表达丰度相对一致的转基因株系，以RT-PCR检测出表达水平相对较高的2、3、5、9、10、11、12和13号株系的cDNA为模板，对其目的基因的表达进行qRT-PCR分析。通过qRT-PCR分析发现，发现2、3、5、10、11号株系中目的基因MsGCHI和MsADCS表达相对一致，且表达水平较高，如图10所示。因此，我们选定上述5个株系进行测定转基因百脉根叶酸含量及其主要衍生物含量。

实施例二、基因MsGCHI和MsADCS提高植物叶酸含量的作用

将实施例一筛选出的5个超表达转基因百脉根株系分别命名为GA-2、GA-3、GA-5、GA-10和GA-11，移栽至装有无菌蛭石的花盆中，用1/2Hoagland营养液浇灌培养。并利用扦插法对转基因株系GA-3、GA-11和野生型百脉根植株进行无性扩繁，每隔2天浇水一次，待扦插苗生根后移栽至装有无菌蛭石的花盆中，用1/2Hoagland营养液浇灌培养，植物培养室中温度为24±2℃、光照为16h·d^-1、相对湿度为65％左右。

1.叶酸及其组分含量测定

1.1标准品配制

用分析天平称取0.01g的标准品，以100mL Na₂CO₃溶液(0.1mol/L，以1mol/L盐酸调节pH＝7)充分溶解(其中：5-甲基四氢叶酸以甲醇溶解)，再用起始流动相(5％乙腈+0.1％甲酸+94.9％水溶液)依次进行梯度稀释，上机检测，最终根据实验样品的检测数据，选择合适的浓度区间绘制“浓度-峰面积”标准曲线。

1.2样品叶酸及其组分提取及测定

具体步骤如下：

(1)分别称取0.5g茎和叶样品，加入液氮研磨成粉末，放于10ml离心管中，加入2.5mL提取液(0.5％氨水溶液，按1％的比例加入抗坏血酸)。同时设置空白样品及回收率检测样品。

(2)先超声30min，再低速涡旋振荡60min、离心混匀(4℃，12000rpm，20min)，4℃浸提12h，再次离心后吸取上清。

(3)滤渣中加入2.5mL甲醇，冰上超声30min，混匀离心(4℃，12000rpm，20min)，4℃浸提1h，再次离心后吸取上清，合并浸提液。

(4)将收集到的洗脱液干燥浓缩成粉末。

(5)每个样品用0.3mL起始流动相(5％乙腈+0.1％甲酸+94.9％水溶液)复溶，涡旋震荡混匀。再经0.22μm的尼龙膜过滤后上机检测。

(6)采用超高效液相色谱仪ACQUITYUPLCH-Class系统进行分析，进样量为1.0μL，流动相A(0.1％甲酸-水溶液)；流动相B(0.1％甲酸-乙腈溶液)。

(7)采用Xevo TQ-S串联四级杆质谱检测系统，离子源为电喷雾源(ESI)，脱溶剂温度(450℃)，脱溶剂流速(1000L/hr)，锥孔器流速(30L/hr)，毛细管电压(+3.5KV)。

(8)样本含量(ng/g)＝检测浓度(ng/ml)×0.3(mL)÷0.5(g)

2.转基因百脉根生长性状的相关指标测定

用直尺直接测量植株的株高和根长，用排水法测量其根体积。

3.数据分析

用MassLynx V4.1软件进行操作和采集叶酸及其组分的数据，利用SPSS 26.0(IBM，美国)数据分析软件对所有数据进行单因素方差分析(ANOVA)和独立样本T检验分析，数据以平均值±标准误(Means±SE)表示，用SigmaPlot 12.5绘图。

4.结果分析

4.1温室条件下转基因百脉根株系中叶酸及前体含量分析

采用高效液相色谱-串联质谱技术(HPLC-MS/MS)对野生型和选定的5个转基因株系的叶酸及前体含量进行分析。结果表明，共表达MsGCHI和MsADCS基因对百脉根株系体内叶酸和前体含量产生了显著影响，转基因株系中叶酸和蝶呤含量均显著高于野生型，除转基因株系GA-10以外，其余转基因株系中p-ABA含量均显著高于野生型(图11)。

野生型植株叶中叶酸含量为1.08μg/100g FW，蝶呤含量为0.31μg/100g FW，p-ABA含量为0.03μg/100g FW。在5株转基因百脉根株系中，叶中叶酸、蝶呤和p-ABA含量与野生型相比平均提高了2.5倍、2.7倍和0.6倍；茎中叶酸、蝶呤和p-ABA含量与野生型相比平均提高了2.0倍、3.3倍和2.1倍；其中GA-3株系叶和茎中叶酸含量分别达到4.68μg/100g FW和2.99μg/100g FW，与野生型植株相比提高幅度最大，分别提高了3.3倍和2.9倍；与野生型植株相比，GA-5株系叶中蝶呤和p-ABA含量提高幅度最大，分别提高了3.7倍和1.6倍，GA-3株系茎中蝶呤含量提高幅度最大，提高了6.1倍，GA-10株系中p-ABA含量提高幅度最大，提高了3.7倍。

进一步分析野生型和转基因百脉根茎和叶中叶酸、蝶呤和p-ABA含量发现，无论是野生型植株还是转基因株系，其叶中叶酸含量显著高于茎，除GA-5株系外，各株系茎中蝶呤和p-ABA含量显著高于叶(如图12所示)。

4.2温室条件下叶酸生物强化对百脉根生长影响的评价

为了排除代谢工程对植株发育可能产生的不利影响，并进一步明确叶酸生物强化对植物的影响，我们分析了野生型和2个转基因株系的株高、1级分枝数、根长和根体积。如图13所示，培养4周龄后，野生型和2个转基因株系长势良好，转基因株系GA-3长势明显优于野生型和转基因株系GA-11。

进一步比较发现，转基因株系GA-3株高显著高于野生型植株和转基因株系GA-11，与野生型相比提高了29.2％；转基因株系的1级分枝数多于野生型，其中转基因株系GA-11比野生型增多了31.4％；转基因株系GA-3根体积显著大于野生型植株和转基因株系GA-11，GA-11根长显著长于野生型植株和GA-3，与野生型相比增长了12.9％(如图14所示)；

综上所述，本发明提供了基因MsGCHI和MsADCS在促进植物生长中的应用，在温室条件下，转基因株系叶中叶酸及前体含量均显著高于野生型，且转基因株系叶中叶酸含量显著高于茎，茎中前体含量普遍高于叶。说明MsGCHI和MsADCS的共表达能够显著提高百脉根中叶酸及前体含量，并且百脉根中前体的转运也是影响叶酸合成的重要因素之一。同时，转基因百脉根株系的生长速度明显优于野生型。说明叶酸生物强化对百脉根生长没有不利影响，且叶酸生物强化合成的内源叶酸还能促进转基因百脉根株系的生长。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量及促进植物生长中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 1

atgggttgtt tagatgatgg tcgattcaat gttgagcttg aaaatgggaa gaacaatggg 60

aaagaaggtt ctgccattga agatgctgtg aaggttttgt tgatgggtct cggtgaagat 120

attaataggg aaggtattag aaagacacca cttcgtgttg ccaaagccct tcgtgaagga 180

acaaaaggtt acaggcaaaa ggtgaaggac attgttgaag gtgctttatt ccctgaagct 240

ggactagata atagagttgg ccatgctggt ggagcaggtg gacttgtgat tgttagagat 300

attgacttgt tttcctattg cgagtcatgc atgcttccat tccaggtcaa gtgtcatgtc 360

ggttacgttc cctccagtga aagagttgtt ggtttaagca aactctcccg tgttgctgat 420

gtatttgcaa agcgacttca agagcctcag cgtcttgcaa atgaagtttg ttctgctttg 480

catcatggaa taaagccaga tggtgttgcc gtcatacttc aatgtacaca catccacttt 540

ccagacgtag aatcagtctt tctcgactca aaccaccaag gattggttaa gatactcgtt 600

tccgctggtt ctggggtttt cgaaaacaag aacgcagacg aatggactga tttctttagt 660

ctcctcaaat ttagaggtat cagtatggaa aaaatcaatt ttagaggatc atctgacatg 720

agctggtgtt cttctcaatc cgccaaaatt tcctccaaaa ccgggcctgt caaccctgca 780

atggtcactg cagtagcttc aattattaaa tctttgggag aagatccact gaggaaggag 840

cttagaggga ctccaactag atttgtgaag tggttgatga actttcaaaa ctgcaacttt 900

gacatgaagt tgaatggttt tctcaatggt gggatagctt ctttaaacac aaataaggag 960

gttgaattga atgacaagaa aatatgttct gagctgaact tagcattttg gtcacaatgt 1020

gagcaccatt tacttccatt tcatggtgtt gttcacatag gttacatcct atcagatgga 1080

tttagtccta ttggaaaatc tcttttacaa tcgatagtac atttttacgg tttcaagctt 1140

caagttcagg agaggcttac cagacagata gctgaaacaa tttcgccgtt gataggtggc 1200

gatgtgatag ttgttgtaga ggctagccac acatgtatga tttctagggg tattgaaaag 1260

tttggaagta gtactgcaac tattgctgtt ttaggacagt tttcaaccga ccttacaaca 1320

agggcttcct tcttgcaggg tattccaagt cctacatctt cagatcaatg a 1371

<210> 2

<211> 456

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 2

Met Gly Cys Leu Asp Asp Gly Arg Phe Asn Val Glu Leu Glu Asn Gly

1 5 10 15

Lys Asn Asn Gly Lys Glu Gly Ser Ala Ile Glu Asp Ala Val Lys Val

20 25 30

Leu Leu Met Gly Leu Gly Glu Asp Ile Asn Arg Glu Gly Ile Arg Lys

35 40 45

Thr Pro Leu Arg Val Ala Lys Ala Leu Arg Glu Gly Thr Lys Gly Tyr

50 55 60

Arg Gln Lys Val Lys Asp Ile Val Glu Gly Ala Leu Phe Pro Glu Ala

65 70 75 80

Gly Leu Asp Asn Arg Val Gly His Ala Gly Gly Ala Gly Gly Leu Val

85 90 95

Ile Val Arg Asp Ile Asp Leu Phe Ser Tyr Cys Glu Ser Cys Met Leu

100 105 110

Pro Phe Gln Val Lys Cys His Val Gly Tyr Val Pro Ser Ser Glu Arg

115 120 125

Val Val Gly Leu Ser Lys Leu Ser Arg Val Ala Asp Val Phe Ala Lys

130 135 140

Arg Leu Gln Glu Pro Gln Arg Leu Ala Asn Glu Val Cys Ser Ala Leu

145 150 155 160

His His Gly Ile Lys Pro Asp Gly Val Ala Val Ile Leu Gln Cys Thr

165 170 175

His Ile His Phe Pro Asp Val Glu Ser Val Phe Leu Asp Ser Asn His

180 185 190

Gln Gly Leu Val Lys Ile Leu Val Ser Ala Gly Ser Gly Val Phe Glu

195 200 205

Asn Lys Asn Ala Asp Glu Trp Thr Asp Phe Phe Ser Leu Leu Lys Phe

210 215 220

Arg Gly Ile Ser Met Glu Lys Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Asp Met

225 230 235 240

Ser Trp Cys Ser Ser Gln Ser Ala Lys Ile Ser Ser Lys Thr Gly Pro

245 250 255

Val Asn Pro Ala Met Val Thr Ala Val Ala Ser Ile Ile Lys Ser Leu

260 265 270

Gly Gly Asp Pro Leu Arg Lys Glu Leu Arg Gly Thr Pro Thr Arg Phe

275 280 285

Val Lys Trp Leu Met Asn Phe Gln Asn Cys Asn Phe Asp Met Lys Leu

290 295 300

Asn Gly Phe Leu Asn Gly Gly Ile Ala Ser Leu Asn Thr Asn Lys Glu

305 310 315 320

Val Glu Leu Asn Asp Lys Lys Ile Cys Ser Glu Leu Asn Leu Ala Phe

325 330 335

Trp Ser Gln Cys Glu His His Leu Leu Pro Phe His Gly Val Val His

340 345 350

Ile Gly Tyr Ile Leu Ser Asp Gly Phe Ser Pro Ile Gly Lys Ser Leu

355 360 365

Leu Gln Ser Ile Val His Phe Tyr Gly Phe Lys Leu Gln Val Gln Glu

370 375 380

Arg Leu Thr Arg Gln Ile Ala Glu Thr Ile Ser Pro Leu Ile Gly Gly

385 390 395 400

Asp Val Ile Val Val Val Glu Ala Ser His Thr Cys Met Ile Ser Arg

405 410 415

Gly Ile Glu Lys Phe Gly Ser Ser Thr Ala Thr Ile Ala Val Leu Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Thr Asp Leu Thr Thr Arg Ala Ser Phe Leu Gln Gly Ile

435 440 445

Pro Ser Pro Thr Ser Ser Asp Gln

450 455

<210> 3

<211> 2613

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 3

atgaacctgt ctttgcgtct catatgtcct acaagtgaat acaaaaatgt gaattctctt 60

ttgtccagac cctccttggc aagggtttct tgtttcgtga agagagatgt atgtaatcgc 120

cgcgatggaa gaaacactag ggtgcattgc caattgatgc atgaccattt agaagaatcg 180

tataaaagaa agaaaatgtt acaagtgcct ctacaaaagc agggttttgt gaggactttg 240

ttgattgata actatgacag ttatacatac aatatatacc aggacctatc tattattaac 300

ggtgtccctc ctgtggtgat tcaaaatgat gattggacgt gggacgaact ttgctattac 360

ttgtacgaag aaaatgcatt tgataacatc gtattatcac ctggacctgg ttctccggca 420

tgcccagaag atataggtat ttgtcttcaa atattgcgtg aatgcaggga tattcctatt 480

ctgggtgttt gcctcggaca ccaggcattg ggttatgtgc atggagctca agttgtccat 540

gcatctgaac cagttcacgg gcgtctgagt gaagttgagc acaatgggtg ccaacttttt 600

cagggcatac cttctggtag aaattctggt ttcaaggtgg ttcgatatca ttcgctggtg 660

atagattctg aatcgcttcc tgaagtgctc attccaatag catggacttc aaataggaca 720

cttccattta ttggatccga ggttttggac aagtacaatg gtcatgaact tcagactgat 780

caaagcattt tccttgattc atttttgcct gaagcaggaa acggaagttc aagccttgtt 840

gactatggac aaactagaaa tgcaagggtt cttatgggag tcaagcattc tacaaggcca 900

cactatggtg tgcagtttca tccagagagt gttgcaacct gccacggaag tcaaatattc 960

aagaatttta gagagattac agatgattat tggctgagat gtagggcatc atacaacaag 1020

ggaaaacgtg ctaattctga tgcacatgcg caggtttcaa gtgctagtag actctacaga 1080

catttagtac ataataatac tgaggtgaac tacaaaactt tgaagttgaa atggaggaaa 1140

tttgatcact tggctgggca agttggtgga gcaaaaagta tattctgtca gttgtttgga 1200

caggaagctg aaaacacctt ttggttggat agttcttcca cagagatggg aagagcacgc 1260

ttttcgttca tgggaggaaa aggtggatca ctttggaagc agttaacgtt caggttgtct 1320

gatcagagtg atgggagttc aaaaggtggt ggccatttat cactggaaga ttctgaaggt 1380

tctgtcaaaa caatattctt ggaaggaggt tttcttgatt atttgaacaa ggagcttcaa 1440

tcatatcgtt atgataagga tgaatatgaa ggtctaccat ttgattttca cggcggatat 1500

gttggttaca tcgggtatga cctcaaagtt gaatgtggtg tcacatgtaa ccatcacaaa 1560

tctaaaactc cagatgcatg ttttttcttt gctgataatc ttgttgctat tgatcacaaa 1620

aatgatgatg tttatttatt ggctatacat gaagaaagtt caagtatttc acaatggttg 1680

gatgatactg aggagaagct tctgagctta actggttctg tgaggatgga tttggaaagg 1740

cagtactctc atccttcaac tttttcctca cataaggctg gtttcgcagc tgaaaaatct 1800

aaagagcagt accttagaga tgttaagaag tgtctaaact atattagaga tggagagagc 1860

tatgagttgt gcctcacaac ccagataagg aaaccgattg aggtattaaa ttctcttgga 1920

ctttacctac atttaagaga aaggaatcca gcaccttatg cggcttggct gaattttcca 1980

aaggaagatc tgtgtatttg ctgttcttcc cctgagaggt tcctgcagtt ggataggagt 2040

gatatgctag aagctaagcc cattaagggt actatagctc gtggtgctac tgaggaggaa 2100

gacaaacaac tcaaattgaa attacagctc agtgaaaagg atcaggcgga aaacctgatg 2160

attgttgacc ttctaagaaa tgaccttggt cgtgtatgtg atcctggatc tgttgacgtg 2220

ccgcatctca tggaagtaca atcatatgca actgttcaca caatggtgag tacaattcgt 2280

gggaaaaaga ggtcagatat aagtgctgta gactgtgtca aagctgcatt tcctggtggt 2340

tcgatgacag gcgcaccaaa gttgagatca atggaacttc ttgattctct tgaaagttgt 2400

tctcgaggca tctactcagg ctgcattgga tttttctcat ataatcaaac atttgatcta 2460

aatattgtca taagaacagt tgttatacat gagggtgaag cttccatagg agctggaggg 2520

gcaattgttg ctctgtcaaa cccagaagac gaatacgaag agatgatctt gaaaacaaaa 2580

gcaccagcaa acactgtgat agattatgaa tag 2613

<210> 4

<211> 870

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 4

Met Asn Leu Ser Leu Arg Leu Ile Cys Pro Thr Ser Glu Tyr Lys Asn

1 5 10 15

Val Asn Ser Leu Leu Ser Arg Pro Ser Leu Ala Arg Val Ser Cys Phe

20 25 30

Val Lys Arg Asp Val Cys Asn Arg Arg Asp Gly Arg Asn Thr Arg Val

35 40 45

His Cys Gln Leu Met His Asp His Leu Glu Glu Ser Tyr Lys Arg Lys

50 55 60

Lys Met Leu Gln Val Pro Leu Gln Lys Gln Gly Phe Val Arg Thr Leu

65 70 75 80

Leu Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Tyr Thr Tyr Asn Ile Tyr Gln Asp Leu

85 90 95

Ser Ile Ile Asn Gly Val Pro Pro Val Val Ile Gln Asn Asp Asp Trp

100 105 110

Thr Trp Asp Glu Leu Cys Tyr Tyr Leu Tyr Glu Glu Asn Ala Phe Asp

115 120 125

Asn Ile Val Leu Ser Pro Gly Pro Gly Ser Pro Ala Cys Pro Glu Asp

130 135 140

Ile Gly Ile Cys Leu Gln Ile Leu Arg Glu Cys Arg Asp Ile Pro Ile

145 150 155 160

Leu Gly Val Cys Leu Gly His Gln Ala Leu Gly Tyr Val His Gly Ala

165 170 175

Gln Val Val His Ala Ser Glu Pro Val His Gly Arg Leu Ser Glu Val

180 185 190

Glu His Asn Gly Cys Gln Leu Phe Gln Gly Ile Pro Ser Gly Arg Asn

195 200 205

Ser Gly Phe Lys Val Val Arg Tyr His Ser Leu Val Ile Asp Ser Glu

210 215 220

Ser Leu Pro Glu Val Leu Ile Pro Ile Ala Trp Thr Ser Asn Arg Thr

225 230 235 240

Leu Pro Phe Ile Gly Ser Glu Val Leu Asp Lys Tyr Asn Gly His Glu

245 250 255

Leu Gln Thr Asp Gln Ser Ile Phe Leu Asp Ser Phe Leu Pro Glu Ala

260 265 270

Gly Asn Gly Ser Ser Ser Leu Val Asp Tyr Gly Gln Thr Arg Asn Ala

275 280 285

Arg Val Leu Met Gly Val Lys His Ser Thr Arg Pro His Tyr Gly Val

290 295 300

Gln Phe His Pro Glu Ser Val Ala Thr Cys His Gly Ser Gln Ile Phe

305 310 315 320

Lys Asn Phe Arg Glu Ile Thr Asp Asp Tyr Trp Leu Arg Cys Arg Ala

325 330 335

Ser Tyr Asn Lys Gly Lys Arg Ala Asn Ser Asp Ala His Ala Gln Val

340 345 350

Ser Ser Ala Ser Arg Leu Tyr Arg His Leu Val His Asn Asn Thr Glu

355 360 365

Val Asn Tyr Lys Thr Leu Lys Leu Lys Trp Arg Lys Phe Asp His Leu

370 375 380

Ala Gly Gln Val Gly Gly Ala Lys Ser Ile Phe Cys Gln Leu Phe Gly

385 390 395 400

Gln Glu Ala Glu Asn Thr Phe Trp Leu Asp Ser Ser Ser Thr Glu Met

405 410 415

Gly Arg Ala Arg Phe Ser Phe Met Gly Gly Lys Gly Gly Ser Leu Trp

420 425 430

Lys Gln Leu Thr Phe Arg Leu Ser Asp Gln Ser Asp Gly Ser Ser Lys

435 440 445

Gly Gly Gly His Leu Ser Leu Glu Asp Ser Glu Gly Ser Val Lys Thr

450 455 460

Ile Phe Leu Glu Gly Gly Phe Leu Asp Tyr Leu Asn Lys Glu Leu Gln

465 470 475 480

Ser Tyr Arg Tyr Asp Lys Asp Glu Tyr Glu Gly Leu Pro Phe Asp Phe

485 490 495

His Gly Gly Tyr Val Gly Tyr Ile Gly Tyr Asp Leu Lys Val Glu Cys

500 505 510

Gly Val Thr Cys Asn His His Lys Ser Lys Thr Pro Asp Ala Cys Phe

515 520 525

Phe Phe Ala Asp Asn Leu Val Ala Ile Asp His Lys Asn Asp Asp Val

530 535 540

Tyr Leu Leu Ala Ile His Glu Glu Ser Ser Ser Ile Ser Gln Trp Leu

545 550 555 560

Asp Asp Thr Glu Glu Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Ser Val Arg Met

565 570 575

Asp Leu Glu Arg Gln Tyr Ser His Pro Ser Thr Phe Ser Ser His Lys

580 585 590

Ala Gly Phe Ala Ala Glu Lys Ser Lys Glu Gln Tyr Leu Arg Asp Val

595 600 605

Lys Lys Cys Leu Asn Tyr Ile Arg Asp Gly Glu Ser Tyr Glu Leu Cys

610 615 620

Leu Thr Thr Gln Ile Arg Lys Pro Ile Glu Val Leu Asn Ser Leu Gly

625 630 635 640

Leu Tyr Leu His Leu Arg Glu Arg Asn Pro Ala Pro Tyr Ala Ala Trp

645 650 655

Leu Asn Phe Pro Lys Glu Asp Leu Cys Ile Cys Cys Ser Ser Pro Glu

660 665 670

Arg Phe Leu Gln Leu Asp Arg Ser Asp Met Leu Glu Ala Lys Pro Ile

675 680 685

Lys Gly Thr Ile Ala Arg Gly Ala Thr Glu Glu Glu Asp Lys Gln Leu

690 695 700

Lys Leu Lys Leu Gln Leu Ser Glu Lys Asp Gln Ala Glu Asn Leu Met

705 710 715 720

Ile Val Asp Leu Leu Arg Asn Asp Leu Gly Arg Val Cys Asp Pro Gly

725 730 735

Ser Val Asp Val Pro His Leu Met Glu Val Gln Ser Tyr Ala Thr Val

740 745 750

His Thr Met Val Ser Thr Ile Arg Gly Lys Lys Arg Ser Asp Ile Ser

755 760 765

Ala Val Asp Cys Val Lys Ala Ala Phe Pro Gly Gly Ser Met Thr Gly

770 775 780

Ala Pro Lys Leu Arg Ser Met Glu Leu Leu Asp Ser Leu Glu Ser Cys

785 790 795 800

Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Gly Cys Ile Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gln

805 810 815

Thr Phe Asp Leu Asn Ile Val Ile Arg Thr Val Val Ile His Glu Gly

820 825 830

Glu Ala Ser Ile Gly Ala Gly Gly Ala Ile Val Ala Leu Ser Asn Pro

835 840 845

Glu Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ile Leu Lys Thr Lys Ala Pro Ala Asn

850 855 860

Thr Val Ile Asp Tyr Glu

865 870

Claims (8)

1.基因MsGCHI和MsADCS在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因MsGCHI的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述的基因MsADCS的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.基因MsGCHI在提高植物叶酸含量的应用，其特征在于，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.基因MsADCS在提高植物叶酸含量的应用，其特征在于，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.基因MsGCHI和MsADCS在提高植物叶酸含量的应用，其特征在于，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.基因MsGCHI和MsADCS在提高内源叶酸促进植物生长中的应用，其特征在于，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

7.基因MsGCHI和MsADCS在促进植物根系生长中的应用，其特征在于，所述的基因MsGCHI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的基因MsADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的促进植物根系生长包括促进根部分支数增多、促进根长变长和促进根体积变大。

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