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CN114651201A - 用于细胞计数测量的系统和方法 - Google Patents

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CN114651201A
CN114651201A CN202080061621.4A CN202080061621A CN114651201A CN 114651201 A CN114651201 A CN 114651201A CN 202080061621 A CN202080061621 A CN 202080061621A CN 114651201 A CN114651201 A CN 114651201A
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L·L·常
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Nexcelom Bioscience LLC
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Abstract

本发明提供了新型的样品室、单元和多孔板及其系统和方法，用于细胞计数方法的内置测量保证和不同类型生物细胞的校准和/或质量保证测量和分析，例如细胞计数、细胞尺寸、细胞浓度、细胞亚群、细胞形态、细胞活力等。

Description

用于细胞计数测量的系统和方法
优先权和相关专利申请
本申请要求2019年9月4日提交的美国临时申请序列号62/895,704的优先权权益，其全部内容以引入方式并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及生物样品的测量和分析。更具体地，本发明涉及用于各种类型生物细胞的校准和/或质量保证测量和分析的新型的细胞计数室、单元和多孔板及其系统和方法，其包含细胞计数、细胞尺寸、细胞浓度、细胞亚群、细胞形态和细胞活力测量。
背景技术
医学诊断和生物医学研究中的一个重要方面涉及通过生物样品如血液、脊髓液、细胞培养物和尿液的测试来检测、鉴定、定量和表征各种感兴趣的细胞和生物分子。医疗保健提供者和生物医学研究人员常规地分析生物样品的微观呈现、细胞计数以及细胞和生物分子的浓度。
例如，在临床实践中，各种血细胞如红细胞和白细胞的浓度可以提供关于患者健康状况的重要信息。细胞计数是基于细胞的测定中的重要参数。它被用于确定细胞培养的合适接种密度、基于蛋白质的测定的归一化、或确定下游测定如流式细胞术所需的细胞数。
传统上，细胞计数是在光学显微镜下用血细胞计数器手动进行的。在最近十年中，自动细胞计数器已可得到并且在生物实验室中得到普及。这些细胞计数器主要用于单个样品检测，并要求操作者将一次性载玻片放入仪器中以进行每次细胞计数。尽管现有技术在减少操作时间和依赖于操作者的变化的方面相对于手动计数显著改进，但是当需要分析大量样品时，它们仍然需要大量时间。
校准和质量保证方法仍然不充分且不完善。在细胞治疗中，细胞计数用于控制给予患者的细胞剂量。细胞活力测量，即测量和计算死细胞和活细胞的分数，在分子生物学研究和临床诊断和治疗中都是重要的。生物样品的浓度和组成变化很大。如果没有准确的校准和适当的测量保证，可能难以知道特定样品是否适合于基于图像的自动细胞计数，以及所获得的数据的置信度水平如何。
具有不仅提供有效的细胞计数测量，而且包含内置校准和测量保证功能的计数仪器和方法是有价值的，这确保样品和方法都适于提供精确的计数测量。
因此，需要一种新颖和改进的装置和方法，其可以对适用于各种细胞类型和条件的生物样品的自动细胞计数测量的快速校准和测量保证，并提供细胞计数数据质量的置信度。
发明内容
本发明提供了新型的样品室、分析单元、多孔板和细胞计数系统，其具有细胞测量和分析的高通量自动校准和保证的内置能力，例如细胞计数、浓度、亚群、形态、尺寸、活力、细胞周期、表面标记物等。
样品室、分析单元和多孔板在成像路径中具有明确限定的微尺度标记、对象或特征(有时统称为“特征”或“微尺度特征”)，其简化测量的校准和结果的质量保证，这对于生物医学应用是关键的。
在一个方面，本发明总体上涉及一种适于容留液体样品以光学成像的样品室。所述样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述样品室内以便观察或分析的入口；(b)用于容留所述液体样品的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通并且包含一个或多个光学透明窗口以适于观察或分析所述成像室内的液体样品；和(c)与成像室流体连通以用于空气逸出或液体样品的流出的出口。所述成像室的特征在于以下一项或多项：变化的室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述一个或多个光学透明窗口的至少一部分，具有相对于所述成像室的焦平面一个或多个已知偏移的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，具有一个或多个已知的尺寸、面积或体积的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，并且所述限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在另一方面，本发明总体上涉及一种样品分析单元。所述样品分析单元包含：(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及(ii)本文所公开的样品室，其设置在所述混合孔的空间附近。
在又一方面，本发明总体上涉及一种样品分析单元。所述样品分析单元包含：(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；和(ii)适于容留液体样品以光学成像的第一样品室。第一样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述第一样品室内以便观察或分析的第一入口；(b)用于留容所述液体样品的第一成像室，其中所述第一成像室与所述第一入口流体连通并且包含第一或第一组光学透明窗口以适于观察或分析所述第一成像室内的液体样品；和(c)与第一成像室流体连通以用于空气逸出或液体样品的流出的第一出口。所述第一成像室的特征在于以下一项或多项：(i)变化的第一室高度，连续的或逐步的，其贯穿第一或第一组光学透明窗口的至少一部分，(ii)具有相对于第一成像室的焦平面一个或多个已知偏移的第一限定特征，其中所述特征经由所述第一或第一组光学透明窗口可光学得到，(iii)具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第一限定特征，其中所述第一特征经由所述第一或第一组光学透明窗口可光学得到，以及(iv)所述第一限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在另一个方面，本发明总体上涉及包含本文所公开的样品分析单元的多孔板或装置。
在又一个方面，本发明总体上涉及包含多个样品分析单元的多孔板，其中每个样品分析单元包含：(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及(ii)适于容留所述液体样品以光学成像的一个或多个样品室。每个样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述样品室内以便观察或分析的入口；(b)用于容留所述液体样品的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通并且包含一个或多个光学透明窗口以适于观察或分析所述成像室内的液体样品；和(c)与成像室流体连通以用于空气逸出或液体样品的流出的出口。所述成像室的特征为：具有相对于成像室的焦平面一个或多个已知偏移的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，和/或具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到。所述限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在又一方面，本发明总体上涉及一种用于分析生物样品的系统，其包含本文所公开的样品分析单元或多孔板。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法。所述方法包括：手动或自动调节焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；根据所述限定特征记录最佳焦点位置；手动或自动地将所述焦点调节到样品的尝试的细胞焦点位置，在所述位置处假定细胞处于用于细胞计数的最佳焦点；根据所述样品记录尝试的细胞焦点位置；执行用于细胞计数测量的图像采集；根据所述限定特征和根据所述样品比较记录的焦点位置；以及确定所述两个记录的焦点位置之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞计数测量。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于获得用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法。所述方法包括：手动或自动调节焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；通过与所述一个或多个限定特征的焦点位置的预限定偏移手动或自动调节所述焦点位置；以及执行用于细胞计数测量的图像采集。
在某些实施方案中，在每种情况下手动调节焦点位置。
在某些实施方案中，在每种情况下自动调节焦点位置。
另一方面，本发明总体上涉及一种用于校准用于细胞计数分析的成像系统的细胞尺寸测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；基于所述特征的已知尺寸和测量尺寸的比较确定校准因子；在细胞尺寸测定中应用校准因子；以及报告细胞尺寸测量的调节值。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的细胞尺寸测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；以及确定所述特征的测量尺寸与其已知尺寸之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞尺寸测量。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于同时评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点和细胞尺寸测量的方法。所述方法包括：手动或自动调节焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；确定两次测量之间的差异是否可接受，以确认或拒绝焦点和细胞尺寸测量的设置；以及重复这些步骤直到获得可接受的尺寸测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于评估样品对于细胞计数分析的适用性的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，并比较记录的细胞计数以确定它们是否与室高度成比例，以确认或拒绝所述细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，并分析记录的细胞计数测量以确定细胞计数测量与室高度成比例的室高度，以确认相应的细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，并分析记录的细胞计数测量以确定细胞计数测量与室高度成比例的细胞计数范围，以确认相应的细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数；分析记录的细胞计数测量以确定哪些测量与已知的室高度成比例；以及确认与室高度充分成比例的细胞计数测量并拒绝那些不成比例的细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数，并且基于计数与所述已知的室高度的期望值匹配程度对所获得的细胞计数测量进行评分；以及确认符合预定规格的那些测量并拒绝那些不符合预定规格的那些测量。
另一方面，本发明总体上涉及一种用于校准用于细胞计数分析的成像系统的荧光测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的荧光；测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；比较限定特征的测量荧光与其已知荧光；基于限定特征的测量荧光与其已知荧光的比较确定校准因子；在细胞的荧光测量中应用校准因子；并报告荧光测量的调节值。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的荧光测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的荧光；测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；以及比较限定特征的测量荧光与其已知荧光以确认或拒绝所述荧光测量。
在又一个方面，本发明总体上涉及一种用于校准和/或评估细胞计数分析的方法，其包括根据本文所公开的一种或多种方法进行校准或评估。
在又一个方面，本发明总体上涉及一种使用本文所公开的样品室、本文所公开的样品分析单元、本文所公开的多孔板或本文所公开的用于分析生物样品的系统进行细胞计数测量的方法。
附图说明
图1.示例性多室厚度的示意图。
图2.示例性计数单元和不同厚度计数室组件一起使用的示意图。
图3.用于系统焦点校准或评估的示例性标记或特征的示意图。
图4.用于细胞尺寸校准或评估的示例性标记或特征的示意图。
图5.用于细胞荧光校准或评估的示例性标记或特征的示意图。
图6.细胞计数与室厚度成比例(逐步变化)的示例性显示。(A)各种厚度的示例性计数室。(B)比例显示。
图7.细胞计数与室厚度成比例(连续变化)的示例性显示。(A)各种厚度的示例性计数室。(C)&(D)比例显示。
图8.共享公共加入口的示例性细胞计数室。
图9.共享公共加入口的不同厚度的示例性细胞计数室。
图10.使用图9中的装置的珠粒计数与有效浓度成比例的示例性显示。
图11.焦点位置和所获得图像的示例性显示。
图12.成像对象和尺寸和圆度直方图的示例性显示。
图13.成像荧光珠粒的示例性显示。
具体实施方式
本发明部分基于新颖的样品室、单元和多孔板及其系统和方法，其具有允许计数方法的评估和校准和/或质量保证的测量以及不同类型的生物细胞的分析的内置特征，例如细胞计数、细胞尺寸、细胞浓度、细胞亚群、细胞形态和细胞活力测量。
细胞计数成比例的校准和评估
本发明的一个特征是在不需要稀释样品和重复测量不同浓度的样品的情况下实现细胞计数比例的验证。传统上，适当的比例是用样品的稀释来验证的，以提供计数方法和方案的置信度。代替产生一系列浓度以验证比例，所公开的方法通过测量具有变化但限定的室厚度的成像室的不同区域来评估细胞计数比例。特别地，通过与体积成比例的室厚度的变化来调整视场中的粒子数量。
如图1所示，多个厚度可以在单个计数室中产生。室厚度的变化可以离散的步骤(图1A)或连续的步骤(图1B)进行。如图1C(从入口到出口的纵向)和图1D(从室的一个边缘到室的另一个边缘的横向)所示，室厚度可以沿着室的任何轴线改变。
如图2所示，不同厚度的多个计数室可以一起使用。多个室可以作为单个单元制备以用作一组。在图2A中，四个厚度的四个室和单个入口被组合在一起成为一组。在图2B中，三个厚度的三个室和单个入口被组合在一起成为一组。多个室也可以连接成多室装置(例如96孔板)中。
图6示出了细胞计数与室厚度成比例的示例性说明，其中厚度以逐步方式变化。使用不同厚度的计数室组(图6A)，其中粘合剂间隔层的不同组合已结合到每个载玻片中。当填充相同珠粒/细胞悬液的样品时，计数的对象数量与室厚度成比例(图6B)。
具有不同厚度的室可以使用多种厚度的粘合剂、多层粘合剂和/或使用压印光刻由UV固化聚合物形成的结构来制备。
图7示出了细胞计数与室厚度成比例的示例性说明，其中厚度连续变化。图7A示出了具有连续变化的室高度的两个计数室(左：横向变化；右侧：纵向变化)，其使用多层粘合剂间隔层制备。粘合剂区域以蓝色突出显示，较深的蓝色表示较厚的粘合剂。围绕计数室的粘合剂层形成台阶，但是室的顶部从室的厚侧平滑地过渡到薄侧，这导致连续变细的室厚度。制备了两种结构，其中室厚度的变化同时发生在计数室的横向(X方向)和纵向(Y方向)。
在一个实验中，将5μm珠粒溶液装入到室中(2e6珠粒/mL)，并且获得珠粒位置的直方图。从直方图的线性拟合获得的斜率和R2值提供了比例度量。图7B中所示的X位置直方图是从载玻片A的计数室之一获得的，而图7C中的Y位置直方图是从载玻片B的计数室之一获得的。
细胞计数室可以被配置为共享公共入口(加入)口。多室装置可以包含独立的室或在一个或多个公共样品加入口处连接的室。在图2C中，多孔板具有10组三个室单元。在图2D中，多孔板具有4组4个室单元和2组3个室单元。
图8显示了举例说明该多室方法的多孔板。测试表明，细胞悬液始终同时流入多个计数室。图8A显示了限定细胞计数室的切开的粘合剂层(未除去衬纸)。图8B显示了具有覆盖的顶片(未除去保护性生膜)的粘合剂层，其显示了加入口和排出口的对准。图8C显示了粘附于96孔板底部的完整细胞计数室的底面。测试多个板的适当流体流动和细胞计数一致性。当珠粒溶液被添加到多个加入口时，对于不同配置的计数室没有观察到浓度测量的显著差异。
在图9中，多孔板包含4个样品加入口，每个加入口与4个不同厚度的计数室相连。图9A示出了板的俯视图，而图9B示出了板的仰视图。每个室延伸跨4个样品观察窗口。所述板可以容留4个样品，在每个样品的4个有效稀释点产生4个重复的线性曲线，如图9C所示。
所述成像系统可快速计数装入到室内的细胞，这些室被制备在标准96孔板的底部。定制软件特征可以并入以分析所测量的细胞计数的比例，并返回判断样品是否适合仪器自动计数。所述软件还可以自动分析各种室高度的计数，并向用户指示细胞悬液是否要进一步稀释或浓缩以便更成功地计数。也可以实现自动排除具有太多或太少对象的室的部分。
系统焦点的校准和评估
本发明的另一个特征是内置的微尺度标记或特征，例如室表面上的二维或三维标记，具有已知的偏移以确保细胞计数和活力测量的一致焦点。本发明的这个特征允许适当和一致的焦点，这对于基于图像的细胞计数至关重要。一致的焦点避免了明视场和荧光照明下细胞外观的改变，这会降低细胞计数算法的精度。
相对于成像室的底板的已知位置处的标记或特征被内置以帮助系统焦点并确保焦点一致性。例如，跨视场间隔的特征允许评估所述室是否水平。在系统分辨率级别上具有高强度对比度的特征可以提供焦点位置的精确确定。例如，如图3所示，包含当处于理想焦点位置时形成高对比度的区域的特征(粗糙细节和精细细节)可以提供更灵敏的确定相对焦点的方法。此外，三维焦点对象可以使用多种长度和高度尺度，其允许算法确定在较宽的距离范围内对比度的变化。
自动聚焦方法可以被实施以确定特征处于最佳焦点位置的焦点位置。这可以通过结合焦点分值优化算法来实现。基于所述特征的图像如何随焦点位置变化的仔细校准可导致系统焦点的快速校准。良好制备的微尺度特征允许这种校准产生几乎瞬时的焦点位置的配准。
一旦系统仪器具有配准的焦点位置，就可以设置偏移以记录特定类型细胞的理想焦点位置。这可以由用户基于视觉检查手动地完成，基于焦点分值自动地完成，或者通过使用用于特定测定的内置偏移来完成。一旦建立了细胞的理想焦点位置和参考标记平面，仪器就可以快速地移动到理想焦点以获取后续图像。
细胞尺寸测量的校准和评估
本发明的另一个特征是使用具有明确限定的标记或特征，其允许系统校准和评估细胞尺寸测量。细胞计数仪器报告它们检测的对象的尺寸。由分割算法报告的尺寸随焦点位置和图像亮度而变化。离焦细胞可以看起来较大，并且可以会如此报告，但是也可以显示较小的对比度，这导致由纹理算法报告的尺寸较小。对于荧光图像，更亮的照明往往给出较大的细胞测量。不良测量的细胞尺寸也可影响浓度测量。
尺寸校准涉及获得精确的像素到微米的转换以及评估分割斑点尺寸的精度。不同尺寸的标记的外观可能受到光衍射的不同影响。在较大距离上具有已知间隔的特征将提供像素到微米转换因子的更精确估计。对于像素到微米的转换，有利的是利用图像所允许的尽可能远且以2D取向的标记或特征。对于分割斑点尺寸精度，最好包含与要计数的细胞相当的尺寸和光学行为的特征。
图4是允许校准分割算法的已知尺寸的微尺度特征的示意图。对于照相机校准，可以使用棋盘图案。已经设计了非常适合以子像素精度查找棋盘的线的算法。另一个示例是彼此之间具有明确限定距离的点簇。例如，限定图案中的5μm点等特征可用于同时建立用于测量细胞位置的校准坐标系和评估分割尺寸的精度。
细胞荧光测量的校准和评估
本发明的另一个特征是使用具有明确限定的荧光的对象或特征，其允许系统校准适当的荧光照明并评估荧光测量。荧光成像模式中的计数和尺寸测量都取决于照相机处接收的光的强度。强度取决于光源的亮度、滤光器的透射效率和细胞自身的荧光强度。荧光标记的细胞表现出发射强度的分布。如果使用强度阈值从背景中分割细胞，则计数的细胞的数量将随激发光的强度而变化。如果为在不同照明条件下进行的实验分析设置相同的阈值，则计数将仅由这个原因变化。结合到计数装置中的良好控制的荧光对象或特征允许对标记物的强度归一化，这导致从实验到实验和仪器到仪器的更好的计数一致性。还允许在不同暴露时间下完成的实验之间进行比较。
例如，如图5中示意性示出的，对于嵌入或添加到细胞计数室或载玻片的良好表征的荧光的对象或特征，成像细胞的强度可以与对象或特征的亮度相关或归一化。这允许比较仪器和实验之间的结果。系统仪器还可以利用这些特征来提供照明是否正确工作的简单确认，从而可以将低的或不存在的细胞计数确信地归因于样品而不是仪器。
图5示出了荧光特征的两个简单图案。在图5A中，提供了荧光棋盘，其允许尺度(例如，正方形的尺寸和/或间距)、荧光强度(例如，使用荧光涂层的亮度)和焦点的校准。图5B示出了已知尺寸的各种颜色的荧光点的可选图案。多个点颜色允许多个荧光通道(亮度和焦点位置)的校准。此外，点对之间的已知距离提供了尺度校准和空间坐标的原点。在图5C中，多个小标记被放置在计数室周围的位置。多种荧光颜色的标记物也允许找到不同波长的焦平面。为了降低这种特征的制备成本，可以利用良好表征的荧光珠粒在细胞室上进行直接标记。
用于多重校准和测量保证的组合标记
焦点配准、比例验证、尺寸校准和荧光强度基准可以一起完成。例如，已知尺寸的对象或特征可以用荧光墨水印刷在载玻片的底部外表面上。系统仪器可以聚焦在对象或特征上，并应用已知的偏移以将焦点移动到细胞的焦平面。系统仪器可检查荧光特征的强度是否在规格范围内，并调节光源的亮度或照相机的增益，以便在必要时进行补偿。还可以检查在对象或特征之间测量的某些距离，以验证图像的校准在可接受的范围内。这样的标记可以被蚀刻、印刷或以其他方式添加到细胞计数室(例如，压印光刻)。
因此，在一个方面，本发明总体上涉及适于容留液体样品以光学成像的样品室。所述样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述样品室内以便观察或分析的入口；(b)用于容留所述液体样品的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通并且包含一个或多个光学透明窗口以适于观察或分析所述成像室内的液体样品；和(c)与成像室流体连通以用于空气逸出或液体样品的流出的出口。所述成像室的特征在于以下一项或多项：变化的室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述一个或多个光学透明窗口的至少一部分，具有相对于所述成像室的焦平面一个或多个已知偏移的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，具有一个或多个已知的尺寸、面积或体积的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，并且所述限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在某些实施方案中，所述室高度的至少一部分是连续变化的。
在某些实施方案中，所述室高度的至少一部分是逐步变化的。
在某些实施方案中，所述室高度是同时连续变化的和逐步变化的(部分连续变化和部分逐步变化)。
在某些实施方案中，所述室高度在约1μm至约5,000μm(例如，约1μm至约5,000μm，约5μm至约5,000μm，约10μm至约5,000μm，约50μm至约5,000μm，约100μm至约5,000μm，约500μm至约5,000μm，约1μm至约1,000μm，约1μm至约500μm，约1μm至约100μm，约1μm至约50μm，约1μm至约10μm)的范围内变化。
在某些实施方案中，所述室高度在约10μm至约500μm(例如，约10μm至约500μm，约25μm至约500μm，约50μm至约500μm，约100μm至约500μm，约10μm至约250μm，约10μm至约100μm，约10μm至约50μm，约10μm至约25μm)的范围内变化。
在某些实施方案中，所述限定特征中的至少一些是三维的，其由一个或多个限定特征高度表征。
在某些实施方案中，所有限定特征是三维的，其由一个或多个限定特征高度表征。
在某些实施方案中，所述一个或多个限定特征高度是相同的。
在某些实施方案中，所述一个或多个限定特征高度是不同的。
在某些实施方案中，所述一个或多个限定特征高度为约0.1μm至约5,000μm(例如，约0.1μm至约1,000μm，约0.1μm至约500μm，约0.1μm至约200μm，从约0.1μm至约100μm，约0.1μm至约50μm，约0.1μm至约25μm，约0.1μm至约10μm，约0.1μm至约5μm，约0.1μm至1μm，约1μm至约5,000μm，约10μm至约5,000μm，约50μm至约5,000μm，约100μm至约5,000μm，约500μm至约5,000μm，约1,000μm至约5,000μm，约1μm至约500μm，约2μm至约200μm，约2μm至约100μm，约5μm至约100μm，约5μm至约50μm)。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知偏移的限定特征刻在在所述成像室的底部上。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知偏移的限定特征刻在所述成像室的顶部上。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征刻在所述成像室的底部上。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征刻在所述成像室的顶部上。
在某些实施方案中，所述限定特征包含多个粗糙特征和精细特征。
在某些实施方案中，所述限定特征表现出一个或多个预限定图案。
在某些实施方案中，限定特征表现出一种或多种荧光颜色和/或一种或多种荧光强度。
在某些实施方案中，所述成像室配置成具有约0.1μL至约200μL(例如，约0.5μL至约200μL，约1μL至约200μL，约10μL至约200μL，约50μL至约200μL，约0.1μL至约100μL，约0.1μL至约50μL，约0.1μL至约20μL，约0.1μL至约10μL，约0.1μL至约5μL，约0.1μL至约1μL)范围内的体积。
在某些实施方案中，所述成像室配置成具有约4μL至约100μL(例如，约10μL至约100μL，约20μL至约100μL，约50μL至约100μL，约4μL至约50μL，约4μL至约20μL，约4μL至约10μL)范围内的体积。
在某些实施方案中，所述成像室配备有单个光学透明窗口。
在某些实施方案中，其中所述成像室配备有两个或更多个光学透明窗口。
在某些实施方案中，所述成像室配备有三个、四个或五个光学透明窗口。
在另一方面，本发明总体上涉及一种样品分析单元。所述样品分析单元包含：(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及(ii)本文所公开的样品室，其设置在所述混合孔的空间附近。
在又一方面，本发明总体上涉及一种样品分析单元。所述样品分析单元包含：(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；和(ii)适于容留液体样品以光学成像的第一样品室。所述第一样品室包含：(a)用于将液体样品引入到第一样品室内以便观察或分析的第一入口；(b)用于留容所述液体样品的第一成像室，其中所述第一成像室与所述第一入口流体连通并且包含第一或第一组光学透明窗口以适于观察或分析所述第一成像室内的液体样品；和(c)与第一成像室流体连通的用于空气逸出或液体样品的流出的第一出口。所述第一成像室的特征在于以下一项或多项：(i)变化的第一室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第一或第一组光学透明窗口的至少一部分，(ii)具有相对于第一成像室的焦平面的一个或多个已知偏移的第一限定特征，其中所述特征经由所述第一或第一组光学透明窗口可光学得到，(iii)具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第一限定特征，其中所述第一特征经由所述第一或第一组光学透明窗口可光学得到，以及(iv)所述第一限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在某些实施方案中，所述样品分析单元还包含适于容留液体样品以光学成像的第二样品室。所述第二样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述第二样品室内以便观察或分析的第二入口；(b)用于容留所述液体样品的第二成像室，其中所述第二成像室与所述第二入口流体连通并且包含第二或第二组光学透明窗口以适于观察或分析所述第二成像室内的液体样品；和(c)与第二成像室流体连通的用于空气逸出或液体样品的流出的第二出口。所述第二成像室的特征在于以下一项或多项：(i)变化的第二室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第二或第二组光学透明窗口的至少一部分，(ii)具有相对于所述第二成像室的焦平面的一个或多个已知偏移的第二限定特征，其中所述第二特征经由所述第二或第二组光学透明窗口可光学得到，(iii)具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第二限定特征，其中所述第二特征经由所述第二或第二组光学透明窗口可光学得到，以及(iv)所述第二限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在某些实施方案中，所述样品分析单元还包含适于容留液体样品以光学成像的第三样品室。所述第三样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述第三样品室内以便观察或分析的第三入口；(b)用于容留所述液体样品的第三成像室，其中所述第三成像室与所述第三入口流体连通并且包含第三或第三组光学透明窗口以适于观察或分析所述第三成像室内的液体样品；和(c)与第三成像室流体连通的用于空气逸出或液体样品的流出的第三出口。所述第三成像室的特征在于以下一项或多项：(i)变化的第三室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第三或第三组光学透明窗口的至少一部分，(ii)具有相对于所述第三成像室的焦平面的一个或多个已知偏移的第三限定特征，其中所述第三特征经由所述第三或第三组光学透明窗口可光学得到，(iii)具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第三限定特征，其中所述第三特征经由所述第三或第三组光学透明窗口可光学得到，以及(iv)所述第三限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在某些实施方案中，所述样品分析单元还包含适于容留液体样品以光学成像的第四样品室。所述第四样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述第四样品室内以便观察或分析的第四入口；(b)用于容留所述液体样品的第四成像室，其中所述第四成像室与所述第四入口流体连通并且包含第四或第四组光学透明窗口以适于观察或分析所述第四成像室内的液体样品；和(c)与第四成像室流体连通的用于空气逸出或液体样品的流出的第四出口。所述第四成像室的特征在于以下一项或多项：(i)变化的第四室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第四或第四组光学透明窗口的至少一部分，(ii)具有相对于所述第四成像室的焦平面的一个或多个已知偏移的第四限定特征，其中所述第四特征经由所述第四或第四组光学透明窗口可光学得到，(iii)具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第四限定特征，其中所述第四特征经由所述第四或第四组光学透明窗口可光学得到，以及(iv)所述第四限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在某些实施方案中，所述样品分析单元还包含一个或多个适于容留液体样品以光学成像的附加样品室。
在所述样品分析单元的某些实施方案中，第一、第二、第三、第四和任何附加入口都共享相同的入口。
在某些实施方案中，第一、第二、第三、第四和任何附加成像室中的每一个的特征在于统一的室高度，而第一、第二、第三、第四和任何附加成像室具有不同的室高度。
在某些实施方案中，第一、第二、第三、第四和任何附加成像室中的每一个的特征在于不统一的室高度。
在某些实施方案中，第一、第二、第三、第四和任何附加限定特征是相同的。
在某些实施方案中，第一、第二、第三、第四和任何附加限定特征是不同的。
在某些实施方案中，所述成像室中的每一个配置成具有约0.1μL至约200μL(例如，约0.5μL至约200μL，约1μL至约200μL，约10μL至约200μL，约50μL至约200μL，约0.1μL至约100μL，约0.1μL至约50μL，约0.1μL至约20μL，约0.1μL至约10μL，约0.1μL至约5μL，约0.1μL至约1μL)的体积。
在某些实施方案中，所述成像室中的每一个配置成具有约4μL至约100μL(例如，约10μL至约100μL，约20μL至约100μL，约50μL至约100μL，约4μL至约50μL，约4μL至约20μL，约4μL至约10μL)的体积。
在某些实施方案中，所述第一或第一组光学透明窗口、第二或第二组光学透明窗口、第三或第三组光学透明窗口以及第四或第四组光学透明窗口中的每一个包含单个光学透明窗口。
在某些实施方案中，所述第一或第一组光学透明窗口、第二或第二组光学透明窗口、第三或第三组光学透明窗口以及第四或第四组光学透明窗口中的每一个包含两个或更多个光学透明窗口。
在某些实施方案中，所述第一或第一组光学透明窗口、第二或第二组光学透明窗口、第三或第三组光学透明窗口以及第四或第四组光学透明窗口中的每一个包含三个、四个或五个光学透明窗口。
在另一个方面，本发明总体上涉及包含本文所公开的样品分析单元的多孔板或装置。
在又一个方面，本发明总体上涉及包含多个样品分析单元的多孔板，其中每个样品分析单元包含：(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及(ii)适于容留液体样品以光学成像的一个或多个样品室。每个样品室包含：(a)用于将所述液体样品引入到所述样品室内以便观察或分析的入口；(b)用于容留所述液体样品的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通并且包含一个或多个光学透明窗口以适于观察或分析所述成像室内的液体样品；和(c)与成像室流体连通以用于空气逸出或液体样品的流出的出口。所述成像室的特征为：具有相对于所述成像室的焦平面一个或多个已知偏移的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，和/或具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到。所述限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
在某些实施方案中，所述多孔板包含2个或更多个样品分析单元。在某些实施方案中，所述多孔板包含4个或更多个样品分析单元。在某些实施方案中，所述多孔板包含6个或更多个样品分析单元。在某些实施方案中，所述多孔板包含8个或更多个样品分析单元。在某些实施方案中，所述多孔板包含10个或更多个样品分析单元。在某些实施方案中，所述多孔板包含12个或更多个样品分析单元。
在所述多孔板的某些实施方案中，每个样品分析单元包含2个或更多个样品室。在所述多孔板的某些实施方案中，每个样品分析单元包含3个或更多个样品室。在所述多孔板的某些实施方案中，每个样品分析单元包含4个或更多个样品室。
在所述多孔板的某些实施方案中，所有限定特征是相同的。
在某些实施方案中，所有限定特征是不相同的。
在某些实施方案中，所述成像室中的每一个配置成具有约0.1μL至约200μL(例如，约0.5μL至约200μL，约1μL至约200μL，约10μL至约200μL，约50μL至约200μL，约0.1μL至约100μL，约0.1μL至约50μL，约0.1μL至约20μL，约0.1μL至约10μL，约0.1μL至约5μL，约0.1μL至约1μL)的体积。
在某些实施方案中，所述成像室中的每一个配置成具有约4μL至约100μL(例如，约10μL至约100μL，约20μL至约100μL，约50μL至约100μL，约4μL至约50μL，约4μL至约20μL，约4μL至约10μL)的体积。
在又一方面，本发明总体上涉及一种用于分析生物样品的系统，其包含本文所公开的样品分析单元或多孔板。
在某些实施方案中，所述系统进一步包含：至少一个荧光光源；至少一个明场光源；至少一个光学系统，以使所述荧光光束和/或所述明场光束的光束变窄；检测装置；以及计算单元。
在某些实施方案中，所述系统包含两个或更多个荧光光源。
在某些实施方案中，所述系统包含两个或更多个明场光源。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法。所述方法包括：调节所述焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；根据所述限定特征记录焦点位置；调节焦点位置直到样品的细胞出现在最佳焦点；根据所述样品记录焦点位置；执行细胞计数测量；根据所述限定特征和根据所述样品比较记录的焦点位置；以及确定所述两个记录的焦点位置之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞计数测量。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法。所述方法包括：手动或自动调节焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；根据所述限定特征记录焦点位置；手动或自动地将所述焦点调节到尝试的细胞焦点位置，在所述位置处假定细胞处于用于细胞计数的最佳焦点；根据所述样品记录尝试的细胞焦点位置；执行用于细胞计数测量的图像采集；根据所述限定特征和根据所述样品比较记录的焦点位置；以及确定所述两个记录的焦点位置之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞计数测量。
在某些实施方案中，在拒绝细胞计数测量的情况下，所述方法进一步包括：手动或自动地将焦点调节到新的尝试的细胞焦点位置，在所述位置处假定细胞处于用于细胞计数的最佳焦点；根据所述样品记录所述新尝试的细胞焦点位置；执行用于细胞计数测量的图像采集；根据所述限定特征和根据所述样品比较记录的焦点位置；以及确定所述两个记录的焦点位置之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞计数测量；以及根据需要重复焦点调节以产生可接受的焦点位置。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于获得用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法。所述方法包括：手动或自动调节焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；通过与所述一个或多个限定特征的焦点位置的预限定偏移手动或自动调节所述焦点位置；以及执行用于细胞计数测量的图像采集。
另一方面，本发明总体上涉及一种用于校准用于细胞计数分析的成像系统的细胞尺寸测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；基于所述特征的已知尺寸和测量尺寸的比较确定校准因子；在细胞尺寸测定中应用校准因子；以及报告细胞尺寸测量的调节值。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的细胞尺寸测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；以及确定所述特征的测量尺寸与其已知尺寸之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞尺寸测量。
在某些实施方案中，在拒绝所述细胞尺寸测量的情况下，所述方法进一步包含：手动或自动调节一个或多个仪器设置；测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；确定所述特征的测量尺寸与其已知尺寸之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞尺寸测量；以及重复这些步骤直到获得可接受的尺寸测量。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于同时评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点和细胞尺寸测量的方法。所述方法包括：手动或自动调节焦点位置直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；测量样品中细胞的尺寸；测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；确定两次测量之间的差异是否可接受，以确认或拒绝焦点和细胞尺寸测量的设置；以及重复这些步骤直到获得可接受的尺寸测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于评估样品对于细胞计数分析的适用性的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，并比较记录的细胞计数以确定它们是否与室高度成比例以确认或拒绝所述细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，并分析记录的细胞计数测量以确定细胞计数测量与室高度成比例的室高度，以确认相应的细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，并分析记录的细胞计数测量以确定细胞计数测量与室高度成比例的细胞计数范围，以确认相应的细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数；分析记录的细胞计数测量以确定哪些测量与已知的室高度成比例；以及确认与室高度充分成比例的细胞计数测量并拒绝那些不成比例的细胞计数测量。
在另一个方面，本发明总体上涉及在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法。所述方法包括：在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数，并且基于所述计数与所述已知室高度的期望值匹配得多好来对所获得的细胞计数测量进行评分；以及确认符合预定规格的那些测量并拒绝不符合预定规格的那些测量。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括丢弃在细胞计数测量与室高度不成比例的室高度处记录的细胞计数测量。
在某些实施方案中，所述方法还包括丢弃在细胞计数测量与室高度不成比例的室高度处记录的细胞计数测量。在某些实施方案中，所述方法还包括基于所述比例结果生成用于所述细胞计数测量的一个或多个质量分值。例如，在装置中有六个不同的室高度，在所有六个室高度上给出成比例计数的样品的测量质量高于由于不成比例而丢弃六个室高度中的三个的另一个测量。
另一方面，本发明总体上涉及一种用于校准用于细胞计数分析的成像系统的荧光测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的荧光；测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；比较限定特征的测量荧光与其已知荧光；基于限定特征的测量荧光与其已知荧光的比较确定校准因子；在细胞的荧光测量中应用校准因子；并报告荧光测量的调节值。
在另一方面，本发明总体上涉及一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的荧光测量的方法。所述方法包括：测量样品中细胞的荧光；测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；以及比较限定特征的测量荧光与其已知荧光，以确认或拒绝所述荧光测量。
在某些实施方案中，在拒绝所述荧光测量的情况下，所述方法进一步包括：手动或自动调节一个或多个仪器设置；测量样品中细胞的荧光；测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；比较限定特征的测量荧光与其已知荧光以确认或拒绝所述荧光测量；以及重复这些步骤直到所述限定特征的荧光测量是可接受的。
在又一个方面，本发明总体上涉及一种用于校准和/或评估细胞计数分析的方法，其包括根据本文所公开的一种或多种方法进行校准或评估。
在某些实施方案中，一个或多个限定特征中的至少一些是三维的，其由一个或多个限定特征高度表征。
在某些实施方案中，所有限定特征是三维的，其由一个或多个限定特征高度表征。
在某些实施方案中，所述一个或多个限定特征高度是相同的。
在某些实施方案中，所述一个或多个限定特征高度是不同的。
在某些实施方案中，所述一个或多个限定特征高度为约0.1μm至约5,000μm(例如，约0.1μm至约1,000μm，约0.1μm至约500μm，约0.1μm至约200μm，约0.1μm至约100μm，约0.1μm至约50μm，约0.1μm至约25μm，约0.1μm至约10μm，约0.1μm至约5μm，约0.1μm至1μm，约1μm至约5,000μm，约10μm至约5,000μm，约50μm至约5,000μm，约100μm至约5,000μm，约500μm至约5,000μm，约1,000μm至约5,000μm，约1μm至约500μm，约2μm至约200μm，约2μm至约100μm，约5μm至约100μm，约5μm至约50μm)。
在某些实施方案中，所述限定特征刻在所述成像室的底部上。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知偏移的限定特征刻在所述成像室的顶部上。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征刻在所述成像室的底部上。
在某些实施方案中，具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征刻在所述成像室的顶部上。
在某些实施方案中，所述限定特征包含多个粗糙特征和精细特征。
在某些实施方案中，所述限定特征表现出一个或多个预限定图案或几何形状。
在某些实施方案中，所述限定特征表现出一种或多种荧光颜色和/或一种或多种荧光强度。
在某些实施方案中，所述成像室配置成具有约0.1μL至约200μL(例如，约0.5μL至约200μL，约1μL至约200μL，约10μL至约200μL，约50μL至约200μL，约0.1μL至约100μL，约0.1μL至约50μL，约0.1μL至约20μL，约0.1μL至约10μL，约0.1μL至约5μL，约0.1μL至约1μL)的体积。
在某些实施方案中，所述成像室配置成具有约4μL至约100μL(例如，约10μL至约100μL，约20μL至约100μL，约50μL至约100μL，约4μL至约50μL，约4μL至约20μL，约4μL至约10μL)的体积。
在又一个方面，本发明总体上涉及一种使用本文所公开的样品室、本文所公开的样品分析单元、本文所公开的多孔板或本文所公开的用于分析生物样品的系统进行细胞计数测量的方法。
本发明非常适于具有自校准和测量保证能力的高通量细胞计数器仪器和相关软件。这种系统的示例利用透射明场通道、五个激发滤光器(375、475、530、540、630nm)和六个发射滤光器(450、525、600、610LP、660、695)用于落射荧光通道。它还使用无限远校正光学物镜实现高分辨率高质量成像。该示例性系统允许X-Y-Z运动以成像和分析标准微孔板(6-1536孔)、T25和T75烧瓶以及玻璃和室载玻片中的细胞。它将明场分析(锥虫蓝)的细胞计数时间改善到24个样品/分钟，并且将荧光分析(吖啶橙和碘化丙啶)的细胞计数时间改善到24个样品/3分钟。
此外，所述仪器可以与液体处理器集成在一起以执行全自动高通量细胞计数过程。
所述示例性系统由设计用于对不同的易耗品类型(如本文所公开的细胞计数板、6-1536孔的标准微孔板、载玻片、T75、T25烧瓶、室载玻片)进行成像和分析的软件构建。其可用于测量细胞浓度、细胞尺寸和形态(如周长、圆度、面积、长/短轴、紧密度、伸长率、偏心率、球度、凸度、长宽比、坚实性)。其可为基于荧光的测定法测量的荧光强度。额外的附加件用于实现全自动化以与板处理器、液体处理器集成来进行高通量细胞计数和分析。
所述软件分析捕获的图像以确定细胞浓度、细胞尺寸和形态、荧光标记群体百分比如活力(吖啶橙、碘化丙啶(PI)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst、7-氨基放线菌素D(7AAD)，Sytox Green、Sytox Red、DRAQ5/7，核绿/红/蓝/远红、锥虫蓝等)；转导效率(绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、mCherry、蓝色荧光蛋白(BFP)、mCardinal、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等)；凋亡(膜联蛋白V-FITC、-PE和PI、或半胱天冬酶3/7)；自噬(LC3II-FITC、-GFP)；细胞周期(PI、Hoechst、DAPI、BrdU(溴脱氧尿苷)、EdU(5-乙炔基-2′-脱氧尿苷))；衰老(Beta-Gal-Green)；生命力(钙黄绿素AM、CFDA-AM(5-羧基荧光素二乙酸酯乙酰氧基甲酯)、FDA(荧光素二乙酸酯)、CFDA)；ROS；线粒体电位与健康；表面标记物染色和细胞内染色。
根据本发明的系统可设计为执行针对肿瘤学、免疫肿瘤学、病毒学、细胞治疗、细胞系发育、再生医学(干细胞研究)、酿造科学和可再生能源的测定。其可用于分析细胞系(NCI-60癌细胞等)、原代细胞(PBMC、脾细胞、白细胞分离法、单采、胸腺细胞)、干细胞、血小板、血红细胞、酵母菌和藻类、CHO细胞等。所述系统可用来执行测定例如细胞生长和增殖、活力、激活引起的细胞尺寸变化、转导效率、凋亡、自噬、细胞周期、衰老、ROS、线粒体电位与健康、表面标记物群体分析、细胞内染色群体分析等。
此外，所述系统可基于尺寸、形态或荧光标记确定群体百分比。通过使用明场或任何其它荧光通道识别总细胞计数、可通过基于尺寸、形态或荧光标记比较细胞计数的数量或目标细胞群体的浓度来确定群体的比率。
以下实施例旨在说明本发明的实施而不以任何方式进行限制。
图10显示了使用图9中的装置和具有三种不同浓度的珠粒溶液样品获得的示例性结果。图像中计数珠粒数与有效浓度作图，有效浓度是样品的真实浓度乘以室的厚度。在有效浓度范围的高端和低端可以看到比例偏差。因此，可以拒绝低浓度和高浓度样品的计数。如果有足够数量的计数落入线性范围内，则可以在去除非线性点并返回确认计数值的情况下重新计数样品。多室厚度还提供增加仪器能够可靠测量的浓度范围的能力。
在图11中，可以看出变化的焦点位置会导致成像对象的变化的图像。在(A)中，目标是对微观对象进行成像以便可以看到表面细节。对象位于透明表面上，但是如果焦点位于表面本身上，则细节变得褪色(B)。例如，该尺寸的类似对象的目标是在距表面182μm处聚焦。已知在感兴趣对象所位于的表面的548μm的平面处，特征是容易识别的(网格线，面板C)。焦点可以可靠地置于网格上，并且一旦网格被聚焦就记录物镜的位置。然后可以将物镜移动548μm的偏移量以到达样品表面，并且移动另外的182μm以到达对象的最佳焦点(总偏移量730μm)。如果聚焦算法由于灰尘和划痕而变得混乱，并且错误地聚焦在用于成像网格或对象(D)的错误位置处，则将报告的焦点偏移与预期的730μm相差过大，并且所述焦点将被拒绝。
图12中示出了成像对象以及尺寸和圆度直方图的示例性显示。图A显示了与已知尺寸硼硅酸盐玻璃珠粒混合的Jurkat细胞悬液的图像的一部分。插图显示了相同样品的图像的略微散焦的区域。所述珠粒具有经认证的17.3μm的平均直径，其标准偏差为2.0μm。算法发现的对象以绿色突出显示。在B中给出了图像中识别的具有良好焦点的对象的尺寸直方图。在20μm处的峰对应于珠粒。使用16至25μm的门孔选择珠粒。为了这些对象，所述算法返回的平均直径为19.96μm，标准偏差为1.94μm。
结果表明，所述算法报告的尺寸比特征(微珠)的实际尺寸大约15％。所报告的细胞尺寸也可能以类似的方式受到影响。在B中还绘制了算法在样品的整个散焦图像中找到的对象尺寸的直方图。对应于珠粒的清晰峰已被消除，并且图像可被拒绝用于细胞计数。图C示出了从具有良好焦点的图像获得的圆度直方图。还绘制了先前被识别为珠粒的那些对象的直方图。峰值未出现在如球形对象所预期的1.0。这是使用已知尺寸的特征(图4)来检测尺寸校准问题的特殊情况。在这种情况下，差异可能是由于沿图像的一个维度的错误长度校准引起的。系统的光学器件也可能导致失真。失真可能是拒绝的另一个原因。
荧光珠粒成像的示例如图13所示。在(A)和(B)中显示了两个含有相似荧光珠粒的Jurkat样品的图像。在每组图像中可见一个细胞和一个珠粒。所述细胞使用标记死细胞的碘化丙啶染色。在第一组(A)中，发现细胞荧光非常暗淡。在不存在珠粒的情况下，可以检测激发照明的强度或照相机的曝光时间是否适于所述测定。所述珠粒允许验证细胞的暗度是由于其没有强烈地发出荧光，而不是仪器或设置有错误。
在第二组图像(B)中，Jurkat细胞吸收了碘化丙啶并强烈地发出荧光。该细胞的荧光图像是用比第一细胞(A)的荧光图像更长的曝光时间来拍摄的，并且在不存在共同参考特征的情况下难以可靠地比较图像。标准珠粒的存在允许两个图像之间的比较和更一致的细胞计数。
图C显示了来自图B的珠粒的强度的校准。在这种情况下，测量一维的简单亮度分布。发现以因子0.8调节第二荧光图像的亮度给出了珠粒强度与A中珠粒的良好一致性。
本文参考附图在优选的实施方案中描述了申请人的公开，在附图中，类似的数字表示相同或相似的要素。在整个说明书中提及的“一个实施方案(one embodiment)”、“实施方案(an embodiment)”或类似语言意思是结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中出现的表述“在一个实施方案中”、“在实施方案中”和类似语言可以但不一定都指同一个实施方案。
在一个或多个实施方案中，可以任何合适的方式组合申请人的公开的所述特征、结构或特性。在本文的描述中，列举了许多具体细节来提供对本发明实施方案的透彻理解。然而，相关领域技术人员应认识到，可在没有一个或多个特定细节的情况下或者用其他方法、部件、材料等的情况下实施申请人的组合物和/或方法。在其他实例中，未详细示出或描述公知的结构、材料或操作以避免混淆本公开的方面。
在本说明书和附随的权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确指出除外。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或测试中，但现在描述了优选的方法和材料。除了所公开的特定顺序外，可以逻辑上可能的任何顺序执行本文叙述的方法。
通过引用并入
本公开中已参考和引用了其他文件，如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网页内容。出于所有目的，所有这样的文件据此全文以引用方式并入本文。据称以引用方式并入本文但与本文明确阐述的现有定义、声明或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分仅在不使所并入的材料与本公开材料之间发生冲突的程度下并入。在发生冲突的情况下，以有利于本公开作为优选公开地解决冲突。
等同物
代表性实施例旨在帮助示意本发明，而不旨在也不应解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文示出和描述的那些外，根据本文件的全部内容，包括实施例及对本文包含的科学和专利文献的提及，本发明的各种修改及其许多其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。实施例含重要的附加信息、例证和指导，其可以其各种实施方案及其等同物适应于本发明的实施。

Claims (97)

1.一种适于容留液体样品以光学成像的样品室，其包含：
(a)用于将所述液体样品引入到所述样品室内以便观察或分析的入口；
(b)用于容留所述液体样品的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通并且包含一个或多个光学透明窗口以适于观察或分析所述成像室内的液体样品；以及
(c)与所述成像室流体连通以用于空气逸出或所述液体样品流出的出口，
其中所述成像室的特征在于以下一项或多项：
变化的室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述一个或多个光学透明窗口的至少一部分，
具有相对于所述成像室的焦平面一个或多个已知偏移的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，
具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，以及
所述限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
2.根据权利要求1所述的样品室，其中所述室高度的至少一部分是连续变化的。
3.根据权利要求1所述的样品室，其中所述室高度的至少一部分是逐步变化的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的样品室，其中所述室高度是同时连续变化的和逐步变化的。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的样品室，其中所述室高度在约1μm至约5,000μm的范围内变化。
6.根据权利要求2-4中任一项所述的样品室，其中所述室高度在约10μm至约500μm的范围内变化。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的样品室，其中所述限定特征中的至少一些是三维的，其由一个或多个限定特征高度表征。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的样品室，其中所有限定特征是三维的，其由一个或多个限定特征高度表征。
9.根据权利要求7或8所述的样品室，其中所述一个或多个限定特征高度是相同的。
10.根据权利要求7或8所述的样品室，其中所述一个或多个限定特征高度是不同的。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的样品室，其中所述一个或多个限定特征高度为约0.1μm至约5,000μm。
12.根据权利要求11所述的样品室，其中所述一个或多个限定特征高度为约1μm至约500μm。
13.根据权利要求12所述的样品室，其中所述一个或多个限定特征高度为约2μm至约200μm。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的样品室，其中具有一个或多个已知偏移的所述限定特征刻在所述成像室的底部上。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的样品室，其中具有一个或多个已知偏移的所述限定特征刻在所述成像室的顶部上。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的样品室，其中具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的所述限定特征刻在所述成像室的底部上。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的样品室，其中具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的所述限定特征刻在所述成像室的顶部上。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的样品室，其中所述限定特征包含多个粗糙特征和精细特征。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的样品室，其中所述限定特征表现出一个或多个预限定图案或几何形状。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的样品室，其中所述限定特征表现出一种或多种荧光颜色和/或一种或多种荧光强度。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的样品室，其中所述成像室配置成具有约0.1μL至约200μL的体积。
22.根据权利要求21所述的样品室，其中所述成像室配置成具有约4μL至约100μL的体积。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的样品室，其中所述成像室配备有单个光学透明窗口。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的样品室，其中所述成像室配备有两个或更多个光学透明窗口。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的样品室，其中所述成像室配备有三个、四个或五个光学透明窗口。
26.一种样品分析单元，其包含：
(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及
(ii)根据权利要求1-25中任一项所述的样品室，其设置在所述混合孔的空间附近。
27.一种样品分析单元，其包含：
(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及
(ii)适于容留液体样品以光学成像的第一样品室，其包含：
(a)用于将所述液体样品引入到所述第一样品室内以便观察或分析的第一入口；
(b)用于容留所述液体样品的第一成像室，其中所述第一成像室与所述第一入口流体连通并且包含第一或第一组光学透明窗口以适于观察或分析所述第一成像室内的液体样品；以及
(c)与所述第一成像室流体连通以用于空气逸出或所述液体样品的流出的第一出口，
其中所述第一成像室的特征在于以下一项或多项：
变化的第一室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第一或第一组光学透明窗口的至少一部分，
具有相对于所述第一成像室的焦平面一个或多个已知偏移的第一限定特征，其中所述特征经由所述第一或第一组光学透明窗口可光学得到，
具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第一限定特征，其中所述第一特征经由所述第一或第一组光学透明窗口可光学得到，以及
所述第一限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
28.根据权利要求27的样品分析单元，其进一步包含适于容留液体样品以光学成像的第二样品室，其包含：
(a)用于将所述液体样品引入到所述第二样品室内以便观察或分析的第二入口；
(b)用于容留所述液体样品的第二成像室，其中所述第二成像室与所述第二入口流体连通并且包含第二或第二组光学透明窗口以适于观察或分析所述第二成像室内的液体样品；以及
(c)与所述第二成像室流体连通以用于空气逸出或所述液体样品的流出的第二出口，
其中所述第二成像室的特征在于以下一项或多项：
变化的第二室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第二或第二组光学透明窗口的至少一部分，
具有相对于所述第二成像室的焦平面一个或多个已知偏移的第二限定特征，其中所述第二特征经由所述第二或第二组光学透明窗口可光学得到，
具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第二限定特征，其中所述第二特征经由所述第二或第二组光学透明窗口可光学得到，以及
所述第二限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
29.根据权利要求28所述的样品分析单元，其进一步包含适于容留液体样品以光学成像的第三样品室，其包含：
(a)用于将所述液体样品引入到所述第三样品室内以便观察或分析的第三入口；
(b)用于容留所述液体样品的第三成像室，其中所述第三成像室与所述第三入口流体连通并且包含第三或第三组光学透明窗口以适于观察或分析所述第三成像室内的液体样品；以及
(c)与所述第三成像室流体连通以用于空气逸出或所述液体样品的流出的第三出口，
其中所述第三成像室的特征在于以下一项或多项：
变化的第三室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第三或第三组光学透明窗口的至少一部分，
具有相对于所述第三成像室的焦平面一个或多个已知偏移的第三限定特征，其中所述第三特征经由所述第三或第三组光学透明窗口可光学得到，
具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第三限定特征，其中所述第三特征经由所述第三或第三组光学透明窗口可光学得到，以及
所述第三限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
30.根据权利要求29所述的样品分析单元，其进一步包含适于容留液体样品以光学成像的第四样品室，其包含：
(a)用于将所述液体样品引入到所述第四样品室内以便观察或分析的第四入口；
(b)用于容留所述液体样品的第四成像室，其中所述第四成像室与所述第四入口流体连通并且包含第四或第四组光学透明窗口以适于观察或分析所述第四成像室内的液体样品；以及
(c)与所述第四成像室流体连通以用于空气逸出或所述液体样品的流出的第四出口，
其中所述第四成像室的特征在于以下一项或多项：
变化的第四室高度，连续的或逐步的，其贯穿所述第四或第四组光学透明窗口的至少一部分，
具有相对于所述第四成像室的焦平面一个或多个已知偏移的第四限定特征，其中所述第四特征经由所述第四或第四组光学透明窗口可光学得到，
具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的第四限定特征，其中所述第四特征经由第四或第四组光学透明窗口可光学得到，以及
所述第四限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
31.根据权利要求30所述的样品分析单元，其进一步包含适于容留液体样品以光学成像的一个或多个附加样品室。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一、第二、第三和第四以及任何附加样品室共用相同的入口。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一、第二、第三、第四和任何附加成像室中的每一个的特征在于统一的室高度，而所述第一、第二、第三和第四成像室具有不同的室高度。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一、第二、第三、第四和任何附加成像室中的每一个的特征在于不统一的室高度。
35.根据权利要求27-34中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一、第二、第三、第四和任何附加成像室包含相同的限定特征。
36.根据权利要求27-34中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一、第二、第三、第四和任何附加成像室包含不同的限定特征。
37.根据权利要求27-36中任一项所述的样品分析单元，其中所述成像室中的每一个配置成具有约0.1μL至约200μL的体积。
38.根据权利要求37所述的样品分析单元，其中所述成像室中的每一个配置成具有约4μL至约100μL的体积。
39.根据权利要求27-38中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一或第一组光学透明窗口、所述第二或第二组光学透明窗口、所述第三或第三组光学透明窗口以及所述第四或第四组光学透明窗口中的每一个包含单个光学透明窗口。
40.根据权利要求27-38中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一或第一组光学透明窗口、所述第二或第二组光学透明窗口、所述第三或第三组光学透明窗口以及所述第四或第四组光学透明窗口中的每一个包含两个或更多个光学透明窗口。
41.根据权利要求27-38中任一项所述的样品分析单元，其中所述第一或第一组光学透明窗口、所述第二或第二组光学透明窗口、所述第三或第三组光学透明窗口以及所述第四或第四组光学透明窗口中的每一个包含三个、四个或五个光学透明窗口。
42.一种多孔板或装置，其包含权利要求26-41中任一项所述的样品分析单元。
43.一种多孔板，其包含多个样品分析单元，其中每个样品分析单元包含
(i)用于制备以便分析的液体样品的混合孔；以及
(ii)适于容留液体样品以光学成像的一个或多个样品室，每个样品室包含：
(a)用于将所述液体样品引入到所述样品室内以便观察或分析的入口；
(b)用于容留所述液体样品的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通并且包含一个或多个光学透明窗口以适于观察或分析所述成像室内的液体样品；以及
(c)与所述成像室流体连通以用于空气逸出或所述液体样品的流出的出口，
其中所述成像室的特征在于：
具有相对于所述成像室的焦平面一个或多个已知偏移的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，和/或
具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征，其中所述特征经由所述一个或多个光学透明窗口可光学得到，
其中所述限定特征表现出一种或多种强度的一种或多种荧光颜色。
44.根据权利要求43所述的多孔板，其包含2个或更多个样品分析单元。
45.根据权利要求44所述的多孔板，其包含6个或更多个样品分析单元。
46.根据权利要求45所述的多孔板，其包含10个或更多个样品分析单元。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的多孔板，其中所述样品分析单元中的每一个包含2个或更多个样品室。
48.根据权利要求47所述的多孔板，其中所述样品分析单元种的每一个包含3个或更多个样品室。
49.根据权利要求48所述的多孔板，其中所述样品分析单元中的每一个包含4个或更多个样品室。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的多孔板，其中所述限定特征是相同的。
51.根据权利要求43-50中任一项所述的多孔板，其中所述成像室中的每一个配置成具有约0.1μL至约200μL的体积。
52.根据权利要求51所述的多孔板，其中所述成像室中的每一个配置成具有约4μL至约100μL的体积。
53.根据权利要求43-52中任一项所述的多孔板，其中所述成像室配备有单个光学透明窗口。
54.根据权利要求43-52中任一项所述的多孔板，其中所述成像室配备有两个或更多个光学透明窗口。
55.根据权利要求43-52中任一项所述的多孔板，其中所述成像室配备有三个、四个或五个光学透明窗口。
56.一种用于分析生物样品的系统，其包含样品分析单元或根据权利要求43-55中任一项所述的多孔板。
57.根据权利要求56所述的系统，其进一步包含：
至少一个荧光光源；
至少一个明场光源；
至少一个光学系统，以使所述荧光光束和/或所述明场光束的光束变窄；以及
检测装置。
58.根据权利要求57所述的系统，其进一步包含：
计算单元。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的系统，其包含两个或更多个荧光光源。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的系统，其包含两个或更多个明场光源。
61.一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法，其包括：
手动或自动调节焦点位置，直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；
根据所述限定特征记录最佳焦点位置；
手动或自动地将焦点调节到样品的尝试的细胞焦点位置，在所述位置处假定细胞处于用于细胞计数的最佳焦点；
根据所述样品记录尝试的细胞焦点位置；
执行用于细胞计数测量的图像采集；
根据所述限定特征和根据所述样品比较记录的焦点位置；以及
确定两个记录的焦点位置之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞计数测量。
62.根据权利要求61所述的方法，在拒绝所述细胞计数测量的情况下，其进一步包括：
手动或自动地将所述焦点调节到所述样品的新尝试的细胞焦点位置，在所述位置处假定细胞处于用于细胞计数的最佳焦点；
根据所述样品记录新尝试的细胞焦点位置；
执行用于细胞计数测量的图像采集；
根据所述限定特征和根据所述样品比较记录的焦点位置；以及
确定两个记录的焦点位置之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞计数测量：以及
根据需要重复焦点调节以产生可接受的焦点位置。
63.一种用于获得用于细胞计数分析的成像系统的焦点设置的方法，其包括：
手动或自动调节焦点位置，直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；
通过与所述一个或多个限定特征的焦点位置的预限定偏移手动或自动调节所述焦点位置；以及
执行细胞计数测量的图像采集。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中在每种情况下手动调节所述焦点位置。
65.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中在每种情况下自动调节所述焦点位置。
66.一种用于校准用于细胞计数分析的成像系统的细胞尺寸测量的方法，其包括：
测量样品中细胞的尺寸；
测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；
比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；
基于所述特征的已知尺寸和测量尺寸的比较确定校准因子；
在细胞尺寸测定中应用所述校准因子；以及
报告细胞尺寸测量的调节值。
67.一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的细胞尺寸测量的方法，其包括：
测量样品中细胞的尺寸；
测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；
比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；以及
确定所述特征的测量尺寸与其已知尺寸之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞尺寸测量。
68.根据权利要求67所述的方法，在拒绝所述细胞尺寸测量的情况下，其进一步包括：
手动或自动调节一个或多个仪器设置；
测量样品中细胞的尺寸；
测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；
比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；
确定所述特征的测量尺寸与其已知尺寸之间的差异是否可接受，以确认或拒绝所述细胞尺寸测量；以及
重复这些步骤直到获得可接受的尺寸测量。
69.一种用于同时评估用于细胞计数分析的成像系统的焦点和细胞尺寸测量的方法，其包括：
手动或自动调节焦点位置，直到所述成像室的一个或多个限定特征出现在最佳焦点中；
测量样品中细胞的尺寸；
测量成像室的一个或多个具有已知尺寸的限定特征的尺寸；
比较限定特征的测量尺寸与其已知尺寸；
确定两次测量之间的差异是否可接受，以确认或拒绝焦点和细胞尺寸测量的设置；以及
重复这些步骤直到获得可接受的尺寸测量。
70.一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于评估样品对于细胞计数分析的适用性的方法，其包括：
在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；
记录所述样品在多个室高度处的细胞计数，和
比较记录的细胞计数以确定它们是否与室高度成比例，以确认或拒绝所述细胞计数测量。
71.一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法，其包括：
在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；
记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数，以及
分析记录的细胞计数测量以确定细胞计数测量与室高度成比例的室高度，以确认相应的细胞计数测量。
72.一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法，其包括：
在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；
记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数，以及
分析记录的细胞计数测量以确定细胞计数测量与室高度成比例的细胞计数范围，以确认相应的细胞计数测量。
73.一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法，其包括：
在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；
记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数；
分析记录的细胞计数测量以确定哪些测量与已知的室高度成比例；以及
确认与室高度充分成比例的细胞计数测量，并拒绝那些不成比例的细胞计数测量。
74.一种在不稀释或浓缩样品的情况下用于细胞计数测量和分析的方法，其包括：
在具有多个室高度的一个或多个样品室中提供样品；
记录所述样品在所述多个室高度处的细胞计数，以及
基于计数与已知的室高度的期望值的匹配程度对所获得的细胞计数测量进行评分；以及
确认符合预定规格的那些测量并拒绝不符合预定规格的那些测量。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的方法，其进一步包括丢弃在细胞计数测量与室高度不成比例的室高度处记录的细胞计数测量。
76.根据权利要求71-75中任一项所述的方法，其进一步包括基于所述比例结果生成用于所述细胞计数测量的一个或多个质量分值。
77.一种用于校准用于细胞计数分析的成像系统的荧光测量的方法，其包括：
测量样品中细胞的荧光；
测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；
比较限定特征的测量荧光与其已知荧光；
基于限定特征的测量荧光与其已知荧光的比较确定校准因子；
在细胞的荧光测量中应用校准因子；以及
报告荧光测量的调节值。
78.一种用于评估用于细胞计数分析的成像系统的荧光测量的方法，其包括：
测量样品中细胞的荧光；
测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；以及
比较限定特征的测量荧光与其已知荧光，以确认或拒绝所述荧光测量。
79.根据权利要求78所述的方法，在拒绝所述荧光测量的情况下，其进一步包括：
手动或自动调节一个或多个仪器设置；
测量样品中细胞的荧光；
测量成像室的一个或多个具有已知荧光的限定特征的荧光；
比较限定特征的测量荧光与限定特征的已知荧光，以确认或拒绝所述荧光测量；以及
重复这些步骤直到所述限定特征的荧光测量可接受。
80.一种用于校准和/或评估细胞计数分析的方法，其包括根据权利要求61-79中的一项或多项执行校准或测量保证。
81.根据权利要求61-80中任一项所述的方法，其中所述一个或多个限定特征中的至少一些是三维的，并且由一个或多个限定特征高度表征。
82.根据权利要求61-80中任一项所述的方法，其中所有所述限定特征是三维的，并且由一个或多个限定特征高度表征。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述一个或多个限定特征高度是相同的。
84.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述一个或多个限定特征高度是不同的。
85.根据权利要求61-84中任一项所述的方法，其中所述一个或多个限定特征高度为约0.1μm至约5,000μm的范围。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述一个或多个限定特征高度为约1μm至约500μm的范围。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述一个或多个限定特征高度为约2μm至约200μm的范围。
88.根据权利要求61-87中任一项所述的方法，其中所述限定特征刻在所述成像室的底部上。
89.根据权利要求61-88中任一项所述的方法，其中具有一个或多个已知偏移的限定特征刻在所述成像室的顶部上。
90.根据权利要求61-89中任一项所述的方法，其中具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征刻在所述成像室的底部上。
91.根据权利要求61-89中任一项所述的方法，其中具有一个或多个已知尺寸、面积或体积的限定特征刻在所述成像室的顶部上。
92.根据权利要求61-91中任一项所述的方法，其中所述限定特征包含多个粗糙特征和精细特征。
93.根据权利要求61-92中任一项所述的方法，其中所述限定特征表现出一个或多个预限定图案或几何形状。
94.根据权利要求61-93中任一项所述的方法，其中所述限定特征表现出一种或多种荧光颜色和/或荧光强度水平。
95.根据权利要求61-94中任一项所述的方法，其中所述成像室配置成具有约0.1μL至约200μL的体积。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述成像室配置成具有约4μL至约100μL的体积。
97.一种用于细胞计数测量的方法，其使用根据权利要求1-25中任一项所述的样品室、根据权利要求26-41中任一项所述的样品分析单元、根据权利要求42-55中任一项所述的多孔板、或根据权利要求56-60中任一项所述的用于分析生物样品的系统。
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