CN114646701A - 一种l-脯胺酰胺中有关物质的hplc测试方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种L‑脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，属于柱色谱法测试或分析材料技术领域。L‑脯氨酰胺有关物质是指在L‑脯氨酰胺合成工艺中引入的或降解生成的杂质，流动相是由辛烷磺酸钠、二水合磷酸二氢钠加水溶解后，再加入乙腈混匀得到的溶液，采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂进行色谱柱分离，流动相作为溶剂，对杂质进行等度洗脱。将本申请应用于L‑脯氨酰胺有关物质的杂质测定，具有色谱条件系统稳定，线性好，精密度高，色谱条件灵敏度高，专属性好，测定溶液35h内稳定等优点。

Description

一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法

技术领域

本申请涉及一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，属于柱色谱法测试或分析材料技术领域。

背景技术

L-脯氨酰胺是一种重要的光学活性吡咯衍生物，是降糖药物维格列汀(Vildagliptin)的重要手性中间体。L-脯氨酰胺分子式为C₅H₁₀N_2O的结构式如式(1)所示：

在合成该化合物的过程中，可能引入的杂质主要有L-脯氨酸、脯氨酸双聚体、L-羟脯氨酸、异构体D-脯氨酰胺等，异构体D-脯氨酰胺可以手性色谱柱进行有效检测，而L-脯氨酰胺及杂质L-脯氨酸、脯氨酸双聚体、L-羟脯氨酸结构无共轭体系，紫外吸收较弱，用常规的HPLC反相色谱分析方法检测其保留时间短、响应值小，无法有效检测，杂质结构式分别如式(2)所示：

L-脯氨酰胺作为维格列汀手性中间体，其纯度及杂质的有效检测对后续的维格列汀合成工艺中质量控制具有重要的现实意义，因此亟待开发出一种简单、准确测定L-脯氨酰胺中的有关物质的方法。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，通过加入一定量的离子对试剂并调节流动相pH，以测定L-脯氨酰胺中有关物质的反相离子对色谱分析方法，使L-脯氨酰胺及其有关物质保留时间增加、响应增强，达到有效分离与检测。

具体地，本申请是通过以下方案实现的：

一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，L-脯氨酰胺有关物质是指在L-脯氨酰胺合成工艺中引入的或降解生成的杂质，测试包括以下两部分：

(1)流动相配制：流动相是由辛烷磺酸钠、二水合磷酸二氢钠加水溶解后，再加入乙腈混匀得到的溶液，辛烷磺酸钠浓度为0.02～0.03mol/L，二水合磷酸二氢钠浓度为0.005～0.015mol/L，乙腈添加体积为流动相总体积的10％～20％，流动相pH值为2.5～3.5，

(2)洗脱分离：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂进行色谱柱分离，色谱条件：流速为0.4～0.6mL/min，柱温为25～35℃，检测波长为190-400nm，步骤(1)的流动相作为溶剂，对杂质进行等度洗脱。

本申请采用高效液相色谱法，利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱实施分离，利用UV检测器进行定量分析，流动相为溶剂进行等度洗脱。十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂赋予色谱柱良好的耐酸性，再以一定比例辛烷磺酸钠、二水合磷酸二氢钠缓冲盐-有机相为流动相进行等度洗脱，定量检测L-脯氨酰胺及其有关物质的含量，从而有效控制L-脯氨酰胺的质量，具有简单、灵敏、准确可靠、重现性好等优点。

进一步的，作为优选：

所述杂质包括L-脯氨酸、环(脯氨酸-脯氨酸)二肽(即脯氨酸双聚体)、L-羟脯氨酸中至少一种，针对不宜测定的杂质，实现高精、灵敏的测定。

所述L-羟脯氨酸线性范围为1.00575～160.92μg/ml，线性方程为y＝0.9861x-0.5863，R²＝1.0000；L-脯氨酸线性范围为1.0015～160.2400μg/ml，线性方程为y＝1.1214x-0.2115，R²＝1.0000；环(脯氨酸-脯氨酸)二肽线性范围为0.0501～40.0800μg/ml，线性方程为y＝67.5073x+1.1843，R²＝1.0000。

所述流动相包含有0.026mol/L的辛烷磺酸钠、0.011mol/L的二水合磷酸二氢钠和流动相总体积15％的乙腈，由此实现最佳流动相的配制。

所述流动相的pH为3.0。更优选的，所述流动相的pH采用磷酸调节。

所述十八烷基硅烷键合硅胶的填充长度为250mm，内径为4.6mm，填料粒径5μm。

所述柱温为28～32℃，该温度阶段中，回收率均在80％～120％之间，回收率的RSD值不大于10.0％，本方法准确度高。

所述色谱条件中，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，吸收波长为200nm，在该色谱条件下，所有的杂质峰有效分离，主峰与相邻杂质峰完全分离。

方法学验证结果表明，本申请所述测试方法色谱条件系统稳定，线性好，精密度高，色谱条件灵敏度高，专属性好，测定溶液35h内稳定，耐用性试验结果显示流速、柱温、pH和流动相比例的微小变化不影响L-脯氨酰胺有关物质的测定。

附图说明

图1为本申请实施例1中L-脯氨酰胺最大吸收波长扫描HPLC检测图谱；

图2为本申请实施例1中L-羟脯氨酸最大吸收波长扫描HPLC检测图谱；

图3为本申请实施例1中脯氨酸双聚体最大吸收波长扫描HPLC检测图谱；

图4为本申请实施例1中L-脯氨酸最大吸收波长扫描HPLC检测图谱；

图5为实施例1系统适用性试验中供试品溶液的HPLC检测图谱；

图6为实施例1系统适用性试验中系统适用性溶液的HPLC检测图谱；

图7为实施例2系统适用性溶液的HPLC检测图谱；

图8为实施例3系统适用性溶液的HPLC检测图谱；

图9为实施例4系统适用性溶液的HPLC检测图谱；

图10为实施例5系统适用性溶液的HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但不限于本实施的范围。在以下各实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂未标明来源和规格的均为市售分析纯或色谱纯。

实施例1

(1)仪器与试剂

①仪器：采用高效液相色谱法，安捷伦1260；电子天平，梅特勒XSR 105；pH计，梅特勒FE28。

②试剂：辛烷磺酸钠(色谱纯)，Scharlau；二水合磷酸二氢钠(分析纯)，国药集团；乙腈(色谱纯)；磷酸(分析纯)，国药集团。

③色谱条件：色谱柱Agilent TC-C18(2)，5μm；4.6×250mm，流速0.5ml/min；检测波长200nm；进样量10μL；柱温30℃。

④流动相：称取辛烷磺酸钠5.13g，二水合磷酸二氢钠1.48g，加水850ml溶解，加入150ml乙腈混匀后，用磷酸调节pH值至3.0。

⑤溶剂：流动相。

(2)各溶剂的配制

①各杂质定位溶液：分别称取杂质L-羟脯氨酸、L-脯氨酸、脯氨酸双聚体适量，配制为0.5mg/ml溶液。

②系统适用性溶液：分别称取L-脯氨酰胺、杂质L-羟脯氨酸、L-脯氨酸、脯氨酸双聚体适量配制为L-脯氨酰胺4mg/ml，杂质0.02mg/ml溶液。

③供试品溶液：称取供试品制成4mg/ml的溶液。

④对照溶液：精密移取1.0ml供试品溶液至100ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.04mg的溶液。

(3)最大吸收波长扫描

精密量取样品以及各杂质溶液10μl注入液相色谱仪，进行峰纯度扫描，在190-400nm波长确定各杂质最大吸收波长，结果见图1、图2、图3、图4。

L-脯氨酸、L-羟脯氨酸及脯氨酸双聚体均在末端有吸收，无其他明显的最大特征吸收峰，由于选定检测波长过低，基线波动较大会影响检测结果，因此选定本品的有关物质检测波长为200nm。

(4)系统适用性试验

分别取取供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液、各杂质定位溶液及盐溶液10μl注入液相色谱仪，进行分离度考察。结果如下表1和图5～图6，Cl-峰、SO₂-峰、L-羟脯氨酸、L-脯氨酸、脯氨酸双聚体与L-脯胺酰胺分离良好。

表1：系统适用性试验结果

(5)线性及范围

为准确测定本品及各杂质，进行线性考察，即设计各物质在一定范围内峰面积与浓度之间的关系，各线性浓度均从定量限浓度开始试验，具体如下：取L-脯氨酰胺及各杂质线性溶液进样分析，绘制L-脯胺酰胺及L-羟脯氨酸、L-脯氨酸、脯氨酸双聚体的回归方程。

结果显示，L-羟脯氨酸在1.00575～160.92μg/ml的浓度范围标准曲线方程为y＝0.9861x-0.5863，R²＝1.0000；L-脯氨酸在1.0015～160.2400μg/ml的浓度范围标准曲线方程为y＝1.1214x-0.2115，R²＝1.0000；脯氨酸双聚体在0.0501～40.0800μg/ml(0.25％～200％)的浓度范围标准曲线方程为y＝67.5073x+1.1843，R²＝1.0000；L-脯氨酰胺在0.5030～40.2400μg/ml(2.5％～200％)的浓度范围标准曲线方程为y＝12.1167x+2.9260，R²＝1.0000。

(6)准确度、精密度实验

①回收率溶液配制：精密移取8000μg/ml供试品储备液10ml、分别精密移取200μg/ml脯氨酸双聚体杂质储备液、400μg/mlL-羟脯氨酸杂质储备液和800μg/ml L-羟脯氨酸杂质储备各1.0ml、2.0ml、4.0ml至20ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，配制50％、100％、200％回收率溶液。

②对照品溶液：移取杂质储备液各1.0ml至10ml容量瓶中，用溶剂稀释定容至刻度。

③取供试品、对照品溶液及回收率溶液进样，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法及外标法计算各杂质的回收率，回收率均在80％～120％之间，回收率的RSD值不大于10.0％，本方法准确度高。

④取50％、100％、200％回收率溶液图谱，计算各杂质50％、100％、200％回收率溶液单位浓度峰面积，回收率溶液单位浓度峰面积的RSD值均不大于10.0％，本方法精密度良好。

(7)稳定性

取系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液，在室温条件放置0、5、10、15、25、35小时，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。35小时内L-脯氨酰胺及各杂质峰面积RSD值不大于10％。各溶液在35小时内稳定。

实施例2

本实施例色谱条件：流速0.4ml/min，其他色谱条件与实施例1相同。

取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

系统适用性溶液有关物质检测结果见表2，所得HPLC图谱见图7，通过表2可以看出，所有的杂质峰有效分离，主峰与相邻杂质峰完全分离。

表2：系统适用性溶液有关物质检测结果

杂质名称	保留时间(min)	分离度	理论塔板数
				L-羟脯氨酸	8.292	1.7	28718
L-脯氨酸	9.665	1.96	17762
				脯氨酸双聚体	11.089	4.96	23867
L-脯氨酰胺	28.625	16.4	17367

实施例3

本实施例色谱条件：流速0.6ml/min，其他色谱条件与实施例1相同。

取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

系统适用性溶液有关物质检测结果见表3，所得HPLC图谱见图8，通过表3可以看出，所有的杂质峰有效分离，主峰与相邻杂质峰完全分离。

表3：系统适用性溶液有关物质检测结果

杂质名称	保留时间(min)	分离度	理论塔板数
				L-羟脯氨酸	5.502	1.71	22619
L-脯氨酸	6.407	1.91	18082
				脯氨酸双聚体	7.384	5	21316
L-脯氨酰胺	18.907	16.96	18078

实施例4

本实施例色谱条件：柱温28℃，其他色谱条件与实施例1相同。

取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

系统适用性溶液有关物质检测结果见表4，所得HPLC图谱见图9，通过表4可以看出，所有的杂质峰有效分离，主峰与相邻杂质峰完全分离。

表4：系统适用性溶液有关物质检测结果

实施例5

本实施例色谱条件：柱温32℃，其他色谱条件与实施例1相同。

取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

系统适用性溶液有关物质检测结果见表5，所得HPLC图谱见图10，通过表5可以看出，所有的杂质峰有效分离，主峰与相邻杂质峰完全分离。

表5：系统适用性溶液有关物质检测结果

柱温28℃	保留时间(min)	分离度	理论塔板数
				L-羟脯氨酸	6.571	1.96	23814
L-脯氨酸	7.598	1.64	19103
				脯氨酸双聚体	8.821	5.42	23261
L-脯氨酰胺	22.117	17.39	17649

结合上述实验、附图以及表1-5可以看出：包含有0.02～0.03mol/L辛烷磺酸钠、0.005～0.015mol/L二水合磷酸二氢钠以及10％～20％乙腈、pH值为2.5～3.5的流动相，在以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂进行色谱柱分离时，可以实现多种杂质较长时间的保留时长，响应度高，能够实现杂质的专属性有效分离与响应，回收率均在80％～120％之间，回收率的RSD值不大于10.0％。

Claims (9)

1.一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于，L-脯氨酰胺有关物质是指在L-脯氨酰胺合成工艺中引入的或降解生成的杂质，测试包括以下两部分：

（1）流动相配制：流动相是由辛烷磺酸钠、二水合磷酸二氢钠加水溶解后，再加入乙腈混匀得到的溶液，辛烷磺酸钠浓度为0.02～0.03mol/L，二水合磷酸二氢钠浓度为0.005～0.015mol/L，乙腈占流动相总体积的10%～20%，流动相pH值为2.5～3.5，

（2）洗脱分离：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂进行色谱柱分离，色谱条件：流速为0.4～0.6mL/min，柱温为25～35℃，检测波长为190-400nm，步骤（1）的流动相作为溶剂，对杂质进行等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：所述杂质包括L-脯氨酸、环（脯氨酸-脯氨酸）二肽、L-羟脯氨酸中至少一种。

3.根据权利要求2所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：分别以L-脯胺酰胺及其杂质对照品溶液浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，L-羟脯氨酸线性范围为1.00575~160.92μg/m，线性方程为y=0.9861x-0.5863，R²=1.0000；L-脯氨酸线性范围为1.0015~160.2400μg/ml，线性方程为y=1.1214x-0.2115，R²=1.0000；环（脯氨酸-脯氨酸）二肽线性范围为0.0501~40.0800μg/ml，线性方程为y=67.5073x+1.1843，R²=1.0000。

4.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：所述流动相包含有0.026mol/L的辛烷磺酸钠、0.011mol/L的二水合磷酸二氢钠和流动相总体积15%的乙腈。

5.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：所述流动相的pH为3.0。

6.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：所述流动相的pH采用磷酸调节。

7.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：十八烷基硅烷键合硅胶的填充长度为250mm，内径为4.6mm，填料粒径5μm。

8.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：所述柱温为28~32℃。

9.根据权利要求1所述的一种L-脯胺酰胺中有关物质的HPLC测试方法，其特征在于：色谱条件中，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，吸收波长为200nm。

Images