CN114502164B - 杂环化合物及其盐的应用 - Google Patents

Abstract

式A所示杂环化合物、水合物、其药学上可接受的碱金属盐或者所述碱金属盐的水合物在制备治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征药物中的用途。实验结果表明，上述化合物通过抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞向肺部的渗透，降低肺血管通透性，减少促炎性细胞因子和细胞因子趋化因子的产生和促进IL‑10的产生，极大地缓解了由香烟烟雾CS诱导或LPS诱导的急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。

Description

杂环化合物及其盐的应用

本申请要求2019年5月22日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为201910431026.4，发明名称为“杂环化合物及其盐的应用”在先申请的优先权。该申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及到杂环化合物及其盐的应用。

背景技术

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是指心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。自1967年Ashbaugh等报道成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)以来，引起了国内外广大学者的极大兴趣，并做了大量临床与实验研究工作。我国先后召开了ALI/ARDS专题研讨会，主要就ALI/ARDS定义、发病机制、诊断标准和治疗作了深入的探讨。对ALI/ARDS的认识有了明显提高，表现在对ALI/ARDS的命名、定义逐渐规范，对其发病机制有了较为深刻的认识，提出了便于临床使用的ALI/ARDS诊断标准，积累了一些较为成熟的治疗经验和措施，使ALI/ARDS的发病率和病死率均有下降趋势。但我们必须清楚地认识到，ALI/ARDS的病因及发病机制错综复杂，致病环节多，目前尚缺乏针对发病机制的有效治疗措施，ALI/ARDS的病死率仍较高。因此有必要开发可以治疗ALI/ARDS的药物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

式A所示杂环化合物、其药学上可接受的盐或其水合物中的至少一种在制备治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征药物中的用途，

根据本发明的实施方案，所述急性肺损伤选自香烟烟雾(cigarette smoke，CS)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤。

根据本发明的技术方案，所述式A所示杂环化合物药学上可接受的盐选自碱金属盐。

根据本发明的技术方案，所述水合物选自式A所示杂环化合物的水合物，或式A所示杂环化合物碱金属盐的水合物。

根据本发明的优选技术方案，所述式A所示杂环化合物或其药学上可接受的盐为结晶形式，如式A所示杂环化合物的晶型、其水合物的晶型、其药学上可接受的碱金属盐的晶型或者所述碱金属盐水合物的晶型。

根据本发明的实施方案，式A所示杂环化合物或其水合物的晶型使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.1±0.2°、11.4±0.2°、17.9±0.2°、22.6±0.2°、24.4±0.2°处具有特征峰。

优选地，所述晶型使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在8.6±0.2°、11.1±0.2°、11.4±0.2°、14.1±0.2°、16.1±0.2°、17.9±0.2°、20.9±0.2°、22.6±0.2°、24.4±0.2°、25.8±0.2°处具有特征峰。

还优选地，所述晶型使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在8.6±0.2°、11.1±0.2°、11.4±0.2°、14.1±0.2°、15.6±0.2°、16.1±0.2°、17.9±0.2°、18.3±0.2°、20.9±0.2°、22.6±0.2°、24.4±0.2°、25.8±0.2°、26.5±0.2°、28.9±0.2°处具有特征峰。

进一步优选地，所述晶型具有基本上如图1所示的X射线粉末衍射谱图。

更优选地，所述晶型具有基本如图2所示的DSC-TGA谱图。

根据本发明，式A所示杂环化合物水合物的晶型优选为一水合物。更优选，所述水合物中水的质量分数为4.2-5.2％，更优选为4.5～5.0％。

所述一水合物如下所示：

还更优选地，所述晶型为单晶，具有下述的单晶参数：

本发明还提供式A所示杂环化合物或其水合物的晶型的制备方法，包括如下步骤：

将式A所示化合物置于酮类溶剂和水构成的混合溶剂中，加热溶解后降温，搅拌析晶得到式A所示杂环化合物或其水合物的晶型，

本发明中式A所示杂环化合物的制备可参考专利文献CN101896178B中实施例3和4所记载的方法制备。例如将式A所示杂环化合物消旋体在Chiralcel OJ-RH柱(ChiralcelTechnologies)上用含0.05％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，分离得到式A所示杂环化合物。

根据本发明的制备方法，所述酮类溶剂选自丙酮或甲乙酮。

根据本发明的制备方法，所述酮类溶剂与水的体积比为(1-3)∶1，例如为1∶1。

根据本发明的制备方法，所述加热的温度为30～80℃，优选为40～60℃。

根据本发明的实施方案，所述式A所示杂环化合物药学上可接受的碱金属盐优选为钠盐、锂盐或钾盐；所述碱金属盐的水合物选自钠盐、锂盐或钾盐的水合物。

优选地，所述式A化合物碱金属盐的晶型为水合物形式。

根据本发明，所述式A化合物碱金属盐的结晶水合物优选为一水合物。

作为实例，所述式A化合物碱金属盐的结晶水合物选自如下式A-N、A-L或A-K所示的化合物：

优选地，式A-N所示的化合物为结晶水合物，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在16.4±0.2°、18.9±0.2°、21.7±0.2°、24.0±0.2°处具有特征峰。

优选地，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.8±0.2°、16.4±0.2°、16.7±0.2°、16.9±0.2°、17.1±0.2°、17.8±0.2°、18.6±0.2°、18.9±0.2°、21.7±0.2°、23.7±0.2°、24.0±0.2°处具有特征峰。

还优选地，所述结晶水合物使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在5.6±0.2°、11.8±0.2°、14.0±0.2°、15.8±0.2°、16.4±0.2°、16.7±0.2°、16.9±0.2°、17.1±0.2°、17.8±0.2°、18.6±0.2°、18.9±0.2°、20.3±0.2°、21.7±0.2°、23.7±0.2°、24.0±0.2°、26.1±0.2°、28.1±0.2°、28.5±0.2°、29.8±0.2°处具有特征峰。

进一步优选地，所述结晶水合物具有基本上如图4所示的X射线粉末衍射谱图(XRPD)。

优选地，所述式A-N所示化合物的结晶水合物中水的质量分数为3.4～4.4％，更优选为3.6～4.2％。

更优选地，所述式A-N所示化合物的结晶水合物具有基本如图5所示的DSC-TGA谱图。

根据本发明，式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在15.6±0.2°、21.4±0.2°、24.0±0.2°处具有特征峰。

优选地，式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.7±0.2°、15.6±0.2°、16.6±0.2°、17.9±0.2°、18.5±0.2°、21.4±0.2°、24.0±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰。

优选地，式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.7±0.2°、15.6±0.2°、15.9±0.2°、16.6±0.2°、17.4±0.2°、17.9±0.2°、18.5±0.2°、21.4±0.2°、23.5±0.2°、24.0±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰。

还优选地，所述式A-K所示化合物的结晶水合物使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.7±0.2°、14.0±0.2°、15.6±0.2°、15.9±0.2°、16.6±0.2°、17.4±0.2°、17.9±0.2°、18.5±0.2°、20.1±0.2°、21.4±0.2°、23.5±0.2°、24.0±0.2°、27.5±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°、28.6±0.2°、29.3±0.2°、29.6±0.2°处具有特征峰。

进一步优选地，所述式A-K所示化合物的结晶水合物具有基本上如图6所示的X射线粉末衍射谱图。

优选地，所述式A-K所示化合物的结晶水合物中水的质量分数为3.3～4.3％，更优选为3.5～4.1％。

进一步优选地，所述式A-K所示化合物的结晶水合物具有基本上如图7所示的DSC-TGA谱图。

根据本发明，式A-L所示的锂盐化合物为结晶水合物，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在16.7±0.2°、18.8±0.2°、21.9±0.2°、23.9±0.2°处具有特征峰。

还优选地，所述式A-L所示化合物的结晶水合物使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在5.6±0.2°、8.8±0.2°、11.8±0.2°、14.0±0.2°、16.3±0.2°、16.7±0.2°、16.9±0.2°、17.0±0.2°、17.7±0.2°、18.5±0.2°、18.8±0.2°、21.9±0.2°、23.9±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰。

进一步优选地，所述式A-L所示化合物的结晶水合物具有基本上如图8所示的X射线粉末衍射谱图。

优选地，所述式A-L所示化合物的结晶水合物中水的质量分数为3.6～4.6％，更优选为3.9～4.5％。

更优选地，所述式A-L所示化合物的结晶水合物具有基本如图9所示的DSC-TGA谱图。

本发明还提供式A所示杂环化合物药学上可接受的盐或者所述盐的水合物的制备方法，包括如下步骤：

将式A所示化合物溶于酮类溶剂中，向酮类溶剂中加入碱金属氢氧化物的水溶液进行反应，过滤干燥即得；其中所述碱金属氢氧化物优选为氢氧化钠、氢氧化锂或氢氧化钾。

本发明中式A所示杂环化合物的制备可参考专利文献CN101896178B中实施例3和4所记载的方法制备。例如将式A所示杂环化合物消旋体在Chiralcel OJ-RH柱(ChiralcelTechnologies)上用含0.05％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，分离得到式A所示杂环化合物。

本发明式A所示杂环化合物、药学上可接受的盐、水合物及其制备以及性能相关数据可以参考申请号为201910024238.0，申请日为2019年1月10日的发明专利申请，其全文引入本文作为参考。

本发明式A所示杂环化合物、药学上可接受的盐、水合物的制备以及性能数据可以参考申请号为201910024247.X，申请日为2019年1月10日的发明专利申请，其全文引入本文作为参考。

本发明还提供一种用于治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的药物组合物，其包括治疗有效量的本发明所述的式A所示杂环化合物、其药学上可接受的盐或其水合物。

根据本发明的实施方案，所述急性肺损伤选自香烟烟雾CS或脂多糖LPS诱导的急性肺损伤。

根据本发明的技术方案，所述式A所示杂环化合物药学上可接受的盐选自碱金属盐。

根据本发明的技术方案，所述水合物选自式A所示杂环化合物的水合物，或式A所示杂环化合物碱金属盐的水合物。

根据本发明的优选技术方案，所述式A所示杂环化合物或其药学上可接受的盐为结晶形式，例如选自式A所示杂环化合物的晶型、其水合物的晶型、其药学上可接受的碱金属盐的晶型或者所述碱金属盐水合物的晶型中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的辅料。所述辅料可以为惰性的、无毒的赋形剂、载体或稀释剂，例如所述辅料选自下列中的一种、两种或多种：崩解剂、助流剂、润滑剂、填充剂、粘合剂、着色剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂、包衣材料等。

本发明还提供一种治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的方法，该方法包括向需要此治疗的哺乳动物患者施用有效治疗量的上述式A所示杂环化合物、其药学上可接受的盐或其水合物。

本发明还提供一种治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的方法，该方法包括向需要此治疗的哺乳动物患者施用有效治疗量的上述药物组合物。

根据本发明的实施方案，所述急性肺损伤选自CS或LPS诱导的急性肺损伤。

根据本发明的技术方案，所述式A所示杂环化合物药学上可接受的盐选自碱金属盐。

根据本发明的技术方案，所述水合物选自式A所示杂环化合物的水合物，或式A所示杂环化合物碱金属盐的水合物。

根据本发明的优选技术方案，所述式A所示杂环化合物或其药学上可接受的盐为结晶形式，例如选自式A所示杂环化合物的晶型、其水合物的晶型、其药学上可接受的碱金属盐的晶型或者所述碱金属盐水合物的晶型中的至少一种。

有益效果

本发明提供式A所示杂环化合物、水合物、其药学上可接受的碱金属盐或者所述碱金属盐的水合物在制备治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征药物中的用途。实验结果表明，上述化合物通过抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞向肺部的渗透，降低肺血管通透性，减少促炎性细胞因子和细胞因子趋化因子的产生和促进IL-10的产生，极大地缓解了由香烟烟雾CS诱导或LPS诱导的急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征，并且由于所述化合物可中止或减缓炎症性肺损伤、减轻肺水肿、保证组织供氧，表明其对于急性呼吸窘迫综合症具有较好的治疗或缓解作用。

附图说明

图1为制备例2所得晶型的XRPD谱图。

图2为制备例2所得晶型的DSC-TGA谱图。

图3为制备例2所得晶型的三维结构图和晶胞图。

图4为制备例3所得钠盐水合物的XRPD谱图。

图5为制备例3所得钠盐水合物的DSC-TGA谱图。

图6为制备例4所得钾盐水合物的XRPD谱图。

图7为制备例4所得钾盐水合物的DSC-TGA谱图。

图8为制备例5所得锂盐水合物的XRPD谱图。

图9为制备例5所得锂盐水合物的DSC-TGA谱图。

图10为CT-NA对BALF中炎症细胞数量，氧分压(PO₂)，肺重量系数和BALF中白蛋白含量的影响。

小鼠连续七天在暴露于CS前1小时灌胃给予CT-NA(10和30mg/kg)、生理盐水、Dex(1mg/kg)。BALF是在最后一次CS暴露后24小时收集。

(A)收集的BALF中的嗜中性粒细胞(黑色箭头)和巨噬细胞(灰色箭头)的图像。

(B)BALF中所有细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞的浸润特征(从左到右分别为载体生理盐水组、载体CS暴露组CT-NA 10mg/kgCS暴露组、CT-NA 30mg/kgCS暴露组及地塞米松(Dex)1mg/kg CS暴露组)。

(C)在CS暴露后24小时使用moor VMS-OXY^TM监测仪(Moor Instruments，UnitedKingdom)测量所有小鼠的氧分压(PO₂)。

(D)从解剖的肺组织吸出表面血液后，肺重量比通过将每只小鼠的个体肺重量除以其总体重来测量肺重量比。

(E)使用白蛋白测定试剂盒测量BALF中的白蛋白浓度。与对照(Ctrl)组相比，##p＜0.01；*p＜0.05和**p＜0.01与模型组(model)相比。数值表示为平均值±SEM；n＝12(每组)。

图11为CT-NA对CS诱导的ALI小鼠的BALF中促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)，趋化因子(KC)和抗炎细胞因子(IL-10)表达的影响。

收集的BALF分别通过ELISA试剂盒分析TNF-α(A)，IL-1β(B)，IL-6(C)，KC(D)和IL-10(E)的表达水平。与对照(Ctrl)组相比，##p＜0.01；*p＜0.05和**p＜0.01与模型组(model)相比。数值表示为平均值±SEM；n＝12(每组)。

图12为CT-NA对CS诱导的ALI小鼠肺组织的组织病理学变化的影响。

将每个实验组的石蜡包埋肺切片用苏木精-伊红染色进行组织病理学评估。(A)用H&E染色的肺组织的代表性图像，以证明巨噬细胞，嗜中性粒细胞和炎症细胞的浸润。(B)定量分析炎症细胞的浸润和根据肺切片判断炎症的严重程度。与对照(Ctrl)组相比，##p＜0.01；*p＜0.05和**p＜0.01与模型组(model)相比。数值表示为平均值±SEM；n＝12(每组)。

图13为CT-NA对肺MPO活性和PGD₂诱导的体外嗜中性粒细胞迁移的影响，评估CSE诱导的PGD₂分泌的原代巨噬细胞。

(A)使用MPO试剂盒测试肺匀浆中MPO的活性。数值表示为平均值±SEM；n＝12(每组)。在不使用CT-NA(B)和使用CT-NA(C)下通过Boyden室检测试剂盒(3μm孔尺寸)检测PGD₂诱导的中性粒细胞迁移。(D)使用不同浓度的CSE(2％，4％和8％)处理分离的原代巨噬细胞24小时，然后通过PGD₂ELISA试剂盒评估分泌细胞外PGD₂的蛋白质水平。##与对照(Ctrl)组相比p＜0.01；*p＜0.05且**p＜0.01与模型组(model)相比。所有实验在每个条件下，在三份孔中进行三次重复实验。数值表示为平均值±SEM。

图14为CT-NA对CSE(4％)-和PGD₂-诱导的促炎性细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)，趋化因子(KC)和RAW 264.7巨噬细胞产生的抗炎细胞因子(IL-10)的蛋白质水平的影响。

从RAW 264.7巨噬细胞中分离出的上清液用CT-NA预处理1小时，并用CSE/PGD₂处理24小时，然后根据说明书的方法分别使用ELISA试剂盒测量IL-1β(A和F)，TNF-α(B和G)，IL-6(C和H)，KC(D和I)和细胞外分泌的IL-10(E和J)的蛋白质水平。##p＜0.01，与对照(Ctrl)组相比；*p＜0.05且**p＜0.01与PGD₂相比。所有实验在每个条件下，在三份孔中进行三次重复实验。数值表示为平均值±SEM。

图15为CT-NA对CSE(4％)-和PGD₂-诱导的促炎性细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)，趋化因子(KC)和RAW 264.7巨噬细胞产生的抗炎细胞因子(IL-10)的mRNA表达的影响。

从RAW 264.7巨噬细胞分离出的RNAs使用CT-NA处理1小时，然后用CSE/PGD₂处理24小时，分别通过RT-PCR分析IL-1β(A和F)，TNF-α(B和G)，IL-6(C和H)，KC(D和I)和IL-10(E和J)的mRNA表达水平。##p＜0.01，与对照(Ctrl)组相比；*p＜0.05且**p＜0.01与PGD₂相比。所有实验在每个条件下，在三份孔中进行三次重复实验。数值表示为平均值±SEM。

图16为制备LPS诱导的ALI小鼠模型过程。在气管内滴注LPS前1小时和12小时后灌胃给予CT-NA(10和30mg/kg)或Dex(阳性对照；1mg/kg)。在LPS诱导后24小时，处死小鼠以制备BALF和肺组织样本。

图17为CT-NA对BALF炎症细胞计数和分类，氧饱和度(SO₂)和肺重量系数的影响。

对于急性肺损伤，(A)CT-NA(10和30mg/kg)或Dex(1mg/kg)在气管内滴注LPS1小时前和12小时后灌胃给予。在LPS诱导后24小时收集BALF以计算细胞总数，嗜中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的数量(细胞总数中从左到右分别为载体生理盐水组、载体LPS诱导组、LPS诱导+CT-NA 10mg/kg组、LPS诱导+CT-NA30mg/kg组及LPS诱导+地塞米松(Dex)1mg/kg组，其他几种检测结果的表述与细胞总数中相同)。(B)在LPS诱导后24小时，使用moor VMS-OXY^TM监测仪测量所有小鼠的氧饱和度(SO₂)。(C)LPS诱导后24小时，肺重量系数通过将每只小鼠的个体肺重量除以其体重来测量。载体生理盐水组##P＜0.01；载体LPS诱导组，*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝12。

图18为CT-NA对LPS诱导的ALI小鼠的BALF中促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)和趋化因子(KC)产生的影响。收集BALF并分别使用对应的ELISA试剂盒分析TNF-α(A)，IL-1β(B)，IL-6(C)和KC(D)水平。载体+载体组##P＜0.01；载体LPS诱导组*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝12。

图19为CT-NA对LPS诱导的ALI小鼠肺组织病理学改变的影响。每个实验组石蜡包埋的肺切片用H&E染色用于组织病理学分析。(A)用H&E染色的肺组织的代表性图像显示出水肿、嗜中性粒细胞和炎性细胞的浸润。(B)由盲选的两位具有肺部专业知识的病理学家对肺损伤进行定量分析病理。载体+载体组##P＜0.01；载体LPS诱导组*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组的n＝12。

图20为CT-NA对LPS诱导的肺血管通透性的影响。LPS诱导LPS诱导LPS诱导后24小时，(A)使用白蛋白测定试剂盒测量BALF中的白蛋白。(B)将伊文思蓝染料(50mg/kg)注入所有小鼠的尾静脉，1小时后安乐死。通过伊文思蓝染料在肺组织中的积累确定肺血管通透性。载体+载体组##P＜0.01；载体LPS诱导组*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组的n＝12。

图21为CT-NA对肺MPO活性、体外PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移的影响，和评估LPS诱导的原代巨噬细胞中PGD₂的分泌。(A)使用MPO试剂盒测量肺匀浆的MPO活性。载体+载体组##P＜0.01；载体LPS诱导组**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝12。(B和C)使用Boyden室检测试剂盒(3μm孔径)评估使用或不使用CT-NA情况下PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移。载体+载体组##P＜0.01；载体组或PGD₂+载体组**P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝3。(D)分离的原代巨噬细胞用不同浓度的LPS(0.01，0.1，1和10μM)预处理24h后收集上清液，用PGD₂ELISA试剂盒测定PGD₂蛋白水平。载体组##P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝3。

图22为CT-NA对促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)和从LPS-或PGD₂刺激的RAW264.7巨噬细胞分泌的趋化因子(KC)的影响。用CT-NA预处理RAW264.7巨噬细胞1小时，并进一步用CT-NA和LPS/PGD₂处理24小时，然后收集培养基分别使用对应ELISA试剂盒测量IL-1β(A和E)，TNF-α(B和F)，IL-6(C和G)和KC(D和H)分泌水平。载体+载体组##P＜0.01；LPS/PGD₂+载体组，*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝3。

图23为CT-NA对促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)和LPS-或PGD₂刺激的RAW264.7巨噬细胞分泌的趋化因子(KC)mRNA表达的影响。用CT-NA预处理RAW264.7巨噬细胞1小时，并进一步用CT-NA和LPS/PGD₂处理24小时，然后提取RNA，使用RT-PCR分析IL-1β(A和E)，TNF-α(B和F)，IL-6(C和G)和KC(D和H)的表达。对照组##P＜0.01；模型组*P＜0.05，**P＜0.01。载体+载体组##P＜0.01；LPS/PGD₂+载体组，*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝3。

图24为CT-NA对促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)、LPS和PGD₂刺激的原代巨噬细胞分泌的趋化因子(KC)mRNA表达的影响。将原代巨噬细胞用CT-NA预处理1小时，并进一步用CT-NA和LPS/PGD₂处理24小时，然后提取总RNA，使用RT-PCR分析IL-1β(A和E)，TNF-α(B和F)，IL-6(C和G)和KC(D和H)的表达。载体+载体组##P＜0.01；LPS/PGD₂+载体组*P＜0.05，**P＜0.01。数值表示为平均值±S.E.M.，每组n＝3。

图25为CT-NA对NF-κ3在RAW 264.7巨噬细胞或肺中的LPS刺激信号通路激活响应的影响。(A)RAW264.7巨噬细胞在LPS(100ng/ml)处理前1小时用CT-NA(0.5，1，10和100μM)预处理1小时。(B)将保存的肺组织在RIPA缓冲液中匀浆以提取总蛋白。用指定的抗体对蛋白质进行蛋白质印迹分析。使用β-肌动蛋白作为内部控制。所有实验至少重复三次。

DSC-TGA检测项目仪器名称及型号：同步热分析仪(STA449F3)20℃升至350℃。

制备例2中XRPD检测项目仪器名称及型号：AFC10/Saturn724+Rigaku型X射线衍射分析仪。

制备例3-5中XRPD检测项目仪器名称及型号：D2 PHASER X射线衍射仪(德国布鲁克)。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

制备例1、式A化合物的制备

参考专利文献CN101896178B中实施例3和4所记载的方法，将式A所示杂环化合物消旋体(20g)在Chiralcel OJ-RH柱(Chiralcel Technologies)上用含0.05％TFA的甲醇洗脱，分离得到式A所示杂环化合物(6.24g，收率为31.2％)。

¹H NMR(600MHz，CD₃OD)：8.14-8.15(m，1H)，8.00-8.03(m，2H)，7.92-7.94(m，1H)，7.38-7.42(m，2H)，7.10-7.13(m，1H)，4.50-4.54(m，1H)，4.38-4.40(m，1H)，3.92-3.96(m，1H)，3.63-3.72(m，2H)，3.17-3.22(m，1H)，2.85-2.95(m，4H)，1.99-2.02(m，1H)，1.76-1.79(m，1H)

制备例2、式A化合物一水合物晶型的制备

参考专利文献CN101896178B中实施例3和4所记载的方法，将式A杂环化合物消旋体(0.500g)在Chiralcel OJ-RH柱(Chiralcel Technologies)上用含0.05％TFA的甲醇洗脱，收集洗脱液浓缩至干，得到产物约0.2g，其为无定型态。向浓缩物中加入丙酮(2.5mL)和水(2.5mL)，40-50℃加热溶解后降至0～10℃，搅拌析晶2～3h，过滤得到式A所示杂环化合物晶型(0.156g)，收率为31.2％。所述晶型的XRPD检测结果如图1所示，其DSC-TGA检测结果如图2所示，由图2的DSC图可知，其分别在86.4℃和130.4℃出现吸热峰，TGA热失重图上显示失重为4.29％。由该晶型的DSC-TGA图谱表明，该晶型为一水合物。图3为所得晶型的三维结构图和晶胞图。

¹H NMR(600MHz，CD₃OD)：8.13-8.15(m，1H)，8.00-8.04(m，2H)，7.92-7.95(m，1H)，7.37-7.42(m，2H)，7.09-7.14(m，1H)，4.50-4.55(m，1H)，4.38-4.42(m，1H)，3.91-3.97(m，1H)，3.61-3.71(m，2H)，3.17-3.23(m，1H)，2.85-2.95(m，4H)，1.97-2.02(m，1H)，1.75-1.79(m，1H)

制备例3、式A化合物钠盐水合物(CT-NA)的制备

将化合物A(17.6g)用丙酮(210mL)溶解，升温至50℃搅拌至溶解，向该溶液中滴加氢氧化钠水溶液(将1.5g氢氧化钠溶于4mL纯化水中配制)，滴加完毕后，50℃保温搅拌4h。过滤，将滤饼在50℃真空减压干燥6h，得化合物A的钠盐水合物(15.8g，收率82％)。所得钠盐呈现良好的结晶性，其XRPD表征数据如图4所示。DSC-TGA检测结果如谱图5所示，由图5的DSC图可知，其分别在130.2℃和176.6℃出现吸热峰，TGA热失重图上显示失重为3.99％。由该晶型的DSC-TGA图谱表明，该晶型为一水合物。

¹H NMR(600MHz，CD₃OD)：8.08-8.10(m，1H)，7.96-8.02(m，3H)，7.37-7.41(m，2H)，7.05-7.08(m，1H)，4.50-4.52(m，1H)，4.37-4.41(m，1H)，3.89-3.93(m，1H)，3.46-3.55(m，2H)，3.17-3.22(m，1H)，2.93(s，3H)，2.90-2.92(m，1H)，1.96-2.00(m，1H)，1.70-1.73(m，1H)

制备例4、式A化合物钾盐水合物的制备

将化合物A(50.0g)用丙酮(600mL)溶解，室温下向反应液中缓慢滴加氢氧化钾水溶液(6.4g氢氧化钾加入到12mL纯化水中配制而成)，室温下搅拌反应3h，抽滤，50℃真空减压干燥6h，得化合物A的钾盐水合物(36.4g，收率64％)。所得钾盐呈现良好的结晶性，其XRPD谱图如图6所示，其DSC-TGA如图7所示。由图7的DSC图可知，其在64.1℃和270.4℃分别出现吸热峰，TGA热失重图上显示失重为3.82％。由该晶型的DSC-TGA图谱表明，该晶型为一水合物。

¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：7.98-8.05(m，3H)，7.80-7.83(m，1H)，7.48-7.52(m，2H)，6.94-6.97(m，1H)，4.30-4.33(m，1H)，4.16-4.20(m，1H)，3.81-3.86(m，1H)，3.06-3.17(m，3H)，2.83(s，3H)，2.76-2.82(m，1H)，1.82-1.90(m，1H)，1.55-1.58(m，1H).

制备例5、式A化合物锂盐水合物的制备

将化合物A(50.0g)用丙酮(900mL)溶解，室温下向反应液中缓慢滴加氢氧化锂(2.75g氢氧化锂加入到18mL纯化水中配制而成)水溶液，室温下搅拌反应3h，抽滤，将滤饼在50℃真空减压干燥6h，得化合物A的锂盐水合物(26.0g，收率49％)。所得锂盐呈现良好的结晶性，其XRPD谱图如图8所示，其DSC-TGA如图9所示。由图9的DSC图可知，其在138.8℃和180.7℃分别出现吸热峰，TGA热失重图上显示失重为4.47％。由该晶型的DSC-TGA图谱表明，该晶型为一水合物。

¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：7.98-8.06(m，3H)，7.81-7.83(m，1H)，7.47-7.52(m，2H)，6.91-6.94(m，1H)，4.28-4.34(m，1H)，4.15-4.19(m，1H)，3.80-3.84(m，1H)，3.18-3.26(m，2H)，3.05-3.08(m，1H)，2.82(s，3H)，2.77-2.81(m，1H)，1.80-1.87(m，1H)，1.53-1.56(m，1H).

测试例1、溶解度测试

将如上所得水合物与式A化合物在不同pH的溶液中进行溶解度测试，测试方法为：

1.1、不同pH介质的配制

pH1.0介质：取盐酸9.0mL，加水稀释至1000mL，摇匀，即得。

pH4.5介质：取磷酸二氢钾(KH₂PO₄)6.80g加水适量使溶解并稀释至1000mL，用磷酸或氢氧化钠调节pH值至4.5，摇匀，即得。

pH6.8介质：取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)55.38g与枸橼酸(C₆H₈O₇·H₂O)4.77g，加水适量使溶解并稀释至1000mL，用磷酸或氢氧化钠调节pH值至6.8，摇匀，即得。

纯水介质：纯化水

1.2、试验方法：取一定量的供试样品，分别逐量加入相应pH的介质，不断震摇，直至达到饱和状态，记录供试品称样量及溶剂用量，记算溶解样品时的浓度，测试结果如表1所示：

表1化合物A、晶型及其盐在水中的溶解度(单位：mg/mL)

由表1结果可知，钠盐水合物在不同pH下的水溶性最好，锂盐水合物与钠盐水合物基本相当，钾盐水合物在pH4.5时与钠盐水合物和锂盐水合物相当，但其它pH和纯化水中均差于钠盐水合物和锂盐水合物，游离酸(化合物A)在不同pH下的水溶性均较差。所得三种盐的水合物中，特别是钠盐和锂盐水合物的溶解性能明显优于化合物A。

同时制备例2的化合物A的一水合物晶型在不同的pH中均具有良好的溶解度。

测试例2、溶出度测试

将如上所得水合物与式A化合物进行溶出度测试，测试方法为：

步骤1：原料预处理

将样品过100目筛。

步骤2：原辅料混合

按处方量称取原料和乳糖，等量递加混合，然后再过筛混合。

步骤3：胶囊灌装

用胶囊填充板灌装胶囊，锁扣，控制装量差异为：±5％。进行外观检测，应锁口到位、无叉口或凹顶现象。

检查方法：溶出度测定法(中国药典2015年版四部通则0931第二法)

溶出介质：水溶液

转速：50rpm

取样时间：30min

具体试验方法：取本品，照溶出度测定法(中国药典2015年版四部通则0931第二法)，以水溶液900ml为溶出介质，转速为50rpm，依法操作，经30min时，取溶液约10ml，滤过，精密量取续滤液适量，用溶出介质定量稀释制成每1ml中约含样品10μg的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版四部通则0401)，于231nm波长处测定吸光度；另取样品对照品适量，精密称定，加溶出介质溶解并定量稀释制成每1ml中约含样品10μg的溶液，同法测定，计算每粒的溶出量。

结果见表2-表4。

表2制备例3化合物A钠盐水合物在水中的溶出度

表3制备例4化合物A钾盐水合物在水中的溶出度

表4制备例5化合物A锂盐水合物在水中的溶出度

采用上述相同的方法测试化合物A的溶出度，因化合物A水溶性较差，其溶出度基本为零。

基于上述内容可知，本发明所得三种盐的水合物均表现出较好的溶出度，其中钠盐水合物的溶出度最好。

测试例3、稳定性测试

试验过程：取各供试品适量置于干净的表面皿上，敞口放置，于光照4500lx±500lx、高温60℃、高湿92.5％RH条件下分别放置5天、10天，测定性状、有关物质，并与0天结果对比，考察稳定性。

有关物质检查方法如下：

供试品溶液的制备：取各供试品约10mg，置10ml量瓶中，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液10μl，按上述色谱方法进样，按面积归一化法计算最大单杂和总杂。

试验结果：

制备例1式A化合物影响因素试验结果

制备例4钾盐水合物影响因素试验结果

制备例5锂盐水合物影响因素试验结果

由上述结果可知，在高温、高湿条件下，式A化合物、本申请所得钠盐、钾盐和锂盐水合物均较为稳定；而在光照条件下，式A化合物降解明显，而其成盐后得到的化合物对光照的稳定性显著增强。由此可见，钠盐、锂盐、钾盐的稳定性明显优于式A化合物。

同时对制备例2的式A化合物一水合物的晶型的稳定性测试结果表明，表明式A化合物的晶型在高温、高湿下具有良好的稳定性。最大单杂不超过0.1％，而总杂不超过0.4％。并且发明人发现，所述式A化合物的晶型在光照条件下的稳定性虽差于高温、高湿下的稳定性，但仍具有相对良好的稳定性。

测试例4引湿性测试

将制备例2所得式A化合物的一水合物晶型进行引湿性测试；

测试方法为：

检查方法：中国药典方法(中国药典2015年版四部通则9103)

试验条件：

操作温度：25℃±1℃

干燥器湿度：80％±2％RH。

具体试验操作：将干燥的扁形称量瓶在恒温干燥器(下部放置氯化铵或硫酸铵饱和溶液)中放置24h后，取实施例1所得晶型1g平铺于扁形称量瓶中，敞口并与瓶盖同置于干燥器中24h。

样品名称	增重(％)	结论
			晶型	0.23	略有引湿性

由上述结果可知，式A化合物的一水合物晶型在高湿条件下，略有引湿性，说明式A化合物的一水合物晶型稳定性较高。

实施例1

将制备例3制备的式A化合物钠盐水合物CT-NA用于活性测试。测试方法如下。

1.1小鼠处理

特异性无病原体(SPF)雌性Balb/c小鼠(22-28克；8周)购自上海SIPPR-BK实验动物有限公司。小鼠在隔离的通风笼中(4-5只小鼠/笼)，在40-60％湿度，24±2℃，按照12小时/12小时暗-光交替的环境中自由进食和饮水。

1.2香烟烟雾(CS)诱导的肺损伤模型的制备和测量氧分压

模型制备：小鼠随机分为5组(每组12只)，分别为对照组(小鼠暴露在新鲜空气中)、生理盐水组(小鼠暴露在香烟烟雾中)、地塞米松(Dex)组(1mg/kg)(小鼠暴露在香烟烟雾中)、CT-NA 10mg/kg组和CT-NA30mg/kg组(小鼠暴露在香烟烟雾中)。根据分组情况分别于小鼠灌胃给予生理盐水、Dex和CT-NA。之后，将小鼠暴露于在新鲜空气中或香烟烟雾中。香烟烟雾由3R4F研究级卷烟(含约600mg TPM/m³和29.9mg尼古丁/m³)在方形塑料箱(65×50×45cm)中按照每天10支，每支燃烧完成后点燃下一支的频率燃烧，共连续重复7天。检查小鼠每天的体重和常规状况。在完成最后一次暴露于香烟气氛中后24小时，使用moor VMS-OXY^TM测量仪测量所有小鼠的氧分压(PO₂)，用于测量在500至650nm的波长范围内含氧/脱氧血红蛋白的微循环中的浓度和氧饱和度(百分比)。之后，所有老鼠被安乐死以收集支气管肺泡灌洗液(BALF)用于测量炎症细胞总数，细胞因子水平和白蛋白浓度。并收集肺部组织以测定肺重量系数，组织检测和MPO活性。

1.2.1炎症细胞计数

将小鼠安乐死后手术暴露气管，然后对右肺用0.4mL/次含有1％FBS和5000IU/L肝素的无菌生理盐水灌洗三次，通过气管导管以收集BALF。用血细胞计数器测量BALF中的细胞总数后，将剩余的BALF在1000×g，4℃下离心10分钟。将上清液等分并且储存在-80℃用于下一步测量细胞因子或白蛋白浓度。将获得的细胞沉淀涂在载玻片上。之后，根据中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的形态学标准，在光学显微镜下对涂片进行Wright-Giemsa染色以计数200个细胞。

1.2.2肺重量比

作为肺水肿的指标，肺重量比为每只小鼠吸去肺表面血液组织后的个体肺重量，除以总体重。

1.2.3白蛋白测定

使用白蛋白测定试剂盒及分光光度计在628nm处测试BALF上清液中的白蛋白浓度。使用BALF测定的白蛋白浓度比率不仅代表白蛋白水平，也代表肺微血管通透性。

1.2.4通过ELISA进行体内细胞因子测定

根据使用说明书分别采用ELISA测试套装测定BALF上清液中促炎性细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)，趋化因子(KC)和抗炎细胞因子(IL-10)的表达水平。测量在450nm处的光密度后，通过标准曲线计算细胞因子的表达。

1.2.5肺组织病理学

将每只小鼠左肺下叶保存在10％中性福尔马林中用于组织病理学检查。将保存的左肺下叶取出包埋在石蜡中，然后切片(4μm)以暴露主要肺内支气管的最大纵向视图。使用标准方法进行苏木精和伊红(H&E)染色。使用5点评分系统来评价肺水肿，炎症的严重程度和炎症细胞的浸润程度。简单来说，得分系统是，0＝正常；1＝非常轻微；2＝轻微；3＝中等；4＝显著；5＝严重。每个肺截面按照至少三个不同的视野进行评分。取12只小鼠得分的平均值。

1.2.6 MPO测定

为了评估MPO活性，取50mg左肺条状组织进行清洗，然后用生理盐水匀浆。使用MPO测定试剂盒，根据检测标准通过测量吸光度在460nm处的变化来确定MPO的活性。

1.2.7嗜中性粒细胞的分离和测试CT-NA对PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移的影响

小鼠灌胃给予20ml/kg的糖原(1.5％)。4小时后对小鼠实施安乐死，从腹膜灌洗中分离嗜中性粒细胞。CT-NA对嗜中性粒细胞迁移的影响使用Boyden腔室检测试剂盒(3μm孔径)检测，PGD₂用作化学引诱剂，因为活化的PGD₂/CRTH2受体促进嗜中性粒细胞的迁移。最初，分离的嗜中性粒细胞(4×10⁵)稀释在100μLHBSS中使其向PGD₂迁移(0.1，1和10μM)4小时以找出合适的PGD₂浓度。然后，使用CT-NA(1和10μM)预处理分离的嗜中性粒细胞(4×10⁵)，它们向PGD₂(1μM)的迁移通过计算迁移的嗜中性粒细胞评估。而且，我们还使用了另一个有效的CRTH2抑制剂OC459，以复查CT-NA的检测结果。

1.2.8香烟烟雾提取物(CSE)的制备

使用真空泵输送3R4F研究级香烟产生的香烟烟雾通过50ml PBS。用五支香烟来制造通过50ml PBS的烟雾，每支香烟点燃5分钟。在没有香烟的情况下采用类似的方法制备对照溶液。烟雾萃取后完成后将CSE储存在-80℃下。

1.2.9原代巨噬细胞的分离和评估CSE诱导的从原代巨噬细胞分泌PGD₂

通过腹膜腔分离原代巨噬细胞，方法简单说明如下：巯基乙酸盐(4％)按照20ml/kg体重的剂量连续三天注入小鼠腹腔。在第5天(最后一次巯基乙酸盐注射后48小时)，小鼠安乐死以便从腹膜灌洗中分离出原代巨噬细胞。将分离的原代巨噬细胞(4×10⁵/孔)加入12孔板并在37℃下培养。之后，将12孔板的培养基用无血清RPMI-1640培养基替换，并培育10-12小时，然后暴露于不同浓度的CSE(2％，4％，和8％)下24小时。处理完成后，收集原代巨噬细胞的上清液，根据说明书的方法，使用ELISA试剂盒测量分泌的细胞外PGD₂的蛋白质水平。

1.2.10细胞活性测试

RAW 264.7巨噬细胞，小鼠白血病单核巨噬细胞，细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。RAW 264.7巨噬细胞在RPMI-1640培养基中培养，该培养基中含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)及10％FBS。单独使用CT-NA(0-100μM)，及其与PGD₂(0-100μM)、CSE组合后测定对RAW264.7巨噬细胞(1-10％)的毒性，根据标准方法，使用甲基噻唑-四唑(MTT)测定评估。简而言之，将RAW 264.7巨噬细胞以4×10⁵个细胞/ml的浓度接种在96孔板中24小时，随后在37℃下暴露于CT-NA(0-100μM)1小时。接下来，将RAW 264.7巨噬细胞进一步暴露于CSE(4％)和PGD₂(10μM)24小时，随后用MTT(5mg/ml)在37℃下处理4小时。然后，用DMSO(200μl/孔)更换每个孔的上清液，测定在570nm处的吸光度。

1.2.11通过ELISA和实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行体外细胞因子测定

将RAW 264.7巨噬细胞加入到两个12孔板。之后，12孔板的培养基用无血清RPMI-1640培养基替换，培育10-12小时后暴露于CT-NA(10和100μM)1小时。1小时后，一个12孔板用CSE(4％)处理，另一个用PGD₂(10μM)处理24小时。处理后，收集处理细胞的上清液，根据说明书的方法，使用ELISA试剂盒测量TNF-α，IL-1β，IL-6，KC和细胞外分泌的IL-10的蛋白质水平。随后，来自每个处理过的板的RNA样品用HiScript5×QRTSuperMix提取并逆转录成cDNA，然后进行RT-PCR。RT-PCR使用BioRad CFX96 Touch^TM实时PCR检测系统(BioRad，美国)进行处理，这个系统使用Green Master Mix。而阈值循环数是使用BioRad CFX Manager软件获得的。用于RT-PCR反应的引物如表1所示。β-actin用作内部对照。RT-PCR反应重复三次。靶mRNA的相对表达通过各自的β-actin矫正。

表1

1.2.12统计分析

数据为平均值±SEM。统计学使用SPSS(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行计算。采用单因素ANOVA方法比较F值，如果p＞0.05，则采用Dunnett multiple comparisons teat计算参数数据的差异；如果p＜0.05，则用Mann-Whitney U non-parametric test比较差异。p＜0.05和p＜0.01被认为是具有统计学意义。

2.1 CT-NA在BALF中对CS诱导的炎症细胞数量的影响

在最后一次暴露于CS后24小时，CT-NA对BALF中总细胞和不同细胞的浸润，尤其是嗜中性粒细胞和巨噬细胞的影响通过Wright-Giemsa染色方法分析。如图10A和B所示，CS暴露后，总细胞数，巨噬细胞数和嗜中性粒细胞数显著增加(p＜0.01)。同时，用CT-NA(10和30mg/kg)和Dex(1mg/kg)预处理显著降低总细胞数，巨噬细胞数和嗜中性粒细胞数(p＜0.01)。这些显著的效果证明CT-NA可以通过CRTH2拮抗作用显著改善CS诱导的肺部炎症。

2.2 CT-NA对CS诱导的低氧血症，肺水肿和肺通透性的影响

CS诱导的低氧血症，肺水肿，肺通透性分别通过测量氧分压(PO₂)，肺重量系数、和BALF白蛋白含量来评估。在CS处理组，PO₂明显降低(p＜0.01)，然而与对照组相比，肺重量系数和BALF白蛋白含量显著增加(p＜0.01)，表明CS诱导的动物模型成功。但是，CT-NA(10和30mg/kg)组PO₂显著升高(p＜0.01)(图10C)，肺重量系数部分降低(p＜0.05)(图10D)，并显著减弱BALF白蛋白含量(p＜0.01)(图10E)。这些优异的结果表明的CRTH2抗体CT-NA通过减轻低氧血症，肺通透性和水肿，可以有效地保护小鼠免受CS诱导的肺损伤。

2.3 CT-NA对BALF中CS诱导的细胞因子分泌的影响

为了确定CT-NA是否可以影响BALF中细胞因子的分泌，分别使用ELISA试剂盒检测促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)，趋化因子(KC)和抗炎细胞因子(IL-10)的表达水平。如图11A，B，C和D所示，CS暴露组的TNF-α，IL-1β，IL-6和KC的表达水平与对照组相比显著增加(p＜0.01)。同时，CS诱导的TNF-α，IL-1β，IL-6和KC的过度表达通过CT-NA处理可以有效地减少(10和30mg/kg)(p＜0.01)。相比之下，CS暴露组中IL-10的表达水平显著降低(p＜0.01)，而CT-NA处理逆转了CS诱导的IL-10抑制作用(p＜0.01)(图11E)。这些结果表明CRTH2受体被CT-NA阻断，从而通过抑制促炎性细胞因子、嗜中性粒细胞趋化因子的产生，和刺激抗炎细胞因子(IL-10)的产生来保护CS诱导的ALI小鼠免于进一步的肺部炎症。

2.4 CT-NA对CS诱导的肺组织病理学改变的影响

为了评估CT-NA对CS诱导的肺组织病理学变化的保护作用，进行了H&E染色实验。如图12A所示，对照组的肺组织显示正常肺组织学，而CS暴露组的肺组织显示明显组织病理学变化，如炎症细胞和巨噬细胞的浸润，及嗜中性粒细胞进入肺泡腔和间质浮肿。相反，通过使用CT-NA(10和30mg/kg)或Dex(1mg/kg)预处理，这些变化显著改善。此外，还进行了病理评分以确定炎症，炎症细胞浸润和肺水肿的严重程度。肺部炎症评分结果显示，暴露在CS下显著增加平均病理评分(p＜0.01)。而CT-NA(10和30mg/kg)和Dex(1mg/kg)以剂量依赖的方式显著降低平均病理评分(p＜0.01)(图12B)。检测结果显示CT-NA通过阻断CRTH2受体显著减轻CS引起的肺损伤的严重程度。

2.5 CT-NA对CS诱导的MPO活性的影响

由于上述良好的检测结果，我们进一步评估了肺组织的MPO活性。由活化的嗜中性粒细胞产生的MPO，是嗜中性粒细胞浸润和肺组织损伤的重要标志物。我们发现肺组织的MPO活性暴露在CS中与暴露在新鲜空气中相比显著增加(p＜0.01)(图13A)。值得注意的是，CT-NA(10和30mg/kg)和Dex(1mg/kg)减弱MPO活性(p＜0.01)，表明CRTH2受体阻滞可有效抑制嗜中性粒细胞侵入肺泡和间隙。

2.6.CT-NA对PGD₂诱导的体外嗜中性粒细胞迁移的影响

基于MPO的检测结果，我们进一步使用Boyden室检测试剂盒评估了CT-NA对PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移的直接影响，因为激活的PGD₂/CRTH2受体促进嗜中性粒细胞的迁移及其功能。此外，嗜中性粒细胞释放的炎症介质极可能加剧肺损伤。从小鼠中腹腔分离出的嗜中性粒细胞用1.5％糖原攻击，然后进行Wright-Giemsa染色和细胞活力测定以检查嗜中性粒细胞的特征。孵育4小时显示出显著的嗜中性粒细胞向PGD₂的迁移(p＜0.01)(1和10μM)(图13B)。同时，用CT-NA预处理(1和10μM)显著减弱PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移(p＜0.01)(图13C)。同样，另一种CRTH2拮抗剂OC459也抑制PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移(图13C)。总之，这些数据清楚地体现CRTH2拮抗剂明显减少PGD₂诱导的嗜中性粒细胞的迁移。

2.7 CSE促进原代巨噬细胞分泌PGD₂

为了测试CSE是否影响PGD₂的分泌，我们使用不同浓度的CSE(2％，4％和8％)处理分离的原代巨噬细胞24小时，然后通过PGD₂ELISA试剂盒评估分泌细胞外PGD₂的蛋白质水平。我们发现与对照组相比使用CSE(4％)处理显著促进了PGD₂的分泌(p＜0.01)(图13D)。

2.8 CT-NA对CSE-和PGD₂-诱导的RAW 264.7巨噬细胞因子分泌的影响

基于显著的体内测试结果，我们进一步考虑CT-NA处理是否能抑制CSE-和PGD₂-刺激的RAW 264.7巨噬细胞细胞因子的分泌，因为激活的巨噬细胞上的PGD₂/CRTH2受体通过增加促炎细胞因子的表达来显著增加疾病活性。MTT测定显示PGD₂(10μM)加浓度高达100μM的CT-NA，和CSE 4％加浓度高达100μM的CT-NA对RAW 264.7巨噬细胞无毒性。此外，ELISA(图14)和RT-PCR(图15)结果证明CT-NA(10和100μM)处理不仅可以抑制由CSE-及PGD₂-刺激的RAW 264.7巨噬细胞产生的IL-1β，IL-6，TNF-α和KC的蛋白和mRNA水平，(p＜0.01)，而且以剂量依赖性的方式逆转CSE-和PGD₂-诱导的IL-10抑制(p＜0.01)。因此，体外获得的检测结果(图14和15)与体内获得的检测结果相似(图11)的检测结果。总的来说，这些数据表明CRTH2拮抗作用有效地改善了促炎性细胞因子和趋化因子的产生，促进来自CSE-和PGD₂-激活的RAW 264.7巨噬细胞产生抗炎细胞因子。

实施例2

2.1.1小鼠处理、制备LPS诱导的ALI模型和测量氧饱和度

特异性无病原体(SPF)Balb/c小鼠(♂/♀；20-26克；8周)购自上海SIPPR-BK实验动物有限公司。小鼠在隔离的通风笼中，在40-60％湿度，24±2℃，按照12小时/12小时暗-光交替的环境中自由进食和饮水。制备LPS诱导的ALI模型时，方法简单说明如下：将小鼠随机分为对照组(12只小鼠)和LPS组(48只小鼠)。LPS组(48只小鼠)进一步分为四个亚组(每组包含12只小鼠)。LPS四个亚组的未麻醉小鼠分别灌胃给予生理盐水(NS)，10mg/kg CT-NA、30mg/kg CT-NA和1mg/kg Dex。1小时后，小鼠用戊巴比妥钠麻醉(腹腔注射40mg/kg)，然后气管内滴注NS至对照组和LPS(4mg/kg)至所有LPS亚组。12小时后，LPS组的未麻醉小鼠分别给予NS、10mg/kgCT-NA、30mg/kg CT-NA和1mg/kg Dex(如图16)。生理盐水和LPS均以10μl/10克体重的方式施用。LPS诱导后24小时，使用moor VMS-OXY^TM测量仪通过测量在500至650nm波长范围内微循环中氧饱和度(％)来测量所有小鼠的氧饱和度。SO₂代表血液中的氧合血红蛋白对总血红蛋白的百分比。在测量完SO₂后，收集每只小鼠的BALF用于炎症细胞计数和分类以及白蛋白浓度和促炎细胞因子/趋化因子水平的测定。此外，肺也用于组织学检查，测定肺重量系数和MPO活性。

2.1.2细胞计数和肺重量系数

将小鼠安乐死以暴露气管，然后对右肺用0.4mL/次含有牛血清白蛋白(BSA)和5000IU/L肝素的无菌生理盐水灌洗三次，通过气管导管以收集BALF。用血细胞计数器测量BALF中的细胞总数后，将剩余的BALF在1000×g，4℃下离心10分钟。将上清液等分并且储存在-80℃用于下一步测量促炎细胞因子或白蛋白浓度。将获得的细胞沉淀涂在载玻片上。之后，根据嗜中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的形态学标准，在光学显微镜下对涂片进行Wright-Giemsa染色以计数200个细胞。取出的肺组织吸出表面血液后称重，计算肺重量系数。肺重量系数为肺水肿的指标，其计算方式为每只小鼠的个体肺重量吸去肺表面血液组织后的个体肺重量除以总体重。

2.1.3通过ELISA评估体内促炎细胞因子和趋化因子

根据使用说明书分别采用对应的ELISA试剂盒测定BALF中促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)，趋化因子(KC，小鼠IL-8同源物)的表达水平。测量在450nm处的光密度后，通过标准曲线计算表达水平。

2.1.4病理学测试

将每只小鼠左肺下叶保存在10％中性福尔马林中用于组织病理学检查，福尔马林按照在室温下在22至25cm H₂O的恒定压力下滴加48小时。将保存的左肺下叶取出包埋在石蜡中，然后切片(4μm)以暴露主要肺内支气管的最大纵向视图。然后使用H&E染色以评估肺水肿，和光学显微镜下观察嗜中性粒细胞和炎症细胞的浸润。对肺部水肿，出血，肺泡壁增厚、嗜中性粒细胞和炎症细胞的浸润进行计数和评分以评价肺损伤的严重程度。得分系统是，0＝正常；1＝非常轻微；2＝轻微；3＝中等；4＝显著；5＝严重。总肺损伤评分为四个标准的总和。取12只小鼠得分的平均值。

2.1.5体内肺血管通透性测试

伊文思蓝是一种快速与白蛋白结合并被限制在血管内的染料，因为内皮在正常生理条件下对白蛋白是不可渗透的。通过测量伊文思蓝染料在肺中的外渗来测量肺微血管通透性。方法简单描述如下：将小鼠随机分为对照组(12只小鼠)和LPS组(48只小鼠)。LPS组(48只小鼠)进一步分为四个亚组(每组包含12只小鼠)。为了测量肺微血管通透性，LPS四个亚组的未麻醉小鼠分别接受NS，10mg/kg CT-NA、30mg/kg CT-NA和1mg/kg Dex灌胃给药。1小时后对照组麻醉小鼠气管内滴注NS(对照组)和LPS(LPS亚组)，两者均以10μl/10克体重的方式施用。LPS诱导后24小时，将伊文思蓝染料(50毫克/千克)注入所有小鼠的尾静脉，1小时后安乐死。小鼠杀死后，NS缓慢注入到小鼠右心室，以排干肺部组织的血液。在室温下，小心地取出右肺，切片并置于甲酰胺(3ml/100mg)中。孵育24小时后，将样品以500×g离心10分钟(4℃)。通过标准曲线法测定620nm处的甲酰胺空白，测定在上清液中提取的伊文思蓝染料的吸光度。测量值表示为微克染料每100毫克湿肺重量。另外，在628nm使用分光光度计和白蛋白测定试剂盒进行测量BALF中的白蛋白浓度。使用BALF测定的白蛋白浓度比率不仅代表白蛋白水平，也代表肺微血管通透性。

2.1.6 MPO活性测定

MPO活性测定步骤如下：准确称取左肺条状组织使用匀浆培养基制备体积分数为5％匀浆(左肺条状组织和匀浆培养基的体积比为1∶19)。然后将匀浆(0.9ml)和反应缓冲液(0.1ml)按照9∶1的比例充分混合(如果没有足够的匀浆，则体积分数为5％匀浆和反应缓冲液可以按照9∶1的比例相应减少)，然后在37℃培育15分钟。之后根据标准曲线使用分光光度计通过测量吸光度在460nm处的变化来测定MPO的活性。

2.1.7分离嗜中性粒细胞和评估PGD₂诱导的体外嗜中性粒细胞迁移

分离嗜中性粒细胞和测试CT-NA对嗜中性粒细胞迁移的影响的方法简单描述如下，将1.5％糖原按照20ml/kg体重的剂量胃内注射给小鼠。四小时后对小鼠实施安乐死，从腹膜灌洗中分离嗜中性粒细胞。CT-NA对嗜中性粒细胞迁移的影响使用Boyden室检测试剂盒(3μm孔径，Billerica，MA)检测，PGD₂用作化学引诱剂，因为活化的PGD₂/CRTH2受体促进嗜中性粒细胞的迁移。首先，将分离的嗜中性粒细胞按照4×10⁵细胞/ml接种在Boyden室检测试剂盒孔的上侧，而下室含有不同浓度的PGD₂(0.1，1和10μM)，让嗜中性粒细胞37℃下向PGD₂迁移4小时，以便于找到出合适的PGD₂浓度。在测试出合适的PGD₂浓度后，测试使用CT-NA(1和10μM)和另一种有效的CRTH2抑制剂OC459(10μM)预处理的嗜中性粒细胞4小时向PGD₂(1μM)的迁移。

2.1.8分离腹腔巨噬细胞和评估LPS诱导的腹腔巨噬细胞分泌PGD₂

方法简单说明如下：巯基乙酸盐(4％)按照20ml/kg体重的剂量连续三天注入小鼠腹腔。最后一次巯基乙酸盐注射后48小时(在第5天)，小鼠安乐死以便从腹膜灌洗中分离出腹腔巨噬细胞。将分离的腹腔巨噬细胞加入12孔板(4×10⁵/孔)并在37℃下培养。通过用热的PBS轻轻洗涤三次除去非粘附细胞。此时，超过90％的细胞是巨噬细胞，将其在37℃下，含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)及10％FBS的DMEM/高葡萄糖培养基中培养。适应后，将无血清DMEM/高葡萄糖加入12孔板中10-12小时，然后用不同浓度的LPS(0.01，0.1，1和10μM)处理24小时。处理完成后，收集腹腔巨噬细胞的上清液，根据说明书的方法，使用ELISA试剂盒测量PGD₂的蛋白质水平。

2.1.9细胞培养和细胞活性测定

RAW 264.7巨噬细胞，小鼠白血病单核巨噬细胞，细胞系购自ATCC，(马纳萨斯，弗吉尼亚州)，并在RPMI-1640培养基中培养，该培养基中含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)及10％胎牛血清。RAW264.7巨噬细胞是筛选抗炎药物和评估刺激促炎细胞因子和酶的产生抑制剂途径的理想模型。根据标准方法，使用MTT测定单独使用CT-NA，及其与PGD₂、LPS组合后对RAW264.7巨噬细胞和分离的腹腔巨噬细胞的毒性。简而言之，将RAW 264.7巨噬细胞以4×10⁵个细胞/ml的浓度接种在96孔板中12小时，随后在37℃下暴露于CT-NA(0-200μM)1小时。接下来，将RAW 264.7巨噬细胞进一步暴露于LPS(100ng/ml)和PGD₂(10μM)24小时，随后用MTT(5mg/ml)在37℃下处理4小时。然后，用DMSO(200μl/孔)更换每个孔的上清液，测定在570nm处的吸光度。

2.1.10体外ELISA测定和实时聚合酶链反应(RT-PCR)分析

对于ELISA和RT-PCR，将RAW 264.7巨噬细胞在70-80％汇合度时加入到两个12孔板。之后，12孔板的培养基用无血清RPMI-1640培养基替换，培育10-12小时后暴露于CT-NA(10和100μM)1小时。一个小时后，一个12孔板用LPS(100ng/ml)处理24小时，另一个用PGD₂(10μM)处理24小时。处理后，收集处理细胞的上清液，根据说明书的方法，使用ELISA试剂盒测量TNF-α，IL-1β，IL-6，KC的蛋白质水平。随后，来自每个处理过的板的RNA样品用HiScript5×QRTSuperMix提取并逆转录成cDNA，然后进行RT-PCR。RT-PCR使用BioRadCFX96 Touch^TM实时PCR检测系统(加利福尼亚州圣地亚哥)进行处理。同样地，使用从分离的腹膜巨噬细胞中提取的总RNA分析IL-1β，TNF-α，IL-6和KC的mRNA水平。用于RT-PCR反应的引物如表2所示。β-actin用作内部对照。RT-PCR反应重复三次。靶mRNA的相对表达通过各自的β-actin矫正。

表2

2.1.11蛋白质印迹分析

进行总蛋白质提取和蛋白质印迹测定方法如下，将肺组织在RIPA缓冲液(0.5MTris-HCl，pH 7.4，1.5M NaCl，2.5％脱氧胆酸，10％NP-40，10mM EDTA)中匀浆，缓冲液中还含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将RAW264.7巨噬细胞以70-80％汇合度接种到两个6孔板中。用无血清RPMI-1640培养基培养过夜饥饿后，用CT-NA预处理RAW264.7巨噬细胞(0.5，1，10和100μM)1小时。之后，一个6孔板用LPS(100ng/ml)处理1小时，另一个用PGD₂(10μM)处理1小时。用PBS洗涤三次后，细胞在冰环境中用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液振荡直接裂解30分钟。然后，将裂解物在4℃环境下以12,300×g离心15分钟，收集上清液。进行Bradford蛋白质测定(BCA)以测量蛋白质浓度。将等量的蛋白质(30μg)在12％SDS-PAGE上分离，转移至0.45μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Bedford，MA)。在室温下用5％(wt/vol)脱脂奶粉将膜封闭1-2小时减少非特异性结合。然后将膜与IκBα(1∶1000)，磷酸-IκBα(1∶1000)，NF-κBP65(1∶1000)，磷酸化NF-κBP65特异性的原代抗体在4℃下一起孵育过夜，与第二抗体IRDye680和800在室温下孵育1小时，然后用TBST洗涤三次。用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences Lincoln，NE)显现免疫反应信号。Western印迹分析重复三次，β-actin用作内标。将肺匀浆后进行相同的操作。

2.1.12统计分析

数据为平均值±SEM。统计学使用SPSS(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行计算。采用单因素ANOVA方法比较F值，如果p＞0.05，则采用Dunnett multiple comparisons teat计算参数数据的差异；如果p＜0.05，则用Mann-Whitney U non-parametric test比较差异。p＜0.05和p＜0.01被认为是具有统计学意义。

3.11 CT-NA缓解了LPS诱导的肺损伤

在LPS诱导后24小时，收集BALF通过Wright-Giemsa染色法分析CT-NA对细胞浸润的影响。与NS攻击组相比，LPS诱导加强了总细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞的浸润(P＜0.01)。然而，与载体处理的对照组相比，10和30mg/kg剂量的CT-NA以剂量依赖性的方式显著减弱LPS诱导的总细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞的增加，但不包括BALF中淋巴细胞(P＜0.01)，CT-NA剂量为30mg/kg时与1mg/kg的Dex表现基本相同(图17A)。分别通过测量SO₂和肺湿重系数来评估LPS诱导的低氧血症和肺水肿，结果表明与对照组相比，LPS诱导组显示较低的SO₂和较高的肺湿重系数(P＜0.01)，使用CT-NA按照10和30mg/kg剂量处理，以剂量依赖的方式显著提高SO₂(P＜0.01)并显著降低肺湿重系数(P＜0.01)(图17B和C)。10或30mg/kg的CT-NA、以及1mg/kg的Dex同样分别增强SO₂和降低肺湿重系数。上述结果表明通过CT-NA的CRTH2拮抗作用可以显著改善LPS诱导的ALI模型中肺部炎症，低氧血症和肺水肿。

3.2 CT-NA改善BALF中LPS诱导的促炎细胞因子和趋化因子的产生

分别使用ELISA试剂盒测量收集的BALF中IL-1β，TNF-α，IL-6和KC的表达水平，以此来确定CT-NA对促炎细胞因子和趋化因子产生的影响。与载体攻击组相比，LPS诱导显著增加IL-1β，TNF-α，IL-6和KC的表达(P＜0.01)，相反，10和30mg/kgCT-NA，1mg/kgDex以剂量依赖性的方式有效减少IL-1β，TNF-α，IL-6和KC的产生(P＜0.05或P＜0.01)(图18A-D)。这些数据意味着CT-NA对CRTH2的拮抗作用可以进一步保护LPS诱导的ALI小鼠避免促炎细胞因子和嗜中性粒细胞趋化因子引起的肺部炎症。

3.3 CT-NA减轻了LPS诱导的肺组织病理学变化

CT-NA对LPS诱导的肺组织病理学的保护作用是在H&E染色和石蜡包埋的肺切片中检查。受LPS诱导的小鼠与对照小鼠相比有显著的组织病理学变化(图19A)。相比之下，用10和30mg/kg的CT-NA或以1mg/kg的Dex处理LPS诱导的小鼠表现出显著减轻的这些组织病理学变化，使用CT-NA引起的组织病理学变化显示出剂量依赖性(图19A)。平均病理学评分，在炎症细胞的出血和浸润、嗜中性粒细胞进入细支气管周围和血管周围组织方面，与载体攻击相比，LPS诱导后显著增加(P＜0.01)，然而CT-NA在10(P＜0.05)和30mg/kg(P＜0.01)或Dex为1mg/kg剂量(P＜0.01)时显著降低了病理评分，CT-NA的结果再次显示出剂量依赖性(图19B)。因此，CT-NA阻断CRTH2受体显著降低了LPS诱导的肺损伤的严重程度，并逆转了LPS诱导的肺组织损伤。

3.4 CT-NA使肺血管通透性最小化

通过测定肺中的BALF中白蛋白含量和伊文思蓝染料的外转来测试CT-NA对LPS诱导的肺血管通透性的保护作用。与对照组相比，LPS诱导组BALF中白蛋白含量显著增加(P＜0.01)，而CT-NA为10mg/kg(P＜0.05)和30mg/kg(P＜0.01)或Dex为1mg/kg(P＜0.01)剂量时，显著降低了BALF中白蛋白含量(图20A)。与对照组相比，LPS诱导组伊文思蓝染料的肺血管渗漏和定量外渗明显增高(P＜0.01)，CT-NA给药10mg/kg(P＜0.05)和30mg/kg(P＜0.01)或Dex以1mg/kg(P＜0.01)剂量给药时显著降低LPS诱导的伊文思蓝染料的肺血管渗漏和外渗(图20B)。因此，这些结果表明CRTH2拮抗能有效改善LPS诱导的ALI小鼠的肺血管通透性。

3.5 CT-NA降低了LPS诱导的肺部MPO活性

MPO由活化的嗜中性粒细胞产生，是嗜中性粒细胞浸润和肺组织损伤的重要标志物。MPO活性的增加反映了活化的嗜中性粒细胞在肺中的积累。LPS诱导组小鼠的MPO活性明显高于对照组(P＜0.01)。CT-NA在10和30mg/kg(P均＜0.01)或Dex 1mg/kg(P＜0.01)剂量处理时显著减弱MPO活性，CT-NA再次表现出剂量依赖性(图21A)。因此，CT-NA阻断CRTH2受体可有效抑制嗜中性粒细胞浸润肺泡和间隙。

3.6 CT-NA减弱了体外PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移

使用transwell测定评价CT-NA对嗜中性粒细胞迁移的影响，因为ALI症状的主要原因是嗜中性粒细胞释放出有害的炎症介质。Wright-Giemsa评估了分离的嗜中性粒细胞的特征，并进行了细胞活性测定。活化的PGD₂/CRTH2受体促进嗜中性粒细胞迁移及其功能，因此我们使用PGD₂作为化学引诱物。孵育4小时后，观察到了明显的嗜中性粒细胞向PGD₂的迁移，浓度范围为1至10μM(P＜0.05或P＜0.01)(图21B)。用1和10μM CT-NA(P均＜0.01)或10μM的OC459(P＜0.01)预处理嗜中性粒细胞，显著减弱1μM的PGD₂诱导的嗜中性粒细胞迁移(图21C)。总的来说，这些数据表明CRTH2拮抗剂显著减弱嗜中性粒细胞向PGD₂的迁移。

3.7 LPS促进分离的腹膜巨噬细胞分泌PGD₂

用不同浓度的LPS诱导分离的腹膜巨噬细胞，采用ELISA试剂盒测定细胞外分泌的PGD₂蛋白的量。与载体处理相比，使用浓度为0.01～10μM的LPS(P均＜0.01)处理显著促进PGD₂的分泌(图21D)。

3.8 CT-NA减少LPS和PGD₂诱导的RAW264.7巨噬细胞和分离的腹膜巨噬细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子

促炎细胞因子是ALI发病机制的关键因素，通过过度表达的促炎细胞因子，巨噬细胞上PGD₂/CRTH2受体的活化显著恶化了疾病状况。因此，还在巨噬细胞中测试了CT-NA处理对LPS-或PGD₂诱导的促炎因子产生的影响。MTT测定表明，以100ng/ml剂量的LPS加高达100μM剂量的CT-NA，或以10μM剂量的PGD₂加高达100μM剂量的CT-NA对RAW264.7巨噬细胞或分离的腹膜巨噬细胞无毒性。CT-NA对促炎细胞因子和趋化因子表达的影响通过ELISA测量。CT-NA分别为10和100μM时以剂量依赖性的方式抑制IL-1β，TNF-α，IL-6和KC对LPS(图22A-D)或PGD₂(图22E-H)刺激响应的蛋白表达。定量RT-PCR证明CT-NA在10和100μM剂量时以剂量依赖性的方式降低了在LPS或PGD₂刺激的RAW264.7巨噬细胞(图23A-H)和分离的腹膜巨噬细胞(图24A-H)中IL-1β，TNF-α，IL-6和KC的mRNA表达(P均＜0.05或P均＜0.01)。因此，这些体外结果与图19所示的体内结果一致，表明CT-NA的CRTH2拮抗作用有效地改善了来源于LPS-或PGD₂-诱导的来自RAW264.7巨噬细胞及分离的腹膜巨噬细胞的促炎细胞因子和趋化因子的产生。

3.9 CT-NA在体外和体内抑制P65活化

CT-NA显著抑制LPS诱导的ALI的潜在机制通过蛋白质印迹分析进行探索。研究的重点是CT-NA对LPS诱导的NF-κB活化通路的影响，因为NF-κB是促炎介质活化，嗜中性粒细胞浸润和肺血管通透性增加所必需的。与载体处理组相比，使用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞和肺组织强烈诱导IκBα的磷酸化和降解，从而分别增加或减少磷酸化P65或P65水平(图25A和B)。用0.5，1.0，10和100μM的CT-NA处理RAW264.7巨噬细胞，或以10mg/kg或30mg/kg剂量处理ALI小鼠，以剂量依赖性的方式降低LPS诱导的IκBα和P65活性，并强烈逆转LPS诱导的IκBα和P65的降解(图25A和B)。因此，CRTH2受体拮抗剂CT-NA最有可能通过抑制NF-κB信号传导的方式保护小鼠免受LPS诱导的ALI。

综上，实验结果表明，本发明提供式A所示杂环化合物、其水合物、其药学上可接受的盐(例如碱金属盐)或者所述盐(例如碱金属盐)的水合物通过抑制肺部巨噬细胞和嗜中性粒细胞不恰当的转移，降低肺血管通透性，改善促炎性细胞因子和细胞因子趋化因子的产生和增强IL-10的产生，极大地缓解了由香烟烟雾CS诱导或LPS诱导的诱导的急性肺损伤。并且，由于可中止或减缓炎症性肺损伤、减轻肺水肿、保证组织供氧，表明本发明提供式A所示杂环化合物的晶型、其水合物的晶型、其药学上可接受的碱金属盐或者所述碱金属盐的水合物对于急性呼吸窘迫综合症具有较好的治疗或缓解作用。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.式A所示杂环化合物碱金属盐的至少一种在制备治疗香烟烟雾诱导的急性肺损伤中的用途，

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述碱金属盐为钠盐、锂盐或钾盐。

3.式A-N、A-L或A-K所示的化合物盐的结晶水合物中的至少一种在制备治疗香烟烟雾诱导的急性肺损伤中的用途：

式A-N所示的化合物为结晶水合物，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.8±0.2°、16.4±0.2°、16.7±0.2°、16.9±0.2°、17.1±0.2°、17.8±0.2°、18.6±0.2°、18.9±0.2°、21.7±0.2°、23.7±0.2°、24.0±0.2°处具有特征峰；

式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.7±0.2°、15.6±0.2°、16.6±0.2°、17.9±0.2°、18.5±0.2°、21.4±0.2°、24.0±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰；

式A-L所示的锂盐化合物为结晶水合物，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在5.6±0.2°、8.8±0.2°、11.8±0.2°、14.0±0.2°、16.3±0.2°、16.7±0.2°、16.9±0.2°、17.0±0.2°、17.7±0.2°、18.5±0.2°、18.8±0.2°、21.9±0.2°、23.9±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，式A-N所示的化合物为结晶水合物，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在5.6±0.2°、11.8±0.2°、14.0±0.2°、15.8±0.2°、16.4±0.2°、16.7±0.2°、16.9±0.2°、17.1±0.2°、17.8±0.2°、18.6±0.2°、18.9±0.2°、20.3±0.2°、21.7±0.2°、23.7±0.2°、24.0±0.2°、26.1±0.2°、28.1±0.2°、28.5±0.2°、29.8±0.2°处具有特征峰。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，式A-N所示的化合物为结晶水合物，所述结晶水合物具有基本上如图4所示的X射线粉末衍射谱图。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，其使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.7±0.2°、15.6±0.2°、15.9±0.2°、16.6±0.2°、17.4±0.2°、17.9±0.2°、18.5±0.2°、21.4±0.2°、23.5±0.2°、24.0±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在11.7±0.2°、14.0±0.2°、15.6±0.2°、15.9±0.2°、16.6±0.2°、17.4±0.2°、17.9±0.2°、18.5±0.2°、20.1±0.2°、21.4±0.2°、23.5±0.2°、24.0±0.2°、27.5±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°、28.6±0.2°、29.3±0.2°、29.6±0.2°处具有特征峰。

8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，式A-K所示的钾盐化合物为结晶水合物，所述式A-K所示化合物的结晶水合物具有基本上如图6所示的X射线粉末衍射谱图。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，式A-L所示的锂盐化合物为结晶水合物，所述式A-L所示化合物的结晶水合物具有基本上如图8所示的X射线粉末衍射谱图。