CN114410803B - 一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用，属于植物线虫分子检测技术领域。所述引物为特异性引物Dp‑482F和Dp‑829R，其核苷酸序列如下：Dp‑482F:5’‑GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC‑3’，Dp‑829R:5’‑CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC‑3’，该引物能特异性检测鳞球茎线虫；本发明还利用该特异性引物构建了检测鳞球茎线虫的方法，该特异性引物和方法的检测阈值高达10pg/μL基因组DNA和1/128头线虫。因此，本发明的引物灵敏度高，特异性强，在鳞球茎线虫的早期诊断和快速检测和预警等方面具有很高的应用价值。

Description

一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及植物线虫分子检测技术领域，特别是涉及一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用。

背景技术

鳞球茎茎线虫(拉丁名为Ditylenchus dipsaci(Kuhn,1987)Filijev)又称起绒草茎线虫，作为一种破坏性寄生线虫，拥有近500多种寄主种类，主要为害部位是茎组织，也对块状茎、鳞茎、球茎以及根状茎等部位有很大危害。该线虫的为害能造成很多农作物的减产，更严重者，能造成植株坏死。20年代，鳞球茎茎线虫使英国水仙种植业几乎毁灭，据报道在水仙上一个生长季节鳞球茎茎线虫可以增15000倍，能使整个鳞茎迅速毁坏。此外，鳞球茎茎线虫严重危害甜菜，并在寄主内大量繁殖，逐渐形成腐烂病，导致贮藏根系数腐坏。少量的鳞球茎茎线虫也能造成极大危害。研究表明，如果有每500g土壤1条线虫的存活量，该线虫即能造成洋葱等植株的减产。一旦其存在于土壤中，即可大量繁殖，非常难以根除。

在茎线虫的分子检测中，Wendt等(1993)开发了ITS-RFLP的技术，利用多种限制性内切酶酶切ITS序列，能够准确的区分马铃薯腐烂茎线虫和鳞球茎线虫。本发明申请人在前期的研究(宛菲等，2008)中发现，马铃薯腐烂茎线虫的ITS具有明显差异，可以分为明显的2种类型，A型和B型，据此设计出2对特异性引物检测A型和B型，A型鳞球茎线虫特异引物为DDS1/DDS2，特异扩增片段为252bp；B型鳞球茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为485bp；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测鳞球茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。Marek等(2010)等根据D.destructor和D.dipsaci的差异开发出能够同时检测上述两种线虫的特异性引物DipU-F/DipU-R，Des2-F/Des1-R，其中DipU-F/DipU-R能够特异的从D.dipsaci检测出333bp的片段，Des2-F/Des1-R能够特意的从马铃薯腐烂茎线虫中检测出453bp的片段。刘斌等(2007)根据马铃薯腐烂茎线虫的ITS序列设计了一组特异性引物，能够扩增出346bp的片段，但是检测的样本只包括了腐烂茎线虫。Esquibet et al.(2003)和Zouhar et al.(2007)分别开发出鳞球茎线虫的SCAR-PCR检测技术，扩增的片段分别为242bp和325bp。

近些年，在我国海关口岸连续从美国、加拿大、日本和西班牙等国家进口的大蒜、洋水仙种球、郁金香种球上截获过大量的鳞球茎线虫，但对于快速检测引物的开发，国内暂无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，能特异性检测鳞球茎线虫，为鳞球茎线虫快速PCR早期诊断和辅助鉴定等服务。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种快速检测鳞球茎线虫的引物，所述引物为特异性引物Dp-482F和Dp-829R，其核苷酸序列如下：

Dp-482F:5’-GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC-3’，

Dp-829R:5’-CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC-3’。

本发明还提供一种快速检测鳞球茎线虫的产品，包括所述的引物。

优选的是，所述产品包括试剂盒、试剂。

本发明还提供一种快速检测鳞球茎线虫的方法，包括利用所述的引物扩增待测样品目的基因片段的步骤。

优选的是，扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，10mM dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，引物Dp-482F和Dp-829R各1.0μL，DNA模板1μL，无菌蒸馏水补充至25μL。

优选的是，扩增条件为：94℃，5min；94℃,30s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min；4℃保存。

本发明还提供一种所述的引物在制备检测鳞球茎线虫试剂或者试剂盒中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明采用通用引物rDNA1和rDNA2扩增出鳞球茎线虫的ITS序列，通过和其他茎线虫的ITS序列比对和PCR检测，设计筛选出一对特异性引物Dp-482F和Dp-829R，并开发出鳞球茎线虫特异性的检测方法，实现了对鳞球茎线虫的检测。采用特异性引物Dp-482F和Dp-829R能够特异检测7个不同地理种群的鳞球茎线虫，扩增片段均为327bp，而其他7类茎线虫属13个种群均扩增到片段。为了降低检测的假阴性结果，在特异性检测的同时加入28s的通用引物D2A和D3B，用于DNA的检测，通用引物D2A和D3B能够从所有的有效的DNA中扩增出长度为780bp左右的片段，阳性的样本将同时出现了327bp的特异性片段和780bp的片段，而非鳞球茎线虫只有780bp的片段，从而降低了误检的可能。同时，通过特异性引物的灵敏度检测，显示鳞球茎线虫的特异性引物和检测方法的检测阈值分别为10ng/μL和1/128头线虫，具有很高的灵敏度。因此，本发明具有极高的特异性和灵敏度，能够快速对鳞球茎线虫进行分子诊断。该方法将可以应用于鳞球茎线虫的田间样品检测和发生分布的监测、预警，具有重要的实际的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明鳞球茎线虫与其他近源种的ITS序列比对及特异性引物设计；

图2为本发明不同引物扩增结果；M为标准DNA分子标记(DNA marker 2000)；1～10分别为10组不同的引物的PCR扩增结果；CK为阴性对照；

图3为本发明鳞球茎线虫特异性检测结果；M为标准DNA分子标记(DNA markerIII)；1～7分别为腐烂茎线虫不同群体(编码为1～7)；8～14分别为鳞球茎线虫不同群体(编码为8～14)；15为非洲茎线虫(编码为15)；16为D.Weischeri群体(编码为16)17为D.gagis群体(编码为18)，18为3个未知种的茎线虫(编码为17，19，20)；CK为阴性对照；

图4为本发明不同稀释倍数的单头鳞球茎线虫DNA灵敏度检测结果；M为标准DNA分子标记(DNA marker III)；1～8分别为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128条鳞球茎线虫；CK为阴性对照。

图5为本发明不同浓度的鳞球茎线虫基因组DNA灵敏度检测结果；M为标准DNA分子标记(DNA marker III)；1～8为鳞球茎线虫基因组DNA(100μg/μL、10μg/μL、1μg/μL、100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10pg/μL和1pg/μL)；CK：阴性对照。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明的实验选用的材料：

2个鳞球茎线虫群体(8号和9号)为本实验室从美国和加拿大等地收集,其他由国内各地海关从进口货物上截获，7个腐烂茎线虫从国内内蒙古通辽、河南郑州、吉林葫芦岛、山东菏泽、江苏铜山、美国和加拿大采集、非洲茎线虫、Ditylenchus weishceri，Ditylenchus gagis和其他茎线虫未知种的DNA为本实验室工作人员从外国收集(见表1)。上述鳞球茎线虫DNA为本实验室均有保存，可以对公众发放。

表1茎线虫种群样品代码及群体来源

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker和PMD 18-T vector购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

实施例1鳞球茎线虫特异性PCR引物设计与筛选

1、线虫DNA的提取

挑取单头待测的茎线虫种群，放入装有7mL的10×PCR缓冲液，3mL蛋白酶K溶液(600mg/mL)和10mL无菌水的PCR管中，液氮中速冻1min，同消毒的玻璃棒将冰快速磨碎，在液氮中重复速冻1min，再次用玻璃棒磨碎，然后在-20℃下冷冻至少2h。随后将PCR管转移到65℃下温育1.5h，在95℃条件下10min，最后12000rpm下离心1min，上清液于-20℃保存备用。

2、鳞球茎线虫ITS序列扩增

以上述鳞球茎线虫DNA为模板，采用通用引物，扩增鳞球茎线虫IT S序列。通用引物为：

rDNA1(SEQ ID NO:4)：5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’；

rDNA2(SEQ ID NO:5)：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’。

PCR的反应体系为：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，10mM dNTPs2μL，引物rDNA1和rDNA2(10μmol/L)各1.0μL，Taq酶(5U/μL,Tak ara)0.5μL，模板DNA 1μL，灭菌重蒸水补足25μL。在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

PCR扩增后，取5μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳1小时，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。

使用琼脂糖胶回收试剂盒，将通用引物rDNA1和rDNA2扩增获得的DNA片段进行回收和纯化，连接到PMD18-T Vector载体上，转化到E.coli中进行克隆，将PCR鉴定为阳性克隆的重组质粒委托生工生物(上海)公司进行测序(SEQ ID NO:1)。

TTGATTAGGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTGCCCGGGACTGAGCCATTTCGAGAAATTCGGGGATTGCCGATTAGCGGTCTTTCGGGATTGCTTTTTGGTGAGAACCAACTTAATCGCAGTGGCTTGAACCGGGCAAAAGTCGTAACAAGGTGGCTGTAGGTGAACCTGCTGCCGGATCATTATCGATCAACCAAAACACTAGGAATTGGACCTGGCTGGACCTTTTCCGTAGAATGAGGAATTCATTCTTACAGCCAATAGTCCAAGAGGGTGCCGTGATATTGGCACGATGCTCACTGGTGATGTCCCCACCGGTTTGCATGCTTATTCTTGGGCGAAAAAACGGCTCTGTTGGCTTCTATGGTTCTCTGAGCAGTTGTATGCCTACGTCCGTGGCTGCGTTGAAGAGAACTGGCACGTGGTCTTCGTGATCGCGAGAATCAATGAGTACCGGTTAGGTGCCGCCAACAAAAACCCCATTTTTGAACTTTTTTACAAGAAAACATTTCTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGTTCATAGATCGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATATATGGTGTGAACTGCAGATATTTTGAACACCAAGAATTCGAATGCACATTGCGCCACTGGATATCTATCCTTTGGCACATCTGGTTCAGGGTCGTAAATACCAAACGAAGGCTAATTCGTTGTTTATGACAAATTCATGGCGGTACTGGTTGGGTGCTTTTCCGTCAGTGTCATGTTTTTGTGAAGGGACTTGCCTACCGGATGATTTTGGCTGTTGATATACGTCTTTGCTAATCTAGACGGAATCGACTGGCTATTTCACTCTGGATGTACGTTGGCATCGATCTTCCGACCTGAGCTCAGTTGTGATTACCTGCTGAACTTAAGCATATCAGTAAGCAGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCTTAGTAACGGCGAGTGAAA

3、特异性引物设计和筛选

根据BLAST比对结果，从NCBI中下载花生茎线虫、食菌茎线虫、多叶茎线虫、D.askenasyi、非洲茎线虫、D.gagis、D.weisheri等多个近缘种线虫的rDNA-ITS序列，使用MEGA 6.0对上述序列及鳞球茎线虫ITS测序结果进行比对分析(见图1)。根据比对结果，采用primer5.0软件在鳞球茎线虫的特异区域设计出10组引物。分别以鳞球茎线虫DNA为模板，进行PCR扩增检测。PCR的反应体系扩扩增体系，同“2、鳞球茎线虫ITS序列扩增”所述。

PCR扩增后，取5μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳1小时，用EB染色，在紫光灯下观测并照相(见图2)。

根据电泳结果，其中图2的通道2的扩增产物单一，无其他杂带，因此选择该组引物用于下一步检测。鳞球茎线虫特异性引物上游引物和下游引物分别命名为Dp-482F和Dp-829R，其序列特征如下：

Dp-482F(SEQ ID NO:2)：5’-GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC-3’，

Dp-829R(SEQ ID NO:3)：5’-CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC-3’。

实施例2鳞球茎线虫PCR分子检测方法特异性和灵敏度检测

1、鳞球茎线虫PCR分子检测方法特异性检测

本发明设计的特异性引物Dp-482F/Dp-829R和通用引物D2A/D3B交由上海生物工程有限公司合成，PCR反应体系：2.5μL 10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2μL 10mM dNTP(2.5mM)，1.5μL引物对Dp-482F/Dp-829R(10μMol/L)，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25μL。以清水作为阴性对照。在Eppendorf 5331 PCR扩增仪上进行PCR扩增。

PCR反应条件如下：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

反应完成后，取5μL扩增产物加1μL 6×上样缓冲液，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，130V下电泳30min，用EB染色，在凝胶成像系统中观测并照相。同时，以rDNA-28S通用引物D2A和D3B对上述DNA进行扩增，扩增体系和条件同上，扩增产物电泳后，用以检测DNA的质量。

如图3所示，结果表明7个鳞球茎线虫种群(泳道8－14))经特异性引物Dp-482F/Dp-829R扩增出一条稳定的条带，长度为327bp，腐烂茎线虫等其他7种茎线虫种群和阴性对照中无扩增条带出现(见图3下图)。而采用通用引物D2A和D3B均从所有群体中稳定扩增出长度为780bp的条带(见图3上图)。上述结果表明：本发明设计的引物鳞球茎线虫Dp-482F/Dp-829R具有很高的特异性。

2、鳞球茎线虫PCR分子检测方法灵敏度检测

提取单条鳞球茎线虫的DNA，采用2倍稀释法，对DNA进行稀释，得到1，1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128条鳞球茎线虫的DNA(图4中泳道1～8)。各取1μL不同稀释倍数的鳞球茎线虫DNA做模板用特异性引物Dp-482F/Dp-829R进行PCR扩增，扩增体系和条件同上“1、鳞球茎线虫PCR分子检测方法特异性检测”，以检验特异性引物的灵敏度。PCR产物电泳结果如图4所示。

提法鳞球茎线虫的基因组DNA，采用Nanodrop2000测定其基因组DNA的浓度，采用无菌水将其稀释成100μg/μL、10μg/μL、1μg/μL、100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10pg/μL和1pg/μL 8个浓度，取1μL不同浓度的鳞球茎线虫DNA做模板，用特异性引物Dp-482F/Dp-829R进行PCR扩增，扩增体系和条件同上“1、鳞球茎线虫PCR分子检测方法特异性检测”，用以检验特异性引物的灵敏度。PCR产物电泳结果如图5所示。

如图4所示，结果表明：从1～1/128条线虫DNA中均能扩增出327bp清晰的条带(图4中泳道1～8)，阴性对照没有扩增条带(CK)。如图5所示，结果表明：该鳞球茎线虫的特异性引物和检测方法的检测阈值为10pg/μL(图5中泳道1～7)，说明该特异性引物及检测方法的具有极高的灵敏度。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

陕西省生物农业研究所

<120> 一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 967

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgattaggt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct gcccgggact gagccatttc 60

gagaaattcg gggattgccg attagcggtc tttcgggatt gctttttggt gagaaccaac 120

ttaatcgcag tggcttgaac cgggcaaaag tcgtaacaag gtggctgtag gtgaacctgc 180

tgccggatca ttatcgatca accaaaacac taggaattgg acctggctgg accttttccg 240

tagaatgagg aattcattct tacagccaat agtccaagag ggtgccgtga tattggcacg 300

atgctcactg gtgatgtccc caccggtttg catgcttatt cttgggcgaa aaaacggctc 360

tgttggcttc tatggttctc tgagcagttg tatgcctacg tccgtggctg cgttgaagag 420

aactggcacg tggtcttcgt gatcgcgaga atcaatgagt accggttagg tgccgccaac 480

aaaaacccca tttttgaact tttttacaag aaaacatttc tagtcttatc ggtggatcac 540

tcggttcata gatcgatgaa gaacgcagcc aactgcgata tatggtgtga actgcagata 600

ttttgaacac caagaattcg aatgcacatt gcgccactgg atatctatcc tttggcacat 660

ctggttcagg gtcgtaaata ccaaacgaag gctaattcgt tgtttatgac aaattcatgg 720

cggtactggt tgggtgcttt tccgtcagtg tcatgttttt gtgaagggac ttgcctaccg 780

gatgattttg gctgttgata tacgtctttg ctaatctaga cggaatcgac tggctatttc 840

actctggatg tacgttggca tcgatcttcc gacctgagct cagttgtgat tacctgctga 900

acttaagcat atcagtaagc agaggaaaag aaactaacaa ggattccctt agtaacggcg 960

agtgaaa 967

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgcgttga agagaactgg cac 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaaaagca cccaaccagt acc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgattacgt ccctgccctt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttcactcgc cgttactaag g 21

Claims (6)

1.引物在制备快速PCR早期诊断和辅助鉴定鳞球茎线虫和非鳞球茎线虫的试剂或者试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物为特异性引物Dp-482F和Dp-829R，其核苷酸序列如下：Dp-482F:5’-GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC-3’，Dp-829R:5’-CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC-3’；

利用所述引物鉴定鳞球茎线虫与非鳞球茎线虫时，扩增的反应体系为：10×PCRBuffer2.5μL，10mM dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，引物Dp-482F和Dp-829R各1.0μL，DNA模板1μL，无菌蒸馏水补充至25μL；

扩增条件为：94℃，5min；94℃30s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

2.一种快速检测鳞球茎线虫的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试剂。

4.一种快速检测鳞球茎线虫的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的引物扩增待测样品目的基因片段的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，10mM dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，引物Dp-482F和Dp-829R各1.0μL，DNA模板1μL，无菌蒸馏水补充至25μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增条件为：94℃，5min；94℃30s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

Images