CN114403127B - 一种间充质干细胞冷藏保护液及保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞冷藏保护液及保存方法，冷藏保护液包括如下组分：海藻糖、低分子肝素钙注射液、右旋糖酐40氯化钠注射液、人血白蛋白、复方电解质注射液。该冷藏保护液不含有DMSO等毒理成分，成分均为国家批准的注射级药辅材料，可直接静脉回输。本发明采用预冷式冷藏保存方法，能使细胞和保护液快速进入低温平衡状态而减少细胞损害，可用于间充质干细胞4℃冷藏条件下的长时间保存，并便于运输，减少了干细胞产品对地域的依赖性。

Description

一种间充质干细胞冷藏保护液及保存方法

技术领域

本发明属于干细胞生物学技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞冷藏保护液及保存方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成神经细胞，成骨细胞，软骨细胞，肌肉细胞及脂肪细胞等，这些特性使其在组织损伤性疾病和免疫性疾病的治疗中有重要的应用价值。

干细胞制备技术和治疗方案具有多样性、复杂性和特殊性。干细胞不同于其它药品，在体外很难长时间保持存活，而干细胞的活率和活性会影响到患者的医疗安全和疗效。在实际应用中，制备的干细胞制剂常常不能立即应用，因此合适的保存溶液和放置时间对细胞活性以及细胞活率影响很大，也是造成干细胞临床应用限制的重要因素。

干细胞保存技术临床上应用比较成熟的有两类：一是冷冻保存，包括液氮-196℃保存和-80℃冰箱保存。冷冻保存即零下温度保存。冷冻保存干细胞安全可靠，在液氮-196℃条件下还可以长久保存。但是冷冻保存的干细胞在临床上不能直接使用，细胞需要解冻，并重悬于细胞输注液中使用。而细胞冷冻和解冻过程需要非常专业的操作，涉及加入冷冻保护剂并分装、降温、储存、熔化、清洗、回输等阶段，在此过程中的每一个环节都会造成细胞损伤和死亡。冷冻保存的细胞使用前需增加无菌洁净环境下清洗及终产品检测环节，一般临床机构难以实现上述操作，限制了干细胞的临床使用。二是冷藏保存，即4℃非冷冻保存。4℃保存干细胞，方法简单，回输前无需解冻，只需细胞复温后即可直接回输使用。4℃保存干细胞，细胞不经过冷冻损伤，细胞中不含DMSO等冷冻保护剂成分，无相关不良反应。但是目前冷藏保存的细胞，保存时间很短，通常需要在12小时以内使用，在临床应用上也受到很大限制。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种间充质干细胞冷藏保护液及保存方法，该冷藏保护液不含有DMSO等毒理成分，成分均为国家批准的注射级药辅材料，可直接静脉回输。本发明采用预冷式冷藏保存方法，能使细胞和保护液快速进入低温平衡状态而减少细胞损害，可用于间充质干细胞4℃冷藏条件下的长时间保存，并便于运输，减少了干细胞产品对地域的依赖性。该冷藏保护液及保存方法可用于间充质干细胞4℃冷藏条件下的长时间保存。该干细胞长时间保存方法无需细胞冻存操作，减少细胞冻存环节造成的细胞损伤，并能避免临床上因干细胞冷冻保护剂成分引起的不良反应。细胞存活率高，且可直接静脉回输。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种间充质干细胞冷藏保护液，所述冷藏保护液包括如下组分：海藻糖、低分子肝素钙注射液、右旋糖酐40氯化钠注射液、人血白蛋白、复方电解质注射液。

进一步地，所述冷藏保护液包括如下组分：

优选地，所述冷藏保护液包括如下组分：

优选地，所述冷藏保护液中的低分子肝素钙注射液的型号为10250AXaIU/ml。

本发明的目的还在于提供一种间充质干细胞冷藏保存方法，基于上述冷藏保护液实现，包括如下步骤：

(1)将冷藏保护液过滤除菌，滤液置于4℃预冷；

优选地，采用0.22μm过滤除菌。

(2)将脐带间充质干细胞与冷藏保护液混合，之后转移至4℃冷藏保存。

优选地，按照1～2×10⁷个/ml的浓度将脐带间充质干细胞与冷藏保护液混合。

优选地，还包括将脐带间充质干细胞与冷藏保护液混合后置于-20℃预冷3～5min，再转移至4℃冷藏保存。

与现有技术相比，本发明提供的间充质干细胞冷藏保护液及保存方法具有以下优势：

(1)本发明提供的间充质干细胞冷藏保护液，在人血白蛋白、海藻糖、右旋糖酐40的相互协同作用下，实现4℃冷藏条件下的细胞内外平衡，维持细胞活性。同时在低分子肝素钙存在下，降低因细胞相互黏附而引起的聚集性凋亡，可实现间充质干细胞4℃冷藏条件下的长时间保存，减少了干细胞产品对地域的依赖性。

(2)本发明提供的间充质干细胞冷藏保护液，均为国家批准的注射级药辅材料，且不含有DMSO等毒理成分，具有更高的安全性，无须进一步的洁净间离心清洗和质量检测，即可直接注射使用，临床应用前景好。

(3)本发明提供的间充质干细胞冷藏保护液，在配置过程中采用了预冷工艺，能使细胞和保护液快速进入低温平衡状态，使细胞在内部不产生冰晶的状态下迅速进入低代谢状态，达到更好的细胞保护。

附图说明

图1：细胞在冷藏5d后进行的间充质干细胞表型流式鉴定结果。

图2：细胞在冷藏5d后重新接种并培养24h的细胞贴壁生长状态，40×。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。

低分子肝素钙注射液为葛兰素史克(天津)有限公司生产，规格为0.4ml:4100AXaIU；

海藻糖(注射级)为Hayashibara生产，规格100g；

6％右旋糖酐40(LMD)/0.9％氯化钠注射液为石家庄四药有限公司生产，规格为500ml:30g右旋糖酐40(LMD)与4.5g氯化钠；

复方电解质注射液为四川科伦药业股份有限公司生产，组分为：每1000ml含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g；

人血白蛋白注射液为Octa pharma生产，规格为50ml，注射液含:10g总蛋白质，其中至少96％为人血白蛋白；

0.9％氯化钠注射液为山东华鲁制药有限公司生产，规格为500ml。

对比例

采用常规细胞冷藏保护液：15％(v/v)人血白蛋白注射液/0.9％氯化钠注射液。作为对照，将1×10⁷个脐带间充质干细胞与1ml的冷藏保护液混合后，转移至4℃冰箱冷藏保存。

实施例1-3

配置含有不同浓度(w/v)海藻糖的冷藏保护液，各组试剂用量如下表所示。将配置好的各组冷藏保护液，用0.22μm滤膜过滤除菌，滤液置于4℃预冷(使滤液温度为4℃)。将1×10⁷个脐带间充质干细胞与1ml的冷藏保护液混合后，转移至4℃冰箱冷藏保存。

分别于0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天从冰箱中取出各组细胞混悬液，混合均匀，吸取50μL，稀释适当倍数后用0.4％台酚蓝染色，加入细胞计数板进行细胞计数，并计算细胞活率(见下表)，分析活细胞率、储存时间与海藻糖的关系，每组实验重复3次。

组别

0天

1天

2天

3天

4天

5天

6天

实施例1

97.3±2.1

93.3±1.0

90.6±2.0

85.1±1.4

75.3±1.1

67.5±1.9

60.2±1.6

实施例2

97.3±2.1

95.7±1.5

93.3±1.1

89.8±1.3

83.1±1.7

77.2±1.4

71.5±2.5

实施例3

97.3±2.1

92.7±1.8

89.3±1.9

83.8±0.9

77.1±2.2

70.2±2.4

63.5±1.5

对照组

97.3±2.1

70.2±1.7

52.4±1.3

35.1±2.0

21.5±3.3

—

—

通过细胞活率比较可知，采用常规冷藏保护液(对照组)进行细胞存储，细胞冷藏1天后，细胞活率即降到80％以下。采用本发明所用的冷藏液配方，在海藻糖浓度(w/v)2％条件下，细胞在4℃条件下放置4天，细胞活率仍为80％以上。

实施例4-6

配置含有不同浓度(v/v)人血白蛋白注射液的冷藏保护液，各组试剂用量如下表所示。将配置好的各组冷藏保护液，用0.22μm滤膜过滤除菌，滤液置于4℃预冷(使滤液温度为4℃)。将1×10⁷个脐带间充质干细胞与1ml的冷藏保护液混合后，转移至4℃冰箱冷藏保存。

分别于0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天从冰箱中取出各组细胞混悬液，混合均匀，吸取50μL，稀释适当倍数后用0.4％台酚蓝染色，加入细胞计数板进行细胞计数，并计算细胞活率(见下表)，分析活细胞率、储存时间与人血白蛋白注射液的关系，每组实验重复3次。

组别

0天

1天

2天

3天

4天

5天

6天

实施例4

98.1±1.9

92.7±1.6

87.7±3.6

83.8±4.1

78.1±1.7

70.2±5.0

63.3±1.5

实施例5

98.1±1.9

96.7±3.7

90.1±3.2

86.8±3.5

82.2±1.5

75.2±3.4

69.4±4.5

实施例6

98.1±1.9

95.9±5.1

91.3±1.8

86.7±4.5

81.9±4.2

72.1±4.8

65.5±3.8

对照组

98.1±1.9

72.6±3.5

50.4±4.2

37.1±2.9

22.5±4.7

—

—

通过细胞活率比较可知，采用常规冷藏保护液(对照组)进行细胞存储，细胞冷藏1天后，细胞活率即降到80％以下。采用本发明所用的冷藏液配方，在人血白蛋白注射液浓度(v/v)为20％和25％条件下，细胞在4℃条件下放置4天，细胞活率均为80％以上，考虑到成本等其它因素，本发明优选20％人血白蛋白注射液浓度为最佳。

实施例7

按照下表(实施例2)配方配置冷藏保护液，将配置好的保护液用0.22μm滤膜过滤除菌，滤液置于4℃预冷(使滤液温度为4℃)。将1×10⁷个脐带间充质干细胞与1ml的冷藏保护液混合后，置于-20℃预冷0～9min，之后转移至4℃冰箱冷藏保存。

细胞冷藏5天后，吸取100μL，稀释适当倍数后用0.4％台酚蓝染色，加入细胞计数板进行细胞计数，并计算细胞活率(见下表)，每组实验重复3次。

-20℃预冷时间

0min

1min

3min

5min

7min

9min

细胞活率％

76.6±1.8

78.4±1.4

84.3±1.4

86.2±1.6

67.3±1.2

50.1±1.0

通过细胞活率比较可知，在冷藏前进行适当时间的细胞的快速预冷(-20℃)可以提高干细胞的冷藏活率，试验显示预冷时间在5min为最优。但是更长时间的预冷(大于7分钟)，细胞冷藏液会发生结冰现象，会对细胞造成损害，造成细胞活率的快速下降，因此预冷的时间需要限定为3～5分钟，本发明优选预冷时间为5分钟。

测试例

按照实施例2的配方配置细胞冷藏保护液，并与1×10⁷个脐带间充质干细胞混合，置于-20℃冰箱预冷5min，之后转移至4℃冷藏保存。细胞冷藏5天后，取出细胞，进行检测：(1)细胞表型流式鉴定

取出冷藏5天的细胞，转移至50ml离心管，加入适量PBS，400g，离心10min，弃上清，收集细胞，PBS重悬细胞，使其密度保持在5×10⁶～10×10⁶/ml之间；交由北京金域医学检验实验室有限公司，按照人间充质干细胞特异性表面抗原的鉴定流程，进行间充质干细胞表型鉴定。具体鉴定的指标包括有CD73、CD90、CD105，HLA-DR、CD34、CD45、CD11b、CD19。

从细胞表型流式鉴定(图1)的结果可知，细胞在经5天冷藏后，各项表型指标均未发生改变，仍保持间充质干细胞的表型稳定性。

(2)24h细胞贴壁情况检测

取出冷藏5天的细胞，转移至50ml离心管，加入适量PBS，400g，离心10min，弃上清，收集细胞，添加含有无血清添加物的α-MEM完全培养基进行重悬，按照5×10⁶个细胞/瓶，将其接种于T175瓶中，待细胞贴壁培养24h后观察细胞形态，同时进行细胞贴壁率检测。

从细胞贴壁培养24h后观察细胞形态(图2)可知，细胞多数都已贴壁，且呈梭形生长，符合间充质干细胞的贴壁形态，细胞贴壁率为73％。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一种间充质干细胞冷藏保护液，其特征在于，所述冷藏保护液包括如下组分：

2.一种间充质干细胞冷藏保存方法，基于权利要求1所述的一种间充质干细胞冷藏保护液实现，包括如下步骤：

1)将冷藏保护液过滤除菌，滤液置于4℃预冷；

2)按照1～2×10⁷个/ml的浓度将脐带间充质干细胞与冷藏保护液混合后置于-20℃预冷3～5min，之后转移至4℃冷藏保存。

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