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CN114409824B - 毛霉胞外多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

毛霉胞外多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114409824B CN202210169055.XA CN202210169055A CN114409824B CN 114409824 B CN114409824 B CN 114409824B CN 202210169055 A CN202210169055 A CN 202210169055A CN 114409824 B CN114409824 B CN 114409824B
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Abstract

本发明提供了毛霉胞外多糖及其制备方法和应用，与现有技术相比，本发明通过乙醇沉法从毛霉(Mucor sp.)发酵液中提取出胞外多糖；所制备的胞外多糖重均分子量为7.78×104Da，主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.466:0.169:0.139:0.126:0.015。本发明制备的胞外多糖以剂量依赖性的方式抑制人胃腺癌细胞SGC‑7901的增殖，通过诱导SGC‑7901细胞凋亡来发挥抗肿瘤活性；可用于制备治疗肿瘤的药物，尤其用于制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。

Description

毛霉胞外多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，毛霉胞外多糖及其制备方法和应用。
背景技术
毛霉(Mucor)属真菌界接合菌门，常存在于土壤、空气、水果和蔬菜等环境中，繁殖迅速，菌丝发达繁密。毛霉所产的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等可以水解大豆中的蛋白、糖类和脂肪等化合物从而制成腐乳、豆豉等物质，这是毛霉在食品发酵工业占据重要地位的原因。随着微生物发酵食品工艺的不断发展和人们对发酵食品质量安全问题的日益重视，越来越多的研究者发现毛霉的代谢产物是一类值得研究和开发的微生物资源。深入挖掘并分析毛霉代谢产物这类生物大分子的理化性质，有助于开拓毛霉在食品发酵工业上的其它应用，有助于从食品发酵类微生物资源中寻找天然活性成分。
真菌多糖是一类从真菌子实体、菌丝体及其发酵液中分离出的天然高分子聚合物，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生理活性，在开发新药方面具有重要的研究价值。大量研究表明真菌多糖的生物活性与其相对分子质量、单糖组成与含量、糖苷键类型和糖环构型等相关。按照多糖产生位置的不同，将真菌多糖分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖三种，其中胞外多糖因具备易于分离、可通过液体发酵获得和生产周期短等优势而备受研究者青睐。
目前有关毛霉胞外多糖的研究较少，且集中在粗多糖的增强免疫力与抗病毒作用等方面。
发明内容
本发明的目的在于提供毛霉胞外多糖及其制备方法，通过乙醇沉法从毛霉(Mucorsp.)发酵液中提取出胞外多糖。
本发明还有一个目的在于提供毛霉胞外多糖的应用，用于制备治疗肿瘤的药物，尤其用于制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。
本发明具体技术方案如下：
毛霉胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)毛霉培养；
2)毛霉胞外粗多糖的提取：将步骤1)制备的毛霉发酵液抽滤除去菌丝体，浓缩后加入乙醇溶液，静置过夜后倾去上清液取底部沉淀，沉淀加水复溶，离心，收集上清液，将上清液浓缩后加入木瓜蛋白酶，加热酶解反应后加入Sevag液混合振荡离心，直至离液面交界处无白色混悬，收集上层水相溶液，通过蒸发除去残留的试剂、脱色，收集洗脱液，旋蒸后滤膜过滤除菌，透析后，经冷冻干燥得到毛霉胞外粗多糖；
3)胞外多糖分离纯化。
步骤1)具体为：
毛霉(Mucor sp.)接种于PDA平板固体培养基活化后，用接种针挑取边缘菌落接入液体培养基中，于26℃～30℃、100～180r/min恒温振荡箱中培养5～9d。
所述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板固体培养基的制备方法：称取200g马铃薯洗净去皮，切成小块，加入1000mL水，煮至能被玻璃棒戳破，用四层纱布过滤，加入16g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后补足水分至1000mL，分装于锥形瓶中，加塞、包扎，高压蒸汽灭菌20min，冷却后贮存备用。
所述液体培养基的配制方法为：称取200g马铃薯洗净去皮，切成小块，加入1000mL水，煮至能被玻璃棒戳破，用四层纱布过滤，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后补足水分至1000mL，分装于锥形瓶中，加塞、包扎，高压蒸汽灭菌20min，冷却后贮存备用。
步骤2)优选的提取方法为：
将步骤1)培养后获得的5L毛霉发酵液经布氏漏斗抽滤除去菌丝体，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积的95％乙醇(v/v)，多糖不溶于乙醇以白色絮状沉淀析出，静置过夜后倾去上清液取底部沉淀，5000～15000r/min离心10～20min，弃上清，沉淀加水复溶，5000～15000r/min离心10～20min，收集上清，将上清液浓缩至300mL，再加入0.1g木瓜蛋白酶，于37～60℃水浴锅中酶解反应1～6h，再加入酶解反应后溶液1/3体积的Sevag液，通过10～15次的混合、振荡、离心直至离液面交界处无白色混悬，收集上层水相溶液，通过旋转蒸发除去残留的试剂；随后用D301型大孔树脂对溶液进行脱色，收集洗脱液，旋蒸浓缩，0.22μm滤膜过滤除菌，使用再生纤维素透析袋，截留分子量1000～10000Da，于4℃冰箱透析24～72h，收集截留液经冷冻干燥得到毛霉胞外粗多糖。
所述Sevag液是指体积比氯仿：正丁醇＝4：1的混合溶液。
步骤3)中所述分离纯化包括离子交换柱层析和凝胶柱层析。
所述离子交换柱层析具体为：
将步骤2)制备的毛霉胞外粗多糖配置为水溶液，用0.45μm一次性针头过滤器除杂，将样品缓慢加入到DEAE-52阴离子交换柱，流动相为水和NaCl溶液，在恒流泵加压下依次用水和NaCl溶液梯度洗脱，采用自动部分收集器收集洗脱液，浓缩并透析脱盐后冻干。
所述凝胶柱层析具体为
将离子交换柱层析纯化后的样品配制成样品溶液，用0.22μm滤器除杂后，将样品缓慢加入到Sephadex G-100凝胶柱，流动相为水，收集洗脱液，用蒽酮硫酸法检测各管糖含量并绘制洗脱曲线，收集主峰部分，浓缩透析冻干得毛霉胞外多糖。
本发明提供的毛霉胞外多糖，采用上述方法制备得到。所述毛霉胞外多糖重均分子量为7.78×104Da，主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.466:0.169:0.139:0.126:0.015。
本发明提供的毛霉胞外多糖的应用，用于制备治疗肿瘤的药物。尤其用于制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。所述毛霉胞外多糖能够抑制人胃腺癌细胞SGC-7901的增殖、诱导SGC-7901细胞凋亡来发挥抗肿瘤活性。
与现有技术相比，本发明通过乙醇沉法从毛霉(Mucor sp.)发酵液中提取出胞外多糖，采用DEAE-52和Sephadex G-100色谱柱分离纯化得到胞外多糖MSEPS(Mucorsp.Exopolysaccharide,MSEPS)，通过高效凝胶渗透色谱、离子色谱、红外分光光度法、气质联用色谱和核磁共振等技术方法对MSEPS的结构进行表征，以MTT法、Hoechst33258染色法和流式细胞术来评价MSEPS的体外抗肿瘤活性。结果显示MSEPS的重均分子量为7.78×104Da，主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.466:0.169:0.139:0.126:0.015。MSEPS的主链为→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→，端基α-L-Araf-(1→连在→6)-α-D-Manp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→的O-3键上。MTT结果提示MSEPS以剂量依赖性的方式抑制人胃腺癌细胞SGC-7901的增殖，Hoechst33258染色和流式细胞术实验表明MSEPS通过诱导SGC-7901细胞凋亡来发挥抗肿瘤活性。以上研究结果表明从毛霉发酵液中提取到的胞外多糖MSEPE在生物医学领域具有潜在的应用。能够用于制备治疗肿瘤的药物。尤其用于制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。
附图说明
图1为本发明毛霉胞外粗多糖制备流程；
图2为MSEPS在DEAE-52离子交换柱上的梯度洗脱图；
图3为MSEPS在Sephadex G-100凝胶柱上的梯度洗脱图；
图4为MSEPS的HPGPC色谱图；
图5为MSEPS的红外光谱；
图6为MSEPS的1H NMR谱；
图7为MSEPS的13C NMR谱；
图8为MSEPS的1H-13C HSQC谱；
图9为MSEPS的1H-1H COSY谱；
图10为MSEPS的1H-13C HMBC谱；
图11为MSEPS的NOESY谱；
图12为MSEPS对HK-2细胞(A)和SGC-7901细胞(B)活力的影响；
图13为MSEPS处理对SGC-7901细胞或细胞核形态改变的影响；
图14为MSEPS对SGC-7901细胞凋亡的影响。
具体实施方式
本发明所用的试剂与仪器具体如下：
试剂：毛霉Mucor sp.(编号CICC 3039，中国工业微生物菌种保藏管理中心)；人胃腺癌细胞SGC-7901细胞(碧云天生物技术有限公司)；三氯甲烷、氯仿、蒽酮、硫酸、氢氧化钠和氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；二乙氨基乙基纤维素-52(DEAE-52)阴离子交换树脂、交联葡聚糖凝胶-100(Sephadex G-100)、D301大孔树脂和木瓜蛋白酶(800000U/g)(北京索莱宝科技有限公司)；透析袋(截留分子量3500Da，上海源叶生物科技公司)；RPMI1640基础培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(LONSA SCIENCE SRL公司)；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和Hoechst33258染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。
仪器：LC-20AP半制备高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm，BoRui Saccharide公司)；Epoch全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司)；N-1100旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)；层析柱(2.5×40cm，1.5×60cm)、BSZ-100自动部分收集器和HL-2D定时数显恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司)；4K15低速大容量冷冻离心机(德国SIGMA公司)；KYC-1102大容显双层恒温摇床(上海新苗朕疗器械制造有限公司)；ICS5000离子色谱仪(ThermoFisher公司)；GCMS-QP201气相质谱联用仪(日本Shimadzu公司)；600MHz核磁共振波谱仪(Bruker公司)；IX53荧光正置显微镜和IX51荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；FACSVerse流式细胞仪(美国Becton,Dickinson公司)；CO2培养箱(美国SIM INTERNATIONAL GROUP公司)。
实施例1
毛霉胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)毛霉的培养：
毛霉Mucor sp.接种于PDA平板固体培养基活化后，用接种针挑取边缘菌落接入锥形瓶液体培养基中，在28℃、130r/min恒温振荡箱中培养6d。
所用液体培养基的配制：称取200g马铃薯洗净去皮，切成小块，加入1000mL水，煮至能被玻璃棒戳破，用四层纱布过滤，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后补足水分至1000mL，分装于锥形瓶中，加塞、包扎，高压蒸汽灭菌20min，冷却后贮存备用。
2)毛霉胞外多糖的提取：
步骤1)制备的5L毛霉发酵液经布氏漏斗抽滤除去菌丝体，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积的95％乙醇溶液，多糖不溶于乙醇以白色絮状沉淀析出，静置过夜后倾去上清液取底部沉淀，8000r/min离心10min，弃上清，沉淀加水复溶，8000r/min离心10min，收集上清，将上清液浓缩至300mL，再加入0.1g木瓜蛋白酶，于40℃水浴锅中酶解反应5h，再加入多糖1/3体积的Sevage液(氯仿：正丁醇＝4：1，v/v)，通过数次的混合、振荡、离心直至离液面交界处无白色混悬，收集上层水相溶液，通过旋转蒸发除去残留的试剂。随后用D301型大孔树脂对溶液进行脱色，收集洗脱液，旋蒸至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，使用再生纤维素透析袋(截留分子量3500Da)于4℃冰箱透析72h，收集截留液经冷冻干燥得到毛霉胞外粗多糖，制备流程如图1所示。
3)胞外多糖的分离纯化：
3-1)DEAE-52离子交换柱层析：
将步骤2)制备的毛霉胞外粗多糖配制10mg/mL的粗多糖溶液10mL，用0.45μm一次性针头过滤器除杂，将样品缓慢加入到DEAE-52阴离子交换柱(2.5×40cm)，流动相为水和NaCl溶液，在恒流泵加压下依次用0、0.2、0.4、0.8和1.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速为0.7mL/min，采用自动部分收集器收集洗脱液，7mL/管，用蒽酮硫酸法跟踪检测各管糖含量，以吸光度对管数绘制洗脱曲线，确定合适洗脱浓度的NaCl溶液，收集合并各梯度中含糖组分，浓缩并透析脱盐后冻干。
粗多糖溶液经过DEAE-52柱时，中性多糖流出，阴离子多糖吸附在色谱柱上。通过DEAE-52分离毛霉胞外粗糖，主要得到两个组分，分别是水洗脱下的中性多糖和0.2mol/LNaCl洗脱下的阴离子多糖，洗脱曲线见图2。阴离子多糖因表面带负电，可与带正电荷的物质发生反应，起到免疫调节、抗病毒和抗肿瘤等作用。本发明选择0.2mol/L NaCl洗脱下的阴离子多糖作为进一步研究对象。
3-2)Sephadex G-100凝胶柱层析：
称取20mg经DEAE-52纯化后的样品，配制成5mg/mL的样品溶液，用0.22μm滤器除杂后，将样品缓慢加入到Sephadex G-100凝胶柱，流动相为水，流速为0.3mL/min，部分收集器收集洗脱液，3mL/管，用蒽酮硫酸法检测各管糖含量并绘制洗脱曲线，收集主峰部分，浓缩透析冻干得相应组分。
采用Sephadex G-100凝胶柱对阴离子多糖进行纯化，如图3所示，阴离子多糖过Sephadex G-100凝胶柱后呈现为单一的主峰，收集峰尖部分，浓缩透析冻干得纯品胞外多糖，命名为MSEPS(Mucor sp.Exopolysaccharide,MSEPS)。
如图1所示，本发明5L发酵液经醇沉、脱色和脱蛋白后得到淡黄色粉末状胞外粗糖1.57g，由此计算胞外多糖得率为约为314mg/L。
上述制备的胞外多糖进行以下检测：
1、上述制备的胞外多糖纯度分析及分子量测定：
采用高效凝胶渗透色谱法(High performance gel permeationchromatography,HPGPC)测定多糖分子量。
色谱方法：色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)，检测器为示差检测器RI-10A，流动相为0.05mol/L NaCl溶液，流速为0.6mL/min，进样量为20μL。
标准曲线的制作：已知分子量的系列标准葡聚糖(MW:667.8、409.8、273、148、80.9、48.6、23.8、11.6和5kDa)。加流动相溶解，配成5mg/mL的溶液。运用GPC分析软件以标准多糖分子量的对数对保留时间作图，绘制标准曲线。
MSEPS的分子量测定：将样品配制成5mg/mL的溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，进样20μL。根据出峰时间对照标准曲线代入回归方程算得样品分子量。
本发明制备的MSEPS的HPGPC色谱图见图4，其在色谱柱上呈现单一对称峰，说明MSEPS纯度较高，可以进行后续分析。将其保留时间为38.316min代入标准曲线方程计算出MSEPS的重均分子量为7.78×104Da，峰位分子量为6.29×104Da，数均分子量为5.24×104Da。
2、上述制备的胞外多糖单糖组成分析：
标准溶液的配制及计算方法：取13种单糖标准品(fucose-岩藻糖，rhamnose-鼠李糖，arabinose-阿拉伯糖，galactose-半乳糖，glucose-葡萄糖，xylose-木糖，mannose-甘露糖，fructose-果糖，ribose-核糖，galacturonic acid-半乳糖醛酸，guluronic acid-古罗糖醛酸，glucuronic acid-葡萄糖醛酸，mannuronic acid-甘露糖醛酸)配成约10mg/mL的标准溶液，取各单糖标准溶液精密配置5mg/mL的梯度浓度标准品作为标准品。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。
MSEPS的准备：精密称量10mg样品(上述Sephadex G-100凝胶柱层析最后浓缩透析冻干产物作为样品)置于安瓿瓶中，加入3mol/L的三氟乙酸TFA10mL，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹干，加入5mL水涡旋混匀，吸取100μL加入900μL去离子水，12000rpm离心5min，取上清进离子色谱分析。
色谱方法：色谱柱为DionexCarbopacTMPA20(3×150mm)；流动相为A:H2O B:15mmol/L NaOH C:15mmol/L NaOH和100mmol/L NaOAc；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；柱温：30℃；检测器为电化学检测器。
MSEPS的单糖组成见表1。MSEPS同标准品的分析方法，通过对比MSEPS与标准品的保留时间确定单糖种类，得出MSEPS主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.466:0.169:0.139:0.126:0.015，还含有少量的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，其中甘露糖含量最高。
3、胞外多糖红外光谱分析：
取1～2mg MSEPS，与200mg纯KBr一起研细均匀，置于模具中，在油压机上压成透明薄片，将样品放入红外光谱仪中测试，波数范围4000-500cm-1，扫描次数32，分辨率4cm-1。
MSEPS的红外光谱见图5，3400cm-1处的强吸收峰为O-H伸缩振动峰；2940cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动峰；1650cm-1处的吸收峰为结合水的吸收峰；1420cm-1处的吸收峰为C-H的变角振动峰；1050cm-1处的吸收峰是C-O-C的伸缩振动峰。
4、胞外多糖甲基化分析：
称取2mg干燥的MSEPS粉末置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，随后快速加入0.6mg的NaOH溶液，在超声作用下溶解，向混合物中加入0.6mL的碘甲烷溶液，在磁力搅拌水浴下30℃反应1h，将2mL超纯水加入到反应混合物中以终止甲基化反应。加入二氯甲烷混匀，分层，收集有机相，通过旋转蒸发除去有机溶剂。甲基化后的样品，加入1mL 2mol/L的三氟乙酸于120℃水解2h。向水解后烘干的样品中加入2mL双蒸水并用60mg硼氢化钠还原8h，随后加入冰醋酸中和样品，减压浓缩蒸干。向还原后的样品中加入1mL醋酐于100℃反应2h，待冷却，减压浓缩蒸干，重复4次，除去多余的醋酐。将乙酰化后的样品用3mL二氯甲烷溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡，除去上层水溶液。二氯甲烷层以适量的无水硫酸钠干燥，定容至10mL，放入液相小瓶，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪。GC-MS条件：色谱柱为RXI-5SIL MS(30m×0.25mm×0.25μm)，升温程序：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min；进样口和检测器温度都设为250℃；载气为氦气，流速为1mL/min。
GC-MS结果如表2所示，显示MSEPS中主要存在的连接方式有→6)-Manp-(1→,→3,6)-Manp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,Fucp-(1→,和Araf-(1→。
表1 MSEPS的单糖组成分析
保留时间(min) 单糖组成 相对摩尔比
5.684 岩藻糖 0.139
11.359 鼠李糖 0
11.909 阿拉伯糖 0.126
14.900 半乳糖 0.169
16.967 葡萄糖 0.015
20.209 木糖 0
20.750 甘露糖 0.466
24.367 果糖 0
27.884 核糖 0
44.942 半乳糖醛酸 0.005
45.992 古罗糖醛酸 0
48.034 葡萄糖醛酸 0.008
50.817 甘露糖醛酸 0
表2 MSEPS的甲基化分析数据
保留时间 甲基化糖苷 质何碎片(m/z) 摩尔比 糖链接类型
9.223 2,3,5-Me<sub>3</sub>-Araf 43,71,87,101,117,129,145,161 0.119 Araf-(1→
11.669 2,3,4-Me<sub>3</sub>-Fucp 43,59,72,89,101,115,117,131,175 0.128 Fucp-(1→
16.274 2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-Manp 43,71,87,101,117,129,145,161,205 0.025 Manp-(1→
17.271 2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-Galp 43,71,87,101,117,129,145,161,205 0.018 Galp-(1→
20.564 3,4,6-Me<sub>3</sub>-Manp 43,87,129,161,189 0.041 →2)-Manp-(1→
20.885 2,3,6-Me<sub>3</sub>-Galp 43,87,99,101,113,117,129,131,161,173,233 0.025 →4)-Galp-(1→
22.241 2,3,4-Me<sub>3</sub>-Glcp 43,87,99,101,117,129,161,189,233 0.009 →6-Glcp-(1→
22.474 2,3,4-Me<sub>3</sub>-Manp 43,71,87,99,101,117,129,159,161 0.282 →6)-Manp-(1→
24.166 2,3,4-Me<sub>3</sub>-Galp 43,87,99,101,117,129,161,189,233 0.052 →6)-Galp-(1→
28.430 2,4-Me<sub>2</sub>-Manp 43,87,117,129,159,189,233 0.099 →3,6)-Manp-(1→
29.438 2,4-Me<sub>2</sub>-Galp 43,87,117,129,159,189,233 0.066 →3,6)-Galp-(1→
5、胞外多糖核磁共振分析：
称取MSEPS样品50mg，将其溶于0.5mg/mL的重水中并冷冻干燥，将多糖中的活泼氢置换为氘，重复以上过程三次，以充分交换活泼氢。然后将样品溶于0.5mL的重水中，在室温25℃下置于600MHz的核磁共振仪上测定1H NMR谱、13C NMR谱、DEPT135一维图谱以及1H-1HCOSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC和1H-1H NOESY等二维图谱。
为了明确MSEPS糖残基之间的的连接方式，对其进行一维和二维核磁分析。在1HNMR中，异头碳质子的信号主要集中在δ4.3-6.0ppm内，糖环上其余碳质子的化学位移集中在δ3.2-4.2ppm内。通常吡喃糖α型糖苷键的异头碳质子的化学位移大于4.8ppm，吡喃糖β型糖苷键的异头碳质子的化学位移在4.4-4.8ppm内。如图6所示，异头区的九个信号分别为δ5.21、5.16、5.01、4.99、4.87、4.82、4.57、4.47和4.41ppm，分别命名为残基A、B、C、D、E、F、G、H和I，说明MSEPS中既有α型糖苷键又有β型糖苷键。δ1.12ppm处的信号可归为岩藻糖的H-6信号。在13C NMR中，通常吡喃糖α型糖苷键的异头碳的化学位移在δ95-101ppm内，吡喃糖β型糖苷键的异头碳化学位移在δ101-112ppm内。如图7所示，异头区从低场到高场依次显示δ109.20,104.35,100.49,99.32,99.07和95.79ppm这六个异头碳信号，其余的碳信号集中在δ60-85ppm内。δ15.37ppm处的信号可归为岩藻糖的C-6信号。
1H-13C HSQC谱可给出同碳上的碳和氢的化学位移。在1H-13C HSQC(图8)中，δ101.75ppm处的异头碳与δ5.21ppm处的H-1相关，δ101.96ppm处的异头碳与δ5.16ppm处的H-1相关，δ108.77ppm处的异头碳与δ5.01ppm处的H-1相关，δ95.78ppm处的异头碳与δ4.99ppm处的H-1相关，δ100.84ppm处的异头碳与δ4.87ppm处的H-1相关，δ100.8ppm处的异头碳与δ4.82ppm处的H-1相关，δ105.8ppm处的异头碳与δ4.57ppm处的H-1相关，δ104.69ppm处的异头碳与δ4.46ppm处的H-1相关，δ104.48ppm处的异头碳与δ4.25ppm处的H-1相关。1H-1H COSY谱可给出相邻碳上氢的化学位移，通过1H-1H COSY谱可从H-1依次找到H-6，结合1H-13C HSQC谱，理论上可实现同一糖环上所有碳氢化学位移的归属。在1H-1H COSY(图9)中，δ5.21ppm处的H-1与δ4.00ppm处的H-2相关，δ5.16ppm处的H-1与δ3.52ppm处的H-2相关，δ5.01ppm处的H-1与δ4.13ppm处的H-2相关，δ4.99ppm处的H-1与δ3.74ppm处的H-2相关，δ4.87ppm处的H-1与δ4.09ppm处的H-2相关，δ4.82ppm处的H-1与δ3.91ppm处的H-2相关，δ4.57ppm处的H-1与δ3.61ppm处的H-2相关，δ4.46ppm处的H-1与δ3.57ppm处的H-2相关，δ4.25ppm处的H-1与δ3.28ppm处的H-2相关，如此依次找到H3-6化学位移，通过氢的化学位移在1H-13C HSQC谱中找到各自对应碳的化学位移。MSEPS中各糖环上碳和氢的具体化学位移归属见表2，结合相似糖基取代的化学位移比对和甲基化分析结果，归纳出残基A-I分别是→2)-α-D-Manp-(1→,α-L-Fucp-(1→,α-L-Araf-(1→,→3)-α-D-Manp-(1→,→3,6)-α-D-Manp-(1→,→6)-α-D-Manp-(1→,→4)-β-D-Galp-(1→,→3,6)-β-D-Galp-(1→,β-D-Galp-(1→。
从1H-13C HMBC谱可得到不同糖残基之间的连接方式。在1H-13C HMBC(图10)中，残基F的H-1与自身的C-6相关，说明存在→6)-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→。残基F的H-1与残基H的C-6相关，说明存在→6)-α-D-Manp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→。残基E的H-1与自身的C-6相关，说明存在→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)-α-D-Manp。残基E的H-1与残基H的C-6相关，说明存在→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→。残基D的H-1与残基F的C-6相关，说明存在→3)-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→。在NOESY谱(图11)中，残基C的H-1分别与残基E的H-3和残基H的H-3相关，说明α-L-Araf-(1→连在→6)-α-D-Manp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→的O-3上。
综上，推测出MSEPS的主链为→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→，端基α-L-Araf-(1→连在→6)-α-D-Manp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→的O-3键上。
表3 MSEPS 13C NMR and 1H NMR的谱值分布
Figure BDA0003516694500000141
Figure BDA0003516694500000151
实施例2
本发明制备的毛霉胞外多糖用于制备治疗肿瘤的药物，尤其用于制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。
本发明进行以下实验：
1、体外抗肿瘤实验：
1-1、细胞培养：
人胃癌腺细胞SGC-7901和人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2分别培养于1640和DMEM完全培养基中(含10％胎牛血清和1％双抗的基础培养基)，在5％CO2、37℃的恒温培养箱中培养。
1-2、细胞活力检测：
用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，加入1640或DMEM培养基制成细胞悬液，调整细胞密度至1×104个/mL，分别将SGC-7901和HK-2细胞接种在96孔板中，每孔100μL。24h后弃培养液，分别将含MSEPS的不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mg/mL)培养液加入到细胞中孵育24h。每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)继续孵育4h，小心吸走上清，每孔加入150μL的DMSO，测定各孔在490nm处的吸光值。
本发明使用MTT法检测MSEPS对SGC-7901细胞活力的影响，很多药物不仅可以影响肿瘤细胞的增殖还可以杀死正常细胞，所以本发明使用人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2作为对照。结果如图12所示，在用不同浓度的MSEPS处理细胞24h后，HK-2细胞的活力不受影响，表明MSEPS对正常细胞几乎无毒。在相同条件下，随给药浓度增大，SGC-7901细胞活力逐渐下降，当给药浓度达到1.6mg/mL时，SGC-7901细胞活力仅有52.79％。以上结果表明MSEPS以浓度依赖性的方式抑制肿瘤细胞的增殖，对正常细胞几乎无毒性作用。
1-3、细胞形态分析与Hoechst 33258染色：
取对数生长期SGC-7901细胞消化后加入1640培养基制成细胞悬液，以2×105个/mL的密度接种到六孔板中，每孔加入2mL细胞悬液。待细胞贴壁后弃培养液，分别将含MSEPS的不同浓度(0、0.2、0.4和0.8mg/mL)培养液加入到细胞中继续培养24h，使用倒置显微镜观察细胞形态并拍照。
为了探究MSEPS对SGC-7901细胞的抑制作用是否与诱导凋亡有关，本发明对SGC-7901的细胞形态学特征进行了研究，结果如图13。图13中A为显微镜下观察细胞(200×)；图13中B为细胞用Hoechst 33258染色，在400×荧光显微镜下观察。如图13中A所示，对照组的SGC-7901细胞形态清晰，分布均匀。经MSEPS处理过的细胞出现收缩、变形和数量明显减少的现象。利用荧光显微镜观察经Hoechst33258染料染色后的SGC-7901细胞核形态，如图13(B)所示，对照组细胞核呈弥漫性均匀的淡蓝色荧光，而给药组细胞核呈亮蓝色荧光，表明经MSEPS处理后的细胞出现细胞核固缩、染色质凝聚、核碎裂等凋亡特征。结果表明，MSEPS可诱导SGC-7901细胞凋亡。
1-4、Annexin V-FITC/PI染色：
将SGC-7901细胞以2×105个/mL的密度接种于六孔板中，待细胞贴壁后弃培养液，将含MSEPS的不同浓度(0、0.2、0.4和0.8mg/mL)培养液加入到细胞中孵育24h。收集处理后的细胞，用结合液重悬细胞，分别加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI，混匀后在室温下避光放置20min。采用流式细胞仪分析凋亡率。
抗肿瘤药物发挥作用的重要机制之一是诱导细胞凋亡，许多多糖被证明可诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡早期时磷酯酰丝氨酸外翻到细胞膜外侧，能与荧光探针FITC标记的磷脂结合蛋白Annexin V结合。晚期凋亡细胞或坏死细胞的细胞膜完整性丧失，裸露出的细胞核能被DNA结合染料碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色。如图14所示，用给药浓度分别为0、0.2、0.4和0.8mg/mL的MSEPS处理SGC-7901细胞24h,用Annexin V和PI染色进行流式细胞术检测。每个值代表平均值±标准差(n＝3)，*P<0.05或**P<0.001与对照组相比。
与对照组相比，MSEPS处理后细胞凋亡率增加。当MSEPS浓度分别为0、0.2、0.4和0.8mg/mL时，SGC-7901细胞的凋亡率分别为4.82％、12.24％、17.21％和23.53％。结果表明MSEPS以浓度依赖性的方式诱导SGC-7901细胞的凋亡。1-5、统计学分析：
所有实验重复进行三次，使用Graphpad Prism 7.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表明统计学具有显著性差异。
本发明从毛霉Mucor sp.发酵上清液中提取出胞外多糖MSEPS，一种结构新颖的杂多糖，分子量约为7.78×104Da，单糖组成实验表明MSEPS主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.466:0.169:0.139:0.126:0.015，红外、甲基化实验及核磁光谱分析表明MSEPS的主链为→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→,端基α-L-Araf-(1→连在→→6)-α-D-Manp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→的O-3键上。另外，生物活性实验显示MSEPS通过诱导SGC-7901细胞凋亡来发挥抗肿瘤活性。本实验为毛霉胞外多糖的开发及应用提供了依据，为抗肿瘤天然药物的研究拓展了新的药物来源。

Claims (5)

1.毛霉胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)毛霉培养：毛霉(Mucor sp.)接种于PDA平板固体培养基活化后，用接种针挑取边缘菌落接入液体培养基中，培养，在26℃～30℃、100～180r/min恒温振荡箱中培养5～9d；获得毛霉发酵液；
2)毛霉胞外粗多糖的提取：步骤1)培养后获得的5L毛霉发酵液经布氏漏斗抽滤除去菌丝体，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积的95％乙醇，多糖不溶于乙醇以白色絮状沉淀析出，静置过夜后倾去上清液取底部沉淀，5000～15000r/min离心10～20min，弃上清，沉淀加水复溶，5000～15000r/min离心10～20min，收集上清，将上清液浓缩至300mL，再加入0.1g木瓜蛋白酶，于37～60℃水浴锅中酶解反应1～6h，再加入酶解反应后溶液1/3体积的Sevag液，通过10～15次的混合、振荡、离心直至离液面交界处无白色混悬，收集上层水相溶液，通过旋转蒸发除去残留的试剂；随后用D301型大孔树脂对溶液进行脱色，收集洗脱液，旋蒸至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，使用再生纤维素透析袋，截留分子量1000～10000Da，于4℃冰箱透析24～72h，收集截留液经冷冻干燥得到毛霉胞外粗多糖；
3)胞外多糖分离纯化：包括离子交换柱层析和凝胶柱层析；
所述离子交换柱层析具体为：
将步骤2)制备的毛霉胞外粗多糖配置为水溶液，用0.45μm一次性针头过滤器除杂，将样品缓慢加入到DEAE-52阴离子交换柱，流动相为水和NaCl溶液，在恒流泵加压下依次用水和NaCl溶液梯度洗脱，采用自动部分收集器收集0.2mol/L NaCl洗脱液，浓缩并透析脱盐后冻干：
所述凝胶柱层析具体为：
将称离子交换柱层析纯化后的样品配制成样品溶液，用0.22μm滤器除杂后，将样品缓慢加入到Sephadex G-100凝胶柱，流动相为水，收集洗脱液，用蒽酮硫酸法检测各管糖含量并绘制洗脱曲线，收集主峰部分，浓缩透析冻干得毛霉胞外多糖。
2.一种权利要求1所述制备方法制备的毛霉胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的毛霉胞外多糖，其特征在于，所述毛霉胞外多糖重均分子量为7.78×104Da，主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.466:0.169:0.139:0.126:0.015。
4.一种权利要求2或3所述的毛霉胞外多糖的应用，其特征在于，所述的毛霉胞外多糖用于制备治疗肿瘤的药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的毛霉胞外多糖用于制备抑制胃癌细胞增殖的药物。
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