CN114409798A

CN114409798A - 制备包含两种或更多种抗体的组合物

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Publication number: CN114409798A
Application number: CN202210107402.6A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·保罗·多恩博斯; 亚历山大·贝特霍尔德·亨德里克·巴克
Original assignee: Merus BV
Current assignee: Merus BV
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2022-04-29

Abstract

本发明涉及制备包含两种或更多种抗体的组合物，特别是用于制备至少两种抗体的装置与方法。方法可以包括：提供带有编码所述抗体的核酸的细胞；培养所述细胞；从培养物来收集所述抗体；以及通过离子交换层析法(IEX)而将被生成的抗体与半抗体分开来。在某些具体例中，在所使用的IEX条件下，此类抗体展现出IEX滞留时间与个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。本发明还有关于由此所生成的抗体的组合物。在某些方面中，本发明有关于包括有2‑10种重组型抗体的组合物，特征在于：在此类IEX条件下，此类抗体中的至少两者的IEX滞留时间与个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。本发明还有关于包括有2‑10种重组型抗体的组合物，特征在于：此类抗体中的至少两者的pI值与该至少两种抗体的平均pI值差异为0.4单位或更少。

Description

制备包含两种或更多种抗体的组合物

本申请是申请号为202080014302.8的发明名称为“制备包含两种或更多种抗体的组合物”的中国专利申请的分案申请，原申请是2020年02月13日提交的PCT国际申请PCT/NL2020/050080于2021年08月13日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明有关于抗体的领域，特别是有关于治疗抗体的领域。此类抗体可以被使用在人类的治疗上。更具体地，本发明有关于多种抗体的生成和/或纯化。一个单一宿主细胞可以生成此类多种抗体。此类抗体也可借由一由宿主细胞所构成的混合物而被生成，此类宿主细胞各自生成此类抗体中的一者。本发明还有关于用于生成包括有这样的抗体的组合物的方法以及用于纯化这样的抗体的方法。

背景技术

多株抗体通常收集自一位个体的血液。多株抗体的一优点(advantage)是：病原经由多个标靶和表位而被攻击。单株或重组型抗体的一优点是完善特征化的特异性与功能而允许这样的抗体得以被使用作具有一定义完善的作用与毒性谱相的精确药物。

一个单株抗体的特异性也可能是一个缺点，特别是当多个标靶需要被解决的时。有可能通过将更多的抗体加入至该药物来减少这个不利条件，但考虑到即使一种单一治疗抗体也可能是昂贵的，被预期到的是：有关这样的多株混合物的成本可能很快就会变得令人望的却步。

双-、三-以及其他多特异性抗体的发展已成功地将一多株抗体的某些方面引入至抗体治疗剂。除了标靶数目的增加的外，它也成功地引入以前使用传统的单特异性单株或多株抗体无法得到的其他功能性。多种双-、三-以及其他多特异性抗体在同一个治疗当中的使用可以提供更进一步的效益。

本发明由描述一种用于从一个单一宿主细胞或任择地一由宿主细胞所构成的混合物而被生成的多种抗体治疗剂的纯化的稳健且经济的方法而提供了本领域的一进步。本发明对于两种或更多种抗体的集合的经济生产是特别有用的，优选地是多特异性抗体。

发明内容

本发明提供一种用于生成至少两种多特异性抗体的方法，包括：

-提供带有编码此类多特异性抗体的核酸的细胞；

-培养此类细胞；

-从培养物来收集此类多特异性抗体；以及

-通过离子交换层析法(IEX)而将被生成的多特异性抗体与半抗体以及选择性地单特异性抗体和/或其他非所欲的抗体产物相关杂质分开来；

该方法特征在于：在所使用的IEX条件下，此类多特异性抗体展现出IEX滞留时间与个别的多特异性抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。此类相应的半抗体以及选择性地单特异性抗体和/或其他非所欲的抗体产物相关杂质的滞留时间优选地落在此类多特异性抗体的滞留时间所跨距的范围的外。

本发明也提供一种用于生成至少两种多特异性抗体的方法，包括：

-提供一带有编码此类多特异性抗体的核酸的细胞；

-培养该细胞；

-从培养物来收集此类多特异性抗体；以及

该方法特征在于：在所使用的IEX条件下，此类多特异性抗体展现出基本上是相同的IEX滞留时间。此类相应的半抗体以及选择性地单特异性抗体和/或其他非所欲的抗体产物相关杂质的滞留时间优选地落在此类抗体的滞留时间所跨距的范围的外。

本发明进一步提供一种用于生成至少两种抗体的方法，其中此类抗体包括有一种单特异性和/或一种多特异性抗体，该方法包括：

–提供带有编码此类抗体的核酸的细胞；

–培养此类细胞；

–从培养物来收集此类抗体；以及

–通过离子交换层析法(IEX)而将被生成的抗体与半抗体分开来；该方法特征在于：在所使用的IEX条件下，此类抗体展现出基本上是相同的IEX滞留时间。此类相应的半抗体以及选择性地单特异性抗体的滞留时间优选地落在此类抗体的滞留时间所跨距的范围的外。

本发明也提供一种包括有可通过一如本文所述的方法而获得的2-10种重组型抗体的组合物。

还被提供的是一种包括有2-10种重组型抗体(诸如多特异性抗体)的组合物，特征在于：在所使用的IEX条件下，此类抗体中的至少两者的IEX滞留时间与个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。

进一步被提供的是一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：此类抗体中的至少两者的IEX滞留时间基本上是相同的。

还被提供的是一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：此类抗体中的至少两者的等电点(PI)与该至少两种抗体的平均pI值优选地差异为0.4单位，0.3、0.2以及优选地0.1单位或更少。该至少两种抗体的每一者的pI值优选地与另一者差异为0.25单位或更少。

附图说明

图1

具体例的一示意图标，其中该组合物包括有两个双特异性抗体共享一共同臂。该图描绘带有重链(1)以及轻链(4)的抗体。4个重链具有3个不相同的可变区(5、6以及7)。具有该共享的可变区(5)的重链具有一个异二聚体化结构域的一个部分(3)。带有可变区(6)以及(7)的此类重链具有该异二聚体化结构域的兼容的部分(2)。异二聚体化区(2)以及(3)的被偏好的配对可以引导双特异性抗体的形成。

图2

图片A：双特异性抗体PB4516生成编号8(p08)在220nm的下的CIEX-曲线图；图片B：双特异性抗体PB6892生成编号4(p04)在220nm的下的CIEX-曲线图。

图3

图3a：双特异性抗体PB4516生成编号10(p10)在220nm的下的CIEX-曲线图；

图3b：双特异性抗体PB11244生成编号1(p01)在220nm的下的CIEX-曲线图；

图3c：每个框有两种双特异性抗体被识别于直行PB(PBXXXX(X))中。关于PB11244和PB4516的重链可变区被表明于直行标靶1和标靶2中。轻链的序列对于所有的抗体为相同的并且具有串行识别编号：26的共同轻链IgKV1*39/jk1的氨基酸序列。对于每一个重链可变区，以ExPASy ProtParam工具被计算的pI值被表明于直行pI中。该两种重链可变区之间的pI值差异被表明于最后的直行中，证明了PB11244和PB4516之间的平均_VHpI值差异为0.08。

图4

池FST2的个别的群落cp12的一抗体制备物在220nm的下的CIEX-曲线图。该CIEX-曲线图显示共洗提抗体PB4516和PB11244的一锐峰。该曲线图显示：该样品含有一有限数量的产物相关杂质。它还显示共洗提双特异性抗体和各自徙动的产物相关杂质之间的良好分离。

图5

群落CP07的一抗体制备物在220nm的下的CIEX-曲线图。该群落从单一群落FST2cp09的个别群落的一收集而被挑选出。第二次的次选殖被完成，以确保FST2cp09-cp07细胞株是一个单源性细胞株。双特异性抗体特异性ELISA表明743μg/mL的EGFR/HER2双特异性抗体PB11244以及1134μg/mL的EGFR/HER3双特异性抗体PB4516的存在。

图6

具有两个相同的可变结构域的抗体同质二聚体(PGXXXX)的滞留时间。该重链可变区的氨基酸序列具有图8中针对MF所出示的序列以及一为串行识别编号：26的共同轻链IgKV1*39/jk1。

图7

每个框有两种双特异性抗体被识别于直行PB(PBXXXX(X))中。此类双特异性抗体的每一者的重链可变区(MFXXXX)被表明于直行标靶1和标靶2中。轻链的序列对于所有的抗体为相同的并且具有串行识别编号：26的共同轻链IgKV1*39/jk1的氨基酸序列。对于每一个重链可变区，以ExPASy ProtParam工具被计算的pI值被表明于直行pI中。两个重链可变区之间的pI值差异以及被测量的滞留时间被表明于最后两个直行中。被测量的滞留时间以及被计算的pI值和平均pI值表明：一对的双特异性抗体在CIEX层析中可以有效地共洗提。此类抗体具有IgG1恒定区以及一个共同轻链。具有共享重链可变区(相同的MF)的带有CH3DE重链或KK重链的重链被表明。关于在每个特异性抗体上所执行的CIEX层析的滞留时间被表明，有一个用于CIEX层析的示例性条件被描述于材料与方法章节中。许多其他的CIEX层析条件将会导致合适的滞留时间介于被条列的具有所提供的pI数值的双特异性抗体配对之间。

图8

相应的抗体的重链可变区(MFXXXX)和轻链可变区的CDRs的氨基酸序列以及共同轻链可变区的氨基酸序列。

具体实施方式

如本文所使用的术语“抗体”是指属于蛋白质的免疫球蛋白类别的蛋白质性分子，其含有结合一位在一抗原上的表位的一个或更多个结构域，其中此类结构域为或者衍生自一个抗体的可变区或者共享该抗体的可变区的序列同源性。抗体通常由基本结构单元所构成各个具有两个重链以及两个轻链。供治疗用途的抗体优选地为尽可能地接近要被治疗的个体的天然抗体(例如供人类个体的人类抗体)。带有被延伸的重链和/或轻链可变区的抗体还被包括在本文中。一根据本发明的抗体不受限于用于生成它的任何特定型式或方法。

半抗体是重链与轻链组合，它们没有被联合以另外一种重链与轻链组合而且它们不与另外一种可变区或类可变区多肽形成一个界面。其他非所欲的抗体产物相关杂质可能是没有被联合以一重链的自由轻链、没有被联合以一轻链或另外一种重链的自由重链，或缺少一轻链的不完全组装的抗体。

供抗体生成的合适的细胞被知晓于本技艺中，并且包括一种融合瘤细胞、一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、一种NS0细胞或一种PER-C6细胞，或为具有本结构域的通常技艺的人士所知晓的各式各样的其他细胞株。各种不同的机构和公司已发展出用于抗体的大规模生产的细胞株，例如供临床应用。除了别的以外，这样的细胞株的非限制性示范例是CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞或HEK293细胞。在一个特别被偏好的具体例中，该细胞是一人类细胞。优选地，一种被一腺病毒E1区或其一功能等效物所转形的细胞。在一个被偏好的具体例中，该细胞是一种CHO细胞或其一变异体。优选地，一种利用一麸胺酰胺合成酶(GS)载体系统来供一抗体的表现的变异体。在一个被偏好的具体例中，该细胞是一种CHO细胞。

此类细胞可被提供以编码此类抗体的核酸。此类细胞将会表现、组装以及排出被形成的抗体至细胞培养物之上澄液的内。一个单一重链与轻链(更确切地说，编码他它的核酸)的引入导致一个单株抗体的生成，该单株抗体具有两个重链各自被联合以一个轻链。

本发明的一方法可以使用包括有各自生成一种不同抗体的两种或更多种细胞的细胞混合物来被执行。使用这样一种混合物的优点是：被收集的抗体的下游加工处理可被更有效率地精简化。一方法的进一步的优点是：抗体产物有如一体被收集与纯化。又，一含有通过本发明的一方法而被生成的两种或更多种抗体的混合物，当与此类抗体的每一者分别需要的试验数量相比较，可以减少为了要获得法定认证所需要的试验数量。

在一个进一步的具体例中，此类细胞为基本上由一个被提供以编码此类相应的抗体的核酸的单一细胞的复制品所构成的一个同质性细胞集合。数种重链在一个细胞中的共同表现允许各种不同的重链组合。带有附加的轻链组合增高了组合的数目。各种不同的方法已被开发，以有利于特定组合的形成胜过其他者。重链变异体已被生成，此类重链变异体具体地促进重链异二聚体(heterodimers)胜过同质二聚体(homodimers)的形成，或者反过来促进重链同质二聚体胜过异二聚体的形成。带有特定的同质-或异二聚体化结构域的重链减少正在由这样的细胞所生成的抗体的数目和/或增高被偏好的抗体的电平胜过替代组合(例如，一种异二聚体胜过一种同质二聚体的较高的生产)。

本发明的一方法具体地适合供两种或更多种多特异性抗体生成，包括双特异性抗体。用于双特异性抗体的生成的各种不同方法存在于本结构域中。一种方法使用一个可以及不同的重链形成有功能的可变结构域的共同轻链。一种用于生成双特异性抗体的被偏好的方法包括一种在它的基因体内藏匿有一共同链的基因转殖动物的使用，而使得这样的动物使用一抗原的免疫产生出根据非共同链而对该抗原具特异性的一个抗体库，其中该抗体库由包括有该共同链以及一种重排的同源链的各种不同抗体所构成。一动物可以使用不同的抗原来被免疫，或者不同的动物可以各自分别地使用相应的抗原来被免疫。编码该非共同链或其可变区的核酸可以得自于该(等)动物，例如B细胞、脾脏或淋巴组织。这些可以被用来产生表现相应的非共同链的核酸，此类核酸接而可被引入至生成细胞的中。该共同链可以在相同或不同的时间被引入。该核酸可以被并入至细胞核的内，而且优选地是宿主细胞的基因体的内，而使得该宿主细胞生成标靶多种抗原的多特异性抗体或多聚体(该(等)基因转殖动物已就此类抗原而被免疫(为了可被组合以一共同链以生成对于不同的标靶和/或不同的表位具有特异性的有功能的可变结构域的可变区的产生的目的，参见举例来说WO 2009/157771，该案在此被并入本案以作为参考)。

一个生成一种共同轻链以及两种不同的重链(各自可和该共同轻链形成一个有功能的可变结构域)的细胞生成，除了别的以外，一种带有两个不同的重链与轻链组合的双特异性抗体。同样地，一个生成一种共同轻链以及三种或更多种不同的重链的细胞可以形成能够标靶三种或更多种抗原的多特异性抗体，或者能够标靶三种或更多种抗原的两种或更多种多特异性抗体的一组合。现今有可能来建立抗体的标准型式(即一个恒定部分以及两个可变结构域)以及加设进一步的结合结构域。照此情形，具有被附接至一个抗体的恒定部分或可变结构域的中的一者或多者的一个或更多个带有附加的结合特异性的单链Fv的多特异性抗体可以被制造出。还有可能生成带有两种或更多种可变区的重链。附加的重链区有利地可以联合以不同的或共同轻链可变区。参见US 62/650467，该专利案在此被并入本案以作为参考。

当该细胞生成两种或更多种多特异性抗体的时，它在某些情况下也会产生如果干数量的半抗体以及带有相同重链的抗体或同质二聚体。后者的数量可以借由包括促进重链内的修饰的异二聚体形成而被减少。如前面所提到的，用于诱发重链的异二聚体化的各种不同的方法存在。带有此类修饰的相应的结构域被统称为异二聚体化结构域。具有有利于相互作用的异二聚体化结构域的重链据说具有兼容的异二聚体化结构域。此类兼容的异二聚体化结构域优选地为兼容的免疫球蛋白重链CH3异二聚体化结构域。本领域描述了各种不同的方法，其中重链的这样的CH3异二聚体化可以被达成。

一种用于生成双特异性抗体的被偏好的方法被公开于US 9,248,181和US 9,358,286中。具体地，用来生成基本上仅有双特异性全长的IgG分子的被偏好的变化为位在该第一CH3结构域(该“KK-变异体”重链)中的氨基酸取代L351K和T366K(EU编号)以及位在该第二结构域(该“DE-变异体”重链)中的氨基酸取代L351D和L368E，或者反之亦然。如前面所提到的，该DE-变异体和KK-变异体优先地配对以形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。DE-变异体重链的同质二聚体化(homodimerization)(DEDE同质二聚体)或KK-变异体重链的同质二聚体化(KKKK同质二聚体)由于位在相同重链之间的CH3-CH3接口中的带电荷残基之间的强烈排斥而几乎不会发生。

在本发明中，被偏好的是：此类细胞被提供以编码一共同轻链的核酸。有各种不同的方法可供熟习此艺的人士来生成具有不同的重链可变区但是相同的轻链可变区的抗体。WO 2004/106375描述使用一种共同轻链可变区的噬菌体库。噬菌体选择得到带有相同的轻链可变区但是不同的重链可变区的可变结构域。此外，具有一共同链以及不相同的同源链的非人类动物被描述于WO 2009/157771中。在这样的动物中的抗体选择得到带有相同的或类似的共同链可变区但是不相同的同源链可变区的可变结构域。WO 2004/106375和WO2009/157771在此被并入本案以作为参考。此类专利刊物(publications)特别是就抗体(具有相同或相似的共同链可变区以及不相同的同源链可变区，优选地是一共同轻链可变区与不相同的重链可变区)以及编码这样的抗体的核酸的产生而被参照。

在一个被偏好的具体例中，此类细胞生成两种或更多种重链以及一种共同轻链。此类相应的重链和轻链可具有一个或更多个可变区与此类相应的链联合。在一个被偏好的具体例中，该细胞生成三种或更多种重链。该三种重链的中的一者优选地含有一个兼容的异二聚体化结构域的一个部分。其他两种或更多种重链优选地包括有该兼容的异二聚体化结构域的另一个部分。如果第一种重链通过字母“A”来被象征性地表示，而其他两种通过字母“B”和“C”，异二聚体化结构域的特定组合导致组合AB和AC的占优势地形成。此类组合AA、BB、CC和BC通过异二聚体化结构域的包括而不被青睐。这样一种细胞生成仅有两种双特异性抗体AB和AC是有效的(参见图1)。在本发明中，被偏好的是：该细胞通过生成至少3种重链而生成该两种抗体。在一个被偏好的具体例中，此类重链的中的一者含有一个兼容的异二聚体化结构域的一个部分，而该其他两种或更多种重链优选地包括有该兼容的异二聚体化结构域的另一个部分。一种被位在一个组合物中的两种或更多种双-或多特异性抗体或多聚体所共享的重链优选地具有该异二聚体化结构域的CH3 DE部分。位于此类双-或多特异性抗体中的其他重链优选地具有CH3 KK部分。

该至少两种抗体优选地为多特异性抗体，优选地是双特异性抗体。在一个被偏好的具体例中，此类抗体中的至少两者共享一相同的重链。该细胞可以通过在此类重链中包括不同不相同的异二聚体化结构域而生成几个系列的双特异性抗体。这样的实施可以导致带有重链组合AB和CD的抗体的占优势的生成。组合AB可以借由一种如本文前面所提到的DE/KK异二聚体化结构域而受青睐，而该CD借由一种“孔中钮(knob in hole)”异二聚体化结构域的并入，或者本领域中已知的其他异二聚体化特征，例如经由电荷工程。一种位于不相同的双-或多特异性抗体之间的共享重链或者带有该共享重链的抗体组合可以借由提供带有一种异二聚体化结构域的一个部分的一种共享重链以及带有该异二聚体化结构域的互补部分的各种不同组合链而被制造出。举例来说，位于该共享重链中的CH3 DE部分以及位于此类组合链中的CH3KK部分。一种共享重链以及两种组合重链在这种情况下将会造成该细胞来生成双-或多特异性多聚体带有重链组合AB和AC(或者对于多特异性多聚体而言是AxBC和AxDE)。其他可能的组合是AB、AE、CD和CF；或者AB、AE、AG和CD，诸如这些。

相较于其他的宿主细胞蛋白质，抗体通常具有一独特的等电点(通常位在pH 6-10的范围中)。此类抗体，诸如多特异性抗体，此外多特异性多聚体，可以经由本文所描述的方法而被纯化为带有一相对较高的纯度。方法可以包括许多步骤，诸如培养该宿主细胞、经历收获物澄清，接续以蛋白质捕捉。诸如阴离子交换层析法的IEX层析法可以被使用于移除宿主细胞DNA，阳离子交换层析法(CIEX)可以被使用，例如用于移除宿主细胞蛋白质、淋溶蛋白质A以及潜在的聚集体。诸如病毒过滤或疏水互作用层析法的附加步骤可以被包括。

抗体通常通过生成细胞而被排出。这样的抗体的收获通常涉及到细胞上澄液的收集，接续以几个纯化步骤来移除细胞碎片或聚集体(它们的存在不被欲求)。收获物澄清可能涉及到抗体生成细胞的培养物上澄液的过滤、离心或这些的一组合。抗体蛋白质捕捉通常通过亲和力纯化而被完成。这可以几种方式来被完成。通常这涉及到使用管柱的纯化，此类管柱具有重组型蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L，此类蛋白质是对于抗体具有一已知的高特异性结合能力的细菌性蛋白质。现今，更加特异性地结合抗体的各种不同的优化突变体为可获得的。举例来说，一种已被移除掉它的非必要结构域的重组型蛋白质A为可获得的，一种已被删除掉它的白蛋白结合地址的重组型蛋白质G为可获得的，此外经修饰的蛋白质L为可获得的。被结合的抗体可以通过针对一个或多个这样的管柱的洗提而被收集。阴离子和阳离子交换层析法可被用来进一步纯化制备物，例如，从半抗体和/或同质二聚体抗体和/或其他非所欲的抗体产物相关杂质(如果有的话)来纯化出双特异性或多特异性抗体。疏水互作用层析法(HIC)在抗体纯化过程中通常被使用作一替代精纯步骤。HIC提供一个针对离子交换层析法的正交选择性，并且可以是一个用于聚集体清除和宿主细胞蛋白质减少的有效步骤。在本发明中，HIC可被使用于供分析目的，在该两种或更多种双-或多特异性抗体或者多聚体的纯化被完成的后，以接而定量具有在IEX上为类似的(优选地是基本上相同的)滞留时间和/或类似的(优选地是基本上相同的)pI值的该两种或更多种物种。因此，HIC被用来定量被纯化的分子的相对数量。

一种疏水互作用树脂被选择作为固定相，而移动相的pH值和/或传导性被调变以达成所要求的选择性。抗体通常在较低的pH值下吸引正电荷，这会影响其极性以及整体表面疏水性。允许位在该制备物中的该两种或更多种抗体的析离的pH条件可以被选择。

在某些具体例中，被收集的抗体首先通过亲和力纯化而从其他蛋白质被分开来，优选地是通过蛋白质A萃取。随后，在收集位在流出分馏物中的此类抗体的条件下，被亲和力纯化的抗体在一种阴离子交换管柱上被运行。抗体可以随后在一种或更多种CIEX管柱上被运行。

一种用于生成至少两种抗体的被偏好的方法由细胞来生成如同一种包括有该两种或更多种抗体的单一组合物的它们而被完成。

一种用于生成至少两种抗体的方法优选地包括培养生成该两种或更多种抗体的宿主细胞，此类细胞之上澄液的收集，在一个收获物澄清过程中处理上澄液收获物，该收获物澄清过程优选地包括使用一个捕集诸如细胞或细胞碎片的聚集体并且允许抗体产物的通过的孔径门槛的过滤。该抗体通过使用蛋白质A的亲和力层析法而从细胞培养物流体(被收集到。被结合至蛋白质树脂的抗体在暴露于低pH值的后从层析管柱被洗提出，而洗出液随后使用一合适的缓冲液来被中和。

如本文所使用的，术语“等电点(pI)”是指蛋白质表面的平均净电荷(即蛋白质的电双层的电势)为0的时的pH值。换句话讲，该术语是指蛋白质的一个基团被解离的点，而使得阳离子和阴离子的数目是相等的，因此该蛋白质的净电荷为0。

如本文所使用的，“pI”基于ExPASy ProtParam工具，使用截至本件申请案的最早申请日(优先权日)的系统内定参数而根据一级氨基酸来被计算。ProtParam是一种工具，它允许针对一被存储于Swiss-Prot或TrEMBL中的给定蛋白质或者一用户输入的蛋白质序列的各种不同的物理和化学参数的运算。被计算参数包括理论的pI值。Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；ProteinIdentification and Analysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed):The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005)pp.571-607。

一个蛋白质的净表面电荷以一取决于蛋白质的pI值的方式而随着pH值来变化。在一个相等于一个蛋白质的pI值的pH值下，该蛋白质将不携带净电荷。在一个低于该pI值的pH值下，该蛋白质将携带一净正电荷。如果缓冲液pH值被升高至高于一个蛋白质的pI值，它将会携带一净负电荷。

一个蛋白质的pI值可以通过它的一级氨基酸序列来被测定并且因此可以被计算，而一确保一感兴趣的蛋白质的一已知净电荷的缓冲液接而可以被选取。当该感兴趣的蛋白质在操作pH值下携带一净正电荷时，一个带负电荷的阳离子交换树脂因此可被选取出。

具有不同pI数值的蛋白质在一给定pH值下将会具有不同程度的电荷而因此对于位在阴离子交换介质的粒子上的带正电荷的表面基团具有不同的亲和力；因此，不同的蛋白质将会以不同的量值结合至该树脂，促进它们的分离。因此，通过产生具有相对于此类同质二聚体与半抗体和/或其他抗体产物相关杂质的独特的pI值的异二聚体多肽，此类异二聚体多肽可以使用标准洗提技术而被容易地纯化，例如，通过施用pH梯度，或通过在一固定的pH值下施用一盐或导电梯度，或者一pH值与一导电梯度的一组合。在本发明的具体例中，位在此类抗体中的恒定部分以及轻链基本上在不同的抗体中具有相同的序列。这样的抗体通常基本上只有在重链可变区的氨基酸序列中有差异。对于这样的抗体，通常足以来计算如本文所示的重链可变区的pI值。计算和标准接而通过使用该重链可变区的pI值而非该(半)抗体的pI值来被设定。该抗体的重链可变区的平均pI值表示该抗体在一个CIEX-管柱中的滞留时间。此类抗体(如果有的话)可以具有相同的或不同的异二聚体化结构域。它们优选地具有相同的异二聚体化结构域。此类抗体可以进一步地在此类恒定部分的正确氨基酸序列中有所差异。

有关于该(等)离子交换层析法(IEX)步骤，这是根据离子和极性分子对于离子交换剂的亲和力来分离它们的过程。它作用于各种不同的带电荷分子—包括大型蛋白质、小型核苷酸以及氨基酸。IEX通常在蛋白质纯化上被使用。水溶性并且带电荷的蛋白质与不溶性固定相形成离子键。被结合的分子接而可以使用一具有较高浓度的离子和/或一不同pH值的洗提剂来被洗提和收集。盐的浓度或者pH值可以呈一逐步方式来被变化；通过逐渐改变层析运行的移动相，或者这些的一组合。两种型式的离子层析法为阴离子交换以及阳离子交换。阳离子交换层析法(CIEX)在本发明中被偏好。抗体CIEX优选地在一生理pH值的下被执行。该pH值通常处于一为5-9的范围中，优选地是6-8。

当该感兴趣的分子在被使用于层析的pH值的下为带正电荷的时，CIEX通常被使用。该分子是带正电荷的，因为用于层析的pH值低于该分子的pI值。在这种型式的中，该固定相是带负电荷的，而带正电荷的分子被装填以被吸引至该固定相。阴离子交换层析法为当该固定相是带正电荷的，而带负电荷的分子(意指用于层析的pH值高于pI值)被装填以被吸引至该固定相。

在促进抗体(诸如一多特异性抗体)对基质的结合的条件下，一抗体(诸如一多特异性抗体)通常在一结合阶段中被结合至该IEX管柱。IEX管柱通常随后被清洗以移除未结合的物质。从该管柱的洗提在一洗提阶段中被完成。一抗体(诸如一多特异性抗体)的滞留时间通常从该洗提阶段的开始来被计算。它为在洗提相被起始的时该抗体花费在该管柱上的时间数量。如果一个样品含有数种化合物，该样品中的每一个化合物通常将会根据它的化学组成而在该管柱上花费一个不相同的时间数量，即每一者将会具有一个不相同的滞留时间。滞留时间通常是秒或分钟的单位引用。

在本发明的一方法中，此类抗体(诸如多特异性抗体)的滞留时间优选地基本上是相同的。不同的抗体在相同的管柱和条件可具有不相同的滞留时间。在本发明中，已被发现到的是：诸如多特异性抗体的抗体可以被选择或设计以具有为足够接近的IEX滞留时间，以允许两种或更多种抗体(诸如两种或更多种多特异性抗体)在一个单一的IEX层析运行中的共纯化。与此类个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低的滞留时间典型的为足够接近的，以允许两种或更多种抗体(诸如两种或更多种多特异性抗体)在一个单一的IEX层析运行中的共纯化。

根据本发明的一种用于抗体纯化和/或分析的合适的CIEX HPLC方法使用TSKgelSP-STAT(7μm粒径，4.6mM I.D.×10cm L，Tosoh 21964)系列的离子交换管柱。此类管柱被填充以用于生物分子的速度与高解析分析此外分离的无孔树脂粒子。位于TSKgel STAT管柱中的粒子含有一由多层离子交换基团所构成的开放式出入网状结构来供装载容量，而该粒径使得这些管柱适合于供HPLC和FPLC系统的用。

一种合适的方法涉及到TSKgel SP-STAT(7μm粒径，4.6mM I.D×10cm L，Tosoh21964)使用缓冲液A(磷酸钠缓冲液，25mM，pH 6.0)的平衡，在这的后抗体借由提高盐浓度以及运行缓冲液B(25mM磷酸钠，1mM NaCl，pH 6.0)的一梯度而从该管柱被排出。流速被设定在0.5mL/分钟。关于测试样品以及对照组的注入样品质量为10μg，而注入体积是10-100μL。层析图根据220nm的结果就所观察到的波峰型态(peak patterns)、滞留时间以及主要波峰的波峰面积来被分析。对于更大量的抗体，该方法可以是成比例的。

抗体制备物的CIEX层析运行的典型图被描绘于图2中。用于这个运行的此类抗体从如示范例中所示的被转染的细胞来被收集，以及借由使用一种蛋白质A管柱而从位于培养基中的许多其他蛋白质被纯化出。如演示例中所示的，抗体借由酸洗提而被洗提出，接续以中和作用于及缓冲液交换成为PBS pH 7.4。该抗体制备物的一样品随后被装填至该CIEX管柱上。在清洗的后，被联合的蛋白质借由施用一盐梯度而被洗提出。对于图2A和图2B中的样品，此类CIEX条件是相同的。滞留时间就双特异性抗体的波峰的顶端来被计算。两种或更多种抗体(诸如多特异性抗体)的滞留时间优选地与该两种或更多种抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。一个大于10％的偏差通常导致此类抗体从半抗体以及选择性地就多特异性抗体而言从同质二聚体和/或其他抗体产物相关杂质的低效分离。在一个被偏好的具体例中，两种或更多种抗体的滞留时间与该两种抗体的滞留时间的平均值偏差为9％或者更低。优选地与该两种或更多种抗体的滞留时间的平均值偏差为8％、7％、6％或5％或者更低。在一个被偏好的具体例中，两种或更多种抗体的滞留时间与该两种或更多种抗体的滞留时间的平均值偏差为4％或者更低。优选地是3％或者更低，优选地是2％或者更低。越来越相似的滞留时间通常允许此类多特异性抗体从半抗体以及选择性地同质二聚体和/或其他抗体产物相关杂质的越来越有效率的分离，而因此允许位于该IEX管柱的分馏物中的该两种抗体的更干净的收集。

在本发明的手段和方法中，该两种或更多种抗体(诸如该两种或更多种多特异性抗体)的平均滞留时间就要被共纯化或收集的此类抗体来被计算。因此在其中要被纯化的此类抗体为多特异性抗体的具体例中，该两种或更多种抗体的平均滞留时间根因此类多特异性抗体被计算。不收集的抗体(诸如同质二聚体抗体)的滞留时间没有被使用于该平均值的计算。

如果选中此项是IEX的条件下具有基本上相同的IEX滞留时间的抗体(诸如多特异性抗体)，诸如多特异性抗体的抗体可以被选择用于本发明的一方法中的共纯化。此类抗体(诸如多特异性抗体)也可以通过一个或更多个可变区的适当修饰而被特制，以在被使用于IEX的相同或相似条件下具有基本上相同的IEX滞留时间。

在一个具体例中，被寻求要被共纯化的被生成的抗体(诸如双-和/或多特异性抗体)具有相似的pI值。此类抗体中的至少两者的等电点(pI)与该至少两种抗体的平均pI值优选地差异为0.4单位，0.3、0.2以及优选地0.1单位或更少。该至少两种抗体的每一者的pI值优选地与另一者差异为0.25单位或更少。

在此类抗体的pI值的中的一个微小至没有差异通常允许一良好的共纯化。有利地，位于一个抗体内的相应的半抗体的pI值与平均值的差异更大。这个差异在该CIEX层析步骤中促进了此类半抗体从“共”-徙动的完整抗体的一良好的分离。

在其中被寻求要被共纯化的此类抗体为双-或多特异性抗体的具体例中，被偏好的是：位于被寻求要被共纯化的此类抗体的每一者的中的可变结构域的pI值与要被共纯化的其他抗体(们)的可变结构域的pI值的平均值差异为大于0.2(优选地0.3，优选地0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.4，优选地是大于1.8或2.0)单位。在这个具体例中，位于一个抗体中的可变结构域的pI值的差异优选地要比“x”和“y”之间的差异大至少0.2单位，优选地它为要比“x”和“y”之间的差异大至少0.3、0.4、0.5(优选地至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、5、0、0、1.2、1.5、0 2.0或2.5)，其中“x”是此类抗体的一第一者的两个可变结构域的pI值的平均值，而“y”是此类抗体的一第二者的两个可变结构域的pI值的平均值。如在位于一个抗体中的可变结构域的pI值中所提及的一个差异通常表示此类抗体产物相关杂质从被寻求要被共纯化的此类抗体的一良好分离和/或从单特异性抗体的一良好分离。

包括有两种或更多种双-或多特异性抗体的某些组合物具有氨基酸序列为相似的或者具有一基本上相同的氨基酸序列的恒定区以及轻链。这样的两种或更多种双-和/或多特异性抗体通常基本上只有在此类可变结构域的氨基酸序列上或者基本上只有在此类重链可变区的氨基酸序列上彼此不相同。在这样的情况下，通常有需要来测定整个抗体的pI值。相反地，此类可变结构域的pI值和/或此类重链可变区的pI值可以被测定。这提供一种用于估量此类抗体在一个CIEX层析步骤中是否可以紧靠在一起徙动(换句话讲此类抗体是否具有滞留时间为足够相同的而允许共纯化)的手段。

在如本文所公开的一种方法或组合物的一具体例中，两种或更多种双-或多特异性抗体具有恒定区以及轻链具有相同的氨基酸序列或具有基本上相同的氨基酸序列。当位于每个抗体中的可变结构域的平均pI值与被寻求要被共纯化的相应的抗体的可变结构域的平均pI值差异为0.7单位或更少的时，该两种或更多种双-或多特异性抗体可以在一个CIEX层析步骤中来被共纯化。在一个被偏好的具体例中，此类抗体的一第一者的两个可变结构域的pI值的平均值“x”以及此类抗体的一第二者的两个可变结构域的pI值的平均值“y”差异为0.6单位或更少，优选地与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“x”和“y”的平均值差异为0.5单位或更少。“x”和“y”与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“x”和“y”的平均值差异优选地为0.4(优选地0.3，优选地0.2以及优选地0.1)单位或更少。这样的双-和/或多特异性抗体通常具有基本上为相同的滞留时间。在这个具体例中，此类抗体的恒定区基本上为相同的。这样的抗体的pI值而且特别是平均值“x”和“y”整体上表示相应的抗体的pI值。在这个具体例中，被偏好的是：位于被寻求要被共纯化的此类抗体的每一者的中的可变结构域的pI值与位于此类抗体中的可变结构域的pI值的平均值差异为大于0.2(优选地0.3，优选地0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.4，优选地是大于1.8或2.0单位。在这个具体例中，位于一个抗体中的可变结构域的pI值的差异优选地要比“x”和“y”之间的差异大至少0.2单位，优选地它为要比“x”和“y”之间的差异大至少0.3、0.4、0.5(优选地至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2.0或2.5)。如在位于一个抗体中的可变结构域的pI值中所提及的一个差异通常表示半抗体从被寻求要被共纯化的此类抗体的一良好分离和/或从单特异性抗体的一良好分离。

在如本文所公开的一种方法或组合物的一具体例中，两种或更多种双-或多特异性抗体具有恒定区以及轻链具有相同的氨基酸序列或具有基本上相同的氨基酸序列。当位于每个抗体中的重链可变区的平均pI值与被寻求要被共纯化的相应的抗体的重链可变区的平均pI值差异为0.7单位或更少的时，该两种或更多种双-或多特异性抗体可以在一个CIEX层析步骤中来被共纯化。在一个被偏好的具体例中，此类抗体的一第一者的两个重链可变区的pI值的平均值“m”以及此类抗体的一第二者的两个重链可变区的pI值的平均值“n”差异为0.6单位或更少，优选地与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“m”和“n”的平均值差异为0.5单位或更少。“m”和“n”与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“m”和“n”的平均值差异优选地为0.4(优选地0.3，优选地0.2以及优选地0.1)单位或更少。这样的双-和/或多特异性抗体通常具有基本上为相同的滞留时间。在这个具体例中，此类抗体的恒定区基本上为相同的。这样的抗体的pI值而且特别是平均值“m”和“n”整体上表示相应的抗体的pI值。此具体例中，被偏好的是：位于被寻求要被共纯化的此类抗体的每一者的中的重链可变区的pI值与位于此类抗体中的重链可变区的pI值的平均值差异为大于0.2(优选地0.3，优选地0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.4，优选地是大于1.8或2.0)单位。在这个具体例中，位于一个抗体中的重链可变区的pI值的差异优选地要比“m”和“n”之间的差异大至少0.2单位，优选地它为要比“m”和“n”之间的差异大至少0.3、0.4、0.5(优选地至少0.6、0.7、7、0、7、0)0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2.0或2.5)。如在位于一个抗体中的重链可变区的pI值中所提及的一个差异通常表示半抗体从被寻求要被共纯化的此类抗体的一良好分离和/或从单特异性抗体的一良好分离。

此类抗体(诸如多特异性抗体)可以具有或被选择以具有重链与轻链组合(半抗体)或同质二聚体(例如，单特异性抗体)或其他抗体产物相关杂质，这些在所使用的IEX条件下具有滞留时间明显地不同于此类完整抗体或所欲的抗体(诸如多特异性抗体)的滞留时间。在其中该细胞表现一种共同轻链的一具体例中，该选择通常落在该重链上。该重链可以被修饰而使得此类半抗体或同质二聚体具有极为不同的滞留时间。在一个被偏好的具体例中，此类半抗体和/或同质二聚体的滞留时间与此类相应的抗体或多特异性抗体的滞留时间的平均值差异大于10％。在一个被偏好的具体例中，一个被寻求不要被共纯化的抗体的个别的重链与轻链组合的pI值的平均值与要被共纯化的该至少两种抗体的重链与轻链的pI值的平均值差异大于0.5单位。

本发明进一步提供一种包括有可通过一如本文所描述的方法而得到的2-10种重组型抗体组合物。还被提供的是一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：此类抗体中的至少两者的IEX滞留时间基本上是相同的。

本发明进一步提供一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：此类抗体中的至少两者的pI值与该至少两种抗体的平均pI值差异为0.4单位，0.3、0.2以及优选地0.1单位或更少。该至少两种抗体的每一者的pI值优选地与另一者差异为0.25单位或更少。

本发明进一步提供一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：该第一抗体的两个可变结构域的pI值的平均值“x”以及该第二抗体的两个可变结构域的pI值的平均值“y”与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“x”和“y”的平均值差异为0.7、0.6以及优选地0.5单位或更少。“x”和“y”与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“x”和“y”的平均值差异优选地为0.4(优选地0.3，优选地0.2以及优选地0.1)单位或更少。这样的抗体(诸如多特异性抗体)通常具有基本上为相同的滞留时间。在这个具体例中，此类抗体的恒定区基本上为相同的。该抗体的各自包括有一个重链可变区与一个轻链可变区的不同可变结构域的pI值而且特别是此类pI值的平均值整体上表示该抗体的pI值。

本发明进一步提供一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：该第一抗体的两个可变结构域的两个重链可变区的pI值的平均值“m”以及该第二抗体的两个可变结构域的两个重链可变区的pI值的平均值“n”与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“m”和“n”的平均值差异为0.7、0.6以及优选地0.5单位或更少。“m”和“n”与被寻求要被共纯化的该第一和第二抗体的“m”和“n”的平均值差异优选地为0.4(优选地0.3，优选地0.2以及优选地0.1)单位或更少。这样的抗体(诸如多特异性抗体)通常具有基本上为相同的滞留时间。在这个具体例中，此类抗体的恒定区以及轻链可变区基本上为相同的。该抗体的不同重链可变区的pI值而且特别是此类pI值的平均值整体上表示该抗体的pI值。

在一个被偏好的具体例中，对于要被收集在该组合物中的所有此类抗体，此类IEX滞留时间和/或此类pI值优选地基本上是相同的。在一个被偏好的具体例中，此类抗体中的至少两者为双特异性抗体。优选地，此类抗体中的至少两者共享一个相同的重链。

在某些具体例中，一个或两个V_H/V_L结合区的共同轻链可变区包括有一个生殖系IgVκ1-39*01可变区V-节段。在特定的具体例中，一个或两个V_H/V_L结合区的轻链可变区包括有κ轻链V-节段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的简写。该基因也被称为免疫球蛋白κ可变1-39、IGKV139、IGKV1-39。关于该基因的外部标识符是：HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。关于该V-区的氨基酸序列被提供于序列识别编号：25的中。该V-区也可被组合以5个J-区的中的一者。被偏好的J-区是jk1和jk5，而被连接的序列被表示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5，替代名称为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据位在imgt.org的IMGT数据库全球网站的命名)。在某些具体例中，一个或两个V_H/V_L结合区的轻链可变区包括有κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05(分别为序列识别编号：26和序列识别编号：27)。

在某些具体例中，一个双特异性抗体的一个或两个V_H/V_L结合区的轻链可变区包括有：一个包括有氨基酸序列QSISSY的LCDR1(序列识别编号：22)、一个包括有氨基酸序列AAS的LCDR2以及一个包括有氨基酸序列QQSYSTP的LCDR3(序列识别编号：24)(即根据IMGT，IGKV1-39的此类CDRs)。在某些具体例中，一个双特异性抗体的一个或两个V_H/V_L结合区的轻链可变区包括有：一个包括有氨基酸序列QSISSY的LCDR1(序列识别编号：22)、一个包括有氨基酸序列AASLQS的LCDR2(序列识别编号：23)以及一个包括有氨基酸序列QQSYSTP的LCDR3(序列识别编号：24)。

在某些具体例中，一个双特异性抗体的一个或两个V_H/V_L结合区包括有一个轻链可变区，该轻链可变区包括有一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于被阐述于序列识别编号：26中的氨基酸序列。在某些具体例中，一个双特异性抗体的一个或两个V_H/V_L结合区包括有一个轻链可变区，该轻链可变区包括有一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于被阐述序列识别编号：27中的氨基酸序列。

举例来说，在某些具体例中，相对于序列识别编号：26或序列识别编号：27，一个双特异性抗体的一个或两个_VH/VL结合区的可变轻链可以具有从0至10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、替换、加入或者这些的一组合。在某些具体例中，相对于被指明的氨基酸序列，一个双特异性抗体的一个或两个V_H/V_L结合区的轻链可变区包括有从0至9个、从0至8个、从0至7个、从0至6个、从0至5个、从0至4个，优选地从0至3个，优选地从0至2个，优选地从0至1个以及优选地0个氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。

在其它的具体例中，一个双特异性抗体的一个或两个V_H/V_L结合区的轻链可变区包括有序列识别编号：26或序列识别编号：27的氨基酸序列。在某些具体例中，一个双特异性抗体的两个V_H/V_L结合区包括有相同的V_L区。在一个具体例中，一个双特异性抗体的两个V_H/V_L结合区的V_L包括有被阐述序列识别编号：26中的氨基酸序列。在一个具体例中，一个双特异性抗体的两个V_H/V_L结合区的V_L包括有被阐述序列识别编号：27中的氨基酸序列。

双特异性抗体(诸如被揭露于本文的方法中的那些)可呈许多的型式被提供。许多不同型式的双特异性抗体被知晓于本技艺中。举例来说，非为带有两个VH/V_L组合的典型抗体的双特异性抗体型式具有至少一个可变结构域包括有一个重链可变区和一个轻链可变区。这个可变结构域可以被连接至提供第二结合活性的一个单链Fv-片段、单体、一个VH以及一个Fab-片段。

双特异性抗体(诸如被揭露于本文所提供的方法中的那些)一般地是属于人类IgG次型(例如，举例来说IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些具体例中，此类抗体是属于人类IgG1次型。全长的IgG抗体因为它们的有利的半衰期以及为了低免疫原性的缘故而被偏好。于是，在某些具体例中，此类双特异性抗体为全长的IgG分子。在一个具体例中，此类双特异性抗体为全长的IgG1分子。

在某些具体例中，抗体包括有一个可结晶的片段(Fc)。双特异性抗体的Fc区优选地由一个人类恒定区所构成。双特异性抗体的一恒定区或Fc对于一个天然存在的人类抗体的恒定区可以含有一个或更多个(优选地不超过10个，优选地不超过5个)氨基酸差异。举例来说，在某些具体例中，此类双特异性抗体的各个Fab-臂可以进一步地包括一个Fc-区包括有促进该双特异性抗体的形成的修饰、影响Fc-媒介的效应子功能的修饰和/或本文所描述的其他特点。

在一个方面中，被提供的是一种药学组合物，其包括有如本文所限定的两种或更多种抗体以及一药学上可接受的载体。如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指由一政府管理机构所批准或者被条列于美国药典或另一种公认的药典的内用于动物(特别是人类)的使用，并且包括其为生理上兼容的任何以及所有的溶剂、盐类、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂与吸收延迟剂，诸如这些。术语“载体”意指伴随化合物被投药的一种稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药学载体可以是无菌的液体，诸如水以及油，包括为石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯(glycerol polyethylene glycol ricinoleate)，诸如这些。水或水性食盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可以被使用作载体，特别是用于可注射的溶液。用于不经肠投药的液体组合物可被配方来供注射或连续输注的投药。通过注射或输注的投药途径包括膀胱内、肿瘤内、静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内以及皮下的。端视投药途径(例如，静脉内地、皮下地、关节内地(intra articularly)，诸如这些)而定，活性化合物可以被包覆在一物质内，以保护该化合物免受酸以及其他可能使该化合物失活的自然状况作用。

适合于供投药给人类病患的药学组合物通常被配方用于不经肠投药，例如，位在一液体载体中，或者适合于供回溶成为液体溶液或悬浮液来供静脉内投药。为了投药的容易性以及剂量的均一性，该组合物可呈剂量单位形式来被配方。

还被包括的是固体制备物，它们被意图在使用前不久被转化为供口服或不经肠投药的液体制备物。这样的液体形式包括溶液、悬浮液以及乳液。

一个“双特异性抗体”是一个如本文所描述的抗体，其中该抗体的一个结构域结合至一个第一抗原，而该抗体的一个第二结构域结合至一个第二抗原，其中该第一和第二抗原不是相同的。术语“双特异性抗体”还涵盖抗体，其中一个重链可变区/轻链可变区(V_H/V_L)组合结合一个位在一抗原上的第一表位，以及一个第二V_H/V_L组合结合一个第二表制。该术语进一步包括抗体，其中一个VH能够特异性地识别一个第一抗原，而在一免疫球蛋白可变区中被配对以该V_H的V_L能够特异性地识别一个第二抗原。所形成的V_H/V_L配对(pair)将会结合抗原1或者抗原2。这种所谓的“二合一抗体”，被描述于例如WO 2008/027236、WO 2010/108127以及Schaefer等人(Cancer Cell 20，472-486，October 2011)的中。一种根据本发明的双特异性抗体不受限于用于生成它的任何特定型式或方法。

当在本文提及核酸或氨基酸序列时，“百分比(％)相同性”被定义为：在排比序列用于最佳比较目的的后，一候选序列中的残基与一选定序列中的残基为相同的百分比。比较核酸序列的百分比序列相同性使用Vector NTI Program Advance 10.5.2软件的AlignX应用程序使用默认值来被测定，此类默认值使用一种改良的ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.，and Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22:4673-4680)、swgapdnarnt得分矩阵(swgapdnarnt score matrix)、一为15的空位开放罚分(gap opening penalty)以及一为6.66的空位延伸罚分(gap extension penalty)。氨基酸序列使用Vector NTIProgram Advance 11.5.2软件的AlignX应用程序使用默认值来被排比，此类默认值使用一种改良的ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.，and Gibson T.J.，1994)、blosum62mt2得分矩阵(blosum62mt2 score matrix)、一为10的空位开放罚分以及一为0.1的空位延伸罚分。

如本文所使用的术语“共同轻链”意指位于双特异性抗体中的两个轻链(或其V_L部分)。该两个轻链(或其VL部分)可以是相同的或者具有某些氨基酸序列差异而全长的抗体的结合特异性未被影响。术语“共同轻链”、“共同V_L”、“单一轻链”、“单一V_L”，有或无术语“重排的”的加入，在本文被互换地使用。“共同”也意指该轻链的氨基酸序列不是相同的功能等效物。此类轻链的许多变异体存在，其中不影响有功能的结合区的形成的突变(删除、取代、插入和/或加入)是存在的。本发明的轻链也可以是一个如本文上面所指明的轻链，具有从0至10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。举例来说，制备或发现非为相同的但仍为功能上等效的轻链落在如本文所使用的共同轻链的定义的范围的内，例如，通过引入以及测试守恒的氨基酸变化、位在当被配对以该重链的时不会或仅部分地有助于结合特异性的区域内的氨基酸的变化，诸如此类。根据本发明的术语“全长的IgG”或“全长的抗体”被定义为包括有一个基本上完整的IgG，但是它不必然地具有一个完整的IgG的所有功能。为了避免疑问，一个全长的IgG含有两个重链和两个轻链。各个链含有恒定区(C)和可变区(V)，它们可被分解成被指派为CH1、CH2、CH3、V_H以及C_L、V_L的结构域。一个IgG抗体经由被包括在Fab部分中的可变区结构域而结合至抗原，并且在结合的后可以通过此类恒定结构域(大多数基于Fc部分)而与免疫系统的分子和细胞相互作用。根据本发明的全长的抗体涵盖IgG分子，其中提供所欲求的特征的突变可能是存在的。全长的IgG不应具有此类区域的任何一者的实质部分的删除。但是，当中的一个或数个氨基酸残基被删除而基本上不改变所形成的IgG分子的结合特征的IgG分子被包罗在术语“全长的IgG”的内。举例来说，这样的IgG分子可以具有一介于1个和10个氨基酸残基之间的删除，优选地位在非-CDR区中，其中此类被删除的氨基酸对于该IgG的抗原或表位结合特异性而言不是必需的。

由于一抗体通常识别一抗原的一表位，而这样的一个表位可能也存在于其他的化合物中，“特异性地识别”一抗原的根据本发明的抗体可能也识别其他的化合物，如果此类其他的化合物含有同一种的表位。因此，术语“特异性地识别”，就一抗原与抗体相互作用而言，不排除此类抗体对含有同一种的表位的其他的化合物的结合。

术语“表位”或“抗原决定位”意指一个位在一抗原上的地址，一个免疫球蛋白或抗体特异性地结合至该地址。表位可以从相连氨基酸或借由一个蛋白质的三级折叠而被并置的非相连氨基酸而被形成(所谓的线形或构形表位)。从相连直链氨基酸而被形成的表位在暴露于变性溶剂的下通常被保留，而通过三级折叠而被形成的表位在使用变性溶剂的处理的下通常会丧失构形。一个表位通常可以在一个独特的空间构形中包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于测定表位的空间构形方法为具有本领域的通常技艺的人士所知晓的，并且包括本领域中的技术，例如X射线晶体学、氢氘交换质谱法(HDX-MS)以及二维核磁共振(2-dimensional nuclear magnetic resonance)、肽扫描(pepscan)以及根据表位的本质的丙胺酸扫描(alanine scan)(参见，例如Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。

为了明确性以及一个简洁的发明说明的目的，特征在此被描述以作为相同的或独立的具体例的部分，然而，将会被理解的是：本发明的范围可以包括具有全部的或者一些的所述特征的组合的具体例。

为了让本发明可以被更容易地了解，某些术语首先被限定。附加定义被阐述于整个详细说明的中。除非另有说明，被使用于本文的所有的技术性和科学性术语具有通常为一具有本领域的通常技艺的人士所了解的意义，而且免疫学、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术与药理学的传统方法被使用。

如本文所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”以及“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。术语“包括(including)”此外其他形式(诸如动词原形的“include”、第三人称单数动词的“includes”和动词过去式的“included”)的使用是没有限制的。

实施例

实施例1

材料与方法

细胞株

HEK293和CHO-K1被维持于生长培养基中。

双特异性抗体的产生

双特异性抗体使用专有的CH3技术(而被产生，以确保一双特异性抗体的有效异二聚体化与形成。如先前所述的(PCT/NL2013/050294；被公告为WO 2013/157954 A1)，该CH3技术利用位于该CH3区中的以电荷为基础的点突变，以允许两个不相同的重链分子的有效配对。

一个VH基因被选殖至两个不相同架构的IgG1载体的中的一者内。端视结合伙伴而定，该VH被选殖至一个包括有带有异二聚体化变异体“DE”的CH3变异体的IgG1架构或者包括有互补的CH3异二聚体化变异体“KK”的IgG1架构中。在其中的两种或更多种抗体共享一个重链的双-或多特异性抗体的情况下，该共享链优选地具有该CH3异二聚体化变异体“DE”(还被称为该DE-重链)，而该两种或更多种独特的重链具有该CH3异二聚体化变异体“KK”(还被称为该KK-重链)。

HEK293细胞被短暂转染以DNA-FUGENE混合物并且被进一步的培养。在转染的后7天，上澄液被收获，而培养基被更新。在转染的后14天，上澄液被合并并且被过滤通过0.22μM。无菌上澄液被储存在4℃下。经悬浮调适的293F细胞被培养于位在一个振荡器盘上的T125培养瓶内直到一为3.0×10⁶个细胞/mL的密度。细胞在一为0.3-0.5×10⁶个活细胞/mL的密度的下被播种至一个24深孔培养盘的每一个孔的内。此类细胞被短暂转染以个别的无菌DNA：PEl-MIX并且被进一步的培养。在转染的后7天，上澄液被收获并且被过滤通过0.22μM。无菌上澄液被保存在4℃下。

共表现两种双特异性抗体的安定的细胞株池的产生

CHO细胞被转染以3种重链构造物以及一种共同轻链构造物，呈一共同轻链构造物(cLC)：EGFR重链：HER2重链：HER3重链的摩尔比为2.5:2：1:1。10个由被安定地转染的细胞所构成的池(A-J)被获得。抗-EGFR、抗-HER2以及抗-HER3抗体的ELISA分析于该10个池的第3天与第6天之上澄液来被执行。全部3种特异性可以在所有的池中被测定出。

共表现两种双特异性抗体的安定的细胞株选殖株的产生

此类池被平板接种于半固体培养基中，并且被允许生长历时7-10天。单一群落被挑选并且被播种至24井培养盘的内。在从培养物之上澄液收集抗体的前，群落被再播种。

抗体力价(antibody titers)的测定

含有一种单一双特异性抗体的样品的抗-HER2抗体力价通过针对Erbb-2Fc蛋白质(R&D systems)的ELISA来被测定。含有一种单一双特异性抗体的样品的抗-HER3力价通过针对人类Erbb-3-Fc蛋白质(R&D systems)的ELISA来被测定。含有一种单一双特异性抗体的样品的抗-EGFR抗体力价通过针对人类EGFR ECD-Fc蛋白质(R&D systems)的ELISA来被测定。此类抗原的连续2倍稀释物被用来涂覆一个ELISA盘的孔，从5μg/mL开始。

用于定量包括有该两种双特异性抗体的组合物的中的EFGRxHER2和EGFR×HER3双特异性抗体的ELISA分析通过以EGFR-Fc(R&D systems)来涂覆ELISA盘而被进行的。在清洗的后，此类盘使用样品来被培育。在清洗的后，带有一个EFGR臂以级一个HER2臂的被结合的双特异性抗体的存在通过以经标示的HER2-Fc来进行培育而被检测。带有一个EFGR臂以级一个HER3臂的被结合的双特异性抗体的存在通过以经标示的HER3-Fc来进行培育而被检测。

IgG纯化

IgG的纯化使用亲和力层析法来被执行。纯化在无菌条件下使用真空过滤来被执行。首先，培养基的pH值被调整至pH 8.0，而生成物随后于25℃的下、在一设为600rpm的平板摇动仪上，以蛋白质ASepharose CL-4B珠粒(50％v/v)(Pierce)被培育历时2小时。其次，此类珠粒借由真空过滤而被收获。珠粒以PBS pH 7.4被清洗2次。IgG在pH 3.0的下使用0.1M柠檬酸盐缓冲液来被洗提，而IgG分馏物立即通过Tris pH 8.0来被中和。缓冲液交换通过使用Ultracel(Millipore)的离心法来被执行。此类样品最后处于一为PBS pH 7.4的最终缓冲液中。

阳离子交换层析法(CIEX)

CEX-HPLC层析法使用TSKgel SP-STAT(7μm粒径，4.6mM I.D.×10cm L，Tosoh21964)系列的离子交换管柱而被完成。此类管柱被填充以用于生物分子的速度与高解析分析此外分离的无孔树脂粒子。位于TSKgel STAT管柱中的粒子含有一由多层离子交换基团所构成的开放式出入网状结构来供装载容量，而该粒径使得这些管柱适合于供HPLC和FPLC系统的用。

TSKgel SP-STAT(7μm粒径，4.6mM I.D×10cm L，Tosoh 21964)使用缓冲液A(磷酸钠缓冲液，25mM，pH 6.0)来被平衡，在这的后抗体借由提高盐浓度以及运行缓冲液B(25mM磷酸钠，1mM NaCl，pH 6.0)的一梯度而从该管柱被排出。流速被设定在0.5mL/分钟。关于所有的测试样品以及对照组(配于PBS中)的注入样品质量为10μg，而注入体积是10-100μL。层析图根据220nm的结果就所观察到的波峰型态、滞留时间以及主要波峰的波峰面积来被分析。

结果

双特异性抗体PB4516p08和PB6892p04的CIEX曲线图被比较(参见图2)。被观察到的是：PB6892的生成含有一明显数量的杂质。又，PB6892的双特异性抗体分馏物的滞留时间是明显地低于PB4516的双特异性抗体分馏物的滞留时间。为了借由同一细胞的共同生成以及随后使用CIEX的共纯化，该两种双特异性抗体的滞留时间优选地是靠得更近。为此原因，PB6892的HER2臂的可变区被替换为一个不相同的可变区。带有可变区MF2032的重链被选择和使用，以生成EGFR×HER2双特异性抗体PB11244。PB4516p10和PB11244p01的CIEX曲线图被显示于图3中。此类双特异性抗体分馏物的滞留时间分别为16.310和16.950。这些滞留时间足够相同以允许在所示的条件下的使用CIEX的共纯化。此外，该图显示：杂质的滞留时间充分地不相同以允许在分析级和制备级管柱中的有效分离。上述的双特异性抗体制备物在HEK293细胞中被生成。

为了共同生成，CHO-K1细胞被使用。CHO细胞被转染以含有三种重链构造物，该三种重链带有MF3755(EGFR)、M2032(HER2)和MF3178(HER3)的相应的可变区，连同以一表现具有序列识别编号：26的轻链可变区的构造物来转染CHO-K1细胞。载体阳性细胞被选择与汇集。由被转染的CHO-K1细胞所构成的10个独立池(被识别为A-J)被产生。

表1显示由相应的池所生成的双特异性抗体PB4516(EGFR×HER3)和PB11244(EGFR×HER2)的数量。又，此类数量的比值此外被生成的IgG的总量被显示。F池和J池被选择用于次选殖。

表2显示由相应的选殖株所生成的双特异性抗体PB4516(EGFR×HER3)和PB11244(EGFR×HER2)的数量。

由选殖株FST2cp12所生成的抗体被使用，以分析CIEX曲线图(参见图4)。清楚可见的是：该两种双特异性抗体有效地共洗提于相同的CIEX洗提分馏物中。

选殖株FST2cp09被进一步地次选殖，以确保该细胞株是单源性，而一个进一步的CIEX曲线图确定了被生成的此类抗体。图5显示该CIEX曲线图。清楚可见的是：该两种双特异性抗体有效地共洗提于相同的CIEX洗提分馏物中。该两种双特异性抗体在该共洗提中的相对贡献通过ELISA和/或通过疏水互作用管柱来被分析。双特异性抗体特异性ELISA表明743μg/mL的EGFR/HER2双特异性抗体PB11244以及1134μg/mL的EGFR/HER3双特异性抗体PB4516的存在。

实施例2

共表现两种双特异性抗体的安定的细胞株池的产生

表现图7中所条列的成双成对的(two by two)双特异性抗体的细胞株如下述来被生成。CHO细胞被转染以3种重链构造物以及1种共同轻链构造物。该3种重链借由被表明于该框中的重链可变区(MFXXXX)来被识别。该轻链包括具有串行识别编号：26的IgVκ1*39/jk1的轻链可变区序列。该两种双特异性抗体具有一个为共同的重链以及一个各自不同的重链。举例来说，被指明于图7中的第一对共享一个共同重链(包括有相同的HER3结合臂包括有一个重链可变区(MF3178))以及一个不相同的第二结合臂。PB4528具有一个EGFR结合臂带有一个重链可变区(MF4003)，而PB4188具有一个HER2结合臂带有一个重链可变区(MF3958)。该共享重链具有兼容的DE/KK异二聚体化结构域的KK CH3区。该共享重链臂也可以具有DE CH3区。举例来说，在图3-5处，两种双特异性抗体被共纯化，PB11244和PB4516。如图3c处所显示的，PB11244和PB4516共享该相同的EGFR结合臂带有一个重链可变区(MF3755)，以及PB11244具有一个HER2结合臂带有一个重链可变区(MF2032)，而PB4516具有一个HER3结合臂带有一个重链可变区(MF3178)。在这一对的双特异性抗体中的共享重链臂具有DE CH3区，而此类不相同的HER2和HER3结合臂具有KK CH3区。

共同轻链构造物(cLC)：共享重链构造物：不相同的重链构造物1：不相同的重链构造物2的莫尔比＝2.5:2:1:1。由被安定地转染的细胞所构成的池被获得。抗原的ELISA分析在从此类池所收集之上澄液来被执行。全部3种抗原结合物种在此类池中被测定出。位在图7的每一对的中的双特异性抗体的CIEX滞留时间在相似的CIEX条件下来被测定并且被表明于第8个直行中。与平均滞留时间的偏差使用公式100x(A-B)/(A+B))来被计算，其中A为具有最长的滞留时间的双特异性抗体的滞留时间。举例来说，有关于第一对的偏差为100×((16.46-16.24)/(16.46+16.24))＝0.67或0.7％。

位于被收集之上澄液中的抗体首先借由蛋白质A萃取，接续以酸洗提与快速中和，而从该上澄液中的其他蛋白质被分离出。被收集的抗体的缓冲液随后被交换为PBS。此类样品随后被装填至CIEX管柱上，并且借由给予一增高的盐梯度来被清洗和洗提。洗出液的吸收在220nm下来被测量，而滞留时间从该盐梯度的起始以及双特异性抗体的波峰的观察来被计算。此类双特异性抗体被收集，而位于被收集的洗出液中的相应的双特异性抗体借由ELISA来被验证(verified)。相应的双特异性抗体的滞留时间被表明于最后一个直行中。清楚可见的是：许多配对具有在一个CIEX管柱中有效地共洗提的滞留时间。还清楚可见的是：该CIEX层析法提供共洗提的双特异性抗体和相应的同质二聚体(如果有的话)的一良好分离。图6条列出存在于共洗提的双特异性抗体中的带有重链(包括有重链可变区)的同质二聚体的各种不同抗体的滞留时间。清楚可见的是：此类同质二聚体的滞留时间充分地不同于相应的双特异性抗体。举例来说，在图7的第一个框中，此类同质二聚体PG3178、PG3958和PG4003可以存在于一个生成物中。此类相应的同质二聚体的滞留时间为大约22、12和13(图6，横列1-3)，而包括有该重链可变区的此类双特异性抗体的滞留时间为大约19和19.5(图7，横列1和2)。

表1

表1：细胞池中的EGFRxHER2与EGFRxHER3双特异性抗体生成的定量。10个池(A-J)的培养物上澄液被估量。ELISA分析根据EGFR-Fc涂覆、被生成的抗体的结合以及使用经标示的HER2-Fc或者经标示的HER3-Fc的检测。A-J池使用该两种ELISA分析来被分析。双特异性抗体PB4516和PB11244为带有兼容的DE/KK异二聚体化结构域的IgG1重链抗体。此类重链被组合以该共同轻链。此类双特异性抗体在一个重链上共享该MF3755重链可变区，并且各自在另一个IgG1重链上具有一个不相同的重链可变区(对于PB4516为MF3178，以及对于PB11244为MF2032)。

表2

表2：被选择的池被使用于单一细胞选殖。18个群落从3个池被挑选出。两个独立的F池(FST1和FST2)以及一个J池(JST1)被使用于单一细胞选殖。指示“cp”接续以一个数字识别一个池的个别的群落。让被挑选的群落生长并且被使用于抗体的收集。来自相同的池的个别的群落生成不同数量的以及不同比例的相应的双特异性抗体。

序列表

<110> 荷兰商美勒斯公司 (MERUS N.V.)

<120> 制备包含两种或更多种抗体的组合物

<140> TW 109104781

<141> 2020-02-14

<150> EP 19178542.7

<151> 2019-06-05

<150> EP 19157286.6

<151> 2019-02-14

<160> 31

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER3-MF3178

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER3-MF3163

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ser Tyr Ser Arg His Phe Tyr Ser Trp Trp Ala Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER3-MF6061

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1-MF6930

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Ile Pro Val Phe Glu Thr Ala Thr Tyr Glu Lys Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Val Glu Ala Thr Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1-MF6256

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Ile Pro Val Phe Asp Thr Ser Ser Tyr Glu Lys Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ile Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Val Glu Ala Thr Leu Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2-MF1849

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LGR5-MF7423

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ser Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Gly Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Ile Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-MF3755

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Asn Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Arg Phe Leu Glu Trp Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LGR5-MF7428

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ser Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Leu Ile Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LGR5-MF7533

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ser Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Gly Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Ile Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LGR5-MF7532

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Cys Asp Ser Thr Ser Cys Tyr Arg Tyr Ser Tyr Gly

100 105 110

Tyr Glu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-MF4280

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Tyr Gly Lys Thr Phe Phe Ala Gln Asn Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ala Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Gly Tyr Tyr Glu Thr Thr Thr Tyr Tyr Tyr Asn Leu Phe

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2-MF3958

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Pro Val Tyr Tyr Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-MF4003

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Phe

20 25 30

Ala Met Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Thr Thr Asn Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Ser Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Tyr Asn Trp Ile Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不适用

<400> 15

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不适用

<400> 16

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2-MF3025

<400> 17

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Ala Val Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-MF4010

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Asp Pro Ser Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Glu Phe Leu Glu Trp Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TIM3-MF6501

<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Asn Ala Trp Asp Ser Met Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2-MF1898

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gly Phe Arg Arg Thr Thr Leu Ser Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2-MF2032

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Tyr Tyr Arg Arg Thr Ala Arg Ala Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1

<400> 22

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR2

<400> 23

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR3

<400> 24

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro

1 5

<210> 25

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgVk1-39*01

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro

85 90 95

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同轻链IgKV1*39/jk1

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共同轻链IgKV1*39/jk5

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 CH1

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys

100 105

<210> 29

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 CH2

<400> 29

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 CH3 KK

<400> 30

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 CH3 DE

<400> 31

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

Claims

1.一种用于生成至少两种抗体的方法，包括：

-提供带有编码此类抗体的核酸的细胞；

-培养此类细胞；

-从培养物来收集此类抗体；以及

-通过离子交换层析法(IEX)而将被生成的抗体与半抗体分开来；所述方法特征在于：在所使用的IEX条件下，此类抗体展现出IEX滞留时间与个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。

2.根据权利要求1所述的方法，其中从所述培养物来收集此类抗体包括由抗体亲和力纯化而从其他蛋白质纯化出抗体，优选地是由蛋白质A萃取。

3.根据权利要求2所述的方法，其中进一步包括将亲和力纯化的抗体引至粒径筛析层析法(size-exclusion chromatography)(凝胶过滤层析法和/或阴离子交换层析法)。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其中在所述IEX之后，被收集的抗体通过疏水互作用层析法(HIC)来被定量分析相对的表现电平。

5.根据权利要求4所述的方法，其中被收集的抗体的特异性借由ELISA来被验证。

6.根据权利要求1-5所述的方法，其中相应的半抗体的滞留时间落在此类抗体的滞留时间所跨距的范围的外。

7.根据权利要求6所述的方法，其中此类细胞生成3种重链。

8.根据权利要求7所述的方法，其中此类重链包括有供重链的有效异二聚体化的结构域。

9.根据权利要求1-8所述的方法，其中此类抗体中的至少两者为双特异性抗体。

10.根据权利要求1-9所述的方法，其中此类抗体中的至少两者共享一个相同的重链。

11.根据权利要求1-10所述的方法，其中此类抗体具有等电点(pI)，其与所述至少两种抗体的平均pI值差异为0.4单位或更少。

12.根据权利要求1-11所述的方法，其中此类抗体被选择用于具有重链与轻链组合，此类重链与轻链组合在所使用的IEX条件下具有滞留时间是明显地不同于完整抗体的滞留时间。

13.根据权利要求12所述的方法，其中重链与轻链组合的pI值与所述至少两种抗体的平均pI值差异为0.4单位或更少。

14.根据权利要求1-13所述的方法，其中此类重链包括有一个有利于重链的异二聚体化的CH3结构域。

15.根据权利要求1-14所述的方法，其中此类抗体的重链为IgG重链。

16.根据权利要求7-15所述的方法，其中一个重链包括有位在CH3区中的氨基酸取代L351K和T366K(EU编号)，而另一个重链包括有位在CH3区中的氨基酸取代L351D和L368E。

17.一种用于生成至少抗体的方法，包括：

-提供带有编码此类抗体的核酸的细胞；

-培养此类细胞；

-从培养物来收集此类抗体；以及

-通过离子交换层析法(IEX)而将被生成的抗体与半抗体分开来；所述方法特征在于：在所使用的IEX条件下，此类抗体展现出IEX滞留时间与个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低，以及其中在所述IEX之后，被收集的抗体通过疏水互作用层析法(HIC)来被定量分析相对的表现电平，以及被收集的抗体的特异性通过ELISA来被验证。

18.一种组合物，其包括有可通过权利要求1-17所述的一方法而获得的2-10种重组型抗体。

19.一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：在此类IEX条件下，此类抗体中的至少两者的IEX滞留时间与个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。

20.一种包括有2-10种重组型抗体的组合物，特征在于：此类抗体中的至少两者的pI值与所述至少两种抗体的平均pI值差异为0.4单位或更少。

21.根据权利要求18-20所述的组合物，特征在于：对于所有的此类抗体，此类IEX滞留时间和/或此类pI值基本上是相同的。

22.根据权利要求18-21所述的组合物，其中此类抗体中的至少两者为双特异性抗体。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中此类抗体中的至少两者共享一个相同的重链。