CN114349801A - 一种锝-99m标记含异腈的铁草胺衍生物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种^99mTc标记含异腈的铁草胺衍生物及其制备方法和应用，将具有细菌特异性的铁草胺(Ferrioxamine B)转化为可与^99mTc络合的异腈基铁草胺(CNFO)，通过利用CNFO配体中的异腈基与^99mTc配位制备工艺，得到^99mTc‑CNFO配合物。该配合物为亲水性物质，放化纯度高、稳定性良好，制备简便，在细菌性炎症部位有较高的摄取与良好的滞留，炎症/肌肉比值好，可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症，可作为新型细菌性炎症显像剂推广应用。

Description

一种锝-99m标记含异腈的铁草胺衍生物及制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及放射性药物化学和临床核医学技术领域，具体说是涉及到一种锝-99m标记含异腈的铁草胺衍生物及制备方法和应用。

背景技术：

近年来，单光子发射计算机断层成像术(Single Photon Emission ComputedTomography,SPECT)和正电子发射断层成像术(Positron Emission Tomography,PET)等核医学成像得到了充分发展，核医学显像可以准确地定位病灶区域，反映炎症的病理生理变化，有助于发现病因从而针对性地制定治疗方案，灵敏度高，特异性强。而随着核医学显像的发展，制备和开发安全、有效的细菌性炎症显像剂，成为当前临床研究的迫切需要。细菌等微生物存在特定的铁代谢，会分泌出特定的铁载体与环境中的铁元素络合得到相应的铁载体的铁络合物，进而特异性摄取铁载体络合物完成其自身铁代谢。铁草胺(FerrioxamineB)是天然铁载体——去铁胺(Desferrioxamine B)与铁元素络合得到的络合物，能被细菌特异性摄取，是细菌性炎症显像剂的研究热点。近期有研究人员通过⁶⁷Ga和⁶⁸Ga标记去铁胺得到铁草胺类似物^67/68Ga-DFO-B，得到较优异的细菌性感染成像效果。然而⁶⁷Ga核素需要加速器制备，来源不方便。⁶⁸Ga核素目前虽然可以通过商业化锗镓发生器获得，但是目前PET/CT在发展中国家的普及程度不够，限制其发展。^99mTc作为最常见的SPECT显像核素，可由⁹⁹Mo/^99mTc发生器淋洗获得，而且^99mTc标记的药物可通过药盒化制备，易于临床推广使用。锝-99m标记的铁草胺作为诊断细菌性炎症的放射性药物还未有报道，因此开发新型锝-99m标记的该类细菌性炎症显像剂具有必要性。

由于异腈基(-NC)属于强配位基团，当其与^99mTc(I)配位时，除了σ配键的生成，还会形成π反馈键，最终可形成六配位的稳定^99mTc标记物。由于标记物中含有6个异腈基配体分子，可增强标记物的靶向性。基于以上背景，本发明通过合成含异腈的铁草胺衍生物(CNFO)，将其进行^99mTc标记来探求新型细菌性炎症显像剂，具有重要的科学意义和广阔的临床应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种含异腈基的铁草胺衍生物及其应用，该类衍生物制备简便，进行放射性标记后，得到一种放射化学纯度高、稳定性良好，制备简便，应用于细菌性炎症显像领域的^99mTc标记的异腈类铁草胺配合物，同时提供其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种^99mTc标记异腈基铁草胺配合物，结构通式为[^99mTc-(CNFO)₆]⁺，其结构式如下：

该结构式中：以^99mTc⁺核为中心核，CNFO配体分子中异腈的碳原子与^99mTc配位形成六配位的^99mTc-CNFO配合物。其中，n表示2及2以上的整数。

^99mTc-CNFO配合物的制备方法如下：

1.配体CNFO的合成：

称取适量氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入适量甲醇溶解，然后加入适量去铁胺甲磺酸盐，滴加含有化合物1的二氯甲烷溶液，室温过夜反应，反应结束后，浓缩母液，冷却后析出沉淀，过滤，得到滤饼用适量二氯甲烷洗涤，干燥后得到化合物2；

称取适量氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入适量甲醇溶液，然后加入适量乙酰丙酮铁，搅拌混合，溶解完全后，加入适量化合物2，室温反应约1小时，反应结束后，利用TLC制备板纯化得到CNFO。

具体合成路线为：

；

2.^99mTc-CNFO的制备：

将适量的柠檬酸钠、L-半胱氨酸溶于生理盐水中，加入一定量的SnCl₂·2H₂O，调节溶液pH 5.6-6.0，向其中依次加入适量CNFO和新鲜淋洗的Na^99mTcO₄溶液，室温下反应30min即得到所述的^99mTc-CNFO配合物。

本发明所述的化学合成试剂均是市售商品，来源广泛，容易获得。

通过上述方法制备的^99mTc-CNFO配合物的放射化学纯度大于90％，其体外稳定性良好。该配合物在金黄色葡萄球菌致炎的小鼠模型中有较高的炎症摄取和炎症/肌肉比值，可以成为一种新型的细菌性炎症显像剂。

实验表明，^99mTc-CNFO配合物的鉴定及性能如下：

1.^99mTc-CNFO配合物的层析鉴定：

薄层层析色谱(TLC)鉴定：用浸渍硅胶玻璃微纤维色谱纸(iTLC-SG)作为支持体，用柠檬酸-葡萄糖溶液(ACD)作展开剂，测定的层析结果见表1。

表1.各层析结果(R_f值)

由上述层析鉴定所测得的标记物的放射化学纯度大于90％。

高效液相色谱法(HPLC)鉴定：

采用高效液相色谱(HPLC)进行标记物放射化学纯度的鉴定：以含0.1％三氟乙酸的纯水(A相)和含0.1％三氟乙酸的乙腈(B相)为流动相，洗脱梯度如下表2所示。

表2.HPLC洗脱梯度

HPLC鉴定结果表明，^99mTc-CNFO配合物的保留时间为9.53min。

2.^99mTc-CNFO配合物的脂水分配系数的测定

取10mL离心管，分别加入0.9mL PBS缓冲溶液(0.025mol/L,pH＝7.4)，1.0mL正辛醇，0.1mL^99mTc-CNFO配合物溶液，于旋涡振荡器旋转混匀3min，之后在5000rpm下离心5min。分别取有机相和水相0.1mL，测定两相放射性计数,平行测定四组，并计算其分配系数P(P＝有机相的放射性活度/水相的放射性活度)，测得log P＝-3.24±0.09(n＝4)，说明^99mTc-CNFO是一种亲水性物质。

3.^99mTc-CNFO配合物的稳定性测定

将标记好的^99mTc-CNFO配合物分别在室温下和在37℃小鼠血清中放置4小时后测定其放射化学纯度均大于90％，说明其体外稳定性良好。

4.^99mTc-CNFO配合物的体外细菌竞争结合实验

在离心试管中加入0.1mL约含金黄色葡萄球菌1×10⁸个的PBS溶液(0.025mol/L，pH＝7.4)、0.8mL生理盐水、0.1mL ^99mTc-CNFO配合物溶液，作为对照组(n＝6)；在37℃恒温箱中孵育1h后，离心，得到细菌沉淀与上清液。移取上清液，用1mL PBS溶液(0.025mol/L，pH＝7.4)洗涤沉淀，并振荡使细菌再次悬浮，再次按上述条件离心，重复两次。用少量PBS溶解洗涤后的细菌沉淀，移取至测试管中，测定细菌沉淀的放射性计数A。结果以平均放射性计数±标准偏差表示。为探究^99mTc-CNFO与细菌的结合是否具有特异性，选取制备的异腈铁草胺(CNFO)配体为竞争药物，进行细菌结合的特异性竞争实验。将CNFO配制成0.5mg/mL的溶液，取0.1mL该溶液与0.7mL生理盐水分别加至离心管中，并加入0.1mL约含金黄色葡萄球菌1×10⁸个的PBS溶液(0.025mol/L，pH＝7.4)，37℃恒温孵育1h。之后加入0.1mL^99mTc-CNFO标记液，作为抑制组(n＝6)，继续在37℃下恒温孵育1h，之后按上述方法计算细菌沉淀的放射性计数。结果表明^99mTc-CNFO在加入CNFO竞争抑制之后，细菌沉淀的放射性计数降低了52.24％，说明^99mTc-CNFO配合物与细菌结合具有特异性。

5.^99mTc-CNFO配合物在炎症小鼠模型中的生物分布实验：

为验证^99mTc-CNFO是否能够区分细菌性炎症与非细菌性炎症，需要分别建立细菌性致炎和非细菌性致炎两种小鼠模型。细菌性致炎小鼠模型的建立：将0.1mL金黄色葡萄球菌(1×10⁹/mL)注射到18～22g的昆明小鼠的左后腿肌肉部位，24h后取感染明显的模型小鼠进行生物分布实验。非细菌性炎症小鼠模型的建立：将0.1mL松节油注射到18～22g的昆明小鼠的左后腿肌肉部位，48h后取致炎明显的模型小鼠进行生物分布实验。对上述两种模型小鼠分别经尾静脉注射0.1mL(约1.85×10⁵Bq)配合物，于注射后0.5h、1h、2h处死。取不同脏器、脓肿肌肉和对侧大腿肌肉称重，并在γ-counter上测其放射性计数，每个时相的小白鼠数为5只。计算各组织的每克百分注射剂量(％ID/g)。结果见表3。

表3.^99mTc-CNFO配合物在不同炎症小鼠模型中的生物分布(n＝5,％ID/g)

*p<0.05

由以上结果可知，^99mTc-CNFO在炎症部位有较高的摄取和良好的滞留，炎症/肌肉比值好，且其在细菌性致炎模型的炎症摄取值更高，表明其可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症。

6.^99mTc-CNFO配合物在同时感染细菌性和非细菌性炎症小鼠模型中的SPECT/CT显像实验：

同时感染细菌性和非细菌性炎症小鼠模型的建立：将0.1mL松节油注射到18～22g的昆明小鼠的右前腿肌肉部位，24h后，在同一只模型小鼠的左前腿肌肉部位注射0.1mL金黄色葡萄球菌(1×10⁹/mL)，24h后进行SPECT/CT显像实验(n＝2)。

将0.1mL(约3.7×10⁷Bq)标记好的配合物溶液从尾静脉注射到模型小鼠体内，分别在2h和4h后用异氟烷将其麻醉，然后进行SPECT/CT显像。SPECT显像结果表明其在细菌性感染部位的放射性摄取明显优于松节油致炎部位的摄取。

本发明为亲水性物质，放射化学纯度高、稳定性良好，制备简便，在细菌性炎症部位有较高的摄取与良好的滞留，炎症/肌肉比值好，可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症，可作为新型细菌性炎症显像剂推广应用，达到了发明目的。

具体实施方式：

下面通过实施例详述本发明：一种^99mTc-CNFO配合物，其结构式如下：

该结构式中：以^99mTc⁺核为中心核，CNFO配体分子中异腈的碳原子与^99mTc配位形成六配位的^99mTc-CNFO配合物。其中，n表示2及2以上的整数。

a.配体CNFO的合成：

称取6.4mg(0.16mmol)氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入10mL甲醇溶解，然后加入104mg(0.16mmol)去铁胺甲磺酸盐，溶解完全后，滴加含有69mg(0.24mmol)化合物1(n＝5)的二氯甲烷溶液，室温过夜反应，反应结束后，浓缩母液，冷却后析出沉淀，过滤，得到滤饼用适量二氯甲烷洗涤，干燥后得到白色固体化合物2(55mg)，产率51％。C₃₂H₅₇N₇O₉:¹H-NMR:(400MHz,DMSO-d₆)δ9.60(s,3H),7.77(s,3H),3.45(t,J＝7.2Hz,8H),3.00(d,J＝6.0Hz,6H),2.57(t,J＝7.0Hz,4H),2.26(t,J＝7.2Hz,4H),2.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.96(s,3H),1.56(d,J＝4.2Hz,2H),1.49(dd,J＝14.2,7.0Hz,8H),1.38(dt,J＝14.2,7.0Hz,6H),1.30(d,J＝8.3Hz,2H),1.21(d,J＝5.8Hz,6H).¹³C-NMR:(101MHz,DMSO-d₆)δ172.84,172.52,172.23,170.98,155.56,47.62,47.34,41.51,35.67,30.45,29.17,28.60,28.06,26.44,25.85,24.93,23.92,20.73.HRMS(m/z):684.4296(calc.684.4290[C₃₂H₅₇N₇O₉]H⁺).

称取4mg(0.10mmol)氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入5mL甲醇溶液，然后加入13mg(0.037mmol)乙酰丙酮铁，搅拌混合，溶解完全后，加入20mg(0.029mmol)化合物2，室温反应约1小时，反应结束后，利用TLC制备板(二氯甲烷：甲醇＝3:1)纯化得到深红色固体CNFO(18mg)，产率84％。C₃₂H₅₄N₇O₉Fe:HRMS(m/z):737.3412(calc.737.3405[C₃₂H₅₄N₇O₉Fe]H⁺).

b.^99mTc-CNFO的制备

将2.6mg柠檬酸钠、1mg L-半胱氨酸溶于生理盐水中，加入0.1mg SnCl₂·2H₂O，调节溶液pH 5.6-6.0，向其中依次加入20μg CNFO和新鲜淋洗的Na^99mTcO₄溶液，室温下反应30min即得到所述的^99mTc-CNFO配合物。

上述所述方法制备得到的^99mTc-CNFO配合物的放射化学纯度大于90％，为亲水性物质，体外稳定性良好。其在金黄色葡萄球菌感染的炎症小鼠模型中，炎症部位摄取高，炎症/肌肉比值好，可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症，可作为新型细菌性炎症显像剂推广应用。

Claims (3)

1.一种^99mTc标记含异腈基的铁草胺衍生物，其分子通式一种^99mTc-CNFO配合物，其结构式如下：

该结构式中：以^99mTc⁺核为中心核，CNFO配体分子中异腈的碳原子与^99mTc(I)配位形成六配位的^99mTc-CNFO配合物。其中，n表示2及2以上的整数。

2.一种权利要求1所述的^99mTc-CNFO配合物的制备方法，其工艺步骤如下：

a.配体CNFO的合成：

称取适量氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入适量甲醇溶解，然后加入适量去铁胺甲磺酸盐，滴加含有化合物1的二氯甲烷溶液，室温过夜反应，反应结束后，浓缩母液，冷却后析出沉淀，过滤，得到滤饼用适量二氯甲烷洗涤，干燥后得到化合物2；

称取适量氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入适量甲醇溶液，然后加入适量乙酰丙酮铁，搅拌混合，溶解完全后，加入适量化合物2，室温反应约1小时，反应结束后，利用TLC制备板纯化得到CNFO；

具体合成路线为：

b.^99mTc-CNFO配合物的制备：

将适量的柠檬酸钠、L-半胱氨酸溶于生理盐水中，加入一定量的SnCl₂·2H₂O，调节溶液pH 5.6-6.0，向其中依次加入适量CNFO和新鲜淋洗的Na^99mTcO₄溶液，室温下反应30min即得到所述的^99mTc-CNFO配合物。

3.如权利要求1所述的^99mTc-CNFO配合物作为细菌性炎症显像剂在核医学显像领域中的应用。