CN114276411B - 含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药合成领域，公开了一种含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法。该方法基于固相合成的方法，首先将树脂与Fmoc保护N端的氨基酸的羧基偶联，然后按多肽的序列设计依次进行氨基酸的酰胺键偶联，随后脱除半胱氨酸的巯基保护基，并与硫化试剂固相关环从而形成目标产物。该方法能够高收率地获得高纯度的含有三硫醚键的环肽化合物，并且该方法操作简单，合成周期短，成本低，适于含三硫醚桥环的环肽或母核结构中以三硫醚键为关键骨架的多肽衍生物的大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药合成领域，特别是涉及一种含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法。
背景技术
以三硫醚键结构为代表的多硫骨架因其在调控生理活动等方面所发挥的关键作用而备受关注，近年来许多内源性的三硫醚化合物被报道，包括含三硫醚键结构的抗体等。同时，三硫醚键是许多天然产物的重要官能团，如Varacins A，DATS，Outovirin C等分子均具有极好的生理活性。此外，包括三硫醚化合物在内的多硫化物也已广泛应用于先进材料领域。以下为几类含三硫醚键结构的代表性分子：
多肽类药物是介于传统小分子药和生物药之间的一类药物，目前已上市80余种，其中含有环肽基本骨架的多肽类药物占多数。由于多肽药物与受体蛋白通常基于蛋白-蛋白相互作用从而发挥药效，环肽分子相比于传统小分子药物具有更宽广的相互作用界面，针对传统意义上“不可成药”的靶点具有更好的成药潜力。
尽管三硫醚键结构和环肽骨架都具有重要意义，然而，目前将三硫醚键结构引入多肽骨架中的报道极少。因此，开发含三硫醚键的环肽化合物的合成方法具有十分重要的科学意义。
发明内容
基于此，本发明提供了一种含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，该方法操作简单，合成周期短，成本低，所得产物的产率和纯度高。
具体技术方案如下：
一种含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(A)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(A)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(B)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(B)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(C)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(C)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(D)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，L选自：H、或者如下结构所示的基团：
Rx、Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
各Rn分别独立地选自：H、Rn与Rx相连形成四氢吡咯环、Rn与Ry相连形成四氢吡咯环、或者Rn与Rz相连形成四氢吡咯环；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n1、n2和n3分别独立的选自：0、或者1以上的正整数。
在其中一些实施例中，所述含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(I)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(I)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(II)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(II)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(III)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(III)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(IV)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，Rx、Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
各Rn分别独立地选自：H、Rn与Rx相连形成四氢吡咯环、Rn与Ry相连形成四氢吡咯环、或者Rn与Rz相连形成四氢吡咯环；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n1、n2和n3分别独立的选自：0、或者1以上的正整数。
在其中一些实施例中，n1选自：0、1或者2，n2选自：0、1-10之间的正整数，n3选自：0、1、2、3或者4。
在其中一些实施例中，所述含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(V)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(V)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(VI)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(VI)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(VII)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(VII)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(VIII)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n2选自：0、1-6之间的正整数。
在其中一些实施例中，所述含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(IX)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(IX)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(X)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(X)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(XI)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(XI)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(XII)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，R0、R1、R2和R3是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团。
在其中一些实施例中，Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3分别独立地选自：H、C1-C10烷基、R4取代的C1-C10烷基；
R4选自：C6-C10芳基、R5取代的C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、R5取代的C5-C10杂芳基、C3-C6环烷基、羧基、羟基、氨基、C1-C6烷基酰基、卤素、巯基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、氨基酰基、胍基、三苯甲硫基、三苯甲氨基羰基、叔丁氧羰基、叔丁氧羰基氨基、Pbf保护的胍基；
R5选自：C1-C6烷基、C3-C6环烷基、羧基、羟基、氨基、C1-C6烷基酰基、卤素、巯基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、叔丁氧羰基、三苯甲基。
在其中一些实施例中，Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3分别独立地选自：H、C1-C6烷基、R4取代的C1-C6烷基；
R4选自：苯基、萘基、羟基取代的苯基、C1-C3烷氧基取代的苯基、羟基取代的萘基、吲哚基、咪唑基、羧基、羟基、氨基、巯基、甲硫基、氨基酰基、胍基、三苯甲硫基、三苯甲氨基羰基、叔丁氧羰基、叔丁氧羰基氨基、Pbf保护的胍基、三苯甲基咪唑基、叔丁氧羰基吲哚基。
在其中一些实施例中，Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3分别独立地选自：H、甲基、正丙基、异丙基、2-甲基丙基、正丁基、异丁基、苯基甲基、对苯酚基甲基、对乙氧基苯基甲基、对叔丁氧基苯基甲基、2-萘基甲基、3-吲哚甲基、N-叔丁氧羰基-3-吲哚基甲基、1-羟基乙基、1-叔丁氧基乙基、羟甲基、叔丁氧甲基、巯基甲基、三苯甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、氨基酰基甲基、三苯甲氨基羰基甲基、氨基酰基乙基、三苯甲氨基羰基乙基、羧基甲基、叔丁氧羰基甲基、羧基乙基、叔丁氧羰基乙基、4-氨基丁基、3-氨基丙基、4-叔丁氧羰基氨基丁基、3-叔丁氧羰基氨基丙基、3-胍基丙基、3-Pbf保护的胍基丙基、4-胍基丁基、4-Pbf保护的胍基丁基、咪唑基甲基、三苯甲基咪唑基甲基。
在其中一些实施例中，R0为H，R1为氢，R2为甲基，R3为氢。
在其中一些实施例中，Q选自：H、氨基保护基、C1-C6烷基酰基、生物素修饰基团、FAM荧光修饰基团、糖基修饰基团、碱基或其衍生物修饰基团。
在其中一些实施例中，Q选自：H、9-笏甲氧羰基、乙酰基。
在其中一些实施例中，所述R选自：Trt、Mmt、StBu或乙酰氨基甲基。
在其中一些实施例中，所述树脂为MBHA树脂、CTC树脂或Wang树脂。
在其中一些实施例中，若所述多肽树脂中氨基酸序列为10以下，则所述树脂的取代度为0.2-0.6mmol/g；若所述多肽树脂中氨基酸序列大于10，则所述树脂的取代度为0.1-0.5mmol/g。
在其中一些实施例中，所述脱去巯基保护基包括：用温和剪切液重复洗涤式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的的多肽树脂，直至溶液颜色由无色变为黄色再变为无色，以脱去巯基保护；所述温和剪切液为TFA、TIS和DCM的混合液。
在其中一些实施例中，所述温和剪切液为体积比为2-4:4-6:90-94的TFA、TIS和DCM的混合液。
在其中一些实施例中，所述硫源选自如下化合物：
在其中一些实施例中，所述硫源为如下化合物：
在其中一些实施例中，所述硫源的制备方法包括如下步骤：在无水条件下，邻苯二甲酰亚胺和一氯化硫在DMF中反应18-22小时，反应温度为室温，所述邻苯二甲酰亚胺和一氯化硫的摩尔比为1.5-2.5:1。
在其中一些实施例中，巯基与硫源进行关环反应包括：将硫源微溶于溶剂中，加入所述含有两个巯基的多肽树脂中，在氮气或惰性气体的保护下进行关环反应，重复反应三遍，每遍1-4小时；所述溶剂为NMP、DMF、DCM、乙腈和甲醇中的一种或多种。
在其中一些实施例中，巯基与硫源进行关环反应包括：将硫源微溶于溶剂中，加入所述含有两个巯基的多肽树脂中，在氮气或惰性气体的保护下进行关环反应，重复反应三遍，每遍1.5-2.5小时；所述溶剂为NMP、DMF和DCM中的一种或多种。
在其中一些实施例中，巯基与硫源进行关环反应的步骤中巯基与硫源进行关环反应的溶剂为体积比为1：98-99的DCM和DMF的混合液。
在其中一些实施例中，所述硫源与步骤A中所述的氨基酸的摩尔比为1:2-3。
在其中一些实施例中，巯基与硫源进行关环反应的步骤中所述溶剂的用量与所述硫源的配比为2-3mL：1mmol。
在其中一些实施例中，将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂包括如下步骤：
步骤1：将所述树脂加入固相反应柱中，用溶剂进行溶胀处理；
步骤2：在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸与步骤1处理后的树脂反应，得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin；
步骤3：在所述化合物Fmoc-AA-Resin中加入脱保护试剂，脱去9-笏甲氧羰基保护基，所得产物记为化合物AA-Resin；
步骤4：将另一N端用Fmoc保护的氨基酸用偶联剂在有机溶剂中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述化合物AA-Resin中，在氮气或者惰性气体的保护下反应，所得产物记为化合物Fmoc-AA2-AA1-Resin；
循环步骤3和步骤4的操作，按多肽的序列设计依次进行氨基酸的酰胺键偶联反应，最后再进行或者不进行N端修饰，得到式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂。
在其中一些实施例中，如果所述树脂为MBHA树脂，则步骤1包括：
将所述树脂加入固相反应柱中，用DCM进行溶胀处理，再加入吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液与树脂反应，重复反应2次，每次1.5-2.5小时，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂；所述吗啉的DMF或NMP溶液中吗啉与DMF或NMP的体积比为1:0.9-1.1；所述哌啶的DMF或NMP溶液中哌啶与DMF或NMP的体积比为1:9-11；
如果所述树脂为CTC树脂或Wang树脂，则步骤1包括：
将所述树脂加入固相反应柱中，用DCM进行溶胀处理。
在其中一些实施例中，如果所述树脂为MBHA树脂或Wang树脂，则步骤2包括：
在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸用缩合剂和DIEA在NMP中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述固相反应柱中与步骤1处理后的树脂反应，重复反应2遍，每遍1.5-2.5小时，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂；得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin；所述缩合剂为HATU或者HCTU；
如果所述树脂为CTC树脂，则则步骤2包括：
在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸和DIEA的DCM溶液加入到所述固相反应柱中与步骤1处理后的树脂反应，重复反应2遍，每遍1.5-2.5小时，两次反应间隙用DCM洗涤树脂；再用含有甲醇和DIEA的DCM溶液进行封尾处理，得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin。
在其中一些实施例中，步骤3包括：在所述化合物Fmoc-AA-Resin中加入吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液，在氮气的保护下反应1.5-2.5小时，重复反应两次，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂，所得产物记为化合物AA-Resin。
在其中一些实施例中，步骤3中所述吗啉的DMF或NMP溶液中吗啉与DMF或NMP的体积比为1:0.9-1.1；所述哌啶的DMF或NMP溶液中哌啶与DMF或NMP的体积比为1:9-11。
在其中一些实施例中，步骤3中所述吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液的添加量与步骤(A)中所述树脂的配比为5-15ml:1g。
在其中一些实施例中，步骤4包括：将另一N端用Fmoc保护的氨基酸用偶联剂在有机溶剂中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述化合物AA-Resin中，在氮气或者惰性气体的保护下反应1.5-2.5小时，重复反应两次，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂，所得产物记为化合物Fmoc-AA2-AA1-Resin。
在其中一些实施例中，步骤4中所述偶联剂为HATU和DIEA的组合，HCTU和DIEA的组合，HOBT和DIC的组合，PyBOP和HOBt的组合，或者TBTU和HOBT的组合；所述有机溶剂为NMP、DMF或者DCM。
在其中一些实施例中，步骤4中所述偶联剂为HATU和DIEA的组合，或者HCTU和DIEA的组合，氨基酸、HATU与DIEA的摩尔比为4:3.5-4:15-25，氨基酸、HCTU与DIEA的摩尔比为4:3.5-4:15-25；所述有机溶剂与DIEA的体积比为1-3:1。
在其中一些实施例中，步骤2和步骤4中氨基酸的物质的量与步骤(A)中树脂取代的物质的量之比为4.8-5.2：1。
在其中一些实施例中，当Q为乙酰基时，所述进行N端修饰包括N端乙酰化封尾反应，所述N端乙酰化封尾反应包括：在氮气或者惰性气体的保护下，加入乙酸酐进行N端乙酰化封尾反应，重复反应2-3遍，每遍15-25分钟，反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂，所述乙酸酐与树脂取代的物质的量之比为9-11：1。
在其中一些实施例中，将所述含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理的试剂为甲醇。
在其中一些实施例中，所述裂解液为TFA、TIS和H2O的混合溶液，TFA、EDT、PhOH和H2O的混合溶液，TFA、EDT、TIS、PhOH和H2O的混合溶液。
在其中一些实施例中，所述TFA、TIS和H2O的混合溶液中TFA、TIS和H2O的体积比为94-96：2-3:2-3；所述TFA、EDT、PHOH和H2O的混合溶液中TFA、EDT、PhOH和H2O的体积比为92-98:4-6:2-4:-13；所述TFA、EDT、TIS、PhOH和H2O的混合溶液中TFA、EDT、TIS、PhOH和H2O的体积比为76-84:4-6:4-6:4-6:4-6。
在其中一些实施例中，所述裂解液的添加量与步骤(A)中所述树脂的配比为3-6mL：1g。
在其中一些实施例中，所述经裂解液裂解的反应时间为1-3小时。
在其中一些实施例中，步骤D中所述将滤液纯化包括如下步骤：滤液用乙醚沉淀，收集沉淀，用乙腈水溶液溶解，再用RP-HPLC系统进行分离，收集目的峰馏分进行浓缩，冷冻干燥，即得所述含有三硫醚键的环肽化合物。
在其中一些实施例中，所述乙腈水溶液的体积分数为4-6％。
在其中一些实施例中，所述用RP-HPLC系统进行分离的条件包括：
色谱柱：反相C18柱；
流动相：A为含三氟乙酸的水溶液，B为乙腈，所述水溶液中三氟乙酸的浓度为0.08-0.12％；
流速：0.8-1ml/min；
淋洗梯度：5-98％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次创造性地在固相条件下将三硫醚键结构引入多肽骨架中，制备得到含有三硫醚键的环肽化合物。本发明的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法能够高收率地获得高纯度的含有三硫醚键的环肽化合物，并且该方法操作简单，合成周期短，成本低，适于含三硫醚桥环的环肽或母核结构中以三硫醚键为关键骨架的多肽衍生物的大规模生产。
附图说明
图1为代表性硫源化合物N,N’-Thiobisphthalintide的核磁谱图。
图2为代表性硫源化合物N,N’-Thiobisphthalintide的电镜形貌图。
图3为实施例1制备的含三硫醚键的环肽的核磁谱图。
图4为实施例1制备的含三硫醚键的环肽的HPLC谱图。
图5为实施例1制备的含三硫醚键的环肽的MS谱图。
图6为实施例4制备的含三硫醚键的环肽的HPLC谱图。
图7为实施例4制备的含三硫醚键的环肽的MS谱图。
图8为实施例5制备的含三硫醚键的环肽的HPLC谱图。
图9为实施例5制备的含三硫醚键的环肽的MS谱图。
图10为实施例6制备的含三硫醚键的环肽的HPLC谱图。
图11为实施例6制备的含三硫醚键的环肽的MS谱图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明提供了一种含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(A)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(A)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(B)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(B)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(C)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(C)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(D)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，L选自：H、或者如下结构所示的基团：
Rx、Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
各Rn分别独立地选自：H、Rn与Rx相连形成四氢吡咯环、Rn与Ry相连形成四氢吡咯环、或者Rn与Rz相连形成四氢吡咯环；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n1、n2和n3分别独立的选自：0、或者1以上的正整数。
进一步地，本发明提共的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(I)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(I)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(II)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(II)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(III)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(III)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(IV)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，Rx、Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
各Rn分别独立地选自：H、Rn与Rx相连形成四氢吡咯环、Rn与Ry相连形成四氢吡咯环、或者Rn与Rz相连形成四氢吡咯环；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n1、n2和n3分别独立的选自：0、或者1以上的正整数。例如，做为进一步优选的技术方案，n1选自：0、1或者2，n2选自：0、1-10之间的正整数，n3选自：0、1、2或者3。
进一步地，本发明提共的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(V)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(V)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(VI)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(VI)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(VII)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(VII)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(VIII)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n2选自：0、1-6之间的正整数。
更进一步地，本发明提共的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(IX)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(IX)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(X)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(X)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(XI)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(XI)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(XII)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，R0、R1、R2和R3是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团。
本发明用Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3表示氨基酸的侧链，所述侧链是指氨基酸中的碳原子上的取代基(例如2位碳上的取代基)，例如丙氨酸(Ala)和缬氨酸(val)的结构式分别如下：
则丙氨酸(Ala)的侧链是甲基，缬氨酸(val)的侧链是异丙基；常见氨基酸(偶联有保护基的氨基酸)的结构式见下表1所示，从表1可知各种氨基酸的侧链取代基，例如：甲基、正丙基、异丙基、2-甲基丙基、正丁基、异丁基、苯基甲基、对苯酚基甲基、3-吲哚甲基、1-羟基乙基、羟甲基、巯基甲基、2-甲硫基乙基、氨基酰基甲基、氨基酰基乙基、羧基甲基、羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、咪唑基甲基。如果，侧链上含有氨基、羧基、羟基、巯基等干扰合成的基团，为防止氨基、羧基、羟基、巯基等基团在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，则对这些基团进行保护，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用的保护基(例如：tBu,Boc,Allyl,Alloc,Pbf,Fmoc,Cbz等)来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基、羟基、巯基等基团，此时，用Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3表示氨基酸的侧链也包括用保护基保护的侧链。例如，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH是指在N端偶联有Fmoc保护基，在2位碳上的取代基甲巯基处偶联有Trt保护基的L-Cys，因此，其侧链是指-CH2S-Trt。
本发明所用术语“烷基”是指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C1-C6烷基”中“C1-C6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如，“C1-C6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。
术语“环烷基”是指具有特定碳原子数目的单环饱和脂肪烃基。例如“环烷基”包括环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。
术语“烷氧基”是指具有-O-烷基结构的基团，如-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-O-CH2CH(CH3)2、-OCH2CH2CH2CH3、-O-CH(CH3)2等。
术语“烷硫基”是指具有-S-烷基结构的基团，如-SCH3、-SCH2CH3、-SCH2CH2CH3、-S-CH2CH(CH3)2、-SCH2CH2CH2CH3、-S-CH(CH3)2等。
术语“杂芳基”是指含有1个或多个选自O、N或S的杂原子的芳香环，本发明范围内的杂芳基包括但不限于：喹啉基、吡唑基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三氮唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、哒嗪基；“杂芳基”也理解为包括任何含有氮的杂芳基的N-氧化物衍生物。杂环取代基的连接可通过碳原子或通过杂原子实现。
正如本领域技术人员所理解的，本文中所用“卤素”(“halo”)或“卤”意指氯、氟、溴和碘。
本发明所用术语“硫源”是指能够提供硫原子以取代巯基氢的化合物，在本发明中更具体地是指在硫化关环形成三硫醚的反应中提供硫原子的关键中间体，例如包括但不限于如下化合物：
半胱氨酸(Cys)是本发明的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法中的必要氨基酸，其侧链甲巯基的保护基可为Trt、Mmt、StBu或乙酰氨基甲基等，通过筛选，优先使用Trt作为优选保护基。
本发明所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法采用固相关环，以形成分子内三硫醚键，具体为：多肽树脂Cys巯基与硫源反应一步直接关环，采用室温固相反应条件，溶剂为NMP或DMF或DCM或乙腈或甲醇，按反应纯度和实际情况考虑，一般选择顺序为NMP>DMF>DCM和乙腈>甲醇。以DMF或者NMP为溶剂相比于DCM等溶剂，反应产物的纯度更高，收率更高，另外DCM在固相鼓氮气的条件下易挥发，相比于DMF和NMP不适合作为固相反应溶剂使用；NMP和DMF的性质及作用相似，但是DMF更廉价易得，因此最优选的溶剂为DMF。为减慢反应速率以减少副产物的生成，经过筛选，该反应以DMF为溶剂，滴加少量DCM助溶，体系中的部分固体会逐步溶解并缓慢反应成环，从而可以高收率地获得分子内三硫醚产物，DCM和DMF的最优配比为体积比为1：99。其中，滴加微量DCM是为了助溶，即使不加DCM，只有DMF也能较好的反应。
本发明所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法可以兼容多种树脂，主要的树脂选择为MBHA树脂、CTC树脂或Wang树脂，其区别在于多肽的C端差异，可根据实际情况选择。其中树脂取代度具体规格多由生产厂家自定，为本领域技术人员所公知。若所合成的多肽序列较短(10个氨基酸以下)，优选取代度为0.2-0.6mmol/g(更优选为0.4-0.6mmol/g，最优选为0.5mmol/g)的树脂，若多肽的序列较长(氨基酸序列大于10)优选取代度为0.1-0.5mmol/g(更优选为0.2-0.4mmol/g，最优选为0.3mmol/g)的树脂。
本发明所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法中，将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂具体包括如下步骤：
步骤1：将所述树脂加入固相反应柱中，用溶剂进行溶胀处理；
步骤2：在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸与步骤1处理后的树脂反应，得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin；
步骤3：在所述化合物Fmoc-AA-Resin中加入脱保护试剂，脱去9-笏甲氧羰基保护基，所得产物记为化合物AA-Resin；
步骤4：将另一N端用Fmoc保护的氨基酸用偶联剂在有机溶剂中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述化合物AA-Resin中，在氮气或者惰性气体的保护下反应，所得产物记为化合物Fmoc-AA2-AA1-Resin；
循环步骤3和步骤4的操作，按多肽的序列设计依次进行氨基酸的酰胺键偶联反应，最后再进行或者不进行N端修饰，得到式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂。
该方法是基于固相合成，因此步骤1中对树脂的活化处理尤为关键，具体为：将树脂和DCM加入固相反应柱进行溶胀处理，若采用MBHA树脂，则用吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液搅拌树脂，洗涤树脂后加入经缩合剂和DIEA活化的氨基酸的DMF或NMP溶液与树脂搅拌反应；若使用Wang树脂，则溶胀洗涤后加入经缩合剂与DIEA活化的氨基酸DMF或NMP溶液进行偶联反应；若使用CTC树脂，则DCM溶胀后氨基酸羧基端不活化，直接使用氨基酸在DIEA催化下在DCM中与树脂搅拌反应，之后用含甲醇与DIEA的DCM溶液封尾，氨基酸与树脂的偶联反应需要重复2遍。
本发明的合成方法是基于固相合成方法，因此去除保护基时宜采用温和条件，以确保多肽在树脂上不会因脱保护操作而破坏或影响到其他氨基酸的保护基。9-笏甲氧羰基保护基作为本发明所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法中的N端保护基，保证其有效脱除是本发明合成方法杂质控制的关键之一。脱去9-笏甲氧羰基保护基团的脱保护试剂选择吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液，若使用吗啉的DMF或NMP溶液，则体积比吗啉：DMF或NMP优选为1:1，若使用哌啶的DMF或NMP溶液，则体积比哌啶：DMF或NMP优选为1:10。Trt是本发明Cys巯基的优选保护基，Trt的脱除方式采取温和剪切液洗涤，该过程伴随明显的颜色变化，直至溶液颜色由无色变黄再变为无色，即反应结束。温和剪切液优选TFA：TIS：DCM的体积比为3:5:92的溶液。
在氨基酸进行酰胺键缩合的反应步骤中(步骤4)，优选的偶联剂为HATU/DIEA偶联体系，根据实际情况也可选择HCTU/DIEA偶联体系，或HOBT/DIC双体系偶联剂，或PyBOP/HOBt双体系偶联剂，或TBTU/HOBt双体系偶联剂。活化时的有机溶剂一般考虑选择NMP、DMF或者DCM，其优选顺序为NMP>DMF>DCM。
在本发明具体实施方式中，所用到的各种常用化学试剂和实验材料，均为市售产品，所有偶联有保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的偶联有保护基的氨基酸购自于吉尔生化有限公司和南京肽业有限公司，所用Rink Amide MBHA树脂购自南京肽业有限公司。其中，本发明具体合成过程中应用的一般性氨基酸的结构及反应添加优选当量比例见表1。
表1氨基酸结构、缩写及添加量
注：以上添加量的合成规模为0.25mmol，氨基酸物质的量通过(0.5mmol/g Resin×0.5g×*5eq.)计算得到。缩合试剂储备液的摩尔浓度为0.38mol/L。
0.0152mol×M(缩合试剂)溶于40ml DMF或NMP，得0.38mol/L的缩合试剂储备液。例：6.288g HCTU溶于40毫升DMF中，得0.38mol/L的HCTU/DMF储备液。
本发明涉及的英文及缩写的中文含义如下：
以下实施例中，没有具体注明反应温度的反应均指在室温下反应，室温的温度范围可以是10-35℃；所述“用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍”的溶剂用量为5-20ml，更具体地为每遍15ml DCM或者15mlDMF。
实施例1
本实施例以固相合成方法制备的含三硫醚键的环肽的序列为Ac-Cys(1)–Gly–Ala–Gly-Cys(1)-Gly-NH2，其结构式如下：
具体制备方法如下：
(1)称取取代度为0.5mmol/g的RinkAmide MBHA树脂2g(合成规模1mmol)，加入到固相反应柱中，用DCM溶胀两遍，每遍15ml DCM，30分钟。
(2)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(3)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。在此过程中，按照树脂取代(官能团)与化合物物质的量比例为1：5:4.8分别称取Fmoc-Gly-OH(无特别标注情况下，其α碳手性均指L型氨基酸，下同)1.485g(5mmol)和HATU 1.83g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Gly氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(4)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(5)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH2.93g(5mmol)和HATU 1.83g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Cys氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(6)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(7)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Gly-OH 1.485g(5mmol)和HATU 1.83g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Gly氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(8)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(9)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Ala-OH 1.655g(5mmol)和HATU 1.83g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Ala氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(10)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(11)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Gly-OH 1.485g(5mmol)和HATU 1.83g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Gly氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(12)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(13)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH2.93g(5mmol)和HATU 1.83g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Cys氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(14)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(15)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。然后在氮气保护下，加入10当量(10mmol)的乙酸酐进行N端乙酰化封尾反应。该反应重复反应三遍，每遍20分钟，反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(16)加入甲醇进行树脂收缩，然后用氮气流吹干树脂，得多肽树脂2.2g，暂存备用。
(17)制备硫源硫代邻苯二甲酰亚胺：
主要试剂为邻苯二甲酰亚胺和一氯化硫。将邻苯二甲酰亚胺(7.36g，0.05摩尔)溶解于无水DMF(40ml，干燥)中，并在室温下(无水条件下)将一氯化硫(S2Cl2，3.4g，0.025摩尔)分若干份滴加至溶液中。20分钟后出现沉淀。黄色混合物在室温下搅拌20小时，然后通过过滤收集无色结晶固体，洗涤过滤后即为产物粗品。通过TLC点板结合核磁和LC-MS进行监测，若硫代邻苯二甲酰亚胺纯度达95％以上则可直接使用，若纯度在80％以下则需要进一步用柱色谱或重结晶进行纯化；制备量较少时，可以选择DCM，MeOH为洗脱剂过柱子；制备量较多时可以直接在DMF中过滤，后处理用DMF洗涤滤饼，得微黄色固体。对本实施例所得产物粗品进行以下后处理：将所得产物粗品用DCM或氯仿溶解，加入部分硅胶旋蒸，使样品负载在硅胶上，然后湿法装硅胶柱，干法上样，用DCM和MeOH为流动相以体积比20:1，10:1，5:1梯度淋洗洗脱样品，收集洗脱溶液，旋蒸。用薄层色谱结合LC-MS初步监测产物，用核磁共振氢谱进一步监测产物。然后对于纯化后的产物，进一步油泵抽2小时，抽干成粉末，得到硫源硫代邻苯二甲酰亚胺12.9g，收率为85％，纯度为96％。其核磁谱图如图1所示，并且具有图2所示的形貌，将产物粗品后处理至具有图2所示的形貌时，具备较好的反应活性。
(18)将步骤(16)得到的多肽树脂，在固相反应柱中用15ml DCM溶胀30分钟后，用TFA：TIS：DCM的体积比为3:5:92的温和剪切液重复洗涤多肽树脂(每次洗涤剪切液的用量为10ml)以去除Cys巯基的Trt保护基，该过程伴随明显颜色变化，直至溶液颜色由无色变黄再变为无色，即认为保护基已去除完毕。之后用DCM和DMF交替洗涤10遍。
(19)将步骤(17)合成的硫源硫代邻苯二甲酰亚胺0.65g(2mmol)微溶于体积比为1：99的DCM和DMF的混合溶剂(5mL)中，加入固相反应柱中，在氮气保护下与多肽进行环化反应，重复反应三遍，每遍两小时。为减慢反应速率，经过筛选该反应以DMF为溶剂，滴加少量DCM助溶，体系中的部分固体会逐步溶解并缓慢反应成环。反应结束后用LC-MS监测。
(20)用甲醇收缩树脂，随后用氮气吹干树脂，称重，得到环化后的多肽树脂2.3g。
(21)将TFA：TIS：H2O为95：2.5:2.5(体积比)的混合裂解液10mL加入固相反应柱将中，与上述环化后的多肽树脂反应2小时，过滤除去树脂。滤液适当抽走后用乙醚沉淀，离心收集沉淀，即为含三硫醚键的环肽粗品，转化率为87％。
(22)将上述含三硫醚键的环肽粗品用5％浓度(体积分数)的乙腈水溶液溶解，用0.2微米规格的滤膜过滤后采用RP-HPLC系统进行分离纯化，分离纯化的条件如下：色谱柱为反相C18柱，以水(含0.1％的三氟乙酸)为A泵流动相(需提前超声)，以乙腈为B泵流动相，按体积比5％-98％梯度淋洗，流速为0.9ml/min。收集目的馏分(用LC-MS进行进一步监测以确保准确无误)，冷冻干燥(将收集的目的馏分置于-78～-80度的冰箱中冷冻1小时，结晶成固体后置于冻干机冷冻干燥)，得纯度为98.5％的精肽0.186g，总收率为35％。相关谱图如图3-图5所示。
实施例2
本实施例以固相合成方法制备的含三硫醚键的环肽的序列为Ac-Cys(1)–Gly–Ala–Gly-Cys(1)-Gly-NH2，其结构式如下：
其制备方法如下：
步骤(1)-步骤(18)同实施例1。
(19)将步骤(17)合成的硫源硫代邻苯二甲酰亚胺分别微溶或者溶于表2所示的溶剂(5mL)中，加入固相反应柱中，在氮气保护下与多肽进行环化反应，复反应三遍，每遍反应2小时。反应结束后用LC-MS监测。
(20)用甲醇收缩树脂，随后用氮气吹干树脂，称重，得到环化后的多肽树脂。
(21)将TFA：TIS：H2O为95：2.5:2.5(体积比)的混合裂解液10mL加入固相反应柱将中，与上述环化后的多肽树脂反应2小时，过滤除去树脂。滤液适当抽走后用乙醚沉淀，离心收集沉淀，即为含三硫醚键的环肽粗品。
将所得含三硫醚键的环肽粗品通过RP-HPLC进行检测，条件如下：色谱柱为反相C18柱，以水(含0.1％的三氟乙酸)为A泵流动相(需提前超声)，以乙腈为B泵流动相，按体积比5％-98％梯度淋洗，流速为0.9ml/min。通过峰面积计算含三硫醚键的环肽的产量，并且计算转化率。
结果如表2所示：以DMF(或者在DMF中加少量DCM)为溶剂能够获得更高的反应转化率(收率)。
表2不同反应溶剂下的环化反应的转化率
| 溶剂 | 转化率％ | |
| 1 | 甲苯 | 35 |
| 2 | 乙酸乙酯 | 43 |
| 3 | DCM | 81 |
| 4 | DMF | 87 |
| 5 | DMF/DCM(99％) | 87 |
| 6 | 甲醇 | 62 |
| 7 | 异丙醇 | 55 |
| 8 | 乙腈/水(98％) | 61 |
| 9 | 乙腈/水(80％) | 64 |
| 10 | 乙腈/水(10％) | 23 |
实施例3
本实施例以固相合成方法制备的含三硫醚键的环肽的序列为Ac-Cys(1)–Gly–Ala–Gly-Cys(1)-Gly-NH2，其结构式如下：
其制备方法如下：
步骤(1)-步骤(18)同实施例1。
(19)将步骤(17)合成的硫源硫代邻苯二甲酰亚胺微溶于DMF(5mL)中，加入固相反应柱中，在氮气保护下与多肽进行环化反应，重复反应三遍，每遍反应时间如表3所示。反应结束后用LC-MS监测。
(20)用甲醇收缩树脂，随后用氮气吹干树脂，称重，得到环化后的多肽树脂。
(21)将TFA：TIS：H2O为95：2.5:2.5(体积比)的混合裂解液10mL加入固相反应柱将中，与上述环化后的多肽树脂反应2小时，过滤除去树脂。滤液适当抽走后用乙醚沉淀，离心收集沉淀，即为含三硫醚键的环肽粗品。
将所得含三硫醚键的环肽粗品通过RP-HPLC进行检测，条件如下：色谱柱为反相C18柱，以水(含0.1％的三氟乙酸)为A泵流动相(需提前超声)，以乙腈为B泵流动相，按体积比5％-98％梯度淋洗，流速为0.9ml/min。通过峰面积计算含三硫醚键的环肽的产量，并且计算转化率。
结果如表3所示：反应时间在1-4小时之间都能获得较好的反应收率，随后再延长反应时间，副产物增多，产物收率降低，更优选的反应时间为1-2.5小时，更优选为1.5-2小时。
表3不同反应时间下的环化反应的转化率
| 反应时间(h) | 转化率％ | |
| 1 | 1.5 | 88 |
| 2 | 2 | 87 |
| 3 | 3.5 | 79 |
| 4 | 24 | 38 |
实施例4
本实施例以固相合成方法制备的含三硫醚键的环肽的序列为H-Cys(1)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(1)-Pro-Leu-Gly-NH2，其结构式如下：
具体制备方法如下：
(1)称取取代度为0.5mmol/g的RinkAmide MBHA树脂2g(合成规模1mmol)，加入到固相反应柱中，用DCM溶胀两遍，每遍15ml DCM，30分钟。
(2)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(3)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。在此过程中，按照树脂取代(官能团)与化合物物质的量比例为1：5:4.8分别称取Fmoc-Gly-OH(无特别标注情况下，其α碳手性均指L型氨基酸，下同)1.485g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Gly氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(4)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(5)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Leu-OH 1.765g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Leu氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(6)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(7)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Pro-OH 1.685g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Pro氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(8)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(9)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH2.93g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Cys氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(10)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(11)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH2.985g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Asn氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(12)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(13)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Gln(Trt)-OH3.055g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Gln氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(14)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(15)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Ile-OH 1.765g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Ile氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(16)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(17)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH2.3g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Tyr氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(18)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(19)上述步骤完成后，用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH2.93g(5mmol)和HATU 1.85g(4.8mmol)，用8ml NMP溶解混合后加入DIEA4ml(23mmol)活化。然后将活化的Cys氨基酸混合溶液加入到固相反应柱中，在氮气保护下反应2小时。该反应重复反应两遍，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(20)加入甲醇进行树脂收缩，然后用氮气流吹干树脂，得多肽树脂2.21g，暂存备用。
(21)制备硫源硫代邻苯二甲酰亚胺：
主要试剂为邻苯二甲酰亚胺和一氯化硫。将邻苯二甲酰亚胺(7.36g，0.05摩尔)溶解于无水DMF(40ml，干燥)中，并在室温下(无水条件下)将一氯化硫(S2Cl2，3.4g，0.025摩尔)分若干份滴加至溶液中。20分钟后出现沉淀。黄色混合物在室温下搅拌20小时，然后通过过滤收集无色结晶固体，洗涤过滤后即为产物粗品。通过TLC点板结合核磁和LC-MS进行监测，若硫代邻苯二甲酰亚胺纯度达95％以上则可直接使用，若纯度在80％以下则需要进一步用柱色谱或重结晶进行纯化；制备量较少时，可以选择DCM，MeOH为洗脱剂过柱子；制备量较多时可以直接在DMF中过滤，后处理用DMF洗涤滤饼，得微黄色固体。对本实施例所得产物粗品进行以下后处理：将所得产物粗品用DCM或氯仿溶解，加入部分硅胶旋蒸，使样品负载在硅胶上，然后湿法装硅胶柱，干法上样，用DCM和MeOH为流动相以体积比20:1，10:1，5:1梯度淋洗洗脱样品，收集洗脱溶液，旋蒸。用薄层色谱结合LC-MS初步监测产物，用核磁共振氢谱进一步监测产物。然后对于纯化后的产物，进一步油泵抽2小时，抽干成粉末，得到硫源硫代邻苯二甲酰亚胺12.9g，收率为85％，纯度为96％。其核磁谱图如图1所示，并且具有图2所示的形貌，将产物粗品后处理至具有图2所示的形貌时，具备较好的反应活性。
(22)将步骤(20)得到的多肽树脂，在固相反应柱中用DCM溶胀30分钟后，用TFA：TIS：DCM的体积比为3:5:92的温和剪切液重复洗涤多肽树脂(每次洗涤剪切液的用量为10ml)以去除Cys巯基的Trt保护基，该过程伴随明显颜色变化，直至溶液颜色由无色变黄再变为无色，即认为保护基已去除完毕。之后用DCM和DMF交替洗涤10遍。
(23)将步骤(21)合成的硫源硫代邻苯二甲酰亚胺微溶于体积比为1：99的DCM和DMF的混合溶剂(5mL)中，加入固相反应柱中，在氮气保护下与多肽进行环化反应，重复反应三遍，每遍两小时。为减慢反应速率，经过筛选该反应以DMF为溶剂，滴加少量DCM助溶，体系中的部分固体会逐步溶解并缓慢反应成环。反应结束后用LC-MS监测。
(24)用DMF和DCM交替洗涤树脂10遍后，加入体积分数为50％的吗啉/NMP溶液20ml，在氮气的保护下反应2小时以脱去9-笏甲氧羰基保护基，重复反应两遍，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂10遍。
(25)用甲醇收缩树脂，随后用氮气吹干树脂，称重，得到环化后的多肽树脂2.19g。
(26)将TFA：TIS：H2O为95：2.5:2.5(体积比)的混合裂解液10mL加入固相反应柱将中，与上述环化后的多肽树脂反应2小时，过滤除去树脂。滤液适当抽走后用乙醚沉淀，离心收集沉淀，即为含三硫醚键的环肽粗品，转化率为43％。
(27)将上述含三硫醚键的环肽粗品用5％浓度(体积分数)的乙腈水溶液溶解，用0.2微米规格的滤膜过滤后采用RP-HPLC系统进行分郭纯化，分离纯化的条件如下：色谱柱为反相C18柱，以水(含0.1％的三氟乙酸)为A泵流动相(需提前超声)，以乙腈为B泵流动相，按体积比5％-98％梯度淋洗，流速为0.9ml/min。收集目的馏分(用LC-MS进行进一步监测以确保准确无误)，冷冻干燥(将收集的目的馏分置于-78～-80度的冰箱中冷冻1小时，结晶成固体后置于冻干机冷冻干燥)，得纯度为97.8％的精肽0.16g，总收率为16％。相关谱图如图6-图7所示。
实施例5
本实施例以固相合成方法制备的含三硫醚键的环肽的序列为Mpa(1)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(1)，其结构式如下：
具体制备方法参照实施例1，其转化率为49％。最后得纯度为96％的精肽0.11g，总收率为13％。相关谱图如图8-图9所示。
实施例6
本实施例以固相合成方法制备的含三硫醚键的环肽的序列为Mpa(1)-(D)Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(1)-Pro-Orn-Gly，其结构式如下：
具体制备方法参照实施例1，其转化率为45％，最后得纯度为98.2％的精肽0.19g，总收率为18％，相关谱图如图10-图11所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (43)
1.一种含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(A)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(A)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(B)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(B)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(C)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(C)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(D)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，L选自：H、或者如下结构所示的基团：
Rx、Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
各Rn分别独立地选自：H、Rn与Rx相连形成四氢吡咯环、Rn与Ry相连形成四氢吡咯环、或者Rn与Rz相连形成四氢吡咯环；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n1、n2和n3分别独立的选自：0、或者1以上的正整数；
其中巯基与硫源关环反应在氮气或惰性气体的保护下在DMF、DCM或其混合物中重复进行三遍，每遍1至4小时。
2.根据权利要求1所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(I)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(I)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(II)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(II)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(III)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(III)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(IV)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
3.根据权利要求1所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，n1选自：0、1或者2，n2选自：0、1-10之间的正整数，n3选自：0、1、2、3或者4。
4.根据权利要求3所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(V)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(V)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(VI)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(VI)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(VII)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(VII)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(VIII)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，Ry和Rz是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团；
n2选自：0、1-6之间的正整数。
5.根据权利要求4所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其包括如下步骤：
步骤A：将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(IX)所示的多肽树脂；
步骤B：脱去式(IX)所示的多肽树脂中的巯基保护基，得到式(X)所示的含有两个巯基的多肽树脂；
步骤C：式(X)所示的含有两个巯基的多肽树脂中的巯基与硫源进行关环反应，得到式(XI)所示的含有三硫醚键的环肽树脂；
步骤D：将式(XI)所示的含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，过滤除去树脂，将滤液纯化后即得式(XII)所示的含有三硫醚键的环肽化合物；
其中，R0、R1、R2和R3是指氨基酸的侧链、带有保护基团的氨基酸的侧链或者氢；
R为巯基保护基；
M为氨基或者羟基；
Q选自：H、氨基保护基、烷基酰基、多肽分子中可接受的修饰基团。
6.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3分别独立地选自：H、C1-C10烷基、R4取代的C1-C10烷基；
R4选自：C6-C10芳基、R5取代的C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、R5取代的C5-C10杂芳基、C3-C6环烷基、羧基、羟基、氨基、C1-C6烷基酰基、卤素、巯基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、氨基酰基、胍基、三苯甲硫基、三苯甲氨基羰基、叔丁氧羰基、叔丁氧羰基氨基、Pbf保护的胍基；
R5选自：C1-C6烷基、C3-C6环烷基、羧基、羟基、氨基、C1-C6烷基酰基、卤素、巯基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、叔丁氧羰基、三苯甲基。
7.根据权利要求6所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3分别独立地选自：H、C1-C6烷基、R4取代的C1-C6烷基；
R4选自：苯基、萘基、羟基取代的苯基、C1-C3烷氧基取代的苯基、羟基取代的萘基、吲哚基、咪唑基、羧基、羟基、氨基、巯基、甲硫基、氨基酰基、胍基、三苯甲硫基、三苯甲氨基羰基、叔丁氧羰基、叔丁氧羰基氨基、Pbf保护的胍基、三苯甲基咪唑基、叔丁氧羰基吲哚基。
8.根据权利要求7所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，Rx、Ry、Rz、R0、R1、R2和R3分别独立地选自：H、甲基、正丙基、异丙基、2-甲基丙基、正丁基、异丁基、苯基甲基、对苯酚基甲基、对乙氧基苯基甲基、对叔丁氧基苯基甲基、2-萘基甲基、3-吲哚甲基、N-叔丁氧羰基-3-吲哚基甲基、1-羟基乙基、1-叔丁氧基乙基、羟甲基、叔丁氧甲基、巯基甲基、三苯甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、氨基酰基甲基、三苯甲氨基羰基甲基、氨基酰基乙基、三苯甲氨基羰基乙基、羧基甲基、叔丁氧羰基甲基、羧基乙基、叔丁氧羰基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基、4-叔丁氧羰基氨基丁基、3-叔丁氧羰基氨基丙基、3-胍基丙基、3-Pbf保护的胍基丙基、4-胍基丁基、4-Pbf保护的胍基丁基、咪唑基甲基、三苯甲基咪唑基甲基。
9.根据权利要求8所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，R0为H，R1为氢，R2为甲基，R3为氢。
10.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，Q选自：H、氨基保护基、C1-C6烷基酰基、生物素修饰基团、FAM荧光修饰基团、糖基修饰基团、碱基或其衍生物修饰基团。
11.根据权利要求10所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，Q选自：H、9-笏甲氧羰基、乙酰基。
12.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述R选自：Trt、Mmt、StBu或乙酰氨基甲基。
13.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述树脂为MBHA树脂、CTC树脂或Wang树脂。
14.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，若所述多肽树脂中氨基酸序列为10以下，则所述树脂的取代度为0.2-0.6mmol/g；若所述多肽树脂中氨基酸序列大于10，则所述树脂的取代度为0.1-0.5mmol/g。
15.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，脱去巯基保护基包括：用温和剪切液重复洗涤式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂，直至溶液颜色由无色变为黄色再变为无色，以脱去巯基保护；所述温和剪切液为TFA、TIS和DCM的混合液。
16.根据权利要求15所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述温和剪切液为体积比为2-4:4-6:90-94的TFA、TIS和DCM的混合液。
17.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述硫源选自如下化合物：
18.根据权利要求17所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述硫源为如下化合物：
19.根据权利要求18所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述硫源的制备方法包括如下步骤：在无水条件下，邻苯二甲酰亚胺和一氯化硫在DMF中反应18-22小时，反应温度为室温，所述邻苯二甲酰亚胺和一氯化硫的摩尔比为1.5-2.5:1。
20.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，巯基与硫源进行关环反应包括：将硫源微溶于溶剂中，加入所述含有两个巯基的多肽树脂中，在氮气或惰性气体的保护下进行关环反应，重复反应三遍。
21.根据权利要求20所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，巯基与硫源进行关环反应包括：将硫源微溶于溶剂中，加入所述含有两个巯基的多肽树脂中，在氮气或惰性气体的保护下进行关环反应，重复反应三遍，每遍1.5-2.5小时。
22.根据权利要求21所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，巯基与硫源进行关环反应的步骤中所述溶剂为体积比为1：98-99的DCM和DMF的混合液。
23.根据权利要求20所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述硫源与步骤A中所述的氨基酸的摩尔比为1:2-3。
24.根据权利要求20所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，巯基与硫源进行关环反应的步骤中所述溶剂的用量与所述硫源的配比为2-3mL：1mmol。
25.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，将氨基酸和树脂以固相合成方法制备得到式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂包括如下步骤：
步骤1：将所述树脂加入固相反应柱中，用溶剂进行溶胀处理；
步骤2：在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸与步骤1处理后的树脂反应，得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin；
步骤3：在所述化合物Fmoc-AA-Resin中加入脱保护试剂，脱去9-笏甲氧羰基保护基，所得产物记为化合物AA-Resin；
步骤4：将另一N端用Fmoc保护的氨基酸用偶联剂在有机溶剂中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述化合物AA-Resin中，在氮气或者惰性气体的保护下反应，所得产物记为化合物Fmoc-AA2-AA1-Resin；
循环步骤3和步骤4的操作，按多肽的序列设计依次进行氨基酸的酰胺键偶联反应，最后再进行或者不进行N端修饰，得到式(A)、式(I)、式(V)或者式(IX)所示的多肽树脂。
26.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，如果所述树脂为MBHA树脂，则步骤1包括：
将所述树脂加入固相反应柱中，用DCM进行溶胀处理，再加入吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液与树脂反应，重复反应2次，每次1.5-2.5小时，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂；所述吗啉的DMF或NMP溶液中吗啉与DMF或NMP的体积比为1:0.9-1.1；所述哌啶的DMF或NMP溶液中哌啶与DMF或NMP的体积比为1:9-11；
如果所述树脂为CTC树脂或Wang树脂，则步骤1包括：
将所述树脂加入固相反应柱中，用DCM进行溶胀处理。
27.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，如果所述树脂为MBHA树脂或Wang树脂，则步骤2包括：
在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸用缩合剂和DIEA在NMP中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述固相反应柱中与步骤1处理后的树脂反应，重复反应2遍，每遍1.5-2.5小时，两次反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂；得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin；所述缩合剂为HATU或者HCTU；
如果所述树脂为CTC树脂，则步骤2包括：
在氮气或者惰性气体的保护下，将N端用Fmoc保护的氨基酸和DIEA的DCM溶液加入到所述固相反应柱中与步骤1处理后的树脂反应，重复反应2遍，每遍1.5-2.5小时，两次反应间隙用DCM洗涤树脂；再用含有甲醇和DIEA的DCM溶液进行封尾处理，得到树脂上连接有一个氨基酸的化合物，记为化合物Fmoc-AA-Resin。
28.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤3包括：在所述化合物Fmoc-AA-Resin中加入吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液，在氮气的保护下反应1.5-2.5小时，重复反应两次，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂，所得产物记为化合物AA-Resin。
29.根据权利要求28所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤3中所述吗啉的DMF或NMP溶液中吗啉与DMF或NMP的体积比为1:0.9-1.1；所述哌啶的DMF或NMP溶液中哌啶与DMF或NMP的体积比为1:9-11。
30.根据权利要求28所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤3中所述吗啉或哌啶的DMF或NMP溶液的添加量与步骤(A)中所述树脂的配比为5-15ml:1g。
31.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤4包括：将另一N端用Fmoc保护的氨基酸用偶联剂在有机溶剂中进行活化，然后将所得活化后的氨基酸混合溶液加入到所述化合物AA-Resin中，在氮气或者惰性气体的保护下反应1.5-2.5小时，重复反应两次，两次反应的间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂，所得产物记为化合物Fmoc-AA2-AA1-Resin。
32.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤4中所述偶联剂为HATU和DIEA的组合，HCTU和DIEA的组合，HOBT和DIC的组合，PyBOP和HOBt的组合，或者TBTU和HOBT的组合；所述有机溶剂为NMP、DMF或者DCM。
33.根据权利要求32所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤4中所述偶联剂为HATU和DIEA的组合，或者HCTU和DIEA的组合，氨基酸、HATU与DIEA的摩尔比为4:3.5-4:15-25，氨基酸、HCTU与DIEA的摩尔比为4:3.5-4:15-25；所述有机溶剂与DIEA的体积比为1-3:1。
34.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤2和步骤4中氨基酸的物质的量与步骤(A)中树脂取代的物质的量之比为4.8-5.2：1。
35.根据权利要求25所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，当Q为乙酰基时，所述进行N端修饰包括N端乙酰化封尾反应，所述N端乙酰化封尾反应包括：在氮气或者惰性气体的保护下，加入乙酸酐进行N端乙酰化封尾反应，重复反应2-3遍，每遍15-25分钟，反应间隙用DCM和DMF交替洗涤树脂，所述乙酸酐与树脂取代的物质的量之比为9-11：1。
36.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，将所述含有三硫醚键的环肽树脂进行收缩处理的试剂为甲醇。
37.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述裂解液为TFA、TIS和H2O的混合溶液，TFA、EDT、PhOH和H2O的混合溶液，TFA、EDT、TIS、PhOH和H2O的混合溶液。
38.根据权利要求37所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述TFA、TIS和H2O的混合溶液中TFA、TIS和H2O的体积比为94-96：2-3:2-3；所述TFA、EDT、PHOH和H2O的混合溶液中TFA、EDT、PhOH和H2O的体积比为92-98:4-6:2-4:-13；所述TFA、EDT、TIS、PhOH和H2O的混合溶液中TFA、EDT、TIS、PhOH和H2O的体积比为76-84:4-6:4-6:4-6:4-6。
39.根据权利要求37所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述裂解液的添加量与步骤(A)中所述树脂的配比为3-6mL：1g。
40.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述经裂解液裂解的反应时间为1-3小时。
41.根据权利要求1-5任一项所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，步骤D中所述将滤液纯化包括如下步骤：滤液用乙醚沉淀，收集沉淀，用乙腈水溶液溶解，再用RP-HPLC系统进行分离，收集目的峰馏分进行浓缩，冷冻干燥，即得所述含有三硫醚键的环肽化合物。
42.根据权利要求41所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述乙腈水溶液的体积分数为4-6％。
43.根据权利要求41所述的含有三硫醚键的环肽化合物的固相合成方法，其中，所述用RP-HPLC系统进行分离的条件包括：
色谱柱：反相C18柱；
流动相：A为含三氟乙酸的水溶液，B为乙腈，所述水溶液中三氟乙酸的浓度为0.08-0.12％；
流速：0.8-1ml/min；
淋洗梯度：5％-98％。
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