CN114259566B

CN114259566B - 一种基于破坏氧化还原平衡的抗肿瘤组合物及应用

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Publication number: CN114259566B
Application number: CN202110995740.3A
Authority: CN
Inventors: 连晓媛; 张治针; 石沐冉; 华琛琛; 王延伟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2041-08-27
Also published as: CN114259566A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的组合物，包括：组合物A或/和组合物B；组合物A是NADPH再生抑制剂，包括G6PD抑制剂、ME1抑制剂和ALDH1A1抑制剂中的两种或三种；组合物B是GSH合成再生抑制剂，包括CBS抑制剂、xTC抑制剂和GR抑制剂中的两种或三种；且，组合物中任意两组分的质量比为1:0.01～1:100；组合物A和组合物B可作为有效成分独立制成药物制剂也可二者联合制成AB复方制剂；且，任意两组合物还可与具有促进线粒体氧化磷酸化和抑制NADPH和GSH从头合成的FBP联合制成复合制剂。

Description

一种基于破坏氧化还原平衡的抗肿瘤组合物及应用

技术领域

本发明涉及制药技术领域，更具体地说是涉及一种基于破坏氧化还原平衡的抗肿瘤组合物及其应用。

背景技术

与正常细胞相比，肿瘤细胞具有多种恶性生物学特征，其中代谢重编程为其核心特征；代谢重编程不仅直接支持肿瘤细胞增殖、存活和肿瘤生长，而且对维持其它恶性特征至关重要。肿瘤细胞代谢重编程也是导致耐药的重要原因。与正常细胞相比，肿瘤细胞处于慢性代谢性氧化应激状态，因此肿瘤细胞需要通过重编程相关代谢通路以提高抗氧化能力来实现适应性存活和生长。晚期肿瘤的癌细胞经常表现出多种基因改变和高氧化应激，这表明可以通过药物产生活性氧损伤来优先清除这些细胞。然而，肿瘤细胞内抗氧化应激能力的上调可导致耐药。

还原型谷胱甘肽(GSH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是细胞内最重要的抗氧化损伤物质。GSH能保持胞内足够的半胱氨酸水平，并能解毒外源性物质包括多种化疗药，同时还能增强癌细胞的化疗抵抗力，高水平的GSH还可促进肿瘤进展包括肿瘤转移。NADPH可将GSSG和TRX-TRX还原为具有清除ROS能力的GSH和TRX，而且，最新研究证明，NADPH作为抗氧化应激损伤物质可独立于GSH和TRX发挥抗铁死亡的作用，从而诱导放疗对抗。除NADPH为肿瘤细胞快速增殖产生的活性氧(ROS)清除提供还原当量外，NADPH还是合成代谢反应(如脂质和核酸生物合成)的必要辅助因子。可见，耗竭肿瘤细胞内的GSH和NADPH不仅可以抑制肿瘤生长而且可以诱导氧化应激损伤，对治疗肿瘤具有重要意义。

目前，已有研究发现FBP的抗肿瘤作用并公布了FBP在制备抗肿瘤药物中的应用。随着研究的深入，发现在胶质瘤细胞中FBP可阻碍葡萄糖和谷氨酰胺流向GSH前体氨基酸和大分子生物合成，同时可促进线粒体氧化磷酸化而增加ROS产生，最终导致胞内NADPH 和GSH的耗竭和氧化应激损伤。但是，对于肺癌等其它癌细胞，仅有少数细胞株重现了胶质瘤细胞对FBP的药效敏感性；而且，FBP不能有效降低胞内NADPH和GSH水平是导致其它癌细胞相对不敏感的主要原因。

因此，如何提供一种能有效降低肿瘤细胞内NADPH水平或/和GSH水平的组合物，并将其应用于抗肿瘤的药物中是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于破坏氧化还原平衡的抗肿瘤组合物，该组合物可以抑制癌细胞的的增殖，各组分间具有协同作用，提高了组合物的细胞毒性。

一种基于破坏氧化还原平衡的抗肿瘤组合物，包括：NADPH再生抑制剂或/和GSH抑制剂；两种抑制剂分别独立成药或组合成药；其中，所述NADPH再生抑制剂包括G6P D抑制剂、ME1抑制剂和ALDH1A1抑制剂中的两种或三种；所述GSH抑制剂包括CBS 抑制剂、xCT抑制剂和GR抑制剂中的任意两种或三种；且该组合物中任意两组分间的质量比均为1:0.01～1:100。

以上技术方案达到的技术效果是：NADPH作为抗氧化应激损伤物质，可以为肿瘤细胞快速增殖产生的活性氧(ROS)清除提供还原当量，促进肿瘤细胞增殖，所以，NADPH 抑制剂可以有效抑制肿瘤细胞增殖；PPP产生的NADPH对于防止由线粒体呼吸和电离辐射引起的ROS损伤至关重要。癌细胞通过PPP和丝氨酸合成通路来从头合成和再生 NADPH和GSH，从而缓解ROS过量引起的氧化损伤、逃避凋亡，因此耗竭NADPH和 GSH可增强结肠癌、卵巢癌和肺癌细胞对ROS介导的凋亡的敏感性。PPP产生的NADPH 对于防止由线粒体呼吸和电离辐射引起的ROS损伤至关重要。6-磷酸葡萄糖脱氢酶 (Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是PPP的限速酶，是催化6-磷酸葡萄糖部分氧化获得NADPH和核糖-5-磷酸的第一步。G6PD在多种肿瘤细胞中高表达，敲除结肠癌细胞的G6PD可以增加对奥沙利铂治疗的敏感性；NADP⁺依赖性苹果酸酶家族(MEs)是NADPH的另一个重要来源，该酶催化苹果酸的氧化脱羧反应，生成二氧化碳和丙酮酸，在此过程中将NADP⁺还原为NADPH。线粒体中的苹果酸酶(ME2)再生NADPH被认为是有潜力的抗癌靶标。线粒体中的柠檬酸被转运到胞浆，在此柠檬酸可为ME1或异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)提供反应底物，均可再生NADPH。ME1促进胃癌细胞生长、肺转移和腹膜扩散，干扰ME1可以减缓肿瘤生长并抑制上皮-间质转化。敲除胃癌细胞中的ME1 会大大降低NADPH合成，导致ROS积累，在氧化应激条件下促进肿瘤细胞的凋亡；醛脱氢酶1家族成员A(Aldehyde Dehydrogenase 1-A,ALDH1A)催化视黄醇代谢物视黄醛氧化为视黄酸，同时将NADP⁺还原为NADPH。与正常结肠细胞相比，溃疡性结肠炎(结肠癌的危险因素)患者的ALDH1A1蛋白水平升高，在结肠炎转化为结肠癌的过程中发挥重要作用。在多种肿瘤中，ALDH1A1高表达与化疗和EGFR抑制剂厄洛替尼等多种治疗的天生和获得性耐药密切相关但是不同的癌细胞可能对G6PD、ME1和ALDH1A1的依赖程度不同，而且，当抑制了其中一个时，剩下的可能起到代偿作用；因此，要有效降低癌细胞内NADPH水平，有必要同时使用两种或三种抑制剂，任意两种或三种之间均具备协同作用，提高了组合物的细胞毒性，较单一使用，降低了癌细胞的活性和增殖率。

CBS抑制剂对CBS和xCT高表达的癌细胞毒性升高更加突出；再添加GR抑制剂可进一步提高对肿瘤细胞的杀伤力，而且这种杀伤力的提高具有广谱性、对GR低表达的癌细胞更加敏感，这说明GR抑制剂对杀伤GR高表达和低表达癌细胞均具有药效价值，也为GR抑制剂与其它作用机制的抗癌物质或药物联合运用提供了科学基础。

作为本发明优选的技术方案，还包括：FBP，该组合物中任意两组分间的比例为 1:0.1～1:100。

作为本发明优选的技术方案，所述G6PD抑制剂包括脱氢表雄酮或6-氨基烟酰胺；所述ME1抑制剂包括胡椒碱；所述ALDH1A1抑制剂包括双硫仑。

作为本发明优选的技术方案，所述CBS抑制剂包括盐酸苄丝肼；所述xCT抑制剂包括索拉非尼或柳氮磺吡啶；所述GR抑制剂包括双氢青蒿素或盐酸阿米替林。

以上技术方案达到的技术效果是：DHEA或6-AN、Piperine和DSF分别为G6PD、 ME1和ALDH1A三种酶的抑制剂，同时抑制2个或3个NADPH再生关键酶，不仅对非小细胞肺癌而且对其它类型的肿瘤包括肝癌、肠癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌等也有显著的抗癌活性。而且，这三种酶的抑制剂联合治疗具有高度的安全性。

上述任意一种组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤包括各种实体瘤和血液肿瘤；所述组合物既可单独抗肿瘤，也可与包括靶向药、化疗和放疗在内的其它治疗联合应用从而起到加强抑癌效果和对抗耐药的作用。

作为本发明优选的技术方案，所述药物由所述组合物联合药学上可接受的赋形剂或载体制备药物制剂组成，包括固体制剂和液体制剂，制剂形式有口服制剂、注射制剂、栓剂、膜剂，控释双层片，控释三层片，控释纳米制剂、微囊制剂、微球制剂、肠溶制剂。

作为本发明优选的技术方案，所述药物的给药途径为口服给药或注射给药或经口鼻喷雾给药或皮肤外敷给药或肛门给药。

综上所述，本发明提供的抗肿瘤的组合物达到的技术效果是：

1)本发明的组合物的各组分均为临床上使用的药物，而且绝大多数是高度安全的非肿瘤治疗药物，因此具有较现有治疗和药物更加安全的优势，而且较从先导化合物开始的抗癌药研发研发周期短，因此可在较短时期内为患者提供安全有效、相对便宜的优质治疗。

2)本发明的组合物制备成的药物可用于独立治疗各种实体瘤和血液肿瘤，对于实体瘤既可手术前也可手术后给药。由于转移中的癌细胞容易受到氧化应激的损伤，本发明的药物制剂除了可以抑制肿瘤生长和杀伤肿瘤细胞外，对防治肿瘤转移也有重要价值。

3)本发明提供的药物可极大地提高靶向药物的治疗价值。靶向药物的优势是治疗早期药效显著，最大缺陷是获得性耐药和先天性耐药，本发明的药物制剂与靶向药物联合，可避免或最少是极大延缓获得性耐药，也可克服先天性耐药，从而极大地提高了靶向药物的治疗价值。

4)本发明提供的药物可提高放射疗法和以产生ROS为治疗原理的化疗药的抗癌药效、但不增加毒性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为ABC复方对非小细胞肺癌细胞株A549、H1975中GSH水平的影响结果图；

图2附图为ABC复方对非小细胞肺癌细胞株A549、H1975中NADPH的水平的影响结果图；

图3附图为胡椒碱(Piperine)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图4附图为脱氢表雄酮(DHEA)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图5附图为氨基烟酰胺(6-AN)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图6附图为双硫仑(DSF)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图7附图为盐酸苄丝肼(BEN)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图8附图为索拉非尼(SOR)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图9附图为柳氮磺吡啶(SAS)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图10附图为双氢青蒿素(DHA)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图11附图为盐酸阿米替林(AMI)对非小细胞肺癌细胞的毒性图；

图12附图为AB复方对LLC移植瘤的药效图；其中，A、B为不同组别的抑瘤结果图； C为不同组别存活时间图；D为不同组别体重变化结果图；

图13附图为AB复方联合FBP对LLC移植瘤的作用图；其中，A、B为不同组别肿瘤体积大小图；C为不同组别体重变化结果图；

图14附图为ABC复方对A549异种移植瘤的作用图；其中，A、B为不同组别肿瘤体积图；C为不同组别存活时间图；D为不同组织体重变化结果图；

图15附图为ABC复方对H1975异种移植瘤的作用图；其中，A、B、C、D、E为不同组别肿瘤体积图；F为不同组别存活时间图；G为不同组别体重变化结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1ABC复方降低肿瘤细胞内GSH的水平

方法：将培养24小时的非小细胞肺癌细胞株A549、H1975，按照表1-1和表1-2的药物干预36小时，用碧云天GSH和GSSG检测试剂盒测定细胞GSH和GSSG水平。

表1-1 A549药物组合方式

表1-2 H1975药物组合方式

**备注：a1＝Piperine；a2＝DHEA；a3＝DSF；A＝a1+a2+a3；b1＝BEN；b2＝SOR；

b3＝DHA；B＝b1+b2+b3；C＝FBP。

结果：如图1所示；

其中，图1-A、图1-B、图1-C和图1-D显示：AB复方、FBP处理细胞36h均可显著降低A549细胞中谷胱甘肽总量(GSSH+GSSG)和GSH储备、升高GSSG和GSSG与 GSSH+GSSG的比值，而ABC复方(A+B+FBP)几乎可完全耗竭谷胱甘肽总量和GSH储备并进一步提高GSSG与GSSH+GSSG的比值，而且FBP组分C对提高此比值发挥了关键性作用，这与FBP可通过促进线粒体氧化磷酸化增加ROS产生的作用原理相符合。相应地，FBP分别与A组分和A+B组分联合，均显著加强了它们耗竭胞内谷胱甘肽储备的药效。A组分也显著降低了谷胱甘肽的总量(GSH+GSSG)，而B组分(A+b1和b2或/ 和b3)特别是全组的加入(A+B)进一步降低了谷胱甘肽抗氧化储备。

图1E、图1-F、图1-G、和图1-H显示，在H1975中A复方显著降低胞内GSSG含量， AC复方显著降低GSH和GSSG的总量，GSH含量和GSSG含量；B复方显著提高GSH 和GSSG的总量，GSH含量和GSSG含量，这与预期不太符合，组分C的加入则可以逆转B复方的作用；AB复方、ABC复方显著降低GSH和GSSG的总量，GSH含量和GSSG 含量，同时提高GSSG与GSH+GSSG的比值，其中ABC复方的影响作用较AB复方更显著。结果表明，ABC复方可以显著降低H1975细胞中谷胱甘肽抗氧化储备，且FBP(组分C)起到主要作用，基本与理论相符。

综上所述，FBP从抑制GSH合成和加强其消耗的角度协同AB几乎可耗竭肿瘤细胞内的谷胱甘肽抗氧化储备。

实施例2ABC复方降低肿瘤细胞内NADPH的水平

方法：将培养24小时的非小细胞肺癌细胞株A549、H1975，按照附表2-1和表2-2 药物干预36小时,用碧云天NADP⁺/NADPH检测试剂盒测定细胞NADPH和NADP⁺水平。

表2-1药物组合方式

表2-2 H1975药物组合方式

b3＝DHA；B＝b1+b2+b3；C＝FBP。

结果：如图2所示；

其中，图2-A、图2-B和图2-C显示：，与模型对照组control(CON)相比，FBP可极大程度地降低A549胞内的NADPH和NADP⁺总量，NADPH和NADP⁺的量也分别显著降低。组分A和A+bn组分均能显著降低NADPH和NADP⁺的总量，但降低程度远不及FBP，特别是这些组分均显著升高了NADPH的水平但降低了NADP⁺的水平，这种变化很可能是因为这些组分的降低阻碍了支持细胞增殖的生物合成从而较少了相应的NADPH被氧化成 NADP⁺。ABC复方降低NADPH和NADP⁺总量的强度与FBP基本一致，而NADPH量也显著高于FBP组。

图2-D、图2-E和图2-F显示，在H1975细胞中，与模型对照组control(CON)相比，FBP、A复方、AB复方以及AC复方、AB复方、ABC复方均能显著降低NADP+和NADPH 总量、NADP+含量，且FBP起到主要作用。然而，这些组合不仅未能降低反而提高了胞内NADPH含量。但由于NADP+和NADPH总量处于较低水平，所以，NADPH亦处于较低水平，表明ABC复方降低了H1975中NADPH的水平。

以上研究结果显示，ABC复方可降低细胞的NADPH水平。

实施例3验证NADPH再生酶ME1、G6PD和ALDH1A抑制剂可产生协同效果

试剂：ME1抑制剂胡椒碱(Piperine)、G6PD抑制剂脱氢表雄酮(DHEA)或6-氨基烟酰胺(6-AN)、ALDH1A1抑制剂双硫仑(DSF)；

方法：将培养24小时的非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703、PC-9、NCI-H1975、NCI-H460、 A549、NCI-H2170、NCI-H1299、NCI-H1395或LLC分别在含(1)12.5、25、50、100、 200、400μM Piperine；(2)25、50、100、200、400μM DHEA；(3)2、5、10、20、50、 100、200μM 6-AN；(4)25、50、100、200、400、800nM DSF的培养基中培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB) 染色分析方法测定细胞活力。

结果如图3、图4、图5和图6所示，Piperine、DHEA或6-AN、DSF，NADPH再生酶抑制剂单独作用均可以显著抑制多株非小细胞肺癌细胞株的细胞活力，但不同细胞对这些抑制剂的敏感性不完全相同。上述结果表明，NADPH再生酶ME1、G6PD和ALDH1A1 抑制剂可抑制非小细胞肺癌细胞增殖。

然后将培养24小时的非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703、PC-9、NCI-H1975、NCI-H460、 A549、NCI-H2170、NCI-H1299、NCI-H1395或LLC分别按照表3-1药物干预72小时。同时设不加任何药物处理的正常对照组(CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB) 染色分析方法测定细胞活力。

表3-1

**备注：a1＝Piperine；a2＝DHEA；a3＝DSF；A＝a1+a2+a3；C＝FBP。

同时，将培养24小时的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SUM-159、HCC-1806，宫颈癌细胞株Hela，结肠癌细胞株SW620、HCT-15、HCT-116，胶质瘤细胞株U251、U87MG、 SHG44，胃癌细胞株SGC-7901，白血病细胞株Jurkat，骨髓瘤细胞株U266、FO、RPMI-8226，肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721、Bel-7402，黑色素瘤细胞株B16-F10，胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC-1分别按照表3-1药物组合方式，但抑制剂浓度设置为：a180μM，a250 μM；a30.2μM(这些浓度分别是所测9株肺癌细胞株的IC₃₀均值)，干预72小时。同时设不加任何药物处理的正常对照组(CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果如表3-2所示；

表3-2抑制NADPH再生酶的癌细胞增殖率(％)

**备注：a1＝Piperine；a2＝DHEA；a3＝DSF；A＝a1+a2+a3。

由表3-2可知，在31株肿瘤细胞株中，有16株细胞包括肺癌细胞PC-9、H1975、H460、H1395、LLC，三阴性乳腺癌细胞SUM-159、HCC-1806，胶质瘤SHG-44，结肠癌细胞 HCT-116，肝癌细胞Huh7、SMMC-7721，胰腺癌细胞BxPC-3，白血病细胞Jurkat，骨髓瘤细胞U266、FO、RPMI-8226，对ME1抑制剂(a1)联合G6PD抑制剂(a2)高度敏感；肺癌细胞A549，肠癌细胞SW620、HCT-15，肝癌细胞HepG2，黑色素瘤细胞B16-F10对 a1联合ALDH1A1抑制剂(a3)高度敏感，值得注意的是，当这三种抑制剂联合时，这些肿瘤细胞均高度敏感，而且绝大多数肿瘤细胞的敏感性进一步提高。可见，同时抑制这3种 NADPH再生酶较抑制其中2种可产生更加广谱、稳定可靠的抗肿瘤药效，因此有理由确定3种NADPH再生酶的抑制剂构成有效复方A。

实施例4验证GSH合成酶CBS、xCT和GR抑制剂可产生协同效果

试剂：CBS抑制剂盐酸苄丝肼(BEN)、xCT抑制剂索拉非尼(SOR)或柳氮磺吡啶(SAS)、GR抑制剂双氢青蒿素(DHA)或盐酸阿米替林(AMI)。

方法：将培养24小时的非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703、PC-9、NCI-H1975、NCI-H460、 A549、NCI-H2170、NCI-H1299、NCI-H1395或LLC分别在含(1)10、20、40、80、160、 320μM BEN；(2)3.125、6.25、12.5、25、50μM SOR；(3)0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、 1.6mM SAS；(4)1、2、4、8、16、32μM DHA；(5)6.25、12.5、25、50、100μM AMI的培养基中培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。

结果如图7、图8、图9、图10和图11所示，BEN、SOR或SAS、DHA或AMI，GSH 合成或再生抑制剂单独作用均可以显著抑制多株非小细胞肺癌细胞株的细胞活力，但不同细胞对这些抑制剂的敏感性不完全相同。上述结果表明，GSH合成酶CBS、xCT和GSH 再生酶GR抑制剂可抑制非小细胞肺癌细胞增殖。

然后将培养24小时的非小细胞肺癌NCI-H1975按照表4-1药物干预72小时。同时设不加任何药物处理的正常对照组(CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。

表4-1

**备注：b1＝BEN；b2＝SOR；b3＝DHA；B＝b1+b2+b3；C＝FBP。

同时，将培养24小时的肺癌细胞NCI-H1975，结肠癌细胞株SW620、HCT-116，肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402，胰腺癌细胞PANC-1，骨髓瘤细胞株FO、RPMI-8226，分别按照表x1药物组合方式，但抑制剂浓度设置为：b185μM，b23.5μM；b32.5μM (这些浓度分别是所测9株肺癌细胞株的IC30均值)，干预72小时。同时设不加任何药物处理的正常对照组(CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果如表4-2所示；

表4-2抑制GSH合成及再生酶的癌细胞增殖率(％)

*备注：b1＝BEN；b2＝SOR；b3＝DHA；B＝b1+b2+b3。

由表4-2可知，在8株肿瘤细胞株中，结肠癌细胞SW620，肝癌细胞Bel-7402、 SMMC-7721，骨髓瘤细胞FO，对xCT抑制剂(b2)联合GR抑制剂(b3)高度敏感；肺癌细胞H1975，肠癌细胞HCT-116、胰腺癌细胞PANC-1对B组抑制剂两者或三者相互联合均不敏感；值得注意的是，当这三种抑制剂联合时，除肠癌细胞HCT-116、胰腺癌细胞PANC-1，这些肿瘤细胞的敏感性反而降低。可见，同时抑制这3种GSH合成和再生酶，尤其是抑制其中2种亦可产生有效的抗肿瘤作用，因此有理由确定3种GSH合成和再生酶的抑制剂构成有效复方B。

实施例5验证NADPH抑制剂和GSH抑制剂具备协同增效作用

为了验证各组分的协同作用，将培养24小时的非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703、PC-9、 NCI-H1975、NCI-H460、A549、NCI-H2170、NCI-H1299、NCI-H1395或LLC分别按照表 5-1药物干预72小时。同时设不加任何药物处理的正常对照组(CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。

表5-1

备注：a1＝Piperine；a2＝DHEA；a3＝DSF；A＝a1+a2+a3；b1＝BEN；b2＝SOR；

b3＝DHA；B＝b1+b2+b3；C＝FBP。

同时，将培养24小时的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SUM-159、HCC-1806，宫颈癌细胞株Hela，胶质瘤细胞株U251、U87MG、SHG44，结肠癌细胞株SW620、HCT-15、 HCT-116，胃癌细胞株SGC-7901，肝癌细胞株Huh7、HepG2、Bel-7402、SMMC-7721，白血病细胞株Jurkat，骨髓瘤细胞株U266、FO、RPMI-8226，胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC- 1，黑色素瘤细胞株B16-F10分别按照表3药物组合方式，但抑制剂浓度设置为：a180μM， a250μM；a30.2μM，b185μM；b23.5μM；b32.5μM(这些浓度分别是所测9株肺癌细胞株的IC₃₀均值)，干预72小时。同时设不加任何药物处理的正常对照组(CON)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力，结果如表5-2所示；

表5-2 B组抑制剂与A复方联合对癌细胞活力的影响(％)

**备注：a1＝Piperine；a2＝DHEA；a3＝DSF；A＝a1+a2+a3；b1＝BEN；b2＝SOR； b3＝DHA；B＝b1+b2+b3。

由表5-2可知，在所测31株肿瘤细胞中，对A复方不敏感(抑制率小于50％)的细胞株 H1703、Hela、U87MG、U251、PANC-1，B组抑制剂的组分b1、b2或b3的加入均能显著提高A复方的细胞毒性；对A复方相对不敏感(抑制率小于60％)的细胞株H1975、H1299、 SW620、SGC-7901和Bel-7402，任何1种及以上B组成分的加入均可进一步提高A复方对细胞的毒性；对于A复方敏感(抑制率超过60％)的21株细胞，B组抑制剂全部加入，其中6株细胞(包括H460、A549、H2170、LLC、MDA-M-231、Hela、SHG-44、HCT-15、 HepG2、BxPC-3、U266、FO、RPMI-8226)的细胞活力进一步显著降低，然而也有少数细胞对B的加入不敏感，甚至B的加入削弱了A复方的细胞毒性，如PC-9、H1395、SUM-159、 HCC-1806、HCT-116、Huh7、B16-F10。总体来说，B组抑制剂可以加强A复方的降低细胞活力的药效，因此明确AB复方较A复方具有更广的抗癌谱和更强的药效。

实施例6验证FBP和A组方、B组方或者与A+B组方的协同作用

首先，验证FBP优化A复方的抗肿瘤活性，方法同实施例3,结果如表6-1所示；再次，验证FBP优化B复方的抗肿瘤活性，方法同实施例4，结果如表6-2所示；最后，以FBP 优化AB复方的抗肿瘤活性，方法同实施例5；结果如表6-3所示。

表6-1 A复方与FBP联合的癌细胞增殖率(％) (C＝FBP)

由表6-1可知，FBP可显著增加肿瘤细胞对A复方部分组分和全组分的敏感性，如当FBP与a1联合时，在所测31株细胞中，其中有10株细胞(H1975、H2170、SUM-159、Hela、U87MG、Jurkat、 U266、FO、HepG2和B16-F10)活力被FBP的加入降低40％以上，其中12株细胞活力被降低20-40％。然而，在此31株肿瘤细胞中，胰腺癌细胞BxPC-3对FBP联合a1的敏感性反而低于对a1的敏感性。

表6-2B复方与FBP联合的癌细胞增殖率(％) (C＝FBP)

由表6-2可知，FBP可显著增加肿瘤细胞对B复方部分组分和全组分的敏感性，如当FBP与b1联合时，在所测8株细胞中，其中有2株细胞(H1975和FO)活力被FBP的加入降低40％以上，其中2 株细胞活力被降低20-40％。以上结果表明，FBP(组分C)可增强B复方的抗肿瘤药效。

表6-3AB复方与FBP联合的癌细胞增殖率(％) (C＝FBP)

由表6-3可知，FBP也可显著增加肿瘤细胞对AB复方部分组分和全组分的敏感性，如当FBP与A+b1联合时，在所测30株细胞中，其中有16株细胞(H1703、PC-9、H217 0、LLC、SUM-159、HCC-1806、U251、SW620、HCT-15、SGC-7901、Huh7、HepG2、S MMC-7721、Bel-7402、BxPC-3、PANC-1)活力被FBP的加入降低40％以上，其中9株细胞活力被降低10％-40％；当FBP与AB全组分联合时，在所测30株细胞中，其中有16 株细胞(PC-9、A549、H2170、MBA-MB-231、SUM-159、SW620、HCT-15、HCT-116、 SGC-7901、Huh7、HepG2、SMMC-7721、Bel-7402、BxPC-3、PANC-1、RPMI-8226)活力被FBP的加入降低20％以上，其中10株细胞活力被降低10-20％。然而，在此28株肿瘤细胞中，三阴性乳腺癌细胞MDA-MD-231、骨髓瘤细胞FO、RPMI-8226对FBP联合A +b1的敏感性反而低于对A+b1的敏感性。

综上，FBP可普遍显著提高AB复方中A组成分和B组成分对肿瘤细胞的毒性，所以将FBP(组分C)加入AB复方以进一步构成ABC复方。

进一步验证ABC复方具有体内抗肿瘤活性

过程：建立皮下移植瘤模型：

(1)LLC模型：按常规方法将鼠源非小细胞肺癌细胞株LLC(100万/只)接种于成年雄性C57BL/6黑小鼠右侧腋下；

(2)A549模型和H1975模型：按常规方法将人源非小细胞肺癌细胞株A549(200万/只)或H1975(200万/只)接种于成年雄性BALB/c Nude裸小鼠右侧腋下。

分组：(1)LLC模型：于荷瘤当天按照体重均匀分组，模型Ⅰ每组动物数量为10，共6组，模型Ⅱ每组动物数量为6，共4组；(2)A549模型和H1975模型：于荷瘤后每隔三天用游标卡尺测量肿瘤的长径和宽径，按照公式：瘤体积(mm³)＝1/2×长径(mm)×宽径(mm)²计算肿瘤体积，待瘤体积生长至50mm³左右，A549移植瘤模型按照瘤体积均匀分为4组，H1975移植瘤模型按照瘤体积均匀分为7组，每组动物数量为7。

药物治疗：所有移植瘤模型中，药物治疗剂量及给药方式均为：紫杉醇(PTX,12mg/kg, 每两天一次,i.p.)，顺铂(CDDP,5mg/kg,每周一次,治疗两周后停药,i.p.)，奥西替尼(OSI, 5mg/kg,每天一次,i.g.)，STG(20mg/kg,每天两次,i.g.,下述S＝STG)，FBP(500mg/kg, 每天两次,i.g.,下述F＝FBP)，Piperine(50mg/kg,每天一次,i.g.,下述a1＝Piperine)，DHEA (60mg/kg,每天一次,i.g.,下述a2＝DHEA)，DSF(60mg/kg,每天一次,i.g.,下述a3＝DSF)， BEN(300mg/kg,每天一次,i.g.,下述b1＝BEN)，SOR(20mg/kg,每天一次,i.g.,下述b2＝ SOR)，DHA(50mg/kg,每天一次,i.g.,下述b3＝DHA)。

(1)LLC模型Ⅰ：①空白对照组CON(纯净水，i.g.)，②阳性对照组PTX，③a1+a2+a3(A＝a1+a2+a3)组，④A+b1+b2组，⑤A+b3组，⑥A+b1+b2+b3(B＝b1+b2+b3)组；LLC模型Ⅱ：①空白对照组CON(纯净水,i.g.)，②A+B组，③S+F(C＝SF)组(FBP于STG给药30min 后再给药)，④C+A+B组；(2)A549移植瘤模型：①空白对照组CON(纯净水，i.g.)，②SF(C)组(FBP于STG给药30min后再给药)，③A+b3组，④C+A+b3组(FBP于STG给药30 min后再给药)；(3)H1975移植瘤模型：①空白对照组CON(纯净水，i.g.)，②阳性对照组OSI，③阳性对照组CDDP，④SF(C)组(FBP于STG给药30min后再给药)，⑤A+B组，⑥C+A+B组(FBP于STG给药30min后再给药)，⑦OSI+C+A+B组(FBP于STG给药30min后再给药)。每组给药量为10μL/g。

指标测量：LLC模型每3天记录一次体重、瘤体积，A549、H1975、MDA-MB-231模型每5天记录一次体重、瘤体，将体重降低超过20％或瘤体积增长至2000mm³以上记为动物死亡终点。

对LLC移植瘤影响：

结果如图12、图13、图14和图15所示，其中，图12-A和图12-B所示，复方全方A+B组、复方组分A+b1+b2组、复方组分A+b3组肿瘤体积明显小于control(CON)组，复方全方A+B 组抑瘤效果最为显著。AB复方肿瘤生长抑制率达到81.3％，复方组分A+b1+b2的抑瘤率为67.3％，复方组分A+b3的抑瘤率为25.7％，A组分的抑瘤率仅为14.8％，而阳性药PTX组抑制率为51.6％(表7-1)。在延长动物生存寿命方面，CON组平均仅存活15.10d，A组平均存活15.33d，A+b3组平均存活13.75d，PTX组平均存活19.10d，A+b1+b2组平均存活24.44 d，A+B组平均存活25.00d，A+b1+b2组和A+B组显著延长了动物生存时间(图12-C)；图 12-D所示，与CON相比，各治疗组动物体重均增加，而PTX组体重增加最为缓慢。研究结果证明，AB复方全方可显著抑制LLC移植瘤生长和延长动物寿命，其药效强度优于复方组分A及阳性对照药PTX，并显示了高度安全性.。

如图13-A和图13-B所示，与模型对照组control(CON)相比，AB复方(A+B)、SF(C)、ABC复方(C+A+B)均能显著抑制肿瘤生长。于试验终点(治疗第19天)，ABC复方肿瘤抑制率达到79.8％，AB复方的抑瘤率为61.8％，SF组的抑瘤率为55.2％(表7-2)。此外，相对于AB复方和组分C治疗组，ABC复方治疗组的肿瘤个体差异更小，说明ABC复方的抗肿瘤药效更加稳定可靠(图13-B)。各治疗组的体重未见降低情况(图13-C)。以上结果说明，FBP联合AB复方可产生较各自更优的抗肿瘤药效，支持二者联合构成ABC复方的抗肿瘤应用。

对A549移植瘤影响：

如图14-A和14-B所示，与模型对照组control(CON)相比，A+b3组、SF(C)组和C联合A+b3 组的肿瘤生长速度均显著缓慢。肿瘤生长到2000mm³，模型组用了47天，这3个治疗组分别用了72天，72天和117天，药物治疗分别推迟了1.5倍，1.5倍和2.5倍。相应地，治疗组的寿命也较CON组显著延长(图14-C)，CON组平均仅存活57.00d，SF(C)组平均存活79.50d， A+b3组平均存活81.14d，C+A+b3组平均存活117.00d，C+A+b3组动物平均寿命较CON组延长了60天。各组体重变化情况如图14-D所示，与CON组相比，药物治疗组未见体重降低情况。以上结果表明，FBP和AB复方组分Ab3对A549异种移植瘤均具有显著抗肿瘤药效，二者联合可极大地提高抗癌效果，这一研究结果也支持ABC复方的抗肿瘤应用前景。

对H1975移植瘤影响：

如图15-A、图15-B、图15-C、图15-D所示，在第22天，模型对照组control(CON)肿瘤生长到2000mm³，SF(C)组未见药效，CDDP组、OSI组、AB复方组、ABC复方(SF+A+B) 组、SOI+ABC复方组的肿瘤体积均显著较小。CDDP组、AB复方组、ABC复方组分别用了 32天，32天，42天肿瘤生长到2000mm³，OSI组、SOI+ABC复方组肿瘤体积尚未达到 2000mm³。其中OSI组在第22天开始出现耐药趋势，OSI+ABC复方组在第62天仍然未见明显的耐药趋势出现，而且肿瘤处于缓慢增长甚至停滞生长状态(图15-E)。相应地，如图 15-F所示，在62天内除OSI组和OSI+ABC复方组，其余治疗组动物全部死亡，而OSI+ABC 复方组在第62天仍未见动物死亡，显著延长了动物寿命，进一步确证了ABC复方与靶向药 OSI合用的抗肿瘤优势。各组体重生长如图15-G所示，除CDDP组有严重的毒性，其他组均未见体重降低情况，说明ABC复方及各组分的体内安全性。

结果表明，在H1975异种移植瘤模型中，ABC复方在药效和安全性方面均优于CDDP，且能显著延缓OSI耐药的出现，显示克服靶向药耐药性的临床应用价值和广泛的应用前景

表7-1 LLC移植瘤模型各组肿瘤抑制率

表7-2 LLC移植瘤模型各组肿瘤抑制率

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种基于破坏氧化还原平衡的抗肿瘤组合物，其特征在于，包括：NADPH再生抑制剂、GSH抑制剂和FBP；其中，所述NADPH再生抑制剂为括胡椒碱、脱氢表雄酮和双硫仑的组合物；所述GSH抑制剂为盐酸苄丝肼、索拉非尼和双氢青蒿素的组合物；且任意两组分间的质量比均为1:0.01~1:100。

2.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括各种实体瘤和血液肿瘤；所述组合物既可单独抗肿瘤，也可与包括靶向药、化疗和放疗在内的其它治疗联合应用从而起到加强抑癌效果和对抗耐药的作用。

3.根据权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物由所述组合物联合药学上可接受的赋形剂或载体制备药物制剂组成，包括固体制剂和液体制剂，制剂形式有口服制剂、注射制剂、栓剂、膜剂，控释双层片，控释三层片，控释纳米制剂、微囊制剂、微球制剂、肠溶制剂。

4.根据权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为口服给药或注射给药或经口鼻喷雾给药或皮肤外敷给药或肛门给药。