CN1142163C - 一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中分离提取埃博霉素(Epothilone)的方法，它是利用混合树脂吸附、固液分步萃取、分子筛层析、结晶和高效液相分离等技术手段，从粘细菌发酵液中分离提取埃博霉素，获得高纯度的抗肿瘤化合物。并且，埃博霉素A和B的提取得率达到了80%以上，降低了成本，提高了效率，大大提高了工业化生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益。

Description

一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种从粘细菌发酵液中分离提纯大环内酯类化合物的方法，具体地说涉及一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法。

(二)背景技术

目前临床上最为成功的抗肿瘤化疗药物是促微管聚合类天然化合物紫杉醇(paclitaxel，Taxol^)及其类似物紫杉特尔(docetaxel，Taxotere^)，被用于卵巢癌、胸腺癌、结肠癌、肺癌和肝癌等实体癌的治疗。诱导型抗肿瘤药物紫杉醇的成功及其在化疗中的不足(低水溶性和化疗过程中出现的细胞耐药性等)，促使研究人员进一步筛选具有更好的化学性质、生物学性质和药理学性质的微管稳定剂。然而经过长时间、大量的筛选，直到近年才发现了四类新的天然化合物——伊璐霉素(eleutherobin)，蒂克霉素(discodermolide)，莱利霉素(1aulimalides)和埃博霉素(Epothilone)具有微管稳定功能。其中，1993年赫弗勒(Hfle)等报道从粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中分离出新的16元大环内酯类化合物埃博霉素(Epothilone)A和B，在1995年博拉格(Bollag)等在对抗肿瘤化合物的大规模筛选中发现埃博霉素的促微管聚合活性后，引起了人们的广泛关注。和紫杉醇相似，埃博霉素可诱导微管蛋白在低温和不含三磷酸鸟苷(GTP)或微管相关蛋白(MAPs)条件下形成微管。与紫杉醇不同的是，埃博霉素对p-糖蛋白表达型多药耐药(MDR)细胞株系和肿瘤依然保持活性。在紫杉醇敏感细胞株系中，埃博霉素B比埃博霉素A或紫杉醇具有更大的抑制活性。另一方面，紫杉醇的内毒素样活性在临床化疗中可能引起非血液性副作用，而埃博霉素不引发细胞的内毒素信号途径。此外，塔拉斯基(Taraschi)等的研究显示微管稳定剂如紫杉醇或埃博霉素A还具有抗疟活性，能够阻碍裂殖子的形成。

埃博霉素较紫杉醇简单的结构、良好的水溶性和极大的药用潜力，使得人们投入了巨大的热情进行研究，以期更快的将其开发成为抗肿瘤药物。化学家们把很多的精力投入到埃博霉素及其类似物的合成和分离上，但是，对于从发酵液中分离提纯埃博霉素，目前一直采用哥特(Gerth)等人的方法。该方法包括树脂吸附，硅胶柱梯度分离，分子筛层析和高效液相分离四个步骤。我们的研究表明，该方法存在着一定的缺陷和不足，尤其是无法达到工业化生产的各种要求。主要表现在：步骤过于繁琐，使得操作的效率较低而过程费用很高；产物的得率较低，不超过30％，过程损失高达70％；树脂吸附时，使用安伯莱特(Amberlite)XAD-16树脂，成本很高，而且国内目前尚无同型号的树脂替代品；要使埃博霉素A和B达到用药纯度(大于90％)，必须经过高效液相分离，这在工业生产中是难以实现的。经过文献和专利的检索，国内外在此方向并没有较大的进展和相关的专利。

(三)发明内容

针对上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法。它可有效地克服现有流程的弊段，达到高效而经济的从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的目的，从而实现提取流程的工业化。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的，具体步骤顺序如下：

(1)混合树脂的配制：将CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合，悬溶于等体积的蒸馏水中，制备成混合树脂溶液；

(2)混合树脂吸附：在进行粘细菌发酵时，向液体培养基中添加0.1％-5％(体积/体积)的上述混合树脂进行吸附，吸附剂存在于整个发酵流程之中，发酵结束后，过滤制得沉淀的吸附树脂混合物，备用；

(3)固液分步萃取：①使用10-20倍体积的甲醇对步骤(2)获得的树脂混合物进行萃取，保温30-50℃，24-48小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；②将第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物，③将第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心收集沉淀，使用10％体积比的正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物；

(4)分子筛层析：将上述第三部分萃取物重溶于2倍体积甲醇，以2-5％柱床体积的加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离；流动相为甲醇或二氯甲烷，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm，埃博霉素的洗脱体积为1.5-2.5倍柱体积；

(5)结晶：将步骤(4)的收集样品制备成酮类过饱和溶液，利用结晶器制备和收集结晶；方法是将恒温槽加热至45-60℃，将样品放入结晶皿中，保温15-30分钟，至样品全部溶解，然后开始梯度降温，速率为0.5～3℃/30分钟，降温至35-40℃后，改用溶剂蒸发法，恒温浓缩液体体积至原始体积的十分之一，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素A和B的混合物；

(6)高效液相分离：若获得完全纯化的埃博霉素A或B，可采用高效液相进行埃博霉素A和B混合物分离，使用反相半制备柱(Hypersil ODS2 C18)，规格为250×8mm，填料粒径10μm，流速为2ml/min，249nm检测，柱温24℃，进样量100μl，检测时间30min，流动相为65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滞留时间为9.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为11.1分钟；收集后即可获得纯化的埃博霉素A或B。

其中步骤(1)所述的CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂混合的重量比是1∶1∶2∶1∶3∶2。

其中步骤(2)所述的进行吸附用混合树脂添加量为液体培养基体积比的0.5％-2％。

其中步骤(3)所述的①中，最适宜的萃取温度为35-40℃。

其中步骤(3)所述的②中，最适宜的萃取温度为22-25℃。

其中步骤(3)所述的③中，最适宜的萃取温度为25-28℃。

其中步骤(4)所述的最适加样量为2.5-3.8％柱床体积。

其中步骤(4)所述的埃博霉素的洗脱体积，在使用甲醇为流动相时，洗脱体积为1.8-2.3倍柱体积；在使用二氯甲烷为流动相时，洗脱体积为1.5-2.1倍柱体积。

其中步骤(5)所述的酮类过饱和溶液是2-丁酮或者丙酮中的一种或两种。

其中步骤(5)所述的梯度降温的最适速率为0.5～1℃/30分钟。

对于分离提纯制备得到的埃博霉素A和B，分别测定了质谱(见附图4)，紫外谱图(见附图5)，红外谱图(见附图6)和核磁共振谱图(见附图7和附图8)，确认了结构(见附图3)。并且，测定了它们的抗肿瘤活性(见附件1)和微管聚合促进活性(见附件2)。

在本发明的方法中，混合树脂对于埃博霉素的吸附率为95-100％，完成结晶步骤时埃博霉素的提取率为85-90％，纯度为95-97％，完成高效液相分离后，埃博霉素A和B的提取率为82-89％，纯度为99.9-99.99％。

本发明的创造性在于，研制了低成本、高效的混合吸附树脂，其吸附率高达95-100％，替代了昂贵的进口吸附树脂；开发了分步固液萃取技术，替代原步骤中的硅胶柱梯度洗脱分离，大大提高了最终的提取得率，降低了成本；开发了结晶工艺，并研制了专用结晶器，创造性的通过结晶对埃博霉素进行了提纯，使得完成结晶步骤时埃博霉素A和B的提取率为85-90％，纯度高达95-97％，完全达到了制备成为药物的要求。而在原始提取流程中，进行高效液相分离前，埃博霉素的纯度不足70％，无法直接制备成为药物。本发明的主要优点是通过分步固液萃取和结晶等工艺，使得抗肿瘤化合物埃博霉素的提取得率达到了80％以上，由于使用了廉价的混合树脂进行吸附，大大降低了成本，提高了效率。考虑到工业化生产时，埃博霉素A和B的药效和毒性大致相当，可以混合制药，所以完成结晶部分即可形成产品，大大提高了工业化生产的可行性和可放大性。这一发明，开创了高效而经济的分离提纯抗肿瘤化合物埃博霉素的创新技术，具备工业化生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。

(四)附图说明图1.从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的工艺流程图

其中：1混合树脂的配置；2混合树脂吸附；3固液分步萃取；4分子筛层析；5结晶；6高效液相分离；7完全纯化的埃博霉素A和B；8较高纯度的埃博霉素A和B混合结晶。图2.进行结晶操作的结晶器构造示意图

其中：9样品结晶皿；10温度计；11样品槽；12样品槽密封盖；13单相同步电机；14电动搅拌器控制器；15电耦变压器；16双位控制器；17电源；18搅拌器；19加热装置；20温度控制仪；21双蒸水；22微量真空泵；23真空抽气管。图3.埃博霉素(Epothilone)A和B的化学结构

图中所示，埃博霉素A的R为H；埃博霉素B的R为CH₃。图4.提纯得到的埃博霉素A和B的质谱谱图

图中所示，(4-A)图的样品为提纯后的埃博霉素A，得出组分的(M+H)⁺为494.2561，拟合化合物的分子式为C₂₆H₃₉O₆NS，相对偏差1.922e-06；(4-B)图的样品为提纯后的埃博霉素B，组分的(M+H)⁺为508.2725，拟合化合物的分子式为C₂₇H₄₁O₆NS，相对偏差4.942e-07，均与埃博霉素A或B的理论值完全吻合。图5.提纯得到的埃博霉素A和B的紫外光谱图

图中所示，提纯得到的埃博霉素A和B具有相同的紫外光谱图，特征峰的波长值和摩尔消光系数分别为λ_max1＝210，logε₁＝14.17，λ_max2＝249，logε₂＝3.97，与埃博霉素A或B的理论值完全吻合。图6.提纯得到的埃博霉素B的红外光谱图

图中所示，提纯得到的埃博霉素B的红外光谱图与埃博霉素B的理论值完全吻合。图7.提纯得到的埃博霉素A和B的PMR谱图

图中所示，(7-A)图的样品为提纯后的埃博霉素A；(7-B)图的样品为提纯后的埃博霉素B，样品溶液均为氘代甲醇，结果与埃博霉素A或B的理论值完全吻合。图8.提纯得到的埃博霉素A和B的¹³C-NMR谱图

图中所示，(8-A)图的样品为提纯后的埃博霉素A；(8-B)图的样品为提纯后的埃博霉素B，样品溶液均为氘代甲醇，结果与埃博霉素A或B的理论值完全吻合。

图9.变温紫外分光光度法检测结果图。

附件1：提纯后的埃博霉素A和B的体外抗肿瘤活性实验报告

结论表明：提纯后的埃博霉素A在浓度大于50ng/ml时，可以杀死两种肿瘤细胞；提纯后的埃博霉素B在浓度大于10ng/ml时，可以杀死两种肿瘤细胞。两样品均具有明显的体外抗肿瘤活性，并且与文献值一致。附件2：提纯后的埃博霉素A和B的促微管聚合活性实验报告

结论表明：提纯后的埃博霉素A和B均能在不存在GTP的情况下，明显的促进微管再体外的聚合作用，而且B的活性高于A，与文献结论一致。

(五)具体实施方式实施例1：本发明利用混合树脂吸附、固液分步萃取、分子筛层析、结晶和高效液相分离等技术手段，从一种粘细菌纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素，具体步骤顺序如下：(1)混合树脂的配制：将CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比1∶1∶2∶1∶3∶2混合，悬溶于等体积的蒸馏水中制备成混合树脂溶液。(2)混合树脂吸附：在进行纤维堆囊菌发酵时，向2000ml液体培养基中添加2％(体积/体积)的混合树脂进行吸附，吸附剂存在于整个发酵流程之中，发酵结束后，过滤制得沉淀的吸附树脂混合物，备用。(3)固液分步萃取：

①使用15倍体积的甲醇对步骤(2)获得的树脂混合物进行萃取，保温38℃，36小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；

②将第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用15倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温24℃，36小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物；

③将第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用15倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温27℃，36小时，离心收集沉淀，使用10％体积比的正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物；(4)分子筛层析：将上述第三部分萃取物重溶于2倍体积甲醇，以3％柱床体积的加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离；流动相为甲醇，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm，埃博霉素的洗脱体积为2.1倍柱体积；(5)结晶：将步骤(4)的收集样品制备成2-丁酮的过饱和溶液，利用结晶器(结晶器构造见附图2)制备和收集结晶；方法是将恒温槽加热至50℃，将样品放入结晶皿中，保温25分钟，至样品全部溶解，然后开始梯度降温，速率为0.8℃/30分钟，降温至38℃后，改用溶剂蒸发法，恒温浓缩液体体积至原始体积的十分之一，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分离：若获得完全纯化的埃博霉素A或B，可采用高效液相进行埃博霉素A和B混合物分离，使用反相半制备柱(Hypersil ODS2 C18)，规格为250×8mm，填料粒径10μm，流速为2ml/min，249nm检测，柱温24℃，进样量100μl，检测时间30min，流动相为65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滞留时间为9.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为11.1分钟；收集后即可获得纯化的埃博霉素A或B。

在本发明的方法中，混合树脂对于埃博霉素的吸附率为100％，完成结晶步骤时，埃博霉素的提取率为90％，纯度为97％，完成高效液相分离后，埃博霉素A和B的提取率为89％，纯度为99.99％。实施例2：本发明利用混合树脂吸附、固液分步萃取、分子筛层析、结晶和高效液相分离等技术手段，从一种粘细菌纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素，具体步骤顺序如下：(1)混合树脂的配制：将CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8∶0.8∶1.8∶0.8∶2.8∶1.8混合，悬溶于等体积的蒸馏水中制备成混合树脂溶液。(2)混合树脂吸附：在进行纤维堆囊菌发酵时，向1000ml液体培养基中添加1％(体积/体积)的混合树脂进行吸附，吸附剂存在于整个发酵流程之中，发酵结束后，过滤制得沉淀的吸附树脂混合物，备用。(3)固液分步萃取：

①使用10倍体积的甲醇对步骤(2)获得的树脂混合物进行萃取，保温31℃，46小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；

②将第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温20℃，46小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物；

③将第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温21℃，46小时，离心收集沉淀，使用10％体积比的正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物；(4)分子筛层析：将上述第三部分萃取物重溶于2倍体积甲醇，以2％柱床体积的加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离；流动相为二氯甲烷，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm，埃博霉素的洗脱体积为1.9倍柱体积；(5)结晶：将步骤(4)的收集样品制备成丙酮的过饱和溶液，利用结晶器(结晶器构造见附图2)制备和收集结晶；方法是将恒温槽加热至45℃，将样品放入结晶皿中，保温30分钟，至样品全部溶解，然后开始梯度降温，速率为0.5℃/30分钟，降温至36℃后，改用溶剂蒸发法，恒温浓缩液体体积至原始体积的十分之一，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分离：若获得完全纯化的埃博霉素A或B，可采用高效液相进行埃博霉素A和B混合物分离，使用反相半制备柱(Hypersil ODS2 C18)，规格为250×8mm，填料粒径10μm，流速为2ml/min，249nm检测，柱温24℃，进样量100μl，检测时间30min，流动相为65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滞留时间为9.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为11.1分钟；收集后即可获得纯化的埃博霉素A或B。

在本发明的方法中，混合树脂对于埃博霉素的吸附率为95％，完成结晶步骤时，埃博霉素的提取率为90％，纯度为95％，完成高效液相分离后，埃博霉素A和B的提取率为82％，纯度为99.91％。实施例3：本发明利用混合树脂吸附、固液分步萃取、分子筛层析、结晶和高效液相分离等技术手段，从一种粘细菌纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素，具体步骤顺序如下：(1)混合树脂的配制：将CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比1.2∶1.2∶2.3∶1.2∶3.2∶2.3混合，悬溶于等体积的蒸馏水中制备成混合树脂溶液。(2)混合树脂吸附：在进行纤维堆囊菌发酵时，向5000ml液体培养基中添加1％(体积/体积)的混合树脂进行吸附，吸附剂存在于整个发酵流程之中，发酵结束后，过滤制得沉淀的吸附树脂混合物，备用。(3)固液分步萃取：

①使用20倍体积的甲醇对步骤(2)获得的树脂混合物进行萃取，保温50℃，28小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；

②将第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温30℃，26小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物；

③将第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用20倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温30℃，28小时，离心收集沉淀，使用10％体积比的正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物；(4)分子筛层析：将上述第三部分萃取物重溶于2倍体积甲醇，以5％柱床体积的加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离；流动相为二氯甲烷，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm，埃博霉素的洗脱体积为2.1倍柱体积；(5)结晶：将步骤(4)的收集样品制备成丙酮与2-丁酮等体积混合的过饱和溶液，利用结晶器(结晶器构造见附图2)制备和收集结晶；方法是将恒温槽加热至60℃，将样品放入结晶皿中，保温15分钟，至样品全部溶解，然后开始梯度降温，速率为1.5℃/30分钟，降温至40℃后，改用溶剂蒸发法，恒温浓缩液体体积至原始体积的十分之一，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分离：若获得完全纯化的埃博霉素A或B，可采用高效液相进行埃博霉素A和B混合物分离，使用反相半制备柱(Hypersil ODS2 C18)，规格为250×8mm，填料粒径10μm，流速为2ml/min，249nm检测，柱温24℃，进样量100μl，检测时间30min，流动相为65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滞留时间为9.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为11.1分钟；收集后即可获得纯化的埃博霉素A或B。

在本发明的方法中，混合树脂对于埃博霉素的吸附率为99.5％，完成结晶步骤时，埃博霉素的提取率为90％，纯度为97％，完成高效液相分离后，埃博霉素A和B的提取率为89％，纯度为99.97％。

附件1：提纯后的埃博霉素A和B的体外抗肿瘤活性实验报告

                           检测报告书样品名称：提纯后的埃博霉素(Epothilone)A和B送检单位：山东大学生命学院位生物技术国家重点实验室送检人：李越中检测目的：检测两样品是否能够在体外杀死肿瘤细胞Hela和Bel-7402收样日期：2001.5.29          报告日期：2001.6.8样品：(1)缓冲液对照样；(2)埃博霉素A；(3)埃博霉素B。检测方法：MTT法检测结果报告如下：测试细胞株：Hela

样品浓度	1000ng/ml	100ng/ml	50ng/ml	10ng/ml	5ng/ml	1ng/ml
							样品(1)	-	-	-	-	-	-
样品(2)	+	+	+	-	-	-
							样品(3)	+	-	+	-	+	-

测试细胞株：Bel-7402

样品浓度	1000ng/ml	100ng/ml	50ng/ml	10ng/ml	5ng/ml	1ng/ml
							样品(1)	-	-	-	-	-	-
样品(2)	+	+	-	-	-	-
							样品(3)	+	+	+	-	-	-

结论：(2)号样品在浓度大于50ng/ml时，可以杀死两种肿瘤细胞；(3)号样品在浓度大于10ng/ml时，可以杀死两种肿瘤细胞。两样品均具有明显的体外抗肿瘤活性。附件2：提纯后的埃博霉素A和B的促微管聚合活性实验报告

                          检测报告书样品名称：提纯后的埃博霉素(Epothilone)A和B送检单位：山东大学生命学院位生物技术国家重点实验室送检人：李越中检测目的：检测两样品是否能够在无GTP条件下促进微管的体外聚合收样日期：2001.6.2             报告日期：2001.6.16样品：(1)缓冲液对照样；(2)埃博霉素A；(3)埃博霉素B。检测方法：变温紫外分光光度法检测结果报告如图9所示。结论：(2)号和(3)号样品均能在不存在GTP的情况下，明显的促进微管再体外的聚合作用，而且(3)号样品的活性高于(2)号样品。

Claims (10)

1.一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，该方法具体步骤顺序如下：

(1)混合树脂的配制：将CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合，悬溶于等体积的蒸馏水中，制备成混合树脂溶液；

(2)混合树脂吸附：在进行粘细菌发酵时，向液体培养基中添加0.1％-5％(体积/体积)的上述混合树脂进行吸附，吸附剂存在于整个发酵流程之中，发酵结束后，过滤制得沉淀的吸附树脂混合物，备用；

(3)固液分步萃取：①使用10-20倍体积的甲醇对步骤(2)获得的树脂混合物进行萃取，保温30-50℃，24-48小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；②将第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物，③将第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心收集沉淀，使用10％体积比的正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物；

(4)分子筛层析：将上述第三部分萃取物重溶于2倍体积甲醇，以2-5％柱床体积的加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离；流动相为甲醇或二氯甲烷，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm，埃博霉素的洗脱体积为1.5-2.5倍柱体积；

(5)结晶：将步骤(4)的收集样品制备成酮类的过饱和溶液，利用结晶器制备和收集结晶；方法是将恒温槽加热至45-60℃，将样品放入结晶皿中，保温15-30分钟，至样品全部溶解，然后开始梯度降温，速率为0.5～3℃/30分钟，降温至35-40℃后，改用溶剂蒸发法，恒温浓缩液体体积至原始体积的十分之一，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素A和B的混合物；

(6)高效液相分离：若获得完全纯化的埃博霉素A或B，可采用高效液相进行埃博霉素A和B混合物分离，使用反相半制备柱(Hypersil ODS2 C18)，规格为250×8mm，填料粒径10μm，流速为2ml/min，249nm检测，柱温24℃，进样量100μl，检测时间30min，流动相为65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滞留时间为9.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为11.1分钟；收集后即可获得纯化的埃博霉素A或B。

2.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(1)所述的CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂混合的重量比是1∶1∶2∶1∶3∶2。

3.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(2)所述的进行吸附用混合树脂添加量为液体培养基体积比的0.5％-2％。

4.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(3)所述的①中，最适宜的萃取温度为35-40℃。

5.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(3)所述的②中，最适宜的萃取温度为22-25℃。

6.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(3)所述的③中，最适宜的萃取温度为25-28℃。

7.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(4)所述的最适加样量为2.5-3.8％柱床体积。

8.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(4)所述的埃博霉素的洗脱体积，在使用甲醇为流动相时，洗脱体积为1.8-2.3倍柱体积；在使用二氯甲烷为流动相时，洗脱体积为1.5-2.1倍柱体积。

9.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(5)所述酮类的过饱和溶液是2-丁酮或者丙酮中的一种或两种。

10.如权利要求1所述的一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，其特征在于，步骤(5)所述的梯度降温的最适速率为0.5～1℃/30分钟。

Images