CN114214406A - 一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的三联标志物及其应用 - Google Patents
一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的三联标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明创造提供了一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的三联标志物及其应用。本发明聚焦“PTRF通过NEAT1调控NF‑κB/PD‑L1轴促进胶质瘤免疫逃逸的机制预测胶质瘤免疫治疗反应性的三联标志物”，为逆转GBM免疫抑制使之响应免疫治疗并提高免疫治疗疗效提供新思路，也为GBM的治疗提供新方法和分子靶点。
Description
技术领域
本发明创造属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的三联标志物及其应用。
背景技术
脑胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的原发恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤(GBM)恶性程度最高，患者预后最差，五年生存率低于10％。尽管有包括外科手术、放射治疗和化学治疗的综合性标准治疗方案，患者在最初诊断后的中位生存期仅为12-14个月。寻找有效的治疗方法，改善患者预后，是目前临床科研工作者面临的紧迫任务。近年来，胶质瘤的免疫治疗受到人们的广泛关注，但目前尚没有关于GBM有效的免疫治疗方法。因此，阐明胶质瘤免疫微环境调控的潜在机制能为GBM提供新的治疗策略。
免疫治疗，尤其靶向作用于程序性死亡受体1(PD-1)/PD-1配体(PD-L1)进行免疫检查点的阻断，已经从根本上改变了多种肿瘤的治疗方法。然而，在GBM患者中靶向PD-1/PD-L1临床效果仍然有限。大多数GBM患者对靶向PD-1/PD-L1耐药，只有少数患者对这种免疫治疗有反应。PD-1/PD-L1阻断的反应与肿瘤细胞中PD-L1的表达水平相关。先前的研究表明，PD-L1蛋白水平与胶质瘤分级相关，肿瘤细胞PD-L1水平的升高有助于胶质瘤患者的免疫逃避。为了增强胶质瘤免疫治疗的有效策略，GBM中PD-L1调节的潜在机制需要进一步研究。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的三联标志物及其应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的标志物，所述标志物包括PTRF、NEAT1和PD-L1。
优选的，所述肿瘤为胶质瘤。
更优选的，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
第二方面，本发明提供一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的产品，所述产品中含有定量检测权利要求1所述的标志物的试剂。
优选的，所述产品包括检测试剂盒、多聚酶链反应试剂、芯片检测试剂或测序试剂。
优选的，所述定量检测权利要求1所述的标志物的试剂为能够定量检测PTRF、NEAT1和PD-L1的引物或探针。
优选的，所述肿瘤为胶质瘤。
更优选为胶质母细胞瘤。
第三方面，本发明提供一种抑制PTRF、NEAT1和PD-L1表达的物质在评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后中的应用。
优选的，所述肿瘤为胶质瘤。
更优选为胶质母细胞瘤。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
本发明研究发现PTRF在GBM免疫微环境中发挥重要作用，同时也发现PTRF作为一种新型RNA结合蛋白。基于GBM原代细胞PTRF的RIP-seq结果，本发明聚焦“PTRF通过NEAT1调控NF-κB/PD-L1轴促进胶质瘤免疫逃逸的机制预测胶质瘤免疫治疗反应性的三联标志物”，为逆转GBM免疫抑制使之响应免疫治疗并提高免疫治疗疗效提供新思路，也为GBM的治疗提供新方法和分子靶点。
附图说明
图1为PTRF促进GBM免疫抑制，并调控PD-L1蛋白的表达结果图；
图2为PTRF作为RNA结合蛋白结合并稳定长链非编码RNA NEAT1结果图；
图3为PTRF-NEAT1通过组蛋白H3K27甲基化调控UBXN1激活NF-κB的活性结果图；
图4为PTRF通过NEAT1调控UBXN1/NF-κB轴促进GBM增殖结果图；
图5为PTRF通过NF-κB增强PD-L1转录并且促进GDM细胞免疫抑制结果图；
图6为PTRF、NEAT1和PD-L1在GBM中作为预测胶质瘤免疫治疗反应性的三联标志物结果图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
本发明聚焦“PTRF通过NEAT1调控NF-κB/PD-L1轴促进胶质瘤免疫逃逸的机制预测胶质瘤免疫治疗反应性的三联标志物”，为证实这一机制通路，拟从表观遗传调控角度，进行以下四个实施例的试验进行验证：
实施例1确定PTRF对PD-L1的调控关系，促进GBM免疫微环境的抑制
1、从美国癌症基因组图谱(TCGA)数据库选取539例GBM病人mRNA芯片；从中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)选取693例GBM病人mRNA芯片。
2、数据分析：
①通过相关性分析选取PTRF正相关(筛选标准R值R＞0.3)基因进行GO富集分析(采用https://david.ncifcrf.gov/在线软件对选取的PTRF正相关基因进行GO富集分析)。
②通过肿瘤纯度(混杂程度)分析确定PTRF与胶质瘤免疫抑制微环境是否相关。
③利用相关性分析确定PTRF与多个免疫治疗靶点(包括CTLA4、PD-L1和PDCD1)的相关性。
具体分析结果见图1，由图1A可以看出：PTRF正相关基因与胶质瘤免疫反应和T细胞活性密切相关，说明PTRF参与调节胶质瘤免疫反应和免疫细胞，同时PTRF与胶质瘤免疫抑制微环境相关。由图1B可以看出：PTRF与CD271(PD-L1)在胶质瘤病人数据库中的相关性为0.56。
3、PTRF与PD-L1的相关性研究：
首先，建立原代细胞系(N9和TBD0220)，其中，N9胶质瘤原代细胞源于北京天坛医院GBM手术病人，由北京师范大学樊小龙教授课题组培养建立原代细胞系并赠与用于实验研究。TBD0220原代细胞源于河北大学附属医院GBM手术病人，由发明人培养并建立原代细胞系，原代细胞的培养建立步骤如下：取临床切除的新鲜胶质瘤组织，使用无菌器械将组织剪成1×1cm大小，放入培养皿中，加入适量DMEM/F12含10％FPS的培养基，置于37℃恒温培养箱中，期间定时换液，细胞长满后进行传代收集，进行后续实验。
在原代细胞中借助慢病毒载体外源性过表达PTRF，进行如下操作和分析：
(1)分别提取N9原代细胞和TBD0220原代细胞的蛋白进行Western Blot分析检测蛋白水平PD-L1的表达变化
其中，细胞总蛋白提取具体步骤如下：
1)在提取蛋白前，先配制细胞蛋白裂解液，一般使用高效RIPA裂解液，添加PMSF使其终浓度为10mM，颠倒混匀，置于冰上待用。
2)去除培养基，使用无菌PBS清洗细胞三遍，向培养皿中添加含PMSF的RIPA裂解液。
3)将培养皿晃动使裂解液浸润细胞，然后置于冰上放置30分钟进一步裂解细胞。
4)使用移液枪将细胞裂解液混合物吸取到干净1.5mL的EP管，在4℃离心机中，12000rpm离心15分钟。
5)离心后，使用移液枪将细胞裂解上清转移到新的EP管中，进行BCA蛋白浓度检测，对细胞总蛋白进行定量。
Western blot蛋白免疫印迹实验具体步骤如下：
配制SDS-PAGE凝胶，按装置夹好胶板放入电泳槽中。加入电泳缓冲液，将样品加入相应的孔中，盖好电泳槽的盖子，连接电泳仪，设置为恒压80kv-100kv。大约90-120分钟，当上样缓冲液中的溴酚蓝跑出胶板底部时，即可终止电泳，进行转膜。将PVDF膜裁剪为大小为5×8cm的长方形膜，并用无水甲醇浸泡激活PVDF。配制转膜缓冲液，将转膜夹放入盘中，将胶板上的胶小心取下，置于转膜夹的海绵垫子和滤纸上，盖上已经激活的PVDF膜，再用另一层滤纸和海绵垫子将胶和PVDF膜覆盖，最后将夹子夹紧合上。将转膜槽放于冰上并倒入转膜缓冲液，将转膜夹按照正负极放入转膜槽相应的位置，盖上转膜槽的盖子，连接电泳仪并通电，将电压设置为80kv，时间为90分钟。配制牛血清白蛋白封闭缓冲液(BSA封闭液)，打开夹子将PVDF膜取出，置于含有5％BSA封闭液的封闭小盒中放在脱水摇床上缓慢摇动，室温孵育1-2小时进行封闭。按照抗体说明书的抗体使用浓度配制一抗工作液，将封闭液从封闭小盒中取出并回收，直接加入配好的一抗工作液，置于4℃摇床上，缓慢摇动过夜。转天，将一抗工作液回收，向PVDF膜加入PBST缓冲液，室温置于脱色摇床上快速摇动，清洗PVDF膜，时间8-10分钟，使用PBST清洗三次。配置相应种属的二抗工作液，待清洗PVDF膜最后一次后，将PBST缓冲液倒掉，重新加入二抗工作液，室温置于摇床上缓慢摇动，孵育1-2小时。将配制化学发光液进行Western blot PVDF膜曝光。
结果见图1C-1E，由图1C可以看出：在N9和TBD0220原代细胞中，Western Blot实验证明过表达PTRF升高PD-L1蛋白表达水平。
(2)分别提取N9原代细胞和TBD0220原代细胞的RNA进行RT-PCR分析检测mRNA水平PD-L1的表达变化
RNA提取操作步骤如下：
1)移除细胞培养基，使用无菌PBS清洗三次，加入Trizol提取试剂，室温静置5min，使用移液枪反复抽吸Trizol吹打细胞，移至无酶EP管中。
2)向EP管中加入五分之一Trizol体积的氯仿，上下颠倒，手动振荡30s，4℃离心机，12000rpm离心15min。
3)离心后将EP管从离心机中小心取出，管中液面分为三层，上层水相为RNA，下层有机相为蛋白质和DNA，小心吸取上层水相的RNA，至另一个无酶的EP管中。
4)向EP管中加入与水相RNA等体积的异丙醇，上下翻转混匀，室温静置10min。
5)将EP管放于4℃离心机中，12000rpm离心15min，取出EP管，可在离心管底部看到片状RNA沉淀，小心将上清倒掉。
6)向EP管中加入1mL 75％的乙醇，上下颠倒，涡旋振荡RNA沉淀30s。EP管于4℃离心机中12000rpm离心15分钟。
7)倒掉EP管中的上清，向EP管中加入1mL无水乙醇，上下颠倒，涡旋振荡RNA沉淀30s，4℃离心机，12000rpm离心15分钟。
8)弃去EP管中的上清，将EP管倒置于超净工作台中，通风干燥10-20分钟。
9)使用移液枪吸取20μL DEPC水溶解RNA沉淀。
荧光定量PCR实验步骤如下：
1)在NCBI使用Primer-BLAST设计引物并在数据库进行比对验证，之后找公司合成引物。
2)在qPCR八联管中按照10μL的2×SYBR Green qPCR混合物、1μL的基因上游引物(10μM)、1μL的基因下游引物(10μM)、2μL的模板DNA/cDNA、6μL的无核酸酶DEPC水总体积为20μL的配制混合液体系，然后使用
3实时荧光定量PCR系统进行荧光定量PCR实验。
3)每个样本分别设置三个重复，根据PCR实验的熔解曲线和CT值，通过ΔΔCT计算公式得出实验结果，以GAPDH为内参比较各组之间目的基因的相对表达水平。
由图1D可以看出：在N9和TBD0220原代细胞中，PCR实验证明过表达PTRF升高PD-L1mRNA表达水平。
(3)将N9原代细胞和TBD0220原代细胞消化成单细胞悬液进行流式染色检测原代细胞中PD-L1的表达水平变化，以确定PTRF对PD-L1的调控作用。
具体步骤如下：
1)将孔板从培养箱中拿出，使用PBS迅速清洗三遍，弃去PBS，向孔板中加入胰蛋白酶，待细胞消化下来后使用培养基终止消化。
2)将细胞悬液转移到流式管中，使用水平转子离心机，室温1000rpm离心5-8分钟。
3)PBS清洗，室温1000rpm离心5-8分钟，重复三遍，加入10％血清重悬细胞，室温30分钟进行封闭。
4)PBS清洗，室温离心5-8分钟，重复三遍，将抗体使用100-200μL细胞染色缓冲液稀释，重悬细胞沉淀，室温孵育30-40分钟。
5)PBS清洗，室温离心5-8分钟，重复三遍，使用100-200μL适宜浓度的荧光染色二抗将细胞沉淀重悬，室温避光孵育30分钟。
6)PBS清洗，室温离心5-8分钟，重复三遍，最后以100-200μLPBS将细胞沉淀重悬，使用BD流式细胞仪上机检测细胞染色蛋白的表达水平。
由图1E可以看出：在N9和TBD0220原代细胞中，流式细胞术分析证明过表达PTRF促进PD-L1表达水平的升高。
实施例2解析PTRF作为RNA结合蛋白参与稳定长链非编码RNA NEAT1的研究
1、RIP结合高通量测序分析：
将待测试的N9细胞进行交联后刮下，经过细胞裂解、蛋白免疫沉淀和RNA纯化实验步骤获得纯化RNA。按照RNA纯化说明书使用RNA-seq文库制备试剂盒建立cDNA文库，进一步应用于Illumina HiSeq X Ten系统进行测序分析。在N9细胞中进行PTRF-RIP测序分析操作过程如图2A所示。
2、PTRF与NEAT1的结合作用分析：
(1)将RIP-seq结果进行结合峰分析(基于三种方法ABLife、Piranha和CIMS)筛选出PTRF作为RNA结合蛋白结合的长链非编码RNA。
(2)在TCGA和CGGA数据库中使用相关性分析得到PTRF正相关的10个长链非编码RNA，如图2B所示，分别为NEAT1、RP11-230G5.2、MEG3、MEG8、LINC01583、AF127936.9、AC.58791.1、RP11-13N12.1、MIP222HG、FTX。
(3)将RIP-seq分析结果和数据库中PTRF正相关的10个长链非编码RNA进行Overlap的韦恩图分析，如图2C所示，得到结果仅有NEAT1。
(4)在两种原代细胞N9和TBD0220中进行RIP实验，利用RT-PCR进行验证PTRF作为RNA结合蛋白是否与NEAT1结合。
在TCGA和CGGA数据库中分析NEAT1的表达对胶质瘤患者生存的影响，结果见图2D，可以看出NEAT1表达水平高的患者生存时间更短，NEAT1表达水平低的患者生存时间更长。在TCGA和CGGA数据库中分析胶质瘤样本中PTRF与NEAT1的相关性，结果见图2E，可见PTRF与NEAT1具有相关性。在N9和TBD0220原代细胞中进行RIP实验，利用RT-PCR进行验证，结果如图2F所示，结果显示PTRF作为RNA结合蛋白可以与NEAT1结合。
(3)PTRF调控NEAT1的RNA稳定性。
在细胞中过表达PTRF和敲低PTRF，通过RT-PCR实验检测RNA水平NEAT1的变化。
具体操作步骤如下：
使用GV348载体构建的PTRF过表达慢病毒载体转染N9和TBD0220原代细胞。使用敲低PTRF慢病毒载体转染N9和TBD0220原代细胞。RT-PCR实验步骤同实施例1。
进一步利用放线菌素D(1μM)按时间梯度处理过表达PTRF的细胞，运用RT-PCR实验与对照组细胞的NEAT1水平对比，分析PTRF对NEAT1稳定性的影响。
具体操作步骤为：将放线菌素D配置成1mM浓度，将细胞铺在6孔板中，每毫升培养基中加入1微升放线菌素D，将一定培养基加入培养板中，分别培养2，4，6和8小时，然后收集细胞进行实验。RT-PCR实验步骤同实施例1。
结果见图2G和2H，由图2G可以看出：在N9和TBD0220原代细胞中过表达PTRF促进NEAT1的表达；由图2H可以看出：敲低PTRF降低NEAT1的表达使用放线菌素D(1μM)按时间梯度处理细胞发现，过表达PTRF抑制了NEAT1 RNA的降解，提高了其稳定性。
实施例3PTRF通过NEAT1介导H3K27me3修饰，抑制UBXN1表达并激活NF-κB活性的体内体外研究
(1)利用ChIP(按照Magna ChIP试剂盒说明书使用)和RT-PCR实验验证PTRF/NEAT1的靶基因。通过Western blot实验确定UBXN1受PTRF通过NEAT1(稳定PRC2复合物)介导的组蛋白(H3K27me3)修饰所调控。
结果见图3，由图3A和3B可以看出：在N9和TBD0220原代细胞中过表达PTRF抑制了UBXN1的表达；敲低PTRF或者NEAT1促进了UBXN1的表达。使用ChIP结合RT-PCR实验验证UBXN1可以作为PTRF和NEAT1下游调控的靶基因(结果如图3C和3D所示)。通过Western blot实验验证PTRF通过NEAT1调控了UBXN1的表达(结果如图3E和3F所示)。
(2)PTRF-NEAT1激活NF-κB信号通路：
在细胞分子生物学水平，通过Western blot、RT-PCR和荧光素酶报告实验验证NF-κB信号通路及其下游靶基因能被PTRF/NEAT1激活。
具体操作步骤为：采用常规方法构建PGL3-Basic-PD-L1野生型(WT)和PGL3-Basic-PD-L1-MUT突变型(Mut)的荧光素酶报告质粒，将N9和TBD0220细胞接种于96孔板中，野生型(WT)或突变型(Mut)的报告质粒用lipo3000转染试剂转染。转染48小时后，通过荧光素酶报告分析系统计算相对荧光素酶活性。用PBS洗两遍，然后加入溶液萤火虫荧光素底物，37度孵育半小时后酶标仪检测荧光强度。使用BCA蛋白浓度检测法测定相应蛋白水平用于最后荧光强度的定量。
结果见图3，由图3E和3F可以看出：在N9和TBD0220原代细胞中过表达PTRF促进NF-κB信号通路的激活，敲低PTRF或者NEAT1阻断NF-κB信号通路。由图3G可以看出：过表达PTRF促进NF-κB转录信号的激活，敲低NEAT1阻断PTRF激活的NF-Kb转录活性。由图3H可以看出：过表达PTRF促进NF-κB信号通路下游靶基因的激活。
(3)体内动物实验验证PTRF/NEAT1/NF-κB轴：建立人源性GBM原位异种移植模型(PDX)，通过慢病毒系统进行PTRF过表达及NEAT1敲低，结合小鼠活体成像、小鼠生存观察、HE染色和免疫组织化学染色检测PTRF/NEAT1/NF-κB轴在胶质瘤中促进肿瘤生长的作用。
具体操作步骤如下：
将肿瘤组织使用无菌器械取下，然后将胰蛋白酶和无菌PBS按1：1稀释并加入DNA酶配成消化液。使用无菌眼科剪，将肿瘤组织块剪成小米粒大小，然后加入消化液放入大皿置于37℃培养箱中，消化1-2小时，每隔15分钟镜下观察消化情况并使用移液枪吹打。待消化后，将消化混合物加入到40μm细胞过滤网中过滤单个肿瘤细胞，将细胞悬液加入到15mL离心管中，室温1000rpm离心10分钟。将上清弃除，使用PBS将细胞沉淀重悬，向肿瘤细胞悬液中加入过表达PTRF慢病毒(慢病毒购于上海吉凯基因化学技术有限公司)以及荧光素酶慢病毒，37℃培养箱反应4小时左右。将转染过表达PTRF慢病毒载体或者敲低NEAT1慢病毒载体和荧光素酶的细胞收集至15mL离心管中，1000rpm离心十分钟，去除上清，使用无菌PBS重悬洗涤细胞并离心。计数细胞，将细胞数量调成至合适密度，移至无菌1.5EP管中1000rpm离心10分钟。
取免疫小鼠称重，使用5％水合氯醛按照小鼠三倍体重(μL)腹腔注射将小鼠麻醉。使用碘伏消毒清洁小鼠头部皮肤，使用无菌手术刀沿头部中线右侧2-3mm切开皮肤，颅骨暴露，取前后囟门中线中点偏右1-2mm处使用针头钻穿颅骨。将小鼠固定到立体定位仪上，使用量程为10μL的微量注射器，吸取3μL细胞悬液，将微量注射器架在立体定位仪上。将微量注射器针头插入颅骨钻孔中，沿针孔插入3.5mm然后后退1mm，然后启动注射泵按照1μL/分钟速度缓慢注射细胞悬液。待注射完成后，静置1分钟，然后使用碘伏消毒颅骨，使用缝合针将切口缝合整齐，再次消毒皮肤，将小鼠放回SPF级动物饲养室。
结果见图4，由图4A可以看出：荷瘤小鼠活体成像荧光定量证明，过表达PTRF促进肿瘤的生长，其作用可以被敲低NEAT1所阻断。由图4B可以看出：过表达PTRF的荷瘤小鼠中生存时间最短，敲低NEAT1可以抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存时间。由图4C和4D可以看出：通过对肿瘤组织进行HE和免疫组织化学染色验证PTRF/NEAT1/NF-κB轴在胶质瘤中促进肿瘤生长的作用。
实施例4PTRF通过NF-κB进一步转录调控PD-L1促进免疫逃逸的研究
(1)确定NF-κB转录激活PD-L1：在PD-L1的启动子区寻找NF-κB的转录结合位点，通过构建野生型和突变型两种NF-κB荧光素酶报告质粒(操作方法同实施例2)并结合CHIP和荧光素酶报告实验确定NF-κB转录激活PD-L1及结合位点。
结果见图5，由图5A可以看出：通过CHIP实验验证NF-κB在PD-L1的启动子区存在的潜在转录结合位点。图5B为NF-κB在PD-L1的启动子区的转录结合位点示意图。由图5C和5D可以看出：通过构建野生型和突变型两种NF-κB荧光素酶报告质粒并结合CHIP(5D)和荧光素酶报告实验(5C)进一步确定了NF-κB可以转录激活PD-L1及转录结合位点。
(2)检测PTRF/NEAT1对GBM细胞免疫功能的影响：
1)通过流式细胞术和免疫荧光检测肿瘤细胞PD-1结合能力。
原代细胞中过表达PTRF以及敲低NEAT1。使用GV348载体构建的PTRF过表达慢病毒载体转染N9和TBD0220原代细胞。使用NEAT1 siRNA转染N9和TBD0220原代细胞敲低NEAT1。
具体操作步骤如下：
当细胞密度至70-90％汇合度时进行转染，在生物安全柜中进行操作。在1.5mL的无菌EP中加入无血清培养基，加入Lipofectamine3000试剂进行充分混匀。在另外一个1.5mL的无菌EP中加入无血清培养基，加入siRNA制成预混液，然后加入相应的P3000试剂充分混匀。然后在稀释Lipofectamine 3000试剂的1.5mL EP管中以1:1比例加入稀释的siRNA，室温孵育5-10分钟。向相应的细胞培养皿中加入siRNA脂质体复合物，细胞在37℃二氧化碳培养箱中孵育2-4天，然后对转染细胞进行相应的分析实验。
由图5E和5F可以看出：流式细胞术验证过表达PTRF可以促进肿瘤细胞PD-1结合能力。由图5G和5H可以看出：免疫荧光实验验证过表达PTRF可以促进肿瘤细胞PD-1结合能力。
(2)利用体外T细胞杀伤实验分析PTRF/NEAT1对GBM细胞的免疫反应的影响。由图5I可以看出：体外T细胞杀伤实验验证过表达PTRF抑制GBM细胞免疫反应，敲低NEAT1逆转PTRF引起的免疫抑制微环境。
(3)收集临床GBM病人组织样本，以免疫组织化学和原位杂交技术联合多种生物标志物检测为手段，研究PTRF、NEATI、p-NF-κB、PDL1和CD8+T细胞的表达空间特征。
具体操作步骤为：
1)石蜡切片脱蜡水化，配制EDTA缓冲液，加入抗原修复盒中置于微波炉里加热至沸腾，将组织切片插入抗原修复盒中，持续时间为15min，置于室温冷却。
3)向组织滴加适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育反应10min。
4)将阻断剂去除，加入PBS溶液，室温摇动5min冲洗三次。滴加适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育反应40分钟至1小时。
5)反应完成后，弃去血清，向组织滴加适量一抗，置于湿盒中，4℃过夜孵育反应。
6)将一抗稀释液回收，加入PBS溶液，室温摇动5min冲洗三次，滴加适量的生物素标记山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育反应40分钟至1小时。
7)将生物素标记山羊抗兔IgG聚合物弃去，加入PBS溶液，室温摇动5min清洗三次，滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，室温孵育反应40分钟至1小时。
8)加入适量新鲜配制的DAB显色液，室温孵育，计时直至镜下观察出现阳性染色。
9)使用苏木素染色液室温孵育反应5分钟，PBS溶液冲洗，盐酸酒精分化，氨水反蓝。
10)将组织石蜡切片脱水透明，使用中性树胶封片。
结果见图6，由图6A可以看出：免疫组织化学染色在病人组织样本中验证PTRF高表达病人NEATI、p-NF-κB和PDL1表达水平增加。由图6B可以看出：单因素和多因素回归分析验证PTRF-NEAT1-CD274(PD-L1)可以作为胶质瘤预后因子。由图6C可以看出：在公共数据库中通过PTRF-NEAT1-PD-L1三者表达水平可以区分患者的预后和预测免疫反应。
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7、Han Yao1,9,Jiang Lan2,9,Chushu Li1,9,Hubing Shi2,9,Jean-PhilippeBrosseau3,Huanbin Wang1，Haojie Lu4，Caiyun Fang4，Yao Zhang1,Lunxi Liang1,5,Xiaolin Zhou6,Chaojun Wang7，Yu Xue8，Yun Cui1 and Jie Xu1.Inhibiting PD-L1palmitoylation enhances T-cellimmune responses against tumours.
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的标志物，其特征在于：所述标志物包括PTRF、NEAT1和PD-L1。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于：所述肿瘤为胶质瘤。
3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于：所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
4.一种用于评价肿瘤患者免疫治疗反应性和评估肿瘤预后的产品，其特征在于：所述产品中含有定量检测权利要求1所述的标志物的试剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述产品包括检测试剂盒、多聚酶链反应试剂、芯片检测试剂或测序试剂。
6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述定量检测权利要求1所述的标志物的试剂为能够定量检测PTRF、NEAT1和PD-L1的引物或探针。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为胶质瘤，优选为胶质母细胞瘤。
8.抑制PTRF、NEAT1和PD-L1表达的物质在评价肿瘤患者免疫治疗反应和评估肿瘤预后中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为胶质瘤。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
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