CN114192200A - 用于将含水液体分离到至少两个腔中的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中的方法、具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在这种方法中的用途以及一种用于将含水液体分离到至少两个腔中的系统。

Description

用于将含水液体分离到至少两个腔中的系统和方法

技术领域

一般而言，本发明涉及用于将例如包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔(例如可应用于诊断测定中的微流体装置)中的系统和方法的技术领域，其中通常目标是能够在通常为一次性装置形式的同一微流体装置上进行一个或多个测试样品的多种不同测定。因此，可以实现在单个分析过程中用多种不同试剂独立地分析一个或多个测试样品，其中仅需要少量的测试样品。

更详细地，本发明涉及一种用于将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中的方法、具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在这种方法中的用途以及一种用于将含水液体分离到至少两个腔中的系统。

特别地，本发明涉及一种用于将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中的改进系统和方法，利用该改进系统和方法能尽可能彻底和尽可能高效地分离一定体积的样品液体。

背景技术

在诊断测定技术领域中，通常需要使诊断测定更快、更便宜和更简单地进行，同时实现常规实验室过程的精度及效率。为了实现这一有利目标，人们已经付出了大量努力来实现各种测定操作的小型化和集成化，以便能够增加单个装置上的平行测定的数量。

一些类型的分析基于在独立的反应体积中对样品进行多次独立分析。迄今为止，执行此类独立的反应有两个主要概念：要么是样品的大量基本上含水的液滴中，这些液滴被不可混溶的流体(例如油)隔开，要么是通过在支撑件中的多个反应室中进行独立的反应，其中这些独立的反应至少部分地被反应室的部件隔开。

此类小型化的反应室可用于分析各种生物材料，诸如蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。如今，存在包括仅几个(诸如96个)到成千上万个反应室的各种尺寸的此类微流体装置，诸如数字聚合酶链式反应技术的微流体芯片。

这些微流体装置提供了微米规模通道以接收可流/可流动液体形式的微升或纳升规模样品。通常，此类微流体装置的特征在于具有提供分离空间的至少一个空隙以及与空隙流体连接并被分离空间分离的至少两个腔。

通常，为了进行诊断测定，诸如PCR测定，最初将微流体装置用通常包含生物样品的含水液体填充，其中借助移液管、泵、流体静压、压差、毛细管力等例如经由入口开口引入含水液体。此后，通常将分离流体例如通过入口开口引入流动通道中，该流动通道首先将任何剩余的含水液体推到任何剩余的空腔中，并且覆盖填充的腔，由此将各个腔与它们的周围环境流体地分离，特别是将彼此流体地分离，以便避免任何交叉污染或粘染。在完成最初的填充过程和随后的分离过程(也称为密封过程)之后，通常使微流体装置经历分析步骤，诸如测定含水液体中生物材料的不存在、存在、活性或浓度。因此，每个含有一种或多种目标物的腔通常将产生正信号，其中在例如热循环之后，正信号与负信号的比率将允许例如借助发光或荧光测试测量精确地计算样品中的初始目标物浓度。此类技术允许在独立的反应体积中以小型化的规模同时进行多个测定。这种分析的实例是“数字”PCR、数字等温扩增、数字RT-PCR和其他基于数字酶的反应。

因此，为了进行这种类型的分析，一方面需要装置和方法来容易地将样品分配到多个小型化的腔中，并且需要在随后的分析步骤(诸如像例如PCR的反应)中保持腔紧密地密封。

在任何情况下，保持所有或高百分比的腔分离是至关重要的。所谓“分离”，是指在一个腔中发生的反应不影响其他通常相邻的腔的反应或结果。相邻的反应室之间的交叉污染被称为“泄漏”，其进一步的同义词是串扰或残留。泄漏意味着含水液体没有完全分离到腔中。相反，至少两个腔之间的含水膜仍然连接这两个腔的含水液体，并允许一个腔的组分交换到另一个腔中。泄漏会对结果的质量产生负面影响，因为阳性反应的数量与没有泄漏的情况不再相同。

泄漏有时可能由含水液体的不完全不润湿引起，即当引入分离液体(目前通常为有机硅油)并且留下连接若干腔的残余含水膜时。

现有技术的用于将含水液体分离到至少两个腔中的常用分离液体是例如与待分离的流体介质样品基本上不混溶的那些，诸如树脂、单体、矿物油、有机硅油、氟化油以及优选地基本上不与水混溶的其他流体(US6143496A)。其他实例是轻质矿物油、氟化流体、氟化醇、Fluorinert、

DEC或它们的组合(参见WO 2019/144050 A2)。

在US 9309557 B2中，描述了用于核酸扩增的方法，所述方法包括形成反应混合物，以及使反应混合物经受适于核酸扩增的条件。在示例性方法中，将含水溶液施加到限定孔阵列的结构的孔中。可以通过在孔上方提供不混溶流体来分离孔中的含水溶液。示例性不混溶流体包括矿物油、有机硅油(例如聚(二甲基硅氧烷))、庚烷、碳酸酯油(例如碳酸二乙基己酯(Tegosoft DEC.RTM.))或它们的组合。

然而，现有技术的油仍然具有以下缺点：当在用于将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中的方法中用作分离液体时，它们会导致泄漏。

本发明的目的是提供一种分离液体，其具有改进的将含水液体分离到腔中因此相邻腔中的反应之间的交叉污染减少的性质。

令人惊讶地，已经发现至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成的分离液显示出优异的将含水液体分离到腔中的性能。

如下面的实施例所示，当用于将含水液体分离到不同的腔中时，测试的所有参考液体都显示出频繁至偶然的泄漏，即在装置的1％至100％的腔中发生。相比之下，根据本发明的所有分离液体具有低得多的泄漏率，仅在0％至0.1％的腔中发生，因此使得泄漏减少至少10倍。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供装置，该装置具有提供分离空间的至少一个空隙，以及与空隙流体连接并被分离空间分离的至少两个腔；

b)向至少两个腔中的每一个腔供应含水液体；以及

c)向分离空间供应用于将含水液体分离到至少两个腔中的分离液体；以及任选地，

d)分析含水液体，优选地其中分析含水液体的步骤包括确定含水液体中生物材料的不存在、存在、活性或浓度，

其中步骤c)中的分离液体至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。

本发明的第一方面的方法涉及将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中。

术语“含水液体”描述了包含水的任何液体。例如，含水液体可包含本领域技术人员已知的任何液体物质，其可与水混溶并且通常适于包含处于适于分析的状态或处于其天然状态的生物材料。此外，含水液体可包含一种或多种液体物质，这些液体物质在使用浓度下是水混溶性的。

合适的液体物质是本领域技术人员熟知的，包括例如水、甘油、二甲基亚砜(DMSO)和/或N,N-二甲基-甲酰胺。

优选地，用于根据本发明的第一方面的方法中的含水液体包含按体积计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％的水。此外，含水液体还可包含水作为唯一的液体物质。

含水液体还可包含允许分析生物材料的试剂。术语“试剂”描述了添加到含水液体中以引起或支持适于分析生物材料的化学反应的任何物质或化合物。此类试剂通常取决于待分析的生物材料的种类(诸如核酸、蛋白质等)以及用于分析生物材料的测定法。

例如，含水液体可包括例如适于生物材料分析诸如PCR的缓冲溶液。合适的缓冲液是本领域技术人员熟知的，诸如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液。

含水液体还可包含有机酸或无机酸和/或有机盐或无机盐，诸如包含镁的盐(例如Mg²⁺，诸如MgCl₂)。含水液体还可包含适于装置的分析或润湿原因的表面活性剂，诸如Tween20、SDS(十二烷基硫酸钠)、十二烷基麦芽糖苷或CHAPS。

此外，含水液体可包含本领域技术人员已知的适于分析生物材料或分析生物材料必需的其他物质，诸如酶(例如聚合酶或逆转录酶)、生物材料的稳定剂、酶抑制剂(例如用于抑制靶向生物材料的酶，诸如DNase、RNase或蛋白酶活性，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA))、dNTP、抗体或其片段、引物、三磷酸核苷或适于检测生物材料的标记物和探针(例如荧光或发光标记物)。

例如，对于PCR或等温扩增反应，可将包含核酸的含水液体例如与聚合酶、逆转录酶、酶抑制剂(例如用于抑制DNase或RNase活性，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA))、抗体或其片段、引物和/或三磷酸核苷或标记物(例如荧光或发光标记物)组合。

在本发明的第一方面的另一优选实施方案中，含水液体包含允许分析生物材料的试剂。

术语“生物材料”描述了可能是感兴趣的分析物的任何种类的有机物质。合适的生物材料可具有天然来源或可人工产生。合适的生物材料可包括例如核酸、氨基酸或糖，它们可作为单一分子存在或可进一步连接到较大的核酸结构、肽、蛋白质或者任何大小或长度的二糖、寡糖或多糖。例如，生物材料可包括任何种类的单链或双链DNA(例如cDNA)、单链或双链RNA(例如mRNA、miRNA或siRNA)、蛋白质、肽、多糖或它们的混合物。生物材料还可包括由这些组分组合而成的分子。

作为这种生物材料，通常使用生物测试样品，它们通常由医务人员从患者身上取出用于实验室分析，例如用于确定所取出的样品内不同组分的浓度水平。

生物材料还可以来源于任何生物源，诸如生理液体，包括血液、血清、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、粪便、精液、乳汁、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、羊水、组织、培养细胞等，其中可以特别怀疑样品含有某种抗原或核酸。

优选地，包含生物材料的含水液体是生物样品，更优选地从人分离并且/或者是血液、血清、组织、唾液、尿液或粪便样品。

本发明的第一方面的含水液体中生物材料的合适浓度是本领域技术人员熟知的。例如，本发明的第一方面的含水液体可包含例如1至20ng/μlDNA或RNA，但单一分子也可以是足够的，或0.003-15mg/ml蛋白质，或例如0至约1分子分析物/腔体积。

步骤a)

根据本发明的第一方面的方法包括步骤a)，该步骤包括提供装置，该装置具有提供分离空间的至少一个空隙，以及与空隙流体连接并被分离空间分离的至少两个腔。

术语“装置”描述了本领域技术人员已知的适于执行根据本发明的第一方面的方法的任何装置，诸如单载体装置(例如微流体装置，诸如微流体芯片)。这些通常提供了接收可流动含水液体形式的微升或纳升规模样品的微米规模通道和微米规模反应区域。

通常，该装置包括两部分，例如微流体装置可以呈现由至少顶部层和底部层组成的结构，其中顶部层或底部层可以提供一个或多个反应区域阵列、入口和出口开口。

空隙在顶部层和底部层之间建立并与反应区域阵列流体连接，这些反应区域阵列可以以至少两个腔(诸如微孔或纳孔)的形式实现，从而使微流体装置成为例如微孔或纳孔板形式的微流体芯片。例如，整个空隙的宽度(也称为巷道宽度)可以在0.5mm与20mm之间的范围内，诸如为6.4mm，优选地在1mm与10mm之间，这通常在宽度上(即在空隙的横向方向上)提供彼此相邻的约1至100个腔/mm宽度、最典型地4至40个腔/mm宽度的空间。

用于将包含生物材料的含水液体分离到至少两个腔中的合适装置是本领域技术人员熟知的。优选地，该装置是可消耗/一次性的形式。同样优选地，该装置适于分析生物材料诸如PCR的方法。此外，该装置可由适于检测在分析含水液体期间出现的荧光或发光信号的透明材料诸如塑料或玻璃制成。作为用于该装置诸如微流体装置(即用于装置层)的材料，可以使用诸如环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)等的材料，其中例如由于成本考虑，使用COP是优选的。

空隙提供了被布置成与至少两个腔流体连接的分离空间。通常，如果空隙供应有含水液体，则空隙的尺寸适于产生毛细管力，并且毛细管力足以用含水液体填充分隔空间和腔。整个空隙的高度可以在10μm至1mm的范围内，优选地介于40μm与400μm之间。此外，整个空隙的长度可以在1mm至200mm的范围内，优选地介于10mm与120mm之间。

该装置还包括至少两个腔，这些腔可构成所谓的结构化区域，其中腔为微结构或纳结构。例如，腔的面积可具有6mm×85mm的尺寸。优选地，腔被布置在空隙的底部处，即在与盖相对的一侧上。通常，腔固定并分离含水液体，从而为含水液体提供储存库和/或反应容器。

至少两个腔和分隔空间的表面可以是亲水性的和/或疏水性的。优选地，至少两个腔和/或分隔空间具有亲水性表面。

腔可具有0.01至1μl的体积。优选地，腔具有0.02至200nl、更优选0.05至50nl并且最优选0.1至5nl的体积。例如，腔可具有0.1nl、1nl或3nl的体积。腔的长度×宽度×深度可为0.2mm×0.1mm×0.16mm、0.15mm×0.07mm×0.12mm或0.06mm×0.03mm×0.06mm。

腔可具有可适于完全填充有液体并且仅具有允许剩余气泡的低风险的任何形状。每个腔的开口的横截面积可以具有圆形、椭圆形或多边形，诸如六边形。对于腔开口的多边形，特别是对于腔开口的六边形，可以将腔开口布置成以彼此之间具有较小的距离，即诸如通过蜂窝布置来实现腔开口在空隙内的分布密度增加。因此，板的孔阵列中腔的数量可以进一步最大化。此外，腔开口的宽度(包括孔之间的中间空间)可以为60μm≤w≤110μm，诸如62μm(小孔)≤w≤104μm(大腔)。

该装置的腔的数量优选地为每个装置至少96个、更优选至少1,536个、甚至更优选至少10,000个并且最优选至少100,000个。例如，该装置可具有20,000、30,000或100,000个腔。

实例是进行一个样品为40μl体积的20’000个d-PCR反应，或进行形成10μl体积的100’000个反应。但是，事实上，反应的总数量可以为非常低至几百万，每个样品的总体积形成1μl至几个100μl。

术语“流体连接”描述了两个空间没有被可阻碍填充到这些空间中的一个空间中的液体流动到另一个空间的任何种类的障碍彼此隔开。因此，表述“与空隙流体连接的至少两个腔”描述了至少两个腔没有被可能阻碍填充到空隙中的液体流动到这些腔中的任何一个腔中的任何种类的障碍彼此隔开。

术语“被分隔空间分离”描述了至少两个腔在空间上被分隔空间分离，使得它们形成不同的空间。然而，即使至少两个腔在空间上与分离空间分离，它们仍可与分离空间流体连接。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，将分离到至少两个腔中的含水液体分离成彼此相同和/或不同的部分。因此，任何数量的腔可包括相同的部分，而任何数量的腔可包括不同的部分。

通常，如果例如经由入口开口将液体引入空隙中，则液体首先进入分离空间。随后，在用含水液体填充分离空间的过程中，液体同时或连续进入至少两个腔。当液体到达分离空间的末端时，其通常例如经由出口开口离开空隙的分离空间。这意味着分离空间可形成用于将液体从空隙的入口开口转移到出口开口而且还用于将液体转移到至少两个腔中的区域。

步骤b)

根据本发明的第一方面的方法的步骤b)涉及向至少两个腔中的每一个腔供应含水液体。

表述“向至少两个腔中的每一个腔供应含水液体”描述了为至少两个腔中的每一个腔提供含水液体。然而，虽然至少两个腔各自供应有含水液体，但可能例如由于气泡而在步骤b)之后并非所有腔都填充有含水液体。

通常例如通过入口开口用含水液体填充空隙。可用含水液体手动或机械填充空隙。例如，可通过使包含含水液体的非自动移液管的移液管尖端与入口开口接触并将含水液体手动注射到空隙中来手动填充空隙。也可通过例如将毛细管连接到入口开口并使用手动泵送装置将含水液体通过毛细管泵送到空隙中来手动填充空隙。类似地，可通过例如将流动回路(诸如通过毛细管)连接到装置并使用机械泵送装置将含水液体通过毛细管泵送到空隙中来机械填充空隙。

在注入含水液体之后，也可以使用毛细管力、由手动或机械供应装置产生的压力、质量惯性、离心力和/或重力来输送液体。

在根据本发明的第一方面的方法的步骤b)中供应的含水液体的体积通常为10μl至100μl。

在步骤b)之后，优选地，至少两个腔的至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％或至少100％填充有含水液体。

步骤c)

根据本发明的第一方面的方法的步骤c)涉及向分离空间供应用于将含水液体分离到至少两个腔中的分离液体。

表述“用于将含水液体分离到至少两个腔中的分离液体”描述了至少两个腔的每一个腔中的含水液体通过一层分离液体与其他腔中的含水液体分离，从而不会发生生物材料的交换，从而在这些腔中的含水液体之间不会发生生物材料的交换，优选地根本不会发生任何组分的交换。

分离液体的另一个功能可以是防止腔中的含水液体例如在热循环过程中蒸发，并将任何气泡冲出装置的空隙。

可使用与步骤b)中用于将含水液体引入空隙中相同的手动或机械装置将分离液体引入空隙中，这提供了分离空间。

在根据本发明的第一方面的方法的步骤c)中供应的分离液体的体积通常为10μl至100μl，这取决于空隙的体积。

将含水液体分离到至少两个腔中通常是向分离空间供应分离液体的结果，这迫使保留在分离空间中的含水液体在分离空间中前进，同时分离液体覆盖供应有含水液体的腔。

在步骤c)之后，0％至<1％的腔可能受到泄漏的影响，即至少两个腔之间的含水膜仍然连接这两个腔的含水液体，并允许一个腔的组分交换到另一个腔中。优选地，0％至0.75％、更优选0至0.5％、尤其更优选0至0.25％并且最优选0％至0.1％的腔在步骤c)之后可能受到泄漏的影响。

此外，在根据本发明的第一方面的方法的步骤c)中，还可向分离空间供应两种或更多种用于将含水液体分离到至少两个腔中的分离液体，可同时或一个接一个供应这些分离液体。

步骤d)

根据本发明的第一方面的方法的任选步骤d)涉及分析含水液体，优选地其中分析含水液体的步骤包括确定至少两个腔中的任一个腔中的含水液体中生物材料的不存在、存在、活性或浓度。

术语“分析”描述了定量和/或定性分析过程。本申请的用于定性或定量分析生物材料的合适方法是本领域技术人员熟知的。例如，可通过对反应区域和其中发生的反应进行光学检测(诸如检测其固有特征(例如其在特定波长处的吸光度))来分析生物材料。例如，如果生物材料包含任何形式的氨基酸、肽或蛋白质，则可通过测量含水液体在280nm处的吸光度来分析这些物质。还可通过检测来自附接到生物材料的标记物(诸如荧光标记物或化学发光标记物)的信号来分析生物材料。

荧光或化学发光标记物通常是可附接到生物材料的靶分子以帮助其检测的分子。通常，将荧光分子(荧光团)或化学发光分子的反应性衍生物用作荧光或化学发光标记物。标记选择性地与靶分子上的特异性区域或官能团结合，由此这种附接可以是化学的或生物的。

合适的荧光标记物是本领域技术人员熟知的，诸如溴化乙锭、荧光素、atto荧光染料或绿色荧光蛋白。合适的化学发光标记物是本领域技术人员熟知的，诸如由辣根过氧化物酶(HRP)转化的那些标记物，诸如TMB、DAB、ABTS。

此外，也可以特异性探针的形式将荧光或化学发光标记物用于检测特定靶标。可通过将标记物附接到与靶标特异性相互作用的分子诸如抗体、蛋白质、氨基酸或肽上来产生此类探针。在这种情况下，如果探针与生物材料特异性相互作用，则附接到探针的荧光或化学发光标记物仅发射信号。

分析生物材料的步骤优选地包括确定在至少两个腔中的任一个腔中的含水液体中生物材料的不存在、存在、活性或浓度。合适的方法是本领域技术人员熟知的，并且部分地也在其他地方例如荧光成像描述。

术语“不存在”描述了目标生物材料在含水液体中不可检测的情况。然而，这并不排除存在目标生物材料，但是其量太低而不能通过本领域技术人员熟知的适于检测特定目标生物材料的常用方法来检测。核酸检测极限的一个实例是每个分区1个分子。任何其他方法(ELISA或类似方法)原则上可表现出相似的灵敏度水平。这里，作为一个实例，在腔体积为1nl的情况下，检测极限可以是每1nl 1个分子。

术语“存在”描述了含水液体包含所寻求的生物材料的条件，而与含水液体中目标生物材料的实际量或浓度无关。

术语“活性”描述了含水液体中的生物材料进行或催化化学反应，例如通过将生物材料靶向的底物转化为产物。一个实例是蛋白质的酶活性，其通常可通过底物转化来检测，例如通过测量含水液体中底物、中间产物和/或产物的量或浓度。用于测量底物转化率的方法是本领域技术人员熟知的。取决于具体生物材料诸如酶，可能需要在将含水液体供应到装置之前将反应所需的组分(诸如底物、酶辅酶(例如三磷酸腺苷(ATP)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+))或辅因子(例如无机离子，诸如Fe²⁺、Mn^{2 +}或Zn²⁺))包括到含水液体中。

术语“浓度”描述了生物材料的总量或单位数除以含水液体的总体积。

根据本发明的第一方面的方法的步骤c)中的分离液至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。

术语“聚硅氧烷”描述了在主链中包含一个或多个硅氧烷(Si-O-Si)键的任何链、环或梯形结构。此外，取决于在分子中的位置(非末端或末端)，每个Si可连接到一个、两个或三个残基Rx。

优选地，聚硅氧烷是包含4至400个、优选5至300个、更优选7至250个、甚至更优选10至200个、尤其更优选10至100个并且最优选15至70个-[O-SiRx₂]单元的直链分子。

残基Rx可彼此独立地为具有1至20个碳原子的取代或未取代的直链或支链烷烃、烯烃或炔烃，优选取代或未取代的C₁-C₂₀-烷基，更优选C₁-C₁₂-烷基，诸如CH₃、-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-CH₃、-CH-(CH₃)₂或-CH₂(-CH₂)_p-CH₃(其中p＝1至10)。

此外，残基Rx可彼此独立地为具有1至20个碳原子的取代或未取代的脂族、脂环族、芳族、杂芳族或杂环基团，优选芳族基团，诸如苯基、甲苯基或苄基。连接到硅氧烷主链的残基Rx还可包含卤素(例如氟)，诸如-CH₂-CH₂-CF₃、-CF₂-CF₂-CF₃或-CF₂(-CF₂)_p-CF₃(其中p＝1至10)。

Rx残基还可彼此独立地为醚、酯、硫酯、硫醚、碳酸和/或硫代羧酸。

聚硅氧烷分子还可包含上述Rx残基的混合物。

优选地，每个Rx可独立地选自由取代或未取代的C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基或芳族基团组成的组。优选地，每个Rx可独立地选自由取代或未取代的C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基或芳族基团组成的组；优选地，其中与C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基的每个碳连接的一个、两个或三个氢原子独立于其他氢原子被卤素、优选氟取代，并且/或者芳族基团是取代或未取代的苯基、甲苯基或苄基。

在根据本发明的第一方面的方法中使用的聚硅氧烷具有至少一个羟基基团。在根据本发明的第一方面的方法中使用的聚硅氧烷还可具有至少两个羟基基团、至少三个羟基基团、至少四个羟基基团或至少五个羟基基团。优选地，聚硅氧烷具有一个或两个、更优选两个羟基基团。

此外，分离液体中羟基的质量百分比可在0.1％至5％的范围内，优选地在0.2％至2.5％的范围内，更优选地在0.3％至1.5％的范围内。可例如通过确定分离液中存在的每种元素的摩尔质量、根据频率确定存在的每种单独元素的质量、确定每种化合物的摩尔质量并将存在的每种元素的质量除以摩尔质量来计算质量百分比。可以由本领域技术人员确定羟基的质量百分比，诸如通过“Comprehensive Organometallic Analysis”,T.R.Crompton,ISBN 978-1-4615-9498-7,第J章“Determination of Silicon-boundHydroxy Groups”中所述的方法。

在本发明的第一方面的另一优选实施方案中，聚硅氧烷具有一个或两个、优选两个羟基基团，并且/或者分离液体中羟基的质量百分比在0.1％至5％的范围内，优选地在0.2％至2.5％的范围内，更优选地在0.3％至1.5％的范围内。

具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷可包含末端或非末端硅烷醇基团，其中至少一个羟基基团可直接连接到末端或非末端Si上。此外，至少一个羟基基团可连接到与非末端或末端Si连接的残基中的任何任一个残基上，例如在甲醇基团中。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷包含硅烷醇基团和/或甲醇基团。

如果聚硅氧烷具有至少两个羟基基团，则这些羟基基团可彼此独立地为末端或非末端硅烷醇和/或甲醇基团。

如果具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷包含甲醇基团，则术语“甲醇基团”描述了任何伯醇、仲醇或叔醇。甲醇基团可与任何C₁至C₁₀-烷基基团、优选C₁至C₈-烷基基团、更优选C₂至C₈-烷基基团并且最优选C₂至C₆-烷基基团连接。

在本发明的第一方面的更优选实施方案中，在包含甲醇基团的聚硅氧烷中，与聚硅氧烷的硅原子连接的甲醇基团包含C₁至C₈-烷基基团、优选C₂至C₆-烷基基团，其中硅烷醇基团代表与有机硅原子连接的羟基基团，并且甲醇基团代表与碳原子连接的羟基基团。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，聚硅氧烷是包含4至400个、优选5至300个、更优选7至250个、甚至更优选10至200个、尤其更优选10至100个并且最优选15至70个-[O-SiRx₂]-单元的直链分子，

每个Rx可独立地选自由取代或未取代的C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基或芳族基团组成的组；优选地，其中与C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基的每个碳连接的一个、两个或三个氢原子独立于其他氢原子被卤素、优选氟取代，并且/或者

芳族基团是取代或未取代的苯基、甲苯基或苄基。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有根据式(I)的结构

或根据式(II)的结构

优选根据式(III)的结构

或根据式(IV)的结构

其中n＝4至400，优选5至300，更优选7至250，甚至更优选10至200，尤其更优选10至100，并且最优选15至70；

其中m₁＝1至10，优选2至8，并且更优选2至6，

其中m₂＝1至10，优选2至8，并且更优选2至6，并且

其中每个Rx独立地选自由以下项组成的组：-CH₃、-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-CH₃、-CH-(CH₃)₂、-CH₂(-CH₂)_p-CH₃、-CH₂-CH₂-CF₃、-CF₂-CF₂-CF₃、-CF₂(-CF₂)_p-CF₃、苯基、甲苯基和/或苄基，其中p＝1至10，并且

其中至少一个Rα或Rω被选择为-OH，而另一个被选择为-OH或-CH₃。

在本发明的第一方面的另一优选实施方案中，具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有根据式(V)的结构

其中n的中值＝4至400，优选5至300，更优选7至100，甚至更优选10至50，并且最优选10至25，并且

其中n＝4至400，优选5至300，更优选10至100，甚至更优选15至70，并且最优选20至50。

聚硅氧烷分子还可包含上述Rx残基的混合物。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有300至30,000g/mol、优选400至20,000g/mol、更优选600至10,000g/mol并且最优选1000至6,000g/mol的平均分子量，并且/或者具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在25℃下具有1至1,000mPas、优选2至750mPas、更优选5至500mPas、甚至更优选10至250mPas、还更优选15至200mPas并且最优选20至150mPas的动态粘度。

用于测量聚硅氧烷的平均分子量的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可通过质谱技术测量平均分子量。

用于测量聚硅氧烷在25℃下的动态粘度的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可通过使用流变仪或玻璃毛细管粘度计来测量聚硅氧烷在25℃下的动态粘度。

分离液至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或至少由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。此外，分离液可包含至少两种具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷、至少三种具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷、至少四种具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷或至少五种具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由这些聚硅氧烷组成。

如果分离液包含至少两种聚硅氧烷，则它可包含上述聚硅氧烷的任何混合物。它还可含有其他组分，诸如直链或环状聚二甲基硅氧烷，只要羟基基团百分比保持在规定的范围内即可。

用于确定分离流体的组成的方法是本领域技术人员熟知的，诸如IR-光谱法、GC、LS、GC-MS、LC-MS、NMR、凝胶渗透色谱法或这些方法的组合。

例如，用于测试在通过分离液体分离包含靶DNA或RNA作为生物材料的含水液体中的有效性的一般过程可如下进行：

1.可将含有待分析的靶DNA或RNA的样品与PCR-或RT-PCR或用于PCR的等温预混液，从而形成反应混合物，浓度优选地为0.05至0.4个分子/腔体积，因此阳性腔比率为5％至40％。

2.可提供具有多个腔的装置。

3.可将反应混合物引入装置中，从而填充腔。

4.可将分离液体引入装置中，从而将反应混合物分离到腔中。

5.可触发或开始反应，并且在此期间或之后，可检测每个腔的信号。

6.可从观察到的腔的信号导出分析结果。

7.例如通过例如使用荧光显微镜进行目视检查和/或将阳性腔数量与预期的阳性腔数量进行比较来分析分析结果和装置的泄漏。

根据例如生物材料、装置和分析种类，根据本发明的第一方面的方法可包括另外的方法步骤。例如，分析生物材料的步骤可包括一个或多个步骤，包括制备用于分析的生物材料，诸如在PCR过程中通过热循环进行材料扩增(见下文)。例如，如果生物材料是任何种类的核酸诸如DNA或RNA，则可进行任何种类的PCR和反转录PCR，诸如数字PCR。该方法还可以包括监测和检测装置中气泡的存在或产生的步骤、例如借助于围绕至少微流体装置的压力室将压力施加到微流体装置上的步骤以及/或者将热循环温度分布施加到反应区域阵列的步骤。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有300至30,000g/mol、优选400至20,000g/mol、更优选600至10,000g/mol并且最优选1000至6,000g/mol的平均分子量，并且/或者

具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在25℃下具有1至1,000mPas、优选2至750mPas、更优选5至500mPas、甚至更优选10至250mPas、还更优选15至200mPas并且最优选20至150mPas的动态粘度，并且/或者

腔具有0.02至200nl、优选0.05至50nl并且更优选0.1至5nl的体积，并且/或者

每个装置的腔的数量优选地为至少96个、更优选至少1,536个、甚至更优选至少10,000个并且最优选至少100,000个。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，将分离到至少两个腔中的含水液体分离成彼此相同和/或不同的部分，并且/或者包含生物材料的含水液体是生物样品，优选地从人分离并且/或者是血液、血清、组织、唾液、尿液或粪便样品。

在第二方面，本发明涉及一种用于将含水液体分离到至少两个腔中的系统，该系统包括：

装置，该装置具有提供分离空间的至少一个空隙，以及与空隙流体连接并被分离空间分离的至少两个腔；

含水液体源，该含水液体源包括包含生物材料的含水液体，用于向装置供应含水液体；

分离液体源，该分离液体源用于向装置供应用于将含水液体分离到至少两个腔中的分离液体，

其中分离液体至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。

关于根据本发明的第二方面的系统，参考在本发明的其他方面的上下文中使用的术语、实例和具体实施方案，它们也适用于该方面。

术语“系统”涉及将含水液体分离到至少两个腔中所需的全部技术手段。

在其他组件中，根据本发明的第二方面的系统包括含水液体源。术语“含水液体源”描述了用于向装置手动或机械供应含水液体的任何技术和/或手动装置。

根据本发明的第二方面的系统还包括分离液体源。术语“分离液体源”描述了用于向装置手动或机械供应含水液体的任何技术和/或手动装置。如果装置供应有多于一种分离液体，则系统可包括多于一个分离液体源。具体地，在装置供应有包括一种相同组成或类型的几种分离液体的情况下，两者的源可由一个共同的密封贮液器实现。

用于向装置供应含水液体或分离液体的合适的技术和手动装置是本领域技术人员熟知的，并且也在本申请的其他地方描述。

本发明的微流体系统的特征还可以在于执行填充检查、正确放置检查等的不同传感器。

该系统还可包括用于控制泵送装置的控制单元，以例如在dPCR期间根据需要泵送各种液体通过空隙。这里，控制单元可以由操作者手动触发，或者例如基于来自检测或监测流动通道内气泡的出现的附加系统组件的反馈信号自动触发。而且，控制单元可以基于预定模式(例如基于要施加到反应区域内的含水液体的热循环步骤)指示泵送装置将预定量的液体泵送通过空隙。

微流体系统还可以包括连接到流动回路的气泡捕捉器，用于从分离液体中分离空气，该气泡捕捉器布置在装置出口的下游。因此，可以从在流动回路中流动的分离液体中除去通过流动的附加液体从微流体装置的空隙中冲出的任何气泡。

微流体系统还可以包括用于分析生物材料或检测装置中气泡的存在或产生的检测装置，诸如光学成像装置，例如光学相机，该装置可以在热循环之前和期间检测和/或监测空隙内气泡的存在或产生，条件是空隙允许光学监测。这里，例如，可以使空隙的内部从外部可见，例如通过观察窗、流动通道的透明壁等。用于分析生物材料的装置可以包括用于单独地、并行地和/或顺序地分析至少两个腔中的每一个腔中的分析反应的装置，诸如用于分析每个腔中的荧光并在每个腔上提供结果的荧光检测或成像装置。

为了能够向反应区域内的样品材料提供热循环温度分布，微流体系统可以包括接收微流体装置的热支架，用于向反应区域阵列提供热循环温度分布。另选地，可以通过用于将附加密封液体的温度加热和/或冷却至所需的热循环温度分布温度的加热和/或冷却装置来向反应区域阵列提供热循环温度分布。此外，该装置还可以包括至少一个传感器，用于控制接收在装置中的生物材料处的温度，其中这种传感器可以是例如与流体流量传感器结合的温度传感器。

根据本发明的dPCR微流体系统的另一具体实施方案，微流体系统可以另外包括围绕至少微流体装置的压力室。

最后，根据方面二的系统还可包括控制单元，该控制单元可以控制上述系统及其组件的任何种类的致动或监测，其中如本文所用的术语“控制单元”涵盖诸如CPU等的任何物理或虚拟处理设备，该处理设备还可以按进行工作流和工作流步骤的方式控制整个实验室仪器或甚至包括一个或多个实验室仪器的整个工作站。例如，控制单元可携带不同种类的应用软件，并指示自动化处理系统或其特定仪器或设备进行分析前、分析后和分析工作流/工作流步骤。控制单元可接收来自数据管理单元的有关需要对特定样本执行哪些步骤的信息。此外，控制单元可与数据管理单元集成，可由服务器计算机构成，并且/或者是一个仪器的一部分，或者甚至分布在自动化处理系统的多个仪器上。控制单元可例如体现为运行计算机可读程序的可编程逻辑控制器，该计算机可读程序设置有执行操作的指令。这里，为了由用户接收此类指令，可以另外提供用户界面，其中如本文所用的术语“用户界面”涵盖用于操作者与机器之间的交互的任何合适的应用软件和/或硬件，包括但不限于用于接收来自操作者的命令作为输入并且还向操作者提供反馈并传递信息的图形用户界面。而且，系统/设备可显示多个用户界面来服务不同种类的用户/操作者。

在本发明的第一方面的优选实施方案中，其中该方法是通过根据本发明的第二方面的系统执行的，或在本发明的第二方面的优选实施方案中，

该系统是微流体系统并且该装置是微流体装置，该装置进一步包括通过所述空隙连接的至少一个入口和至少一个出口，

优选地其中

空隙是微流体装置中的流动通道，并且/或者

腔是流体容器，并且/或者

空隙和/或腔和/或流动通道具有亲水性表面，

进一步优选地其中微流体系统进一步包括

可连接到微流体装置的流动回路，用于使液体流过微流体装置的空隙；以及

连接到流动回路的泵送装置。

术语“微流体装置”描述了提供接收可流动样品液体(诸如含水样品液体)形式的微升或纳升规模样品的微米规模通道和微米规模反应区域的装置。合适的微流体装置的实例是例如微流体芯片。

除了分隔空间和至少两个腔之外，该装置通常进一步包括通过空隙连接的至少一个入口和至少一个出口。

术语“入口”和“出口”描述了装置中允许分别将流体(即液体和气体)引入或排出装置的任何开口。

入口和出口可布置在装置的底部、顶部和/或一个或多个侧壁中。如果装置包括支撑件和盖，则入口和出口开口可布置在装置的支撑件和/或盖中，优选地，它们布置在装置的支撑件中。

入口可用于将液体或气体引入装置的空隙中，并且出口可用于将液体或气体从装置的空隙中排出。空隙的入口和出口通常通过空隙、优选地通过流体连接部连接，即不存在可阻碍填充到空隙的入口开口中的液体流动到空隙的出口开口的任何种类的障碍物。微流体装置的入口和/或出口可以分别以单个连接端口的形式实现，诸如例如鲁尔锁适配器等形式的圆形流体密封端口，用于连接微流体装置与含水液体源，或用于连接微流体装置与分离液体源。

优选地，空隙提供了装置中的流动通道，这意味着它允许引入装置中的液体流向其目标区域，诸如流向至少两个腔和/或出口。例如，空隙在孔的开口侧上呈封闭的填充通道形式，其在一侧上与宏观填充入口端口连接，而在另一侧上与溢流出口端口连接。

同样优选地，腔是流体容器。术语“流体容器”描述了适于容纳液体的任何容器，例如用于为液体提供储存库和/或反应容器。

优选地，空隙和/或腔和/或流动通道具有亲水性表面。例如，空隙表面和/或腔表面和/或流动通道表面的亲水性本身呈现出约30°至90°范围内的表面接触角，但也可以<30°，这是在含水液体与表面之间测量的。优选地，空隙表面和/或腔表面和/或流动通道表面的亲水性本身呈现出约<90°、更优选<60°(例如40°或<10°)范围内的表面接触角。此外，空隙表面和/或腔表面和/或流动通道表面也可具有不同的亲水性。

用于调节空隙、腔和/或流动通道的表面的亲水性的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可通过微流体装置的材料特性、通过相应表面的表面处理(诸如通过等离子体亲水化处理)或通过设置在相应表面上的亲水涂层(诸如SiO₂涂层)来提供一定的亲水性。

同样优选地，微流体系统包括可连接到微流体装置的流动回路，用于通过使液体流过微流体装置的空隙，例如用于通过流动回路向微流体装置提供含水液体或分离液体。此外，流动回路可以通过管道系统来实现，例如由一个或多个柔性管组成的柔性管道系统，这些管可以由乙烯丙烯二烯单体(EPDM)橡胶的内层和丁腈橡胶(NBR)橡胶的外层制成，也可以用合成丝网加强，或者通常可以由EPDM、NBR、氟化乙烯-丙烯聚合物(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚醚砜(PES)、氟弹性体(FKM)、有机硅制成，并且可以另外通过热隔离材料加套。流动回路可经由入口和出口连接到装置。

术语“泵送装置”描述了适于向流动回路手动或机械供应液体(诸如含水液体或分离液体)的任何装置。

作为一个实例，本发明的机械泵送装置可以是蠕动泵、计量泵、纳升泵或注射泵中的一种，或者另选地，具有附加的流体组件诸如阀等，本发明的泵送装置可以是任何其他类型的泵，例如隔膜泵、摇摆活塞泵、微型齿轮泵等。例如，可以使用施加约500毫巴的压力的蠕动泵来将分离液体填充到流动通道中。

手动泵送装置可以是例如由人驱动的移液管或手动微型注射泵。

此外，微流体系统可包括检测装置，用于例如分析生物材料，诸如通过检测至少两个腔的每一个腔中生物材料的存在、不存在、活性或浓度，或者用于检测微流体装置中气泡的存在或产生。

在本发明第一方面和第二方面的另一优选实施方案中，含水液体包含待分析的核酸作为生物材料，优选地其中在分析时扩增核酸，并且/或者其中在扩增反应中、更优选地通过聚合酶链式反应(PCR)或通过等温扩增反应分析核酸。

可使用根据本发明的第一方面的方法或根据本发明的第二方面的系统来分析的合适的核酸是本领域技术人员熟知的，并且可以是任何种类的单链或双链核酸，优选任何种类的单链或双链DNA或RNA，诸如mRNA、miRNA或siRNA、ssDNA、dsDNA或cDNA或质粒。

优选地，可在扩增时或在扩增后检测在靶分子(分析物分子)存在于腔中的情况下发生的核酸扩增。更优选地，通过聚合酶链式反应(PCR)或通过等温扩增反应来扩增核酸。

例如，在PCR过程中，通常通过热循环来扩增核酸。详细地，热循环通常用于加热和冷却反应室内的样品中的反应物，以扩增这些DNA或RNA片段，其中通常使用包括热循环仪的实验室仪器以便基于PCR实现诊断测定的自动化过程，其中在PCR进行期间，必须将液体PCR样品重复加热和冷却到不同的温度水平，并且必须将这些样品在不同的温度平稳段下保持一定量的时间。作为一个实例，在典型的PCR进行过程中，通过一系列重复的步骤循环扩增特异性靶核酸，在这些步骤循环中，存在于反应混合物中的核酸(a)在相对高的温度下(例如，在超过90℃、通常约94℃至95℃的变性温度)下变性，以分离双链DNA，然后(b)将反应混合物冷却至短寡核苷酸引物与单链靶核酸结合的温度(例如，约52℃至56℃的退火温度)，以使引物在分离的DNA链处结合以便提供模板(退火)，并且之后(c)例如在约72℃的延伸温度下使用聚合酶延伸/延长引物，以产生新的DNA链，使得原始核酸序列被复制。变性、退火和延伸的重复循环(通常约25至30个重复循环)使得样品中存在的靶核酸序列的量呈指数增加。现在，为了能够在热循环过程中精确地保持此类温度平稳段，应当保持反应区的均匀温度分布，使得可以均匀地加热和冷却所有的反应区，以在含有样品的反应区之间获得均匀的样品产率。为了进行常规PCR方法，可以使用用于扩增DNA片段的通常已知的热循环装置，诸如热循环仪，这些热循环装置基本上由用于接收样品的支架(通常也称为样品调温支架)和连接到支架的热泵组成，该热泵通常以用于主动加热和冷却支架因此用于主动控制提供给样品的温度的珀尔帖元件和热耦合到珀尔帖(Peltier)元件和耦合到珀尔帖元件以便将热量散逸出去并且例如散逸到周围环境中的相应散热器的组合形式提供。

合适的PCR应用是例如定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、多重PCR或巢式PCR。

根据本发明的第一方面的方法和根据本发明的第二方面的装置也可用于任何形式的等温扩增反应。通常，等温扩增反应以流线型、线性或指数方式提供对核酸靶序列的检测，并且不受热循环约束条件的限制。用于等温扩增反应的合适方法是本领域技术人员熟知的，诸如环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、全基因组扩增(WGA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或基于核酸序列的扩增(NASBA)或滚环扩增(RCA)。

用于分析含水液体中的核酸的方法是本领域技术人员熟知的，并且也如上所述。

如果使用染料分析核酸，则合适的染料是本领域技术人员熟知的，诸如5(6)-羧基荧光素(5-FAM和6-FAM^TM)、Cy3TM、Cy5TM、6-羧基-2',4,4',5',7,7'–六氯荧光素(HEX^TM)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE^TM)、5(6)-羧基-X-若丹明(ROX^TM)、5-羧基四甲基若丹明(TAMRA^TM)、四氯荧光素(TET^TM)、磺酰若丹明101酰氯(Texas

)或R-藻红蛋白偶联的磺酰若丹明101酰氯(PE-Texas

)。

在本发明第一方面和第二方面的另一个优选实施方案中，含水液体包含待分析的蛋白质作为生物材料，优选地其中通过免疫测定法、更优选采用能够特异性结合蛋白质的抗体或其片段的测定法来分析蛋白质。

术语“蛋白质”描述了包含一个或多个氨基酸残基长链的分子。通常，蛋白质包含至少30个氨基酸。

可通过分析一种或多种固有特征诸如吸光度(如上所述)或通过蛋白质标记(诸如通过过渡金属或免疫测定法)来分析蛋白质。

例如，对于蛋白质标记，过渡金属(诸如镍)可用于将探针中的特定残基连接到位点特异性靶标诸如N-末端、C-末端或蛋白质内的内部位点。用于蛋白质标记的其他探针的实例包括双砷标签、组氨酸(His)标签、FLAG标签，诸如Ni-NTA-Atto缀合物(缀合到Atto染料的Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸、镍(II)复合物)，其可提供对带有His标签的融合蛋白的特异性和高灵敏度检测。

优选地，通过免疫测定法来分析蛋白质。术语“免疫测定法”描述了通过使用抗体或其片段或抗原、优选抗体或其片段来测量溶液中分子诸如蛋白质的存在或浓度的任何生物化学测试。合适的抗体的实例是多克隆抗体、单克隆抗体、它们的片段(诸如F(ab')2)和Fab片段，以及任何天然存在的或重组产生的结合配偶体，它们是特异性结合样品中待特异性测量的一种分子的分子。可以使用保留上述特异性结合剂标准的任何抗体片段。

通常，对抗体或其片段进行进一步标记以允许检测抗体和抗原。标记物通常与所需抗体或抗原化学连接或缀合。合适的标记物是例如酶(例如用于酶联免疫吸附测定法(ELISA)或酶倍增免疫测定技术(EMIT))、放射性同位素、DNA报告基因、荧光报告基因(诸如藻红蛋白)、电致发光标签和无标记免疫测定。优选地，免疫测定法是ELISA。

在ELISA中使用的酶的实例是辣根过氧化物酶(HRP)，其可被束缚到特异性识别感兴趣的分子的抗体上。然后该酶复合物催化底物的反应，当使用过氧化氢作为氧化剂被HRP氧化时，该反应产生可通过分光光度法检测的特征颜色变化。例如，HRP催化显色底物(例如，TMB、DAB、ABTS)转化成有色产物，并且在作用于化学发光底物时产生光(例如，通过鲁米诺增强的化学发光)。

表述“特异性结合蛋白质”描述了抗体与抗原之间的任何相互作用，诸如任何非共价结合，例如通过离子结合、氢键或范德华力。

在第三方面，本发明涉及具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在根据本发明的第一方面的用于分离含水液体的方法或根据本发明的第二方面的系统中的用途。

关于根据本发明的第三方面的用途，参考在本发明的其他方面的上下文中使用的术语、实例和具体实施方案，它们也适用于该方面。

根据本发明的第一方面的方法和根据本发明的第二方面的装置可例如用于需要将含水液体分离到至少两个腔中的任何方法中，诸如任何种类的PCR应用(诸如定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、多重PCR或巢式PCR)或免疫测定(诸如ELISA)。根据本发明的第一方面的方法和根据本发明的第二方面的装置的用途的其他实例也在本申请的其他地方描述。

上述本发明的方法以及本发明的系统可以是通常在现有技术实验室中用于自动处理生物样品的自动化处理系统(诸如分析、分析前或分析后处理系统)的一部分，其可以包括可操作以对一个或多个生物样品执行一个或多个处理步骤/工作流步骤的任何装置或装置组件，并且涵盖分析仪器、分析前仪器和分析后仪器。因此，表述“处理步骤”是指物理执行的处理步骤，诸如进行dPCR的特定步骤。如本文所用的术语“分析”涵盖由一个或多个可操作以对一个或多个生物样品进行分析测试的实验室装置或操作单元进行的任何处理步骤。在生物医学研究的背景下，分析处理是表征生物样品或分析物的参数的技术过程。这种参数表征包括例如确定来源于人或实验动物等的生物样品中各种大小的特定蛋白质、核酸、代谢物、离子或分子的浓度。所收集的信息可以用于评价例如施用药物对生物体或特定组织的影响。进一步的分析可确定生物样品或包含在样品材料中的分析物的光学、电化学或其他参数。

除非上下文另有明确指出，否则本文和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。同样，词语“包含”、“含有”和“包括”应包容性而非排他性地加以解释，换句话说，其意义为“包括但不限于”。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个，即2或>2，具有整数倍，其中术语“单个”是指一个，即＝1。此外，术语“至少一个”应理解为一个或多个，即1或>1，同样具有整数倍。因此，使用单数或复数的字词也分别包括复数和单数。此外，在本专利申请中使用的字词“本文”、“上文”、“前文”和“下文”以及类似意义的字词应当是指整个专利申请，而不是指本专利申请的任何特定部分。

本发明的具体实施方案的描述并非旨在是穷举性的或将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文出于说明目的描述了本公开的具体实施方案和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在如所附权利要求所呈现的本公开的范围内，各种等效修改是可能的。任何前面和后面描述的实施方案的具体元件可以组合或替代其他实施方案中的元件。而且，在附图中，相同的参考标号表示相同的元件以避免重复，并且可省略本领域普通技术人员容易实现的部分。此外，尽管已经在这些实施例的上下文中描述了与本公开的某些实施例相关联的优点，但是其他实施例也可以表现出此类优点，并且并非所有实施例都必须表现出此类优点才能落入由所附权利要求书限定的本公开的范围内。

以下实施例旨在说明本发明的具体实施方案。因此，如后文讨论的具体实施方式不应解释为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离如由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可做出各种等同形式、改变和修改，因此应当理解，此类等同实施方案包括在本文中。根据下文对附图中示出的特定实施例的描述，本发明的其他方面和优点将变得显而易见。

附图说明

通过结合附图参考以下描述，本公开的前述和其他目的、方面、特征和优点将变得更加明显和更好理解，其中：

图1是如在本发明的方法或系统的实施方案中使用的用于并行进行多重分析的装置的分解示意图；

图2是如在本发明的方法或系统的实施方案中使用的用于并行进行多重分析的装置的横截面示意图；

图3是图2的细节区段的示意图，其示出了包括六个腔的装置区段；

图4是图3的细节区段的示意图，其示出了包括两个腔的装置区段；

图5I-VI是含水液体(I-III)然后是分离液体(IV-VI)穿过图1的装置的具有六个示例性腔的空隙的过程的横截面示意图；以及

图6I和II是具有六个示例性腔的图1的装置的横截面示意图，其中这些腔填充有含水液体并被分离液体分离(I)或仅被分离液体不完全分离(II)(泄漏)。

参考标号列表

1 用于并行进行多重分析的装置

2 支撑件

3 腔

31 腔之间的边缘

32 腔的底部

33 腔的侧壁

34 涂层

3 腔，空的

3A 腔，填充有含水液体

3B 腔，被分离液体分离

4 空隙

5 入口

6 出口

7 盖

71 盖的涂层

40 含水液体

41 弯液面

42 残余膜

50 分离液体

60 流动方向

91 细节区段

92 细节区段

具体实施方式

图1通过分解透视图示出了如在本发明的方法或系统的实施方案中使用的用于并行进行多重分析的装置1的示意图。装置1基本上包括两个部件，诸如支撑件2和板或箔形式的盖7，部件2、7可以彼此附接。在支撑件2的一个表面中，提供了空隙4，该空隙进一步提供了引入腔阵列3的表面。这里，出于说明目的，仅示出了空隙4内少量的腔3。此外，该装置包括引入支撑件2中的入口5和出口6。

图2以截面视图示出了如在本发明的方法、系统或用途的实施方案中使用的用于并行进行多重分析的装置1的示意图。除了图1的描述之外，还示出了盖7可紧密地附接到支撑件2上，由此覆盖支撑件2的一个表面中的空隙4，同时至少两个腔3与空隙4处于流体连接。此外，示出了入口5和出口6可提供空隙的唯一开口，用于将液体或流体引入和排出空隙4。细节区段91示意性地标记了包括6个腔的示例性区段，该区段在图3中详细示出。

图3示出了图2的细节区段91的示意图。详细地，图3示出了包括6个腔的装置区段。图1和图2的描述也适用于该图。更详细地示出了在该图中被认为是空的至少两个腔3与空隙4流体连接。细节区段92示意性地标记了包括两个腔的示例性区段，该区段在图4中详细示出。

图4示出了图2的细节区段92的示意图，其着重于包括两个腔的装置区段。除了图1、图2和图3的描述之外，图4提供了腔3以及支撑件2和盖7的表面的相应涂层71和34的更多细节。详细地，在图4中示出了腔被边缘31彼此隔开，这些边缘布置在腔3之间并且通过将腔3引入支撑件2的表面中而露出。每个腔具有底部32和至少一个侧壁34(侧壁34的数量取决于底部32的形状)。腔3的至少一个侧壁34还是腔3之间的边缘31的表面。腔3与空隙4流体连接。盖7包括涂层71，诸如SiO₂涂层，该涂层被施加到其底表面，即覆盖空隙4的表面。支撑件2包括涂层34，诸如SiO₂涂层，该涂层被施加到提供空隙4的表面。详细地，支撑件2的涂层34覆盖支撑件2的引入腔3的表面，即腔3的侧壁33、腔的底部32和边缘31的顶表面，该顶表面是支撑件2的引入腔3的表面的一部分。

图5的示意图示例性示出了向装置1供应含水液体40(图5I-III)然后向装置1供应分离液体(图5IV-VI)的过程，该分离液体至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。示出了如针对图3示例性说明的具有六个示例性腔的装置的横截面视图(图5I)。图5II示出了向装置供应含水液体40的步骤。在该过程中，含水液体40流过空隙4并在流动方向60上形成弯液面41。流动方向60用箭头表示。与此同时，腔3一个接一个被含水液体40填充。因此，虽然空隙4的一部分填充有含水液体40并且靠近空隙4的该部分的腔3A也已经填充有含水液体40，但是靠近空隙4的还没有填充含水液体40的部分的剩余腔3也不包括含水液体40。在图5III中，完成了向至少两个腔3供应含水液体40的步骤，并且理想情况下，整个空隙4和所有腔3A都填充有含水液体40。然而，在不幸的情况下仍可能出现气泡或并非所有腔3都被填充。

图5IV至VI示出了向装置供应分离液体50的过程。在该过程中，分离液体50流入空隙4中，同时空隙4中剩余的含水液体40被置换。多余的含水液体可通过朝向出口6流动而离开空隙4，并且可任选地通过出口6离开装置1。流动方向60同样用箭头表示。与此同时，腔3A随着时间被分离液体50彼此分离。因此，虽然空隙4的一部分填充有分离液体50并且靠近空隙4的该部分的腔3B已被分离液体50分离，但是靠近空隙4的还没有填充分离液体50的部分的剩余腔3A还没有被分离。分离液体50仅替代空隙4中的含水液体40，而不替代腔3A中的含水液体。因此，填充有含水液体的腔3B被分离液体50彼此分离。在图IV中，该过程刚刚开始，而在图V中前进并在图VI中结束，其中填充有含水液体的所有腔3B被分离液体50彼此分离。

图6以横截面视图示出了具有六个示例性腔的图1的装置的示意图，其中腔3B填充有含水液体并且全部被分离液体50分离(图6I，也可见图5VI)或仅被分离液体50不完全分离(图6II)。图6II示出了如上所述的泄漏情况。详细地，含水液体在所有腔3B中没有被分离液体50完全分离。相反，在图6II中，三个腔之间的残余膜42仍然连接两个腔的含水液体，并允许一个腔的组分交换到另一个腔中(交叉污染)，从而导致结果错误。

实施例

实施例1：各种分离液体的有效性

测试各种分离液体在分离含水液体中的有效性。

对于这些实验，使用以下装置：

使用以下液体作为参考液体

下表示出了根据本发明的分离液体：

本发明的分离液体和参考液体是可商购获得的产品，例如可从Merck或硅产品制造商获得。

来自组R1至R4或X1至X4的液体是可商购获得的产品，诸如来自Merck或Sigma-Adrich，或来自有机硅、聚硅氧烷有机硅聚合物或此类产品的前体的制造商，或由本领域技术人员从可商购的产品衍生。

在许多情况下，已经研究了产品的同系物系列，例如研究了粘度为5mPas、10mPas、25mPas、50mPas、100mPas或200mPas(也表示聚合物链的分子量和长度(由n表示)增加)的PDMS产品。

使用以下配置研究参考液体或分离液体在分离含水液体中的有效性：

1.将含有待分析的人基因组DNA的样品与PCR预混液混合，从而形成反应混合物。

2.提供具有多个腔的装置(上述A、B或C中的任何一种)。

3.使用0至300毫巴的压力将反应混合物引入装置中，在5至180秒的时间范围内填充装置，从而填充腔。

4.使用50至300毫巴的压力将分离液体引入装置中，在5至180秒的时间范围内分离腔。

5.在40个循环内进行热启动PCR，由此阳性反应形成荧光信号，并检测每个腔的信号。

6.从观察到的腔的信号导出分析结果，由此将对阳性反应的数量进行计数用于计算样品中靶分子的浓度。

在用于监测分离流体的有效性的典型实验中，作为靶分析物，将人g-DNA用作靶分析物，更具体地是染色体11中的β-珠蛋白编码基因座。相应地，将分析物的目标浓度调整为0.05至0.5个拷贝/腔体积的范围内

如上所述的范围内的阳性率允许有效地筛选泄漏。阳性腔的频率在较低浓度下太低，而在较高浓度下太高。当然，在最终应用中，阳性率在许多情况下是未知的，并且有待查明或有待分析。

作为预混液，使用例如Roche LightCyler

对照DNA试剂盒(目录号12 158 833001)，其包括在存在靶分析物时产生阳性荧光信号的所有元件，尤其是引物、探针、FastStart Master、SYBR Green I DNA嵌入剂染料、Mg2+表面活性剂和BSA。

手动并通过毛细管力将含水液体填充到装置中。

手动填充分离液体，通过气动系统施加50至300毫巴的压力。一旦所有腔都被填充和分离，就中断加压。

热循环用于产生所有含有靶分子(或显示泄漏)的腔的可检测信号。使用PCR试剂盒的标准热曲线，但已将温度调整为0.5至2℃/s的范围。

热循环后，使用480nm/20nm的激发波长和535nm/30nm的发射波长对装置、特别是腔进行荧光成像。

为了验证分离流体的分离有效性，确定并计算阳性腔比率，并将其与无泄漏情况下所预期的值进行比较。最重要的是，使用目视检查，特别是观察阳性腔及其相邻(最初为阴性)腔，或观察更宽的区域，从而在大视场的腔的情况下显示或多或少的阳性(显示荧光)。

如下对泄漏进行评级：

结果：

下表示出了参考液体和本发明的分离液体在分离含水液体时的有效性结果。

详细地，对每种参考液体或分离液体进行了分析，当从腔中导出分析结果时，看每个装置有多少腔显示出泄漏。

如上所述，“泄漏”(其同义词是串扰、交叉污染或残留)意味着含水液体没有完全分离到腔中。相反，至少两个腔之间的含水膜仍然连接这两个腔的含水液体，并允许一个腔的组分交换到另一个腔中。

在本实施例中，如果装置的5％至100％的腔显示出泄漏，则将观察到的泄漏确定为“频繁”至“非常频繁”。如果仅0％至1％的腔发生泄漏，则将观察到的泄漏确定为“不存在”至“非常罕见”。

当用于将含水液体分离到不同的腔中时，测试的所有参考液体显示出频繁至非常频繁的泄漏，即在装置的5％至100％的腔中发生。相比之下，根据本发明的所有分离液体具有低得多的泄漏率，在不存在至非常罕见的范围内，即在0％至1％的腔的范围内。在一些情况下，观察到新的分离流体的泄漏总体减少(之前/之后)20倍至>100倍，通常>10倍。

虽然已经结合具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，该描述仅用于说明目的。因此，本发明旨在仅受所附权利要求书的范围的限制。

Claims (15)

1.一种用于将包含生物材料的含水液体(40)分离到至少两个腔(3)中的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供装置(1)，所述装置具有提供分离空间的至少一个空隙(4)，以及与所述空隙(4)流体连接并被所述分离空间分离的至少两个腔(3)；

b)向所述至少两个腔(3)中的每一个腔供应所述含水液体(40)；以及

c)向所述分离空间供应用于将所述含水液体(40)分离到所述至少两个腔(3)中的分离液体(50)；以及任选地，

d)分析所述含水液体(40)，优选地其中分析所述含水液体(40)的步骤包括确定所述含水液体(40)中生物材料的不存在、存在、活性或浓度，

其中步骤c)中的所述分离液体(50)至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。

2.一种用于将含水液体(40)分离到至少两个腔(3)中的系统，所述系统包括：

装置(1)，所述装置具有提供分离空间的至少一个空隙(4)，以及与所述空隙(4)流体连接并被所述分离空间分离的至少两个腔(3)；

含水液体源，所述含水液体源包括包含生物材料的含水液体，用于向所述装置(1)供应含水液体(40)；

分离液体源，所述分离液体源用于向所述装置(1)供应用于将所述含水液体(40)分离到所述至少两个腔(3)中的分离液体(50)，

其中所述分离液体(50)至少包含具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷，或由具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷组成。

3.根据权利要求1所述的用于分离含水液体(40)的方法，其中所述方法是通过根据权利要求2所述的系统执行的，或根据权利要求2所述的系统，

其中所述系统是微流体系统并且所述装置(1)是微流体装置(1)，所述装置(1)进一步包括通过所述空隙(4)连接的至少一个入口(5)和至少一个出口(6)，

优选地其中

所述空隙(4)是所述微流体装置(1)中的流动通道，并且/或者

所述腔(3)是流体容器，并且/或者

所述空隙(4)和/或所述腔(3)和/或所述流动通道具有亲水性表面(34、71)，

进一步优选地其中所述微流体系统进一步包括

可连接到所述微流体装置(1)的流动回路，用于使液体流过所述微流体装置(1)的所述空隙(4)；以及

连接到所述流动回路的泵送装置。

4.根据权利要求1或3中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2或3中任一项所述的系统，其中所述含水液体(40)包含待分析的核酸作为生物材料，优选地其中在分析时扩增所述核酸，并且/或者其中在扩增反应中、更优选地通过聚合酶链式反应(PCR)或通过等温扩增反应分析所述核酸。

5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至4中任一项所述的系统，其中所述含水液体(40)包含待分析的蛋白质作为生物材料，优选地其中通过免疫测定法、更优选采用能够特异性结合所述蛋白质的抗体或其片段的测定法来分析所述蛋白质。

6.根据权利要求1或3至5中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至5中任一项所述的系统，其中所述含水液体(40)包含允许分析所述生物材料的试剂。

7.根据权利要求1或3至6中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至6中任一项所述的系统，其中

所述聚硅氧烷具有一个或两个、优选两个羟基基团，并且/或者

所述分离液体(50)中羟基的质量百分比在0.1％至5％的范围内，优选地在0.2％至2.5％的范围内，更优选地在0.3％至1.5％的范围内。

8.根据权利要求1或3至7中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至7中任一项所述的系统，其中所述具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷包含硅烷醇(silanole)基团和/或甲醇(carbinol)基团。

9.根据权利要求8所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求8所述的系统，其中在所述包含甲醇基团的聚硅氧烷中，与所述聚硅氧烷的硅原子连接的所述甲醇基团包含C₁至C₈-烷基基团，优选C₂至C₆-烷基基团。

10.根据权利要求1或3至9中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至9中任一项所述的系统，其中

所述聚硅氧烷是包含4至400个、优选5至300个、更优选7至250个、甚至更优选10至200个、尤其更优选10至100个并且最优选15至70个-[O-SiRx₂]-单元的直链分子，

每个Rx可独立地选自由取代或未取代的C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基或芳族基团组成的组；优选地，其中与所述C₁-C₂₀-烷基、优选C₁-C₁₂-烷基的每个碳连接的一个、两个或三个氢原子独立于其他氢原子被卤素、优选氟取代，并且/或者

所述芳族基团是取代或未取代的苯基、甲苯基或苄基。

11.根据权利要求1或3至10中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至10中任一项所述的系统，其中所述具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有根据式(I)的结构

或根据式(II)的结构

优选根据式(III)的结构

或根据式(IV)的结构

其中n＝4至400，优选5至300，更优选7至250，甚至更优选10至200，尤其更优选10至100，并且最优选15至70；

其中m₁＝1至10，优选2至8，并且更优选2至6，

其中m₂＝1至10，优选2至8，并且更优选2至6，并且

其中每个Rx独立地选自由以下项组成的组：-CH₃、-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-CH₃、-CH-(CH₃)₂、-CH₂(-CH₂)_p-CH₃、-CH₂-CH₂-CF₃、-CF₂-CF₂-CF₃、-CF₂(-CF₂)_p-CF₃、苯基、甲苯基和/或苄基，其中p＝1至10，并且

其中至少一个Rα或Rω被选择为-OH，而另一个被选择为-OH或-CH₃。

12.根据权利要求1、3至8或10至11中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至8或10至11中任一项所述的系统，其中所述具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有根据式(V)的结构

其中n的中值＝4至400，优选5至300，更优选7至100，甚至更优选10至50，并且最优选10至25，并且

其中n＝4至400，优选5至300，更优选10至100，甚至更优选15至70，并且最优选20至50。

13.根据权利要求1或3至12中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至12中任一项所述的系统，其中

所述具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷具有300至30,000g/mol、优选400至20,000g/mol、更优选600至10,000g/mol并且最优选1000至6,000g/mol的平均分子量，并且/或者

所述具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在25℃下具有1至1,000mPas、优选2至750mPas、更优选5至500mPas、甚至更优选10至250mPas、还更优选15至200mPas并且最优选20至150mPas的动态粘度，并且/或者

所述腔(3)具有0.02至200nl、优选0.05至50nl并且更优选0.1至5nl的体积，并且/或者

每个装置(1)的腔(3)的数量优选地为至少96个、更优选至少1,536个、甚至更优选至少10,000个并且最优选至少100,000个。

14.根据权利要求1或3至13中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至13中任一项所述的系统，其中

将分离到所述至少两个腔(3)中的所述含水液体(40)分离成彼此相同和/或不同的部分，并且/或者

所述包含生物材料的含水液体(40)是生物样品，优选地从人分离并且/或者是血液、血清、组织、唾液、尿液或粪便样品。

15.具有至少一个羟基基团的聚硅氧烷在根据权利要求1或3至14中任一项所述的用于分离含水液体(40)的方法或根据权利要求2至14中任一项所述的系统中的用途。

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