CN114195900B

CN114195900B - 一种抗4-1bb/pd-l1双特异性抗体及其用途

Info

Publication number: CN114195900B
Application number: CN202010983606.7A
Authority: CN
Inventors: 翟天航; 缪小牛; 许英达; 王涛; 曾竣玮; 黄威峰
Original assignee: Biotheus Inc
Current assignee: Biotheus Inc
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: US20230348627A1; KR20230069955A; JP2023541473A; AU2021345856A1; CN114195900A; EP4215549A4; EP4215549A1; CN116096897A; CA3195675A1; AU2021345856A9; WO2022057871A1

Abstract

本发明提供了抗PD‑L1/4‑1BB双特异性抗体的构建、制备及用途。具体地，本发明提供了一种抗PD‑L1/4‑1BB的双特异性抗体，该抗体具有阻断PD‑L1与受体PD‑1结合的功能。同时该双特异性抗体还可以结合免疫细胞上的4‑1BB，激活肿瘤微环境中的免疫细胞活性，更有效地提高抑制肿瘤发生和发展的效果。

Description

一种抗4-1BB/PD-L1双特异性抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗4-1BB/PD-L1双特异性抗体及其用途。

背景技术

程序性死亡因子1配体1(programmed death 1ligand 1，PD-L1)又称CD274，为B7家族成员，是PD-1的配体。PD-L1属于I型跨膜蛋白，共290个氨基酸，包含1个IgV样区、1个IgC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。与其他B7家族分子不同的是，PD-L1具有负向调节免疫应答的作用。研究发现，PD-L1主要表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，除淋巴细胞外，PD-L1也表达于其他多种组织如胸腺、心脏、胎盘等的内皮细胞，以及各类非淋巴系如黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、食道癌、头颈癌等。PD-L1在调节自身反应性T、B细胞和免疫耐受方面具有一定广泛性，并且在外周组织T和B细胞应答起作用。PD-L1在肿瘤细胞上的高表达与癌症患者的不良预后相关。

此外，肿瘤坏死因子受体超家族(4-1BB)又名CD137，或TNFRF9，是TNF受体家族的成员之一。4-1BB是一个阅读框含有255个氨基酸(NCBI：NP_001552)的I型跨膜蛋白，由含有17个氨基酸的N端信号肽，169个氨基酸的胞外区，27个氨基酸的跨膜区和42个氨基酸的C端胞内区组成。4-1BB分子主要表达在活化的T细胞，NK细胞，调节性T细胞，树突状细胞，单核细胞，中性粒细胞和嗜酸性细胞中，肿瘤血管的内皮细胞也有报道表达4-1BB。因此，在肿瘤治疗和一些自身免疫性疾病的治疗中，4-1BB也是一个重要的靶点。

目前上市在售的抗体药物多为单克隆抗体，治疗性单克隆抗体已被用于治疗癌症、自身免疫病、炎症和其他疾病，多数是针对一个靶标的特异性。然而，病人接受单克隆抗体治疗可能产生耐药性或无应答。并且有些疾病在体内的影响因素是多方面的，包括不同的信号通路、不同的细胞因子和受体的调节机制等，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。因此，需要通过组合不同的药物，或是使用多特异性抗体的多重靶向策略来实现。

双功能抗体虽然是抗体药物研发的方向，但面临诸多挑战，比如临床前评价模型、表达量低、稳定性差、工艺复杂、质控差异性大等问题，因此一直以来双功能抗体的研发困难重重。

因此，本领域迫切开发一种特异性佳、疗效好且易于制备的抗肿瘤双特异性抗体。

发明内容

本发明的目的就是提供一种特异性佳、疗效好且易于制备的抗肿瘤双特异性抗体。

在本发明的第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：

(a)抗PD-L1单域抗体；和

(b)抗4-1BB单域抗体。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括1-3个抗PD-L1单域抗体，较佳地，包括1或2个抗PD-L1单域抗体。

在另一优选例中，所述的PD-L1单域抗体可以阻断PD-1和PD-L1的相互作用。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括1-3个抗4-1BB单域抗体，较佳地，包括1或2个抗4-1BB单域抗体。

在另一优选例中，所述的4-1BB单域抗体能够激活免疫细胞。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体还包含源自人免疫球蛋白的Fc区。

在另一优选例中，所述的人免疫球蛋白选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或其组合；优选地为IgG1。

在另一优选例中，所述双特异性抗体的Fc区选自下组：CH1+CL1结构域、人IgG结构域或其组合。

在另一优选例中，所述Fc区是经过改造的突变型，优选地为LALA突变型并且含有Knob-in-hole突变型。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体是由肽链i和肽链ii构成的二聚体，所述的肽链i和肽链ii的结构分别如式I和式II所示，

A-L1-Fc1-L2-B (式I)

A-L3-Fc2-L4-B (式II)

其中，

A、B各自独立地为无、抗PD-L1单域抗体或抗4-1BB单域抗体；

L1、L2和L3各自独立地为无或连接元件；

L4为连接元件；

Fc1、Fc2各自独立地为人免疫球蛋白的Fc区(优选地为LALA突变型)；和

“-”为肽键；

并且其中，所述的双特异性抗体中包括至少一个抗PD-L1单域抗体，和至少一个抗4-1BB单域抗体；

并且其中，式I所示的多肽与式II所示的多肽通过二硫键作用及杵-进入-臼结构(Knob–in-hole)而形成异源二聚体。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体是同二聚体或异二聚体。

在另一优选例中，所述的Fc区为LALA突变型Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述Fc1和Fc2分别具有knob突变和hole突变。

在另一优选例中，所述Fc1的氨基酸序列中，基于SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第132位具有S132C突变，并且第144位具有T144W突变。

在另一优选例中，所述Fc2的氨基酸序列中，基于SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第127位具有Y127C突变、第144位具有T144S突变，并且第146位具有L146A突变。

在另一优选例中，所述的Fc1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述的Fc2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述抗4-1BB单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:2所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述抗PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述接头元件的序列为(G₄S)_n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n为2或4。

在另一优选例中，所述接头元件的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或与SEQ IDNO:5所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体是同二聚体，其由两条相同的肽链通过二硫键所用形成，所述肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(即Bi-400)，或与SEQ ID NO:1所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体是同二聚体，其由两条相同的肽链通过二硫键所用形成，所述肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示(即Bi-088)，或与SEQ ID NO:6所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体是异二聚体，其由肽链i和肽链ii通过杵-进入-臼作用(Knob-in-hole)形成；其中，肽链i的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQID NO:7所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；并且肽链ii的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；。(即Bi-401-091)

在另一优选例中，所述的双特异性抗体是异二聚体，其由肽链i和肽链ii通过杵-进入-臼作用(Knob-in-hole)形成；其中，肽链i的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQID NO:7所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；并且肽链ii的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，或与SEQ ID NO:10所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；。(即Bi-061-091)

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的双特异性抗体。

在另一优选例中，当所述双特异性抗体为异二聚体时，所述多核苷酸中，编码所述肽链i的多核苷酸序列与编码所述肽链ii的多核苷酸序列的比例为1:1。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合；优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸；

或者，所述的宿主细胞表达如本发明第一方面所述的双特异性抗体。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种产生如本发明第一方面所述双特异性抗体的方法，包括步骤：

(a)在合适的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含所述双特异性抗体的培养物；和

(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，获得所述的双特异性抗体。

在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白A亲和柱纯化分离获得目标抗体。

在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。

在本发明的第六方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

在另一优选例中，所述的放射性核素包括：

(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或

(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133Yb-169、Yb-177、或其组合。

在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。

在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。

在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。

特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。

在另一优选例中，所述的毒素选自下组：

耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。

在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(如DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(如顺铂)。

在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的双特异性抗体。

在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的双特异性抗体。

在本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体，或如本发明第六方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-L1和/或4-1BB；其中，所述药剂用于治疗或预防表达PD-L1(即PD-L1阳性)的肿瘤。

在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。

在另一优选例中，所述的试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。

在另一优选例中，所述检测样品中PD-L1和/或4-1BB的试剂为(体内)检测PD-L1和/或4-1BB分子的造影剂。

在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。

在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。

在另一优选例中，所述的药剂用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用，同时通过结合4-1BB激活免疫细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括但不限于：急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤，或其组合。

在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(i)如本发明第一方面所述的双特异性抗体，或如本发明第六方面所述的免疫偶联物；和

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。

在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤的其他药物，如细胞毒性药物。

在另一优选例中，所述的治疗肿瘤的其他药物包括紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、派姆单抗。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备防治肿瘤的药物。

在本发明的第九方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体的一种或多种选自下组的用途，包括：

(i)用于检测人PD-L1分子和/或4-1BB分子；(ii)用于流式检测；(iii)用于细胞免疫荧光检测；(iv)用于治疗肿瘤；(v)用于肿瘤诊断；(vi)用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用；和(vii)用于结合4-1BB激活免疫细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤为表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。

在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。

在本发明的第十方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、HA标签和Fc标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于PD-L1和/或4-1BB。

在本发明的第十一方面，提供了一种检测样品中PD-L1和/或4-1BB的方法，所述方法包括步骤：(1)将样品与如本发明第一方面所述的双特异性抗体接触；(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-L1和/或4-1BB。

在本发明的第十二方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的免疫偶联物，或如本发明第八方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，优选地是人。

在本发明的第十三方面，提供了一种PD-L1和/或4-1BB检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包含如本发明第六方面所述的免疫偶联物和检测学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的检测学上可接受的载体为无毒的、惰性的水性载体介质。

在另一优选例中，所述的检测试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂用于体内检测。

在另一优选例中，所述的检测试剂的剂型为液态或粉状(如水剂，针剂，冻干粉，片剂，含服剂，吸雾剂)。

在本发明的第十四方面，提供了一种检测PD-L1和/或4-1BB的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如本发明第六方面所述的免疫偶联物或如本发明第十三方面所述的检测试剂，以及说明书。

在另一优选例中，所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的PD-L1和/或4-1BB表达。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤的检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明所设计的双特异性抗体结构。

图2A显示了本发明的双特异性抗体可以和CHO-S细胞表面过表达的人PD-L1蛋白结合。

图2B显示了本发明的双特异性抗体可以和CHO-S细胞表面过表达的食蟹猴PD-L1蛋白结合。

图2C显示了本发明的双特异性抗体可以和CHO-S细胞表面过表达的人4-1BB蛋白结合。

图2D显示了本发明的双特异性抗体可以和CHO-S细胞表面过表达的食蟹猴4-1BB蛋白结合。

图2E显示了本发明的双特异性抗体和CHO-S细胞无非特异性结合。

图3显示了本发明的双特异性抗体可以阻断PD-L1蛋白与CHO-S细胞表面过表达的人PD-1蛋白结合。

图4A显示了本发明的双特异性抗体可以同时结合过表达人4-1BB的CHO-S细胞和过表达人PD-L1的CHO-S细胞。

图4B显示了本发明的双特异性抗体可以同时结合人4-1BB和人PD-L1蛋白。

图5A显示了本发明的双特异性抗体在CHO-S细胞和过表达人4-1BB Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因细胞共孵育系统内无荧光信号激活活性。

图5B显示了本发明的双特异性抗体可以在过表达人PD-L1 CHO-S细胞和过表达人4-1BB Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因细胞共孵育系统内激活荧光信号。

图5C显示了本发明的双特异性抗体可以在过表达人PD-L1 CT-26细胞和过表达人4-1BB Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因细胞共孵育系统内激活荧光信号。

图6A显示了本发明的双特异性抗体CHO-S细胞和人原代T细胞共孵育系统内无激活T细胞活性。

图6B显示了本发明的双特异性抗体可以在PD-L1 CHO-S细胞和人原代T细胞共孵育系统内激活T细胞分泌IL-2。

图7显示了本发明的双特异性抗体在混合淋巴细胞反应体系内可以激活T细胞分泌IL-2。

图8显示了本发明的双特异性抗体在小鼠体内的半衰期。

图9显示了本发明的双特异性抗体抑制转入人PD-L1的CT-26细胞在人PD-L1/PD-1/4-1BB三转基因小鼠体内的生长。

图10显示了本发明的双特异性抗体抑制转入人PD-L1的MC38细胞在人PD-L1/4-1BB双转基因小鼠体内的生长。

图11显示了本发明的双特异性抗体在人4-1BB小鼠毒理试验肝组织HE染色未见明显单核细胞浸润。

图12显示了本发明的双特异性抗体在人4-1BB小鼠毒理试验肝组织IHC染色未见明显CD8阳性T细胞浸润。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体。具体地，实验结果表明，本发明的双特异性抗体具有阻断PD-L1与受体PD-1结合的功能；同时，该双特异性抗体还可以结合免疫细胞上的4-1BB，激活肿瘤微环境中的免疫细胞活性，更有效地提高抑制肿瘤发生和发展的效果。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

如本文所用，术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

如本文所用，术语“给予”、“施用”可互换使用，是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

双特异性抗体

如本文所用，术语“本发明的双特异性抗体”、“本发明的双抗”、“抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体”具有相同的含义，均指特异性识别和结合PD-L1和4-1BB的双特异性抗体。

本发明提供了一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体，其包括：抗PD-L1单域抗体和抗4-1BB单域抗体。

优选地，所述的双特异性抗体是由肽链i和肽链ii构成的二聚体，所述的肽链i和肽链ii的结构分别如式I和式II所示，

A-L1-Fc1-L2-B (式I)

A-L3-Fc2-L4-B (式II)

其中，

A、B各自独立地为无、抗PD-L1单域抗体或抗4-1BB单域抗体；

L1、L2和L3各自独立地为无或连接元件；

L4为连接元件；

“-”为肽键；

在本发明的实施方式中，所述的双特异性抗体是同二聚体或异二聚体。

在一个实施方式中，所述的Fc区为LALA突变型Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

在另一个实施方式中，所述Fc1和Fc2分别具有knob突变和hole突变。其中，所述的knob突变是指基于SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第132位具有S132C突变，并且第144位具有T144W突变。所述的hole突变是指基于SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第127位具有Y127C突变、第144位具有T144S突变，并且第146位具有L146A突变。

优选地，所述的Fc1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性；所述的Fc2的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示，或与SEQ ID NO:9所示序列具有≥85％(优选地90％，更优选地95％)的序列同一性。

如本文所用，术语“单域抗体”、“纳米抗体VHH”、“纳米抗体”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。

如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明双抗的亲和力可以通过KD值(解离常数)(或其它测定方式)进行评估或测定，例如生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)，使用FortebioRed96仪器测量确定。

如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的PD-L1/4-1BB双特异性抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-L1和/或4-1BB蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有PD-L1和/或4-1BB蛋白结合活性的双抗。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含相同CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合PD-L1和/或4-1BB蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的抗体

在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，PD-L1/4-1BB双特异性抗体可以用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。

检测方法

本发明还涉及检测PD-L1和/或4-1BB蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-L1和/或4-1BB蛋白的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测PD-L1和/或4-1BB水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-L1和/或4-1BB蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的单域抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PD-L1和/或4-1BB的临床诊断和靶向治疗，如肿瘤治疗。

本发明的主要优点包括：

1)本发明纳米抗体高特异性针对人的具有正确空间结构的PD-L1蛋白及4-1BB蛋白。

2)本发明双特异性抗体的亲和力强。

3)本发明双特异性抗体的生产简便。

4)本发明的双特异性抗体具有阻断PD-L1与受体PD-1结合的功能。同时该双特异性抗体还可以结合免疫细胞上的4-1BB，激活肿瘤微环境中的免疫细胞活性，更有效地提高抑制肿瘤发生和发展的效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：双特异抗体的克隆和表达

1.1抗体构建物的结构

在本实施例中，构建了4种抗4-1BB/PD-L1双特异性抗体，分别为：

Bi-400：由2条相同的多肽链组成，其结构示意图如图1A所示，肽链具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，其包含抗4-1BB的纳米抗体HZ-L-Yr-13&14-16-01氨基酸序列(SEQID NO:2)，在所述纳米抗体氨基酸序列C端直接连接衍生自人IgG1 Fc氨基酸序列(引入LALA突变以降低Fc功能，SEQ ID NO:3),将抗PD-L1的纳米抗体C-Ye-18-5(专利申请号：2019108631090)(SEQ ID NO:4)的N端通过21个氨基酸残基(G₄S)₄G(SEQ ID NO:5)的柔性肽连接于重链的C端。

Bi-088：由2条相同的多肽链组成，其结构示意图如图1B所示，肽链具有SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列，其包含抗PD-L1的纳米抗体C-Ye-18-5(专利申请号：2019108631090)(SEQ ID NO:4)，在所述纳米抗体氨基酸序列C端直接连接衍生自人IgG1Fc氨基酸序列(引入LALA突变以降低Fc功能，SEQ ID NO:3),将抗4-1BB的纳米抗体HZ-L-Yr-13&14-16-01氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的N端通过21个氨基酸残基(G₄S)₄G(SEQ ID NO:5)的柔性肽连接于重链的C端。

Bi-401-091：由2条多肽链组成，其结构示意图如图1C所以，肽链#1具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，其包含抗PD-L1的纳米抗体C-Ye-18-5(专利申请号：2019108631090)(SEQ ID NO:4)，在所述纳米抗体氨基酸序列C端直接连接衍生自人IgG1Fc氨基酸序列(引入LALA突变以降低Fc功能，引入Knob in hole突变以形成异源二聚体，SEQ ID NO:8),将抗4-1BB的纳米抗体HZ-L-Yr-13&14-16-01的N端通过21个氨基酸残基(G₄S)₄G(SEQ ID NO:7)的柔性肽连接于Fc的C端；肽链#2具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，其包含人IgG1 Fc氨基酸序列(引入LALA突变以降低Fc功能，引入Knob in hole突变以形成异源二聚体，SEQ ID NO:9)。

Bi-061-091：由2条多肽链组成，其结构示意图如图1D所以，肽链#1具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列；肽链#2具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，其包含抗PD-L1的纳米抗体C-Ye-18-5(专利申请号：2019108631090)(SEQ ID NO:4)，在所述纳米抗体氨基酸序列C端直接连接衍生自人IgG1 Fc氨基酸序列(引入LALA突变以降低Fc功能，引入Knob inhole突变以形成异源二聚体，SEQ ID NO:9)。

1.2基因克隆及蛋白制备

将上述基因片段构建入pCDNA3.1载体中。采用ExpiCHOTM表达系统试剂盒(购自Thermo)，将质粒转入Expi-CHO细胞中，转染方法按照商品说明书，细胞培养5天后收集上清利用蛋白A磁珠(购自金斯瑞)分选法纯化目的蛋白。将磁珠用适当体积的结合缓冲液(PBS+0.1％吐温20，pH 7.4)重悬(1-4倍磁珠体积)后加入至待纯化样品中，室温孵育1小时，期间温柔振荡。样品置于磁力架上(购自海狸)，弃去上清，磁珠用结合缓冲液清洗3遍。按照磁珠体积的3-5倍体积加入洗脱缓冲液(0.1M sodium citrate,pH 3.2)室温振荡5-10分钟，置回磁力架上，收集洗脱缓冲液，转移至已加入中和缓冲液(1M Tris，pH 8.54)的收集管中混匀。

实施例2：双特性抗体细胞水平结合

通过转染克隆到MCS的编码人或食蟹猴4-1BB(PD-L1)cDNA的pCHO1.0载体(购自Invitrogen)产生过表达人或食蟹猴4-1BB(PD-L1)的CHO细胞。将扩大培养的过表达细胞调整细胞密度至2×10⁶细胞/ml，100μl/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的4-1BB抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点，将上述稀释好的样品100μl/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。100μl/孔加入用PBS稀释100倍的羊F(ab’)2抗人IgG-Fc(PE)(购自Abcam)，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。100μl/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex(Bechman)流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。INBRX-105-1B(专利号：WO2017/123650A2)(SEQ NO ID:11)作为双特异性抗体阳性对照；将纳米抗体HZ-L-Yr-13&14-16-01连接到人IgG1 Fc(LALA突变)上(SEQ NO ID:3)，作为抗4-1BB阳性对照；将纳米抗体C-Ye-18-5(专利申请号：2019108631090)(SEQ ID NO:5)连接到人IgG1 Fc(LALA突变)上(SEQ NO ID:3)作为抗PD-L1阳性对照。此外，目前已经在临床研究阶段的两个抗4-1BB单克隆抗体utomilumab(专利号：US20120237498)(其重链和轻链的序列分别如SEQ NO ID:12和13所示)及urelumab(INN号:104)(其重链和轻链的序列分别如SEQ NO ID:14和15所示)被用作抗4-1BB阳性对照。

结果如图2A显示，不同结构的双特异抗体与人PD-L1过表达CHO细胞显示不同结合活性，有些结构结合活性与对照抗体相当；如图2B显示，不同结构的双特异抗体与食蟹猴PD-L1过表达CHO细胞显示不同结合活性，有些结构结合活性与对照抗体相当；如图2C显示，不同结构的双特异抗体与人4-1BB过表达CHO细胞显示不同结合活性，有些结构结合活性与对照抗体相当；图2D显示，不同结构的双特异抗体与食蟹猴4-1BB过表达CHO细胞显示不同结合活性，有些结构结合活性与对照抗体相当；图2E显示，不同结构的双特异抗体与CHO-S细胞均无明显的非特异性结合。

实施例3：双特异抗体阻断PD-L1与PD-1CHO细胞结合

本实施例中，将扩大培养的CHO-hPD-1细胞调整细胞密度至2×10⁶细胞/ml,100μl/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的双特性抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点，将上述稀释好的样品60μl/孔加入96孔样品稀释板，同时60μl/孔加入生物素标记的人PD-L1蛋白(购自AcroBiosystems)，终浓度为500ng/ml，4℃共孵育30分钟。将共孵育样品以100μl/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃孵育30分钟,PBS清洗两次。100μl/孔加入用PBS稀释100倍的APC羊抗鼠IgG抗体(购自Biolegend)，4℃孵育30分钟,PBS清洗两次。100μl/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex(Bechman)流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。

结果如图3显示，本发明不同结构的双特异性抗体均可以阻断PD-L1与PD-1的结合，且阻断水平随结构不同有所区别，有些结构的双特异抗体的阻断水平与对照抗体相当。

实施例4：双特性抗体细胞共结合检测

本实施例中，用CFSE(购自Thermo)标记人4-1BB过表达CHO细胞,用CTV(购自Thermo)标记人PD-L1过表达CHO细胞。用PBS分别重悬细胞调整细胞密度为4×10⁶细胞/ml，等比例混合两细胞悬液，50μl/孔加入96孔U底板(购自Thermo)内,同时50μl/孔加入PBS梯度稀释的双特性抗体，37℃孵育两小时，在CytoFlex(Bechman)流式细胞仪上进行检测并计算双阳性细胞比例。

结果如图4A显示，双特异抗体可以同时结合人4-1BB过表达CHO细胞和人PD-L1过表达CHO细胞，且结合活性随双特异性抗体结构不同有所区别。

实施例5：双特性抗体蛋白水平共结合试验

人4-1BB蛋白(购自ACRO)按照说明书溶解，用ELISA包被液(购自上海生工)稀释至1μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜，PBST清洗3次，200μl/孔加入5％BSA(购自上海生工)室温封闭1小时。弃去包被液，100μl/孔加入1％BSA梯度稀释的双特异性抗体，室温孵育2小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入1％BSA稀释的生物素标记的PD-L1蛋白(购自恺佧)，室温孵育1小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入1％BSA稀释的SA-HRP(购自abcam),室温孵育0.5小时。PBST清洗3次，100μl/孔加入ELISA显色液(购自索莱宝)室温反应3分钟，50μl/孔加入ELISA终止液(购自索莱宝)，读取450nm处吸光度数值。

结果如图4B显示，双特异抗体可以同时结合人4-1BB和人PD-L1蛋白，且结合活性随分子结构不同有所区别。

实施例6：双特性抗体激活活性检测(荧光素酶报告基因)

将编码人4-1BB的质粒及编码NF-κB荧光素酶报告基因质粒(购自Promega)共转入Jurkat细胞获得hu4-1BB Jurkat-NF-κB细胞。扩大培养hu4-1BB Jurkat-NF-κB细胞，1640完全培养基重悬细胞至4x10⁶细胞/ml。用1640完全培养基将过表达人PD-L1的CHO-S细胞，CHO-S细胞，过表达人PD-L1的CT-26细胞稀释至4x10⁵细胞/ml。将上述3种细胞悬液分别与hu4-1BB Jurkat-NF-κB细胞1:1混合均匀，50μl/孔加入无菌96孔白底板(购自nunc)内，加入1640完全培养基梯度稀释的双特异抗体样品。37℃，5％CO₂共孵育16小时，检测荧光素酶信号。

结果如图5A、5B、5C显示，双特异抗体样品在hu4-1BB Jurkat-NF-κB细胞与CHO-S细胞共孵育体系内未见明显信号激活，在hu4-1BB Jurkat-NF-κB细胞与过表达人PD-L1的CHO-S细胞或过表达人PD-L1的CT-26细胞共孵育系统内有显著信号激活活性。这是由于PD-L1引起的抗体聚集效应使得抗体另一端结合的Jurkat细胞上的4-1BB也聚集在一起，激活了NF-κB通路。

实施例7：双特性抗体激活活性检测(原代T细胞激活)

用丝裂霉素处理过表达人PD-L1的CHO-S细胞细胞或CHO细胞4小时，用X-VIVO15培养基调解细胞密度为2×10⁶细胞/ml。将OKT-3抗体(购自Biolegend)用无菌PBS(购自Hyclone)稀释至1μg/ml，100μl/孔包被96孔细胞培养平底板(购自Thermo)，37℃孵育两小时。复苏冻存的人PBMC(购自上海赛笠)，用人T细胞分离纯化试剂盒(购自Stemcell)分离出T细胞，用X-VIVO15培养基(购自LONZA)重悬T细胞，调整细胞密度为2×10⁶细胞/ml，与上述丝裂霉素处理过的过表达人PD-L1的CHO-S细胞或CHO细胞等比例混合。待抗体包被完成，弃去包被液，PBS清洗两次，弃去PBS，100μl/孔加入上述细胞混合液，同时100μl/孔加入X-VIVO15梯度稀释的双特异抗体样品。37℃，5％CO₂培养3天，收集上清检测IL-2含量。

实验结果如图6A、6B所示，双特异抗体样品在T细胞与CHO-S细胞共孵育体系内未见明显信号激活，在T细胞与过表达人PD-L1的CHO-S细胞共孵育系统内有显著T细胞激活和IL-2的释放。

实施例8：双特性抗体混合淋巴细胞反应

复苏PBMC细胞(购自SAILY BIO，SLB-HPB)，离心，用10ml X-VIVO-15培养基(购自LONZA)重悬PBMC，于细胞培养箱内37℃贴壁培养2小时，吸去未贴壁细胞。加入10ml DC培养基：X-VIVO-15培养基加入10ng/ml GM-CSF(购自R&D)，20ng/ml IL-4(购自R&D)，培养3天，补加5ml DC培养基，继续培养至第6天，加入DC成熟培养基：X-VIVO-15培养基加入1000U/mlTNF-α(购自R&D)，10ng/ml IL-6(购自R&D)，5ng/ml IL-1β(购自R&D)，1μM PGE2(购自Tocris)，培养2天，收集成熟的DC细胞，用X-VIVO-15培养基调整细胞密度为2×10⁵细胞/ml。

复苏另一位捐献者的PBMC细胞(购自SAILY BIO,SLB-HPB)，离心，用10ml X-VIVO-15培养基重悬PBMC。用T细胞分选试剂盒(购自Stemcell)富集T细胞，X-VIVO-15重悬T细胞，调整细胞密度为2×10⁶细胞/ml，和上述收集的成熟DC细胞按1:1比例混合，100μl/孔加入96孔U底板。同时100μl/孔加入X-VIVO-15培养基稀释双特性抗体样品，培养3天，收集上清，ELISA(购自eBioscience)方法检测IL-2表达量。

实验结果如图7所示，双特异抗体样品在混合淋巴细胞反应体系内可以激活T细胞释放IL-2。

实施例9：双特性抗体在小鼠体内半衰期

实验用Balb/c小鼠，雌雄各半，12/12小时光/暗调节，温度24±2℃，湿度40-70％，自由进水饮食。实验当天对Balb/c小鼠单次尾静脉注射双特异抗体分子，注射剂量为10mg/kg。

取血时间点：给药后5分钟、0.5小时、2小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、504小时于小鼠眼眶采血。全血样品2-8℃放置30分钟，12000rpm离心5分钟收集血清，所得血清再于2-8℃，12000rpm离心5分钟，-80℃保存，ELISA检测血清中双特异抗体分子含量。结果如图8所示，本发明双特异抗体分子在小鼠体内半衰期约为174小时。

实施例10：双特性抗体小鼠体内药效

本实验采用表达人PD-L1的CT-26细胞(h-PD-L1 KI CT-26)在人4-1BB/PD-L1/PD-1转基因小鼠(购自集萃药康)内测定双特异性抗体的抗肿瘤作用。首先采用皮下接种的方式建立h-PD-L1 KI CT-26荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至100-200mm³时进行分组，腹腔注射给予不同抗体和不同剂量的治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次，连续监测2到3周，给药剂量和方式如表1。

结果如图9显示，双特性抗体可以显著抑制h-PD-L1 KI CT-26细胞增长，抑制活性显著优于联合用药组和Urelumab对照组，抑制活性和对照抗体INBRX-105-1B相当。

表1双抗的肿瘤抑制活性实验方案

实施例11：人PD-L1/4-1BB双转基因小鼠移植huPD-L1 MC-38细胞药效模型

本实验采用表达人PD-L1的MC-38(huPD-L1 MC-38)细胞在PD-L1/4-1BB转基因小鼠(购自百奥赛图基因生物技术有限公司)测定Bi-088的抗肿瘤作用。首先采用皮下接种的方式建立huPD-L1 MC-38荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至80-120mm³时进行分组，腹腔注射给予不同抗体和不同剂量的治疗，给药剂量和方式如下表。待小鼠肿瘤完全消退后，在小鼠对侧接种新一轮的huPD-L1MC-38细胞，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次。

表2 Bi-088的肿瘤抑制活性实验方案

组别	给药剂量	给药次数
			阴性对照	N/A	3
Urelumab	4mg/kg	3
			Bi-088	3mg/kg	3
INBRX-105-1B	3mg/kg	3

表3小鼠再次接种后肿瘤消退情况

试验结果如图9所示，各组小鼠肿瘤完全消退情况如表所示。接种了huPD-L1MC-38细胞后阴性对照组肿瘤体积不断增大，而Bi-088组经治疗后6只小鼠肿瘤完全消退，且在最后一次给药后31天在对侧再次接种huPD-L1 MC-38细胞，肿瘤细胞也不再生长。

实施例12：人4-1BB转基因小鼠肝毒性试验

本实验在人4-1BB转基因小鼠(购自百奥赛图基因生物技术有限公司)测定Bi-088的肝毒性。Bi-088分子和对照分子按照下表方式给药。在初次给药后第20天安乐死小鼠取肝脏组织进行包埋固定，切片，HE染色和CD8阳性细胞染色。结果如图11、12所示：Urelumab组小鼠可见明显的肝内单核细胞浸润和CD8细胞阳性染色，INBRX-105-1B组部分小鼠可见明显的肝内单核细胞浸润和CD8细胞阳性染色，Bi-088组小鼠未见明显的肝内单核细胞浸润和CD8细胞阳性染色。

表4 4-1BB转基因小鼠肝毒性试验方案

组别	给药剂量	给药次数
			阴性对照	N/A	5天/次×4次
Urelumab	10mg/kg	5天/次×4次
			Bi-088	7.5mg/kg	5天/次×4次
INBRX-105-1B	7.5mg/kg	5天/次×4次

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 普米斯生物技术（珠海）有限公司

<120> 一种抗4-1BB/PD-L1双特异性抗体及其用途

<130> P2020-1620

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

210 215 220

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

Ser Leu Ser Pro Gly

340

<210> 11

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys

20 25 30

Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu

115 120 125

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

130 135 140

Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys

145 150 155 160

Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr

165 170 175

Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

180 185 190

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

195 200 205

Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser

210 215 220

Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

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325 330 335

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340 345 350

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

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Gly Lys

465

<210> 12

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

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Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

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65 70 75 80

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100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

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210 215 220

Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val

290 295 300

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305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

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340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

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405 410 415

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435 440

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

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1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

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Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

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Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 14

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

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1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

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225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

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275 280 285

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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

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<210> 15

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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65 70 75 80

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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

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130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括：

(a)抗PD-L1单域抗体；和

(b)抗4-1BB单域抗体；

所述的双特异性抗体包括1或2个抗PD-L1单域抗体，且所述抗PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的双特异性抗体包括1或2个抗4-1BB单域抗体，且所述抗4-1BB单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的双特异性抗体还包含源自人免疫球蛋白的Fc区，所述的Fc区为LALA突变型Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体是同二聚体或异二聚体。

3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，当所述的双特异性抗体是同二聚体时，其由两条相同的肽链通过二硫键所用形成，所述肽链各包括1个抗PD-L1单域抗体和1个抗4-1BB单域抗体，且所述肽链的Fc区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

当所述的双特异性抗体是异二聚体时，所述的双特异性抗体是由肽链i和肽链ii构成的二聚体，所述的肽链i和肽链ii的结构分别如式I和式II所示，

A-L1-Fc1-L2-B(式I)

A-L3-Fc2-L4-B(式II)

其中，

A、B各自独立地为无、抗PD-L1单域抗体或抗4-1BB单域抗体；

L1、L2和L3各自独立地为无或接头元件；

L4为接头元件；

Fc1、Fc2各自独立地为人免疫球蛋白的Fc区LALA突变型；和

“-”为肽键；

并且其中，式I所示的多肽与式II所示的多肽通过二硫键作用及杵-进入-臼结构(Knob–in-hole)而形成异源二聚体；

所述Fc1和Fc2分别具有knob突变和hole突变，所述的Fc1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述的Fc2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的人免疫球蛋白选自下组：IgG1。

5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述LALA突变型Fc含有Knob-in-hole突变型。

6.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体还含有接头元件，所述接头元件的序列为(G4S)n，其中，n为2或4。

7.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体是同二聚体，其由两条相同的肽链通过二硫键所用形成，所述肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

8.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体是同二聚体，其由两条相同的肽链通过二硫键所用形成，所述肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

9.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体是异二聚体，其由肽链i和肽链ii通过杵-进入-臼作用(Knob-in-hole)形成；其中，肽链i的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；并且肽链ii的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

10.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体是异二聚体，其由肽链i和肽链ii通过杵-进入-臼作用(Knob-in-hole)形成；其中，肽链i的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；并且肽链ii的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

11.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体。

12.如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，当所述双特异性抗体为异二聚体时，所述多核苷酸中，编码所述肽链i的多核苷酸序列与编码所述肽链ii的多核苷酸序列的比例为1:1。

13.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求11或12所述的多核苷酸。

14.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求13所述的载体，或其基因组中整合有如权利要求11或12所述的多核苷酸；

或者，所述的宿主细胞表达如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体。

15.一种产生如权利要求1-10中任一项所述双特异性抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在合适的条件下，培养如权利要求14所述的宿主细胞，从而获得含所述双特异性抗体的培养物；和

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纯化可以通过蛋白A亲和柱纯化分离获得目标抗体。

17.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、酶、金纳米颗粒或纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。

18.如权利要求17所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记物包括放射性核素。

19.如权利要求17所述的免疫偶联物，其特征在于，所述药物包括细胞因子。

20.如权利要求17所述的免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：多价的如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体。

21.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体，或如权利要求17-20中任一项所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-L1和/或4-1BB；其中，所述药剂用于治疗或预防PD-L1阳性的肿瘤。

22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。

23.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的药剂用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用，同时通过结合4-1BB激活免疫细胞。

24.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤，或其组合。

25.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(i)如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体，或如权利要求17-20中任一项所述的免疫偶联物；和

(ii)药学上可接受的载体。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤的其他药物。

27.如权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述其他药物选自：细胞毒性药物。

28.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体的一种或多种选自下组的非疾病诊断的和非疾病治疗的用途，包括：

(i)用于检测人PD-L1分子和/或4-1BB分子；(ii)用于流式检测；(iii)用于细胞免疫荧光检测；(iv)用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用；和(v)用于结合4-1BB激活免疫细胞。

29.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：(i)如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

30.一种非疾病诊断目的检测样品中PD-L1和/或4-1BB的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)将样品与如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体接触；(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-L1和/或4-1BB。

31.一种PD-L1和/或4-1BB检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包含如权利要求17-20中任一项所述的免疫偶联物和检测学上可接受的载体。

32.一种检测PD-L1和/或4-1BB的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求17-20中任一项所述的免疫偶联物或如权利要求31所述的检测试剂，以及说明书，其中所述说明书记载了所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的PD-L1和/或4-1BB表达。