CN114181300A - 一种高纯度单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种高纯度单克隆抗体的制备方法，涉及单克隆抗体提纯技术领域。该制备方法，包括以下步骤：(1)澄清；(2)蛋白A亲和层析；(3)低pH灭活；(4)中和；(5)中间品深层过滤；(6)混合模式层析；(7)除病毒过滤以及超滤渗滤。通过该制备方法纯化的单克隆抗体，纯度高，残留指标符合原液要求，不仅适用于小规模的实验室生产，而且适用于大规模的产业化生产。
Description
技术领域
本申请涉及单克隆抗体提纯技术领域，具体涉及一种高纯度单克隆抗体的制备方法。
背景技术
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。
单克隆抗体在现代生物检测和医疗领域所起到的作用越来越重要，不管是何种抗体，来源于哪种形式，在用于检测和治疗之前都需要纯化。而纯化工艺不仅要适用于小规模的实验室生产，还要适用于大规模的产业化生产。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供了一种高纯度单克隆抗体的制备方法，通过该制备方法纯化的单克隆抗体，纯度高，残留指标符合原液要求，不仅适用于小规模的实验室生产，而且适用于大规模的产业化生产。
一种高纯度单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将包含单克隆抗体的细胞发酵液使用离心机、深层过滤器以及除菌过滤器依次处理，得到包含单克隆抗体的第一处理物；
(2)将包含单克隆抗体的第一处理物在蛋白A亲和色谱柱上处理，得到包含单克隆抗体的第一洗脱物；
(3)调节包含单克隆抗体的第一洗脱物的pH值至3.6～3.7，进行病毒灭活，得到包含单克隆抗体的第二处理物；
(4)调节包含单克隆抗体的第二处理物的pH值至6.95～7.15，得到包含单克隆抗体的第三处理物；
(5)将包含单克隆抗体的第三处理物用深层过滤器进行过滤，得包含单克隆抗体的第四处理物；
(6)将包含单克隆抗体的第四处理物使用混合型阴离子交换色谱柱处理，得到包含单克隆抗体的第二洗脱液；
(7)将包含单克隆抗体的第二洗脱液用病毒过滤器处理，后经超滤渗滤，得到单克隆抗体滤液。
优选地，所述步骤(1)中深层过滤器包括初级深层过滤器和次级深层过滤器，所述初级深层过滤器、次级深层过滤器以及除菌过滤器依次串联。
优选地，所述初级过滤器与次级过滤器的膜包配比为2:1，所述初级过滤器的载量小于等于69L/m2，所述次级过滤器的载量小于等于138L/m2。
优选地，所述步骤(2)中蛋白A亲和色谱柱的柱高为22cm，柱直径为2.6cm，洗脱pH值为3.6～3.7。
优选地，所述步骤(2)中蛋白A亲和色谱柱的载量为12.5～35.0g/L。
优选地，所述步骤(3)中调节包含单克隆抗体的第一洗脱物的pH值至3.65。
优选地，所述步骤(4)中调节包含单克隆抗体的第二处理物的pH值至6.95。
优选地，所述步骤(5)中混合型阴离子交换色谱柱的柱高为20cm，柱直径2.6cm，洗脱pH值为4.5～5.5。
优选地，所述步骤(7)中在将包含单克隆抗体的第二洗脱液用病毒过滤器处理前，先用预过滤器过滤。
本申请的有益效果包括但不限于：
本申请提供的高纯度单克隆抗体的制备方法，对包含单克隆抗体的细胞发酵液进行澄清，可以去除细胞及碎片和大部分非可溶性杂质；亲和层析用于单克隆抗体的捕获以及杂质的去除；经低pH病毒灭活和中间品的深层过滤，可以去除潜在的脂包膜病毒和HCP等杂质；混合模式层析采用“结合-洗脱”的方式进一步去除抗体的电荷异构变体、部分HCP、残留蛋白A等杂质；使用除病毒过滤可以进一步去除潜在的病毒，尤其是非包膜病毒；经该制备方法纯化的单克隆抗体，纯度高，残留指标符合原液要求，不仅适用于小规模的实验室生产，而且适用于大规模的产业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
实施例中未注明具体条件的，按照本领域技术人员熟知的常规条件操作或者按照制造商建议的条件操作即可。所使用的原料、试剂或者仪器未注明生产厂商的，均通过商业途径购买。
本申请实施例中的包含单克隆抗体的细胞发酵液的来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体细胞发酵液，在以下实施例中将不再赘述。
说明：
PB指磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液；
SEC：Size Exclusion Chromatography，排阻层析法；
NR_CE：Non-reduced Capillary Electrophoresis，非还原的毛细管电泳；
R_CE：Reduced Capillary Electrophoresis，还原的毛细管电泳；
HCP：Host Cell Protein，宿主细胞蛋白；
DNA：Deoxyribose Nucleic Acid，脱氧核糖核酸；
ProA：Protein A，蛋白A；
NA：Not Applicable，不适用。
高纯度单克隆抗体的制备方法
1、澄清
步骤1.1、将放置包含单克隆抗体的细胞发酵液的容器、深层过滤器以及除菌过滤器依次串联，深层过滤器包括初级深层过滤器和次级深层过滤器，初级过滤器采用Millipore D0HC，次级过滤器采用Millipore A1HC，初级过滤器与次级过滤器的膜包配比为2:1，初级过滤器的载量小于等于69L/m2，次级过滤器的载量小于等于138L/m2；
步骤1.2、首先，使用纯水漂洗深层过滤器，进口流速控制在350～550LMH；
其次，使用平衡液平衡深层过滤器，进口流速控制在180～250LMH，平衡液由50mMPB(磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液)和150mM NaCl组成，该平衡液的pH值为7.5；
再次，过滤包含单克隆抗体的细胞发酵液，进口流速控制在30～50LMH；
最后，使用pH值为7.5的50mM PB和150mM NaCl淋洗深层过滤器，进口流速控制在20～40LMH；
步骤1.3、将经过深层过滤器过滤后的包含单克隆抗体的细胞发酵液再经除菌过滤器过滤，得到包含单克隆抗体的第一处理物。
其中，将包含单克隆抗体的细胞发酵液经过澄清处理后，实验结果见表1，表1为将澄清工艺放大后的实验结果。
表1
如果仅将包含单克隆抗体的细胞发酵液进行两级离心处理，具体操作步骤是：在15℃下，1000g×10min离心，取上清，并将上清进行二级离心，8000g×30min离心，取上清，计算其固含量为5.6％。
2、蛋白A亲和层析
此步骤使用蛋白A亲和色谱柱，柱高为22cm，柱直径为2.6cm；
步骤2.1、对蛋白A亲和色谱柱进行漂洗，漂洗用的溶液是pH值为7.5的50mM PB和150mM NaCl；
步骤2.2、对蛋白A亲和色谱柱进行使用前消毒，消毒使用的溶液是浓度为0.2M的NaOH，消毒20分钟；
步骤2.3、对蛋白A亲和色谱柱进行平衡，平衡使用的溶液是pH值为7.5的50mM PB和150mM NaCl；
步骤2.4、对蛋白A亲和色谱柱进行上样，样品为包含单克隆抗体的第一处理物，保留6min；
步骤2.5、对蛋白A亲和色谱柱进行第一次淋洗，第一次淋洗使用的溶液是pH值为7.5的50mM PB和150mM NaCl；
步骤2.6、对蛋白A亲和色谱柱进行第二次淋洗，第二次淋洗使用的溶液是pH值为7.5的50mM PB和150mM NaCl；
步骤2.7、对蛋白A亲和色谱柱进行第三次淋洗，第三次淋洗使用的溶液是pH值为5.2的100mM NaAc-HAc；
步骤2.8、对蛋白A亲和色谱柱进行洗脱，得到包含单克隆抗体的第一洗脱物，洗脱使用的溶液是pH值为3.65的100mM NaAc-HAc。
当蛋白A亲和色谱柱的载量分别为12.5g/L和35.0g/L时，亲和层析结果见表2。
表2
3、低pH灭活
使用浓度为1M的HAc调节包含单克隆抗体的第一洗脱物的pH值至3.65，得到包含单克隆抗体的第二处理物。
4、中和
使用浓度为1M的Tris-base调节包含单克隆抗体的第二处理物的pH值至6.95，得到包含单克隆抗体的第三处理物。
5、中间品深层过滤
中间品是指经过澄清、蛋白A亲和层析、低pH灭活以及中和处理后的包含单克隆抗体的第三处理物；使用的深层过滤器为Millipore A1HC；
步骤5.1、使用高纯水对深层过滤器进行漂洗；
步骤5.2、使用浓度为180mM、pH值为7.0的Tris-HAc对深层过滤器进行平衡；
步骤5.3、使用深层过滤器过滤包含单克隆抗体的第三处理物；
步骤5.4、使用浓度为180mM、pH值为7.0的Tris-HAc对深层过滤器进行淋洗；
得到包含单克隆抗体的第四处理物。
6、混合模式层析
此步骤使用的仪器是混合型阴离子交换色谱柱，柱高为20cm，柱直径2.6cm；洗脱pH值为5.0；
步骤6.1、使用浓度为1.2M的NaOH溶液对混合型阴离子交换色谱柱进行使用前消毒，消毒80min；
步骤6.2、使用浓度为180mM、pH值为7.0的Tris-HAc溶液对混合型阴离子交换色谱柱进行平衡；
步骤6.3、上样，在上样之前，先将包含单克隆抗体的第四处理物的pH值调节到6.9；
步骤6.4、使用浓度为180mM、pH值为7.0的Tris-HAc溶液对混合型阴离子交换色谱柱进行淋洗；
步骤6.5、对混合型阴离子交换色谱柱进行洗脱，洗脱液是浓度为45mM的NaAc-HAc，以及浓度为30mM的NaCl，洗脱液的pH值为5.0；
经洗脱后得到包含单克隆抗体的第二洗脱液。
7、除病毒过滤以及超滤渗滤
将包含单克隆抗体的第二洗脱液用病毒过滤器处理，后经超滤渗滤，得到单克隆抗体滤液。
将最终经过超滤浓缩渗液
此步骤中在使用病毒过滤器过滤包含单克隆抗体的第二洗脱液之前，将使用预过滤器过滤，预过滤器采用Millipore除菌过滤器，病毒过滤器采用Planova 15N过滤器；使用预过滤器和病毒过滤器的步骤相同，都包括使用高纯水进行漂洗；用pH值为5的45mM NaAc-HAc和30mM NaCl进行平衡，过滤后使用pH值为5的45mM NaAc-HAc和30mM NaCl进行淋洗。
3L包含单克隆抗体的细胞发酵液规模的产品质量及回收率见表3。
表3
可见，采用本申请的制备方法提纯后的单克隆抗体产品，纯度和残留指标均符合原液要求。
15L包含单克隆抗体的细胞发酵液规模的产品质量及回收率见表4。
表4
50L包含单克隆抗体的细胞发酵液规模的产品质量及回收率见表5。
表5
从表4和表5中可以看出，本申请的高纯度单克隆抗体的制备方法，不仅适用于小规模的实验室生产，也适用于大规模的产业化生产。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高纯度单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将包含单克隆抗体的细胞发酵液使用离心机、深层过滤器以及除菌过滤器依次处理，得到包含单克隆抗体的第一处理物；
(2)将包含单克隆抗体的第一处理物在蛋白A亲和色谱柱上处理，得到包含单克隆抗体的第一洗脱物；
(3)调节包含单克隆抗体的第一洗脱物的pH值至3.6～3.7，进行病毒灭活，得到包含单克隆抗体的第二处理物；
(4)调节包含单克隆抗体的第二处理物的pH值至6.95～7.15，得到包含单克隆抗体的第三处理物；
(5)将包含单克隆抗体的第三处理物用深层过滤器进行过滤，得包含单克隆抗体的第四处理物；
(6)将包含单克隆抗体的第四处理物使用混合型阴离子交换色谱柱处理，得到包含单克隆抗体的第二洗脱液；
(7)将包含单克隆抗体的第二洗脱液用病毒过滤器处理，后经超滤渗滤，得到单克隆抗体滤液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中深层过滤器包括初级深层过滤器和次级深层过滤器，所述初级深层过滤器、次级深层过滤器以及除菌过滤器依次串联。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述初级过滤器与次级过滤器的膜包配比为2:1，所述初级过滤器的载量小于等于69L/m2，所述次级过滤器的载量小于等于138L/m2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋白A亲和色谱柱的柱高为22cm，柱直径为2.6cm，洗脱pH值为3.6～3.7。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋白A亲和色谱柱的载量为12.5～35.0g/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中调节包含单克隆抗体的第一洗脱物的pH值至3.65。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中调节包含单克隆抗体的第二处理物的pH值至6.95。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中混合型阴离子交换色谱柱的柱高为20cm，柱直径2.6cm，洗脱pH值为4.5～5.5。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中在将包含单克隆抗体的第二洗脱液用病毒过滤器处理前，先用预过滤器过滤。
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