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CN114127301B - 用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法 - Google Patents

用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法 Download PDF

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CN114127301B CN201980081433.5A CN201980081433A CN114127301B CN 114127301 B CN114127301 B CN 114127301B CN 201980081433 A CN201980081433 A CN 201980081433A CN 114127301 B CN114127301 B CN 114127301B
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Immuno Vir Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种用于治疗对象中肿瘤的组合物，其包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD‑1抗体的溶瘤性单纯疱疹病毒。其中外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。

Description

用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法
技术领域
本发明涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物，特别涉及包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）的药物组合物。本发明还涉及一种包含携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和oHSV的药盒，以及使用所述药物组合物和所述药盒治疗肿瘤的方法。
背景技术
癌症作为一种疾病是多方面的敌人，它可以屈服于指定的治疗方法，也可以对各种疗法产生抵抗力。肿瘤内的细胞子集对常规治疗方式有抵抗力，并且可以导致疾病复发。
手术治疗癌症是常见的局部治疗。除了血液系统的某些恶性肿瘤（例如白血病，淋巴瘤等）外，其他各种恶性肿瘤还具有一种或多种可以通过手术移除的有形实体瘤。但是，手术总是有一定的风险，并且经常有其他并发症或潜在的器官功能障碍。
迄今为止，非手术治疗癌症（主要是常规化学疗法、靶向生物疗法和放射疗法）尚未取得完全令人满意的结果。持续存在的问题包括靶标选择性低、耐药性、无法有效解决转移性疾病和严重的副作用。相反，目前整体上激发宿主免疫力来诱导针对肿瘤的全身反应的免疫疗法提供了许多临床前景。
溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）正被广泛地进行实体瘤治疗的研究。溶瘤性单纯疱疹病毒在整体上相比传统癌症疗法有很多优点。具体而言，oHSV通常包含突变以使它们易受先天性免疫的抑制。因而，它们能够在癌细胞中复制，而不能在正常细胞中复制，因为在这些癌细胞中，一种或多种对感染的先天免疫反应受损害，而在正常细胞中这些免疫反应是完整的。oHSV通常被直接递送至肿瘤实体中，病毒可以在肿瘤实体中复制。因为病毒被递送至靶组织而不是全身性地给药，所以这种抗癌药不会产生任何副作用。病毒的一个特征是能够诱导获得性免疫反应，这导致它们不能被多次施用。oHSV已被多次施用至肿瘤，但没有证据显示它们的效力丧失或诱导出副反应（如炎症反应）。HSV是大的DNA病毒，其能够将外源DNA加入到它们的基因组中并在施用至肿瘤后调节这些基因的表达。适合与oHSV一起使用的外源基因是那些能够帮助对肿瘤诱导出获得性免疫反应的基因。
克服细胞先天免疫反应的缺陷决定了该病毒作为抗癌剂能够溶瘤的肿瘤范围。缺失的序列越多，能够被治疗的癌细胞的范围就越窄，oHSV的有效性取决于被缺失的病毒基因的功能。大多数最近的oHSV加入了至少一个细胞基因以支持其抗癌活性。
oHSV疗法的成功取决于对癌细胞的破坏程度。在oHSV疗法的早期开发过程中就意识到，HSV无法单独杀死实体瘤中的所有癌细胞，oHSV治疗不太可能可以有效地消除所有癌细胞，在临床试验中，oHSV对肿瘤的破坏必须包括对肿瘤的获得性免疫反应。进一步的研究显示，由受感染的肿瘤细胞碎片引起的抗肿瘤免疫反应可通过加入细胞因子而被放大。无细胞因子基因的oHSV与加入免疫刺激性细胞因子的oHSV的比较结果证实了这种猜想并且最终导致将GM-CSF加入到oHSV中，用于治疗黑素瘤。
加入编码免疫刺激性细胞因子的基因可增强对肿瘤的免疫反应，但不会有效地增强由T细胞导致的细胞毒作用，后者对于抗肿瘤作用至关重要。肿瘤通过PD-1和CTLA4抑制途径来使免疫系统沉默。PD-1在活化的T细胞上以及其他造血细胞上表达，而CTLA4表达于活化的T细胞，包括调节性T细胞。肿瘤使用PD-1和CTLA4抑制途径来逃避宿主免疫反应。
尽管在临床前和临床环境中进行了广泛的研究和测试，但用于治疗肿瘤的方法仍然存在未满足的需求。
概述
在一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体，以及治疗有效量的表达免疫刺激剂或免疫刺激剂和抗PD-1抗体的溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）。
外泌体包含外泌体包装相关的基序（下文中也指“外泌体基序”），该基序任选地通过连接子可操作地连接至靶向CTLA4的miRNA。在一个实施方案中，所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA，其中靶向CTLA4的miRNA具有结合CTLA4的mRNA的种子序列；并且外泌体基序与靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强靶向CTLA4的miRNA包装至外泌体中。在一些实施方案中，外泌体基序位于靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。在一些实施方案中，外泌体基序位于靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并通过连接子与其连接。在一些实施方案中，外泌体基序是通过突变靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。在一些实施方案中，外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序。在一些实施方案中，当可操作地连接时，靶向CTLA4的miRNA与外泌体基序共享至少一个或两个核苷酸。
oHSV是表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的重组溶瘤HSV-1。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体、治疗有效量的oHSV和药学上可接受的载体。外泌体包含外泌体包装相关的基序，该基序任选地通过连接子可操作地连接至靶向CTLA4的miRNA。oHSV表达免疫刺激剂，或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗肿瘤的药盒，其包含携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV。药盒可以进一步包含使用外泌体和oHSV治疗肿瘤的说明。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗对象中的肿瘤的方法，该方法包含同时向该对象施用治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV。
本发明的另一方面涉及一种用于在对象中增强oHSV疗法的功效的方法，除oHSV疗法外，该方法包含向有此需要的对象施用治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。
通过阅读下面的描述，将容易获得本发明的其他方面。
附图说明
图1。图A是编码靶向CTLA4的miRNA的质粒的示意图。该质粒由编码EGFP的序列组成，在其3'-UTR中包含编码设计的靶向CTLA4基因的miRNA（miR-CTLA-4）的序列。图B示出了靶向小鼠CTLA4基因的miRNA的核苷酸序列。以粗体、斜体和下划线突出显示的核苷酸表示外泌体包装相关的基序（外泌体基序）。图C示出了设计的miRNA对CTLA4的下调。将接种在24孔板中的HEp-2细胞与0.25 μg表达10个编码针对CTLA4（1#-10#）的miRNA或非目标miRNA（NT）的DNA序列的质粒和0.25 μg编码His标记的小鼠CTLA4（His-标记的CTLA4）的质粒共转染。转染72小时后收获细胞。使用本领域技术人员公知的方法测量CTLA4和GAPDH的积累。
图2。携带miR-CTLA-4的外泌体的表征。将接种于T150烧瓶中的HEp-2细胞用10 μgmiR-CTLA-4-3#质粒或表达非目标miRNA（NT）的质粒转染，然后在无血清培养基中孵育。48小时后收集培养基并如材料和方法中所述的纯化外泌体。对纯化的外泌体进行2个系列的分析。首先（图A）等量的产生外泌体的细胞和等量的外泌体被溶解，在变性凝胶中进行电泳，并用抗CD9、Flotilin-1和Calnexin的抗体进行探测。通常，纯化的外泌体含有CD9、Flotilin-1，但缺乏Calnexin。由转染的细胞产生的外泌体的大小分布（图B）按照材料和方法中所述的进行。
图3。携带miR-CTLA-4的外泌体单独施用（图A）或其与T1012G（图B）、T2850（图C）或T3855（图D）同时施用对MFC肿瘤生长的影响。MFC肿瘤细胞被皮下注射至C57BL/6J小鼠的右侧。将平均80 mm3的MFC肿瘤以8只动物为一组，单独注射10 μg外泌体或其与50 μl 1×107pfu T1012G、T2850或T3855同时注射。所有研究同时进行，结果显示在4个图中。肿瘤体积显示为每组8只动物的平均值±SEM。
本发明的详细说明
定义
要注意的是，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“外泌体”被理解为表示一个或多个外泌体。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度与序列共有的匹配或同源位置的数目相关。“不相关的”或“非同源的”序列与本文的其中一个序列共享小于40％的同一性，优选小于25％的同一性。
一个多核苷酸或多核苷酸区域（或一个多肽或多肽区域）与另一个序列具有特定百分数（例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％）的“序列同一性”是指，当比对时，在比较两个序列时该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。
如本文所使用的，术语“连接子”是指含有两个或更多个相同的或不同的核苷酸的核苷酸序列的短片段，其中所述核苷酸选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。
如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，目的是预防或减缓（减轻）不希望的生理变化或紊乱，例如肿瘤的进展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，缓解症状、减少疾病程度、稳定（即不恶化）肿瘤状态、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、延迟或减慢肿瘤进展、改善或减轻肿瘤状态以及症状消失（无论是部分还是全部），无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的病人包括那些已经患有肿瘤的人，以及那些容易患有肿瘤的人。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文的对象优选是人。
如本文所使用的，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的对象”等短语包括受益于施用本发明的用于例如检测、诊断程序和/或治疗的组合物的对象，例如哺乳动物对象。
本发明尤其使用反义寡聚体和类似物用于调节编码CTLA4的核酸分子的功能或作用。本发明的寡聚物与其靶核酸的杂交通常称为“反义”。因此，被认为包括在本发明的一些优选实施方案的实践中的优选机制在本文是指“反义抑制”。此类反义抑制通常基于寡核苷酸链或区段的基于氢键的杂交，使得至少一条链或区段被切割、降解或以其他方式使其不可操作。在这方面，目前优选靶向特定核酸分子及其用于这种反义抑制的功能。
被干扰的RNA的功能可以包括诸如RNA易位至蛋白质翻译位点、RNA易位至细胞内远离RNA合成位点的位点、蛋白质从RNA翻译、RNA的剪接产生一种或多种RNA种类、以及涉及RNA参与或由RNA促进的催化活性或复合物形成。这种干扰靶核酸功能的一个优选结果是调节CTLA4的表达。在本发明的上下文中，“调节”和“表达调节”意指减少（抑制）编码基因的核酸分子（例如DNA或RNA）的量或水平。mRNA通常是优选的靶核酸。
在本发明的上下文中，“杂交”是指互补的寡聚体链的配对。在本发明中，优选的配对机制涉及氢键，其可以是寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基（核碱基）之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过形成氢键而配对。杂交可以在不同的情况下发生。
在本发明中，短语“严格的杂交条件”或“严格的条件”是指本发明化合物与其靶序列杂交但与最少数量的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的，并且在本发明的上下文中，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚体的性质和组成以及它们被研究的测定法决定。
如本文所使用的，“互补的”是指寡聚化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸（寡聚化合物）的某个位置处的核碱基能够与靶核酸的某个位置处的核碱基形成氢键，则所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，然后，寡核苷酸和靶核酸之间氢键的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被能够彼此结合成氢键的核碱基占据时，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够数量的核碱基足够程度的精确配对或互补性，使得在寡核苷酸和靶核酸之间稳定的和特异性的结合的术语。
应理解，在本领域中反义寡聚体的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补即可特异性杂交。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，使得插入或相邻区段不参与杂交事件（例如环结构或发夹结构）。优选本发明的反义化合物与靶核酸内的靶区域具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％的序列互补性，更优选地是它们包含至少90％的序列互补性，甚至更优选地包含它们与被靶向的靶核酸序列内的靶区域至少95％或至少99％的序列互补性。例如，反义寡聚体的20个核碱基中的18个与靶区域互补并因此特异性杂交的反义化合物将代表90％的互补性。在该实施例中，剩余的非互补核碱基可以与互补的核碱基成簇或散布，并且不需要彼此邻接或与互补的核碱基邻接。因此，长度为18个核碱基的反义寡聚体具有4个非互补核碱基，其侧翼为与靶核酸完全互补的两个区域，与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此属于本发明的范围。可以使用本领域已知的BLAST程序（基础的局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序常规地确定反义化合物与靶核酸的区域的互补百分比。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）的寡聚物或聚合物或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间（骨架）键组成的寡核苷酸，以及具有相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。这种修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，因为其具有所需的性质，例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力以及在核酸酶存在下增加的稳定性。
如本文所用，术语“microRNA”、“miRNA”或者“miR”是指起转录后调节基因表达的功能的RNA，通常通过结合靶信使RNA（mRNA）转录本的3’非翻译区（3’UTRs）的互补序列，通常导致基因沉默。miRNA通常是小的调节RNA分子，例如长度为21或22个核苷酸。术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”可互换使用。
如本文所使用的，术语“肿瘤”是指恶性组织，其包含不受控制地生长的转化细胞（即过度增殖性疾病）。肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、浆细胞瘤等；以及实体瘤。可以根据本发明治疗的实体瘤的实施例包括但不限于恶性肿瘤和癌，例如黑色素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤（Ewing’s tumor）、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤（Wilms’ tumor）、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。
如本文所使用的，术语“CTLA4”是指“细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4”，其是能够通过抑制共刺激并向T细胞传递抑制信号来减弱T细胞活化的许多共抑制分子中的一个。CTLA4的氨基酸序列可从NCBI获得，登录号为NP_033973.2或NP_001268905.1。CTLA4也称为Ctla-4、Cd152或Ly-56。CTLA4的NCBI序列登录号为NC_000067.6，基因ID为12477。人CTLA4基因编码属于免疫球蛋白超家族的233个氨基酸蛋白质。CTLA4由一个侧翼为两个疏水区的V样结构域组成。CTLA4还可以改变免疫突触的结构，在T细胞增殖和分化中起关键作用。CTLA4的多态性与多种疾病的易感性有关，包括I型糖尿病、胆汁性肝硬变和格雷夫斯氏病（Graves' disease）。
如本文所使用的，术语“IL-12”是指“白细胞介素12”，其是具有有效抗肿瘤作用的细胞因子。因此，IL-12诱导TH-1型免疫反应，这可以提供持久的抗肿瘤作用。据报道，IL-12具有体内抗血管生成活性，这也可以有助于其抗肿瘤作用。最后，据报道IL-12可刺激产生高水平的IFN-γ，具有多种免疫调节作用，包括刺激CTL、自然杀伤细胞和巨噬细胞的活化以及诱导/增强II类MHC抗原表达的能力。IFN-γ在诱导T细胞向肿瘤部位迁移的过程中起重要作用。肿瘤内IFN-γ水平的增加与肿瘤负荷大小的减小相关。
程序性细胞死亡1（PD-1）是最初通过经历细胞凋亡的小鼠T细胞系的消减杂交鉴定的50-55 kDa I型跨膜受体（Ishida et al., 1992, Embo J. 11:3887-95）。CD28基因家族的成员PD-1在激活的T细胞、B细胞和骨髓谱系细胞上表达（Greenwald et al.,2005.Annu. Rev. Immunol. 23:515-48; Sharpe et al., 2007, Nat. Immunol. 8:239-45）。人和鼠PD-1具有约60％的氨基酸同一性，具有四个潜在的N-糖基化位点和定义Ig-V结构域的残基的保守性。PD-1负调节T细胞活化，并且该抑制功能与其胞质结构域的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序（ITIM）相关（Parry et al., 2005, Mol. Cell. Biol. 25:9543-53）。破坏PD-1的这种抑制功能能够导致自身免疫。
如本文所使用的，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别并结合一种或多种抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此，术语“抗体”包括任何具有抗原结合生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的蛋白质或肽。这样的实施例包括，但不限于，重链或轻链的互补决定区（CDR）或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架（FR）区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。术语抗体还包括在激活时具有抗原结合能力的多肽或多肽复合物。
“治疗有效量”是指本发明的溶瘤病毒和/或外泌体以足以用于如上所述“治疗”的量被施用。在治疗特定个体的疾病或病症中治疗有效的量将取决于疾病的症状和严重程度，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中推断有效剂量。
靶向CTLA4的miRNA
术语“靶向CTLA4的多个miRNA”、“靶向CTLA4的一个miRNA”、“靶向CTLA4的miRNA”在本文中可互换使用，是指设计用于靶向或特异性结合编码蛋白质CTLA4的mRNA的小的非编码RNA（microRNA或miRNA），使得CTLA4在细胞中的转录、翻译和反过来表达受损、减少或消除。如上所述，miRNA不一定以100％特异性结合靶mRNA。已知miRNA具有种子序列（5'末端的2至8个核苷酸），其决定与靶mRNA结合的特异性，而剩余的核苷酸不一定与靶mRNA完全互补。因此，在一个实施方案中，miRNA具有核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或者SEQ ID NO: 4中的任何一个的种子序列。在一些实施方案中，靶向CTLA4的miRNA在递送至细胞后阻断细胞中CTLA4蛋白的表达。
携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体
外泌体是来自细胞膜的小的、相对尺寸均匀的囊泡。例如，外泌体具有约30至约100 nm的直径。它们含有几种关键蛋白质（例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜联蛋白、Flotillin等），此外它们包装蛋白质、mRNA、长非编码RNA和miRNA。外泌体将有效负载从一个细胞传递至另一个细胞。在进入受体细胞后，外泌体有效负载被释放到细胞质中。
在一些实施方案中，靶向CTLA4的miRNA通过外泌体递送至细胞。因此，在一个实施方案中，提供了携带如上所述的任何靶向CTLA4的miRNA的外泌体。本发明使用本文提到的“外泌体基序”的核苷酸序列片段，以促进或增强miRNA包装到外泌体中。在一个实施方案中，外泌体基序选自表1中确定的任何序列。
表1 与本发明的miRNA一起使用的外泌体基序的序列
序列ID 核苷酸序列 序列ID 核苷酸序列
SEQ ID NO. 21 5’-GGAG-3’ SEQ ID NO. 36 5’-CGCC-3’
SEQ ID NO. 22 5’-GGAC-3’ SEQ ID NO. 37 5’-CGGG-3’
SEQ ID NO. 23 5’-GGCG-3’ SEQ ID NO. 38 5’-CGGC-3’
SEQ ID NO. 24 5’-GGCC-3’ SEQ ID NO. 39 5’-CCCU-3’
SEQ ID NO. 25 5’-GGGG-3’ SEQ ID NO. 40 5’-CCCG-3’
SEQ ID NO. 26 5’-GGGC-3’ SEQ ID NO. 41 5’-CCCA-3’
SEQ ID NO. 27 5’-UGAG-3’ SEQ ID NO. 42 5’-UCCU-3’
SEQ ID NO. 28 5’-UGAC SEQ ID NO. 43 5’-UCCG-3’
SEQ ID NO. 29 5’-UGCG SEQ ID NO. 44 5’-UCCA-3’
SEQ ID NO. 30 5’-UGCC SEQ ID NO. 45 5’-GCCU-3’
SEQ ID NO. 31 5’-UGGG SEQ ID NO. 46 5’-GCCG-3’
SEQ ID NO. 32 5’-UGGC SEQ ID NO. 47 5’-GCCA-3’
SEQ ID NO. 33 5’-CGAG SEQ ID NO. 48 5’-GGAGGAC-3’
SEQ ID NO. 34 5’-CGAC SEQ ID NO. 49 5’-GGACUGGGAG-3’
SEQ ID NO. 35 5’-CGCG-3’ SEQ ID NO. 50 5’-GGAGGAG-3’
SEQ ID NO. 51 5’-GGACGGAG-3’ SEQ ID NO. 52 5’-GGAGGCGGAG-3’
在一些实施方案中，外泌体基序被组合使用。例如，将表中确定的两个或更多个外泌体基序组合以形成双倍外泌体基序。基序可以通过将一个外泌体基序的5'末端连接至另一个外泌体基序的3'末端而被线性组合。在这种情况下，当一个外泌体基序的5'末端的第一个核苷酸与另一个外泌体基序的3'末端的最后一个核苷酸相同时，相同的核苷酸中的一个可以被设计为被省略。例如，“GGAG”（SEQ ID NO. 21）与“GGAC”（SEQ ID NO. 22）组合以形成双倍外泌体基序“GGAGGAC”（SEQ ID NO. 48）。而当一个外泌体基序的5'末端的第一个核苷酸与另一个外泌体基序的3'末端的最后一个核苷酸不相同时，两个外泌体基序可以通过一个连接子连接或通过共价键连接。例如，“GGAC”（SEQ ID NO. 22）与“GGAG”（SEQ IDNO. 21）可以通过连接子“UG”连接以形成双倍外泌体基序“GGACUGGGAG”（SEQ ID NO. 49），“GGAC”（SEQ ID NO. 22）与“GGAG”（SEQ ID NO. 21）也可以通过共价键连接以形成双倍外泌体基序“GGACGGAG”（SEQ ID NO. 51）。本发明还考虑了三倍或更多倍的外泌体基序，即由SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47中的三个或更多个基序组成的外泌体基序。因此，本文使用的术语“外泌体基序”意在包括能够增强或促进miRNA包装至外泌体的核苷酸序列，包括SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47的任何单一外泌体基序和任何由单一基序的组合产生的双倍（例如SEQ ID NO.48-52中任一个）、三倍或更多倍的外泌体基序。
在本发明中，外泌体基序与miRNA的种子序列可操作的连接。术语“可操作的连接”是指调节序列（例如外泌体基序）和核酸序列（例如miRNA的种子序列）之间的功能性连接，导致增强或促进miRNA包装进外泌体中。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。可操作地连接的RNA序列可以彼此邻接，也可以通过连接子连接。
在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游。在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的上游。在一些实施方案中，miRNA的种子序列侧翼为外泌体基序。在一个实施方案中，外泌体基序可操作地连接至miRNA的种子序列。在一个实施方案中，外泌体基序是通过突变miRNA的除种子序列以外的一个或多个核苷酸序列而获得的。在一个实施方案中，具有外泌体基序的靶向CTLA4的miRNA含有SEQ ID NO. 5、SEQ IDNO. 6、SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的核苷酸序列。在一个实施方案中，具有外泌体基序的靶向CTLA4的miRNA是SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的核苷酸序列。
在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，种子序列的3'末端最后的核苷酸和外泌体基序的5'末端第一核苷酸共享相同的核苷酸，例如核苷酸“G”。例如，SEQ ID NO. 6示出了外泌体基序和种子序列之间核苷酸“G”的共享。在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，种子序列的3'末端最后两个的核苷酸和外泌体基序的5'末端前两个核苷酸共享两个相同的核苷酸，例如，两个核苷酸“GG”。例如，SEQID NO. 8示出了外泌体基序和种子序列之间两个核苷酸“GG”的共享。
在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，其通过连接子（例如“GC”）与种子序列连接。例如，SEQ ID NO. 7示出了外泌体基序与种子序列通过连接子“GC”连接。
除了种子序列和外泌体基序之外，miRNA还包括另外的核酸序列以促进与mRNA的靶区域的结合。这些另外的核酸通常位于外泌体基序的下游，具有几个核苷酸的长度，例如1至10个核苷酸。另外的核酸序列优选与靶mRNA的相应区段互补，但是，如上所述，不一定是100％互补的。
miRNA转移到外泌体中的方法是在本领域中可获得的，例如如实施例中所述的通过用miRNA表达载体和编码CTLA4的质粒共转染细胞。外泌体的分离、鉴定或表征在本领域中技术上是可行的。几种蛋白质，例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜联蛋白、Flotillin等能够被用作外泌体的标记物。将miRNA包装到外泌体中的其他方法也适用于本发明。
本发明的外泌体含有抑制量的靶向CTLA4的miRNA。抑制量是指一旦所讨论的miRNA递送到肿瘤细胞中就足以抑制蛋白质CTLA4表达的量。
下表列出了本发明实施例中使用的miRNA、种子序列和miRNA-基序的核酸序列。
表2 miRNA、种子序列以及与外泌体基序连接的miRNA的核酸序列
序列ID 身份 描述 核酸序列
SEQ ID NO. 1 miR-CTLA4-1# 种子序列 5’-ACCUUCA-3’
SEQ ID NO. 2 miR-CTLA4-2# 种子序列 5’-UUCAGUG-3’
SEQ ID NO. 3 miR-CTLA4-3# 种子序列 5’-CUGUGCU-3’
SEQ ID NO. 4 miR-CTLA4-6# 种子序列 5’-UCCAAGG-3’
SEQ ID NO. 5 miR-CTLA4-1# miRNA + 外泌体基序 5’-AACCUUCAGUGGAGUUGGCGA-3’
SEQ ID NO. 6 miR-CTLA4-2# miRNA + 外泌体基序 5’-CUUCAGUGGAGUUGGCGAGCA-3’
SEQ ID NO. 7 miR-CTLA4-3# miRNA + 外泌体基序 5’-ACUGUGCUGCGGAGGACAAAU-3’
SEQ ID NO. 8 miR-CTLA4-6# miRNA + 外泌体基序 5’-AUCCAAGGACUGGGAGCUGUU-3’
SEQ ID NO. 9 miR-CTLA4-4# 种子序列 5’-GACAUUC-3’
SEQ ID NO. 10 miR-CTLA4-5# 种子序列 5’-AACCUCA-3’
SEQ ID NO. 11 miR-CTLA4-7# 种子序列 5’-CUCAUGU-3’
SEQ ID NO. 12 miR-CTLA4-8# 种子序列 5’-GCAACGG-3’
SEQ ID NO. 13 miR-CTLA4-9# 种子序列 5’-GGCAACG-3’
SEQ ID NO. 14 miR-CTLA4-10# 种子序列 5’-GACUGUG-3’
SEQ ID NO. 15 miR-CTLA4-4# miRNA + 外泌体基序 5’-CGACAUUCACGGAGGAGAAUA-3’
SEQ ID NO. 16 miR-CTLA4-5# miRNA + 外泌体基序 5’-GAACCUCACCCUCCAAGGACU-3’
SEQ ID NO. 17 miR-CTLA4-7# miRNA + 外泌体基序 5’-ACUCAUGUACCCUCCGCCAUA-3’
SEQ ID NO. 18 miR-CTLA4-8# miRNA + 外泌体基序 5’-GGCAACGGGAGGCGGAGUUAU-3’
SEQ ID NO. 19 miR-CTLA4-9# miRNA + 外泌体基序 5’-GGGCAACGGGACGGAGAUUUA-3’
SEQ ID NO. 20 miR-CTLA4-10# miRNA + 外泌体基序 5’-UGACUGUGCUGCGGCGGACAA-3’
溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）
如本文所使用的，溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）是指本领域已知的被设计为可用于或有效破坏肿瘤细胞的任何溶瘤I型单纯疱疹病毒（HSV-1）。此外，本发明中使用的oHSV也可以被基因工程化，从而删除天然oHSV的一个或多个特征。此外或替代地，天然存在的oHSV可以被基因工程化以将一个或多个编码序列的外源片段引入病毒的基因组，从而提供病毒的一种或多种附加功能，例如免疫治疗或免疫刺激特性。本领域技术人员将会理解，本发明的被缺失的核苷酸的确切起始位置和终止位置取决于HSV-1病毒的菌株和基因组异构体，并且可以容易地通过本领域已知的技术确定。在一些实施方案中，缺失导致基因组中核苷酸117005至132096的切除。在一些实施方案中，oHSV选自HSV-1的毒株17（GenBank登录号NC001806.2）、毒株KOS 1.1（GenBank登录号KT899744）或毒株F（GenBank登录号GU734771.1）。在一些实施方案中，oHSV是HSV-1的毒株F。
在一些实施方案中，oHSV是基因工程化的HSV-1 F毒株，其表达选自GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27的免疫刺激剂。在一些实施方案中，oHSV是仅表达IL-12的基因工程化HSV-1 F毒株。在一些实施方案中，oHSV是表达IL-12和抗PD-1抗体的基因工程化HSV-1 F毒株。
方法与疗法
本发明的一个方面提供一种用于治疗对象中肿瘤的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV。
本发明的一个方面提供一种用于在对象中增强oHSV疗法的功效的方法，除oHSV疗法外，所述方法还包含向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。在一些实施方案中，oHSV表达免疫刺激剂，或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体。在一些实施防范中，oHSV仅表达IL-12。在一些实施方案中，oHSV表达IL-12和抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，在本发明的方法中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV的施用通过给对象施用药物组合物来进行，所述药物组合物包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体、治疗有效量的表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV、以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，在本发明的方法中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV的施用是通过分别向对象施用携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV来进行的。在一些实施方案中，在表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV的施用之前、同时或之后施用携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至72小时内以两种形式给对象施用。然而，在某些情况下，可能希望将治疗时间显著延长，在单独的施用之间间隔几天（2、3、4、5、6或7）至几周（1、2、3、4、5、6、7或8）的时间。
在一些实施方案中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体与表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV同时施用。在一些实施方案中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体以包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和药学上可接受的载体的药物组合物的形式被施用，并且表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV以包含治疗有效量的表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV和药学上可接受的载体的药物组合物的形式被施用。在这样的实施方案中，包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和药学上可接受的载体的药物组合物，以及包含治疗有效量的表达免疫刺激剂或表达免疫刺激剂和抗PD-1抗体的oHSV和药学上可接受的载体的药物组合物可以被包装在单个药盒中。
在某些实施方案中，任何药物组合物被肠胃外或非胃肠外施用，例如肿瘤内地、静脉内地、肌肉内地、经由皮肤地或皮内地。在一些实施方案中，任何药物组合物优选地被肿瘤内施用。
在某些实施方案中，治疗肿瘤的方法增强oHSV疗法的抗肿瘤功效，例如就抑制肿瘤生长和/或减少肿瘤体积而言。因此，在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗肿瘤的方法，该方法包含将如上所述的治疗有效量的外泌体与治疗有效量的oHSV组合施用于有此需要的对象。在某些实施方案中，治疗肿瘤的方法防止与肿瘤有关的症状的发作、发展和/或复发。因此，在一些实施方案中，用于防止对象中与肿瘤相关的症状的方法包含将如上所述的治疗有效量的外泌体与治疗有效量的oHSV施用于有此需要的对象。
在一些实施方案中，oHSV是基因工程化的HSV-1 F毒株，其表达选自GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27的免疫刺激剂。在一些实施方案中，oHSV是仅表达IL-12的基因工程化HSV-1 F毒株。在一些实施方案中，oHSV是表达IL-12和抗PD-1抗体的基因工程化HSV-1 F毒株。
考虑了本发明的方法来治疗各种肿瘤，特别是实体瘤。能够根据本发明治疗的实体瘤的实施例包括但不限于恶性肿瘤和癌，例如黑素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。
药物组合物和药盒
本发明的一个方面提供一种药物组合物，其包含如上所述的治疗有效量的外泌体、治疗有效量的oHSV和药学上可接受的载体。该药物组合物被用于预防或治疗对象的肿瘤。可以在合适的药学上可接受的载体或赋形剂中制备药物组合物。
本发明的另一方面提供第一药物组合物，其包含如上所述的治疗有效量的外泌体和药学上可接受的载体。另外，本发明还提供第二药物组合物，其包含如上所述的治疗有效量的oHSV和药学上可接受的载体。在这样的方面，本发明提供一种药盒，其包括以单个包装的第一药物组合物和第二药物组合物。该药盒可以进一步包括医师在临床使用期间能够参考的使用说明。
在一些实施方案中，oHSV是基因工程化的HSV-1 F毒株，其表达选自GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27的免疫刺激剂。在一些实施方案中，oHSV是仅表达IL-12的基因工程化HSV-1 F毒株。在一些实施方案中，oHSV是表达IL-12和抗PD-1抗体的基因工程化HSV-1 F毒株。
在常规的储存和使用条件下，这些制剂/组合物包含防腐剂以防止微生物的生长。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的程度。该形式必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须进行防止微生物（例如细菌和真菌）的污染。
载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和/或植物油。在分散的情况下，例如通过使用诸如卵磷脂的包衣维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖、氯化钠或磷酸盐缓冲盐水。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂（例如单硬脂酸铝和明胶），可以使可注射组合物的吸收延长。
对于肠胃外以水溶液施用，例如，溶液应适当地缓冲（如果需要的话），并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。就此而言，根据本发明的内容，能够使用无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1 mL的等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000 mL的皮下灌注液中，或者在所建议的输注位置注射（参见例如"Remington'sPharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580）。根据所治疗的对象的状况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责施用的人员将确定用于个体对象的适当剂量。此外，对于人体施用，制剂应满足FDA所要求的无菌性、无热原性、一般安全性和纯度标准。
通过将活性化合物以需要的量与上面列举的各种其它成分按需要合并在合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自上面列举的所需其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分及任何其他所需成分的粉末。
本发明的组合物可以被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐（与蛋白质的游离氨基形成），包括与无机酸（如盐酸或磷酸）或有机酸（如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等）形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱（例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁）和有机碱（如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等）。在配制时，溶液将以与剂量配方相配的方式以及治疗上有效的量被施用。该制剂易于以各种剂型（如可注射溶液、药物释放胶囊等）施用。
如本文所使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。用于药物活性物质的这样的介质和药剂的使用在本领域是公知的。除了与活性成分不相容的任何常规的介质或试剂之外，预期其他介质或试剂可以用于所述治疗组合物中。补充的活性成分也可以并入组合物中。
短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和成分。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域公知的。典型地，这样的组合物被制备为注射剂，无论作为液体溶液或混悬液；也可以制备为适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
实施例
我们描述了一种辅助疗法的发展，该疗法由被工程化以携带和释放miRNA（尤其是被设计为靶向编码CTLA4检查点的mRNA）至肿瘤细胞中的外泌体组成。
外泌体是根据大小和蛋白质含量定义的用于治疗应用目的的细胞外囊泡。它们在产生它们的细胞中包装RNA和蛋白质，并将货物运送到暴露它们的细胞中。在本报告中描述的研究中，所需的外泌体有效载荷是miRNA。
miRNA是有效的工具，原则上能够被用于控制编码某些蛋白质的RNA的复制。目的是设计能够阻止细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4复制并且可以通过外泌体递送至被感染的细胞的miRNA。我们设计了10个靶向编码CTLA4的mRNA的miRNA。在这10个miRNA中，miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-3#和miR-CTLA4-6#在转染到易感细胞中后能有效阻断CTLA4的积累。为了促进miRNA包装到外泌体中，我们将miR-CTLA4-3#的序列合并至外泌体包装基序。根据我们之前的研究，miR-CTLA4-3#能够被包装到外泌体中，并成功地通过外泌体递送至易感细胞，并在易感细胞中保持稳定至少72小时。此外，通过外泌体递送至肿瘤的miR-CTLA4-3#有效降低了CTLA4的表达。
将RNA并入外泌体中是序列依赖性的，并且由hnRNPA2B1（一种外泌体的组分）促进。hnRNPA2B1分为外泌体RNA，包含两种已知的外泌体包装基序（外泌体基序）中的一种。hnRNPA2B1的关键功能是调节mRNA运输至神经细胞中的轴突，其是通过结合称为RNA运输序列（RTS）的21-nt RNA序列介导的。该序列包含两个外泌体基序。
我们鉴定了一种对鼠T1、T2和T3系列oHSV的溶瘤活性具有相对抗性的鼠肿瘤。oHSV的T1系列是不表达免疫调节剂（以下也称为“T1012G”）的HSV-1 F毒株。oHSV的T2系列是仅表达IL-12的HSV-1 F毒株（以下也称为“T2850”）。oHSV的T3系列是同时表达IL-12和抗PD-1抗体（以下也称为“T3855”）的HSV-1 F毒株。
实施例显示，通过将包含T3855（或T2850）和携带被设计为靶向编码CTLA4的mRNA的miRNA的外泌体的组合物递送至肿瘤能够增强T2850（尤其是T3855）的抗肿瘤功效，并且能够减少肿瘤体积。
材料和方法
同源小鼠模型。MFC肿瘤的同源小鼠是Balb/c。
表达miR-CTLA-4的质粒。使用Life Technologies的BLOCK-iT™ RNAi Designer设计针对小鼠CTLA4的目标miRNA序列，并由Ige Biotechnology（中国广州）合成。合成的miRNA片段用BamHI和XhoI限制酶消化，并克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒（Invitrogen）的相应位点。miRNA的序列如下：
miR-CTLA4-1#：
5’-AACCTTCAGTGGAGTTGGCGAGTTTTGGCCACTGACTGACTcGCCAACCACTGAAGGTT-3’(SEQID NO. 53)；
miR-CTLA4-2#：
5’-CTTCAGTGGAGTTGGCGAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTCGCCCtCCACTGAAG-3’(SEQID NO. 54)；
miR-CTLA4-3#：
5’-ACTGTGCTGCGGAGGACAAATGTTTTGGCCACTGACTGACATTTGTCCCGCAGCACAGT-3’(SEQID NO. 55)；
miR-CTLA4-4#：
5’-CGACATTCACGGAGGAGAATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATTCTCCCGTGAATGTCG-3’(SEQID NO. 56)；
miR-CTLA4-5#：
5’-GAACCTCACCCTCCAAGGACTGTTTTGGCCACTGACTGACAGTCCTTGGGGTGAGGTTC-3’(SEQID NO. 57)；
miR-CTLA4-6#：
5’-ATCCAAGGACTGGGAGCTGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACAGCTCAGTCCTTGGAT-3’(SEQID NO. 58)；
miR-CTLA4-7#：
5’-ACTCATGTACCCTCCGCCATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATGGCGGGGTACATGAGT-3’(SEQID NO. 59)；
miR-CTLA4-8#：
5’-GGCAACGGGAGGCGGAGTTATGTTTTGGCCACTGACTGACATAACTCCCTCCCGTTGCC-3’(SEQID NO. 60)；
miR-CTLA4-9#：
5’-GGGCAACGGGACGGAGATTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAAATCTCTCCCGTTGCCC-3’(SEQID NO. 61)；
miR-CTLA4-10#：
5’-TGACTGTGCTGCGGCGGACAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGTCCGCCAGCACAGTCA-3’(SEQID NO. 62)；
下划线表示成熟的miRNA序列。
带有His标签的小鼠CTLA4表达质粒（mCTLA4-his）购自YouBio Biotechnology（中国长沙）。
细胞系。HEp-2细胞从美国菌种保藏中心获得，并在补充有5%（vol/vol）胎牛血清（FBS）的DMEM（Life Technologies）中常规培养。MFC（小鼠前胃癌）细胞由JOINNLaboratories，Inc.（中国北京）提供。B16（小鼠黑色素瘤）由深圳国际生物医学研究所（中国深圳）提供。
抗体。本研究中使用的抗体是抗-His-标签（Cat No. 66005-1-Ig，ProteintechGroup）和抗-GAPDH（Cat No.2118，Cell Signaling Technology）。
外泌体分离。用10 μg 表达miR-CTLA-4的质粒转染HEp-2细胞（5×106）。孵育4小时后，将细胞用PBS冲洗3次以排除外泌体在血清中的潜在污染，并将细胞在无血清培养基中再培养48小时。收集上清液与推荐剂量的总外泌体分离试剂盒试剂（Thermo Fisher CatNo. 4478359）混合，在4℃下储存过夜，然后离心1小时。然后将沉淀的外泌体重悬于200 μlPBS中或在RIPA缓冲液中裂解，然后根据制造商的说明使用增强型BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国）通过BCA检测进行定量。通过针对标准曲线的校准来确定外泌体蛋白质含量，该标准曲线是通过将562 nm处的吸光度相对于牛血清白蛋白标准浓度作图来获得。
外泌体大小和定量分析。使用qNano系统（Izon，基督城，新西兰）进行外泌体大小分布分析。Izon的qNano技术（www.izon.com）被用于通过单分子电泳检测穿过纳米孔的细胞外囊泡。在实践中，它能够准确地逐个颗粒地表征外泌体大小从75至150 nm的囊泡，而无需平均颗粒大小。纯化的外泌体在含有0.05% Tween-20的PBS中稀释至1：10，剧烈摇晃，并根据制造商的说明使用NP150（A45540）纳米孔孔径进行测量。数据处理和分析在IzonControl Suite软件v3.3（Izon Science）上进行。
免疫印迹分析。通过免疫印迹法检测带有His标签的CTLA-4、GAPDH和外泌体标记蛋白。收获细胞并用补充有1 mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（Beyotime）和磷酸酶抑制剂（Beyotime）的RIPA裂解缓冲液（Beyotime）裂解。使细胞裂解物热变性，并通过SDS-PAGE分离，转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。蛋白质通过以下方法检测：先与适当的一抗一起孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗（Pierce）和ECL试剂一起孵育，并暴露于薄膜或用ChemiDoc Touch Imaging System（Bio-Rad）捕获图像，然后使用ImageLab软件进行处理。使用ImageJ软件对相应条带的密度进行定量。
oHSV构建体。示例性oHSV（例如T2850和T3855）的构建体涉及一种重组溶瘤I型单纯疱疹病毒(HSV-1)，其包含（a）经修饰的HSV-1基因组，其中所述修饰包含在野生型HSV-1基因组的UL56基因的启动子与US1基因的启动子之间的序列缺失，使得（i）所有双拷贝基因的一个拷贝被缺失，并且（ii）用于表达所述缺失后的病毒DNA中存在的所有开放阅读框（ORF）所需的序列是完整的；以及（b）编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被稳定地加入到至少是所述经修饰的HSV-1基因组的被缺失的区域。当只有一个编码免疫刺激剂或免疫治疗剂的外源性核酸序列被插入时，该外源性核酸序列优选被整合到基因组的被缺失的区域中。当多于一个编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列被插入时，第一外源性核酸序列优选被插入到基因组的被缺失的区域中。第二个或更多个外源性核酸序列被插入到基因组的L组分中。WO2017/181420提供了对溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）的构建和特性的更详细描述。
结果
设计和产生含有miR-CTLA-4的外泌体（miR-CTLA-4 exo）
第一系列实验的目的是设计和产生含有靶向CTLA4的miRNA的外泌体。为此，我们首先构建了10个miRNA，分别命名为miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-3#、miR-CTLA4-4#、miR-CTLA4-5#、miR-CTLA4-6#、miR-CTLA4-7#、miR-CTLA4-8#、miR-CTLA4-9#和miR-CTLA4-10#。图1A中示出的每个miRNA的序列包含在miRNA种子序列的下游示为外泌体包装相关基序（exo-motifs）的另外的序列。如图1A所示，如材料和方法中所述的将miRNA克隆到miRNA表达载体的编码EGFP的开放阅读框的下游，命名为“pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒”。
然后，为了测试miRNA，将HEp-2细胞与上述miRNA表达载体（miRmCTLA4-1#、miRmCTLA4-2#、miRmCTLA4-3#、miRmCTLA4-4#、miRmCTLA4-5#、miRmCTLA4-6#、miRmCTLA4-7#、miRmCTLA4-8#、miRmCTLA4-9#、miRmCTLA4-10#）和在C末端用His标记的编码CTLA4的质粒（mCTLA4-His）共转染。如图1B所示，在抑制CTLA4积累的过程中，miR-CTLA4-3#是10个构建体中最有效的。结果表明，miR-CTLA4-3#以更高效率抑制CTLA4的积累。miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-4#、miR-CTLA4-5#、miR-CTLA4-6#和miR-CTLA4-7#显示中等程度的作用，而非目标（NT）、miR-CTLA4-8#、miR-CTLA4-9#和miR-CTLA4-10#质粒对CTLA4的积累没有影响（图1C）。因此，选择miR-CTLA4-3#进行进一步研究。
在下一步中，我们构建了编码所选miR-CTLA-4的外泌体。用10 μg编码miR-CTLA4-3#的质粒或表达非目标miRNA（NT）的质粒转染接种在T150烧瓶中的HEp-2细胞。48小时后，收获细胞外培养基并如材料和方法中所述的纯化外泌体。
携带miR-CTLA-4的外泌体的表征
进行了几个实验来表征携带miR-CTLA-4的外泌体。首先，等量的产生外泌体的细胞与等量的外泌体被溶解，在变性凝胶中进行电泳，并用具有CD9、Flotilin-1和 Calnexin的抗体进行探测。正如预期的那样，结果（图2A）显示外泌体含有CD9和Flotilin-1，但不含有Calnexin。
然后，从用10 μg编码miR-CTLA4的质粒或表达非目标miRNA的质粒转染的HEp-2细胞纯化外泌体，通过使用Izon的qNano技术的纳米颗粒跟踪分析测量外泌体的大小。结果（图2B）显示经转染的细胞产生的外泌体平均直径为100至200 nm。
携带miR-CTLA-4的外泌体和oHSV同时施用至植入的MFC肿瘤中增强T3 oHSV的溶 瘤活性，而没有增强T1或 T2 oHSV的溶瘤活性
在本系列实验的第一步中，用miR-CTLA4-3#的质粒转染HEp-2的重复培养物，培养细胞48 h。然后，如材料和方法中所述纯化在HEp-2中产生的外泌体（miR-CTLA-4 exo）。
在第二步中，如材料和方法中所述构建oHSV T1012G、T2850和T3855。然后在8组每组8只C57BL/6J小鼠的右侧皮下注射小鼠前胃癌（MFC）细胞以产生肿瘤。当肿瘤平均达到80mm3时，肿瘤内单次单独注射1×107 pfu的T1012G（图3B）、T2850（图3C）或T3855（图3D）或分别与10 μg miR-CTLA-4外泌体组合注射。
最后，每3天或4天测量一次肿瘤体积，直到注射后26天。结果表明注射后每个组中肿瘤体积逐渐增大。图3A显示注射miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积增大的几乎与对照的肿瘤体积一样快，并且注射后26天时，注射miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积大于对照的肿瘤体积。图3B显示注射后对照组、T1012G组和T1012G + miRNA-CTLA4 exo组的肿瘤体积逐渐增大。注射26天后，注射T1012G + miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积小于对照组和T1012G组的肿瘤体积。在图3C中，T2850组和T2850 + miRNA-CTLA4 exo组的肿瘤体积比对照组的肿瘤体积增加得更慢。注射26天后，T2850组和T2850 + miRNA-CTLA4 exo组的肿瘤体积均小于对照组的肿瘤体积，并且T2850 + miRNA-CTLA4 exo组的肿瘤体积与单独的T2850组的肿瘤体积没有显著差异。在图3D中，T3855 + miRNA-CTLA4 exo组的肿瘤体积增加最慢，其次是T3855组，最后是对照组。注射26天后，对照组的肿瘤体积最大，其次是T3855组的肿瘤体积，T3855 + miRNA-CTLA4 exo组的肿瘤体积最小。
这一系列实验的结果表明，T2850和T3855可以有效抑制肿瘤的生长，同时瘤内施用T3855和miRNA-CTLA4 exo增强了T3855的抗肿瘤功效，抑制了肿瘤的生长。
结果表明，miR-CTLA4-3#靶向CTLA-4并下调CTLA-4的表达。我们还说明了miR-CTLA4-3#被包装在外泌体中，并且纯化的外泌体含有CD9、Flotilin-1但缺乏Calnexin。转染质粒miR-CTLA4-3#或非目标miRNA（NT）的Hep-2细胞产生的外泌体的直径平均为100-200nm。本文的结果还表明，单独表达IL-12或表达IL-12和抗PD-1抗体的oHSV能够有效抑制肿瘤的生长。最后，我们已经表明，同时在肿瘤内施用携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和表达IL-12和抗PD-1抗体的oHSV能够增强oHSV的抗肿瘤功效并抑制肿瘤的生长。
应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选的特征被具体公开，但是对本文所呈现的内容的修改、改进和变化是本领域技术人员容易意识的，并且这些修改、改进和变化被认为是在本发明的范围内。本文提供的材料、方法和实施例是优选的实施方案的代表，是示例性的，并非意图作为对本发明范围的限制。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用明确地整体并入本文，其程度如同每个单独地通过引用并入一样。如果发生冲突，以本说明书（包括定义）为准。本文说明性描述的公开内容可以在缺少本文未具体公开的任何要素、限制的情况下适当地被实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地阅读而不受限制。另外，本文使用的术语和表达被用作描述性的而非限制性的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等效物或其部分，但应认识到，在本发明所要求保护的范围内可以进行各种修改。
序列表
<110> 深圳市亦诺微医药科技有限公司
<120> 用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法
<130> 21D-1815-CNP
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-1# 种子序列
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accuuca 7
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<211> 7
<212> RNA
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<220>
<223> miR-CTLA4-2# 种子序列
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<212> RNA
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<210> 4
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<212> RNA
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<220>
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acugugcugc ggaggacaaa u 21
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auccaaggac ugggagcugu u 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-9# 种子序列
<400> 13
ggcaacg 7
<210> 14
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-10# 种子序列
<400> 14
gacugug 7
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-4# + 外泌体基序
<400> 15
cgacauucac ggaggagaau a 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-5# + 外泌体基序
<400> 16
gaaccucacc cuccaaggac u 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-7# + 外泌体基序
<400> 17
acucauguac ccuccgccau a 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-8# + 外泌体基序
<400> 18
ggcaacggga ggcggaguua u 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-9# + 外泌体基序
<400> 19
gggcaacggg acggagauuu a 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-10# + 外泌体基序
<400> 20
ugacugugcu gcggcggaca a 21
<210> 21
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 21
ggag 4
<210> 22
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 22
ggac 4
<210> 23
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 23
ggcg 4
<210> 24
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 24
ggcc 4
<210> 25
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 25
gggg 4
<210> 26
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 26
gggc 4
<210> 27
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 27
ugag 4
<210> 28
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 28
ugac 4
<210> 29
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 29
ugcg 4
<210> 30
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 30
ugcc 4
<210> 31
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 31
uggg 4
<210> 32
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 32
uggc 4
<210> 33
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 33
cgag 4
<210> 34
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 34
cgac 4
<210> 35
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 35
cgcg 4
<210> 36
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 36
cgcc 4
<210> 37
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 37
cggg 4
<210> 38
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 38
cggc 4
<210> 39
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 39
cccu 4
<210> 40
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 40
cccg 4
<210> 41
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 41
ccca 4
<210> 42
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 42
uccu 4
<210> 43
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 43
uccg 4
<210> 44
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 44
ucca 4
<210> 45
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 45
gccu 4
<210> 46
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 46
gccg 4
<210> 47
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 47
gcca 4
<210> 48
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 48
ggaggac 7
<210> 49
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 49
ggacugggag 10
<210> 50
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 50
ggaggag 7
<210> 51
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 51
ggacggag 8
<210> 52
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外泌体基序
<400> 52
ggaggcggag 10
<210> 53
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-1#的序列
<400> 53
aaccttcagt ggagttggcg agttttggcc actgactgac tcgccaacca ctgaaggtt 59
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-2#的序列
<400> 54
cttcagtgga gttggcgagc agttttggcc actgactgac tgctcgccct ccactgaag 59
<210> 55
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-3#的序列
<400> 55
actgtgctgc ggaggacaaa tgttttggcc actgactgac atttgtcccg cagcacagt 59
<210> 56
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-4#的序列
<400> 56
cgacattcac ggaggagaat agttttggcc actgactgac tattctcccg tgaatgtcg 59
<210> 57
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-5#的序列
<400> 57
gaacctcacc ctccaaggac tgttttggcc actgactgac agtccttggg gtgaggttc 59
<210> 58
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-6#的序列
<400> 58
atccaaggac tgggagctgt tgttttggcc actgactgac aacagctcag tccttggat 59
<210> 59
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-7#的序列
<400> 59
actcatgtac cctccgccat agttttggcc actgactgac tatggcgggg tacatgagt 59
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-8#的序列
<400> 60
ggcaacggga ggcggagtta tgttttggcc actgactgac ataactccct cccgttgcc 59
<210> 61
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-9#的序列
<400> 61
gggcaacggg acggagattt agttttggcc actgactgac taaatctctc ccgttgccc 59
<210> 62
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-CTLA4-10#的序列
<400> 62
tgactgtgct gcggcggaca agttttggcc actgactgac ttgtccgcca gcacagtca 59

Claims (16)

1.一种用于治疗对象中肿瘤的药物组合物，其包含：
治疗有效量的外泌体，
治疗有效量的溶瘤性单纯疱疹病毒，以及
药学上可接受的载体，
其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中，并且
其中所述溶瘤性单纯疱疹病毒是表达IL-12和抗PD-1抗体的HSV-1；
其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列为如SEQ ID NO.3所示的核酸序列；
其中所述外泌体基序为如SEQ ID NO.48所示的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，当可操作地连接时，所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序构成SEQ ID NO.7的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述HSV-1是HSV-1的F毒株。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中天然骨架的117005至132096的核苷酸序列片段被删除。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述恶性肿瘤是前胃癌。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述对象是人。
9.一种用于治疗对象中肿瘤的药盒，其包含：
(a)治疗有效量的外泌体，其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中,
(b)治疗有效量的溶瘤性单纯疱疹病毒，其中所述溶瘤性单纯疱疹病毒是表达IL-12和抗PD-1抗体的HSV-1；
其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列为如SEQ ID NO.3所示的核酸序列；
其中所述外泌体基序为如SEQ ID NO.48所示的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的药盒，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。
11.根据权利要求9所述的药盒，其中，当可操作地连接时，所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序构成SEQ ID NO.7的核酸序列。
12.根据权利要求9所述的药盒，其中所述HSV-1是HSV-1的F毒株。
13.根据权利要求12所述的药盒，其中天然骨架的117005至132096的核苷酸序列片段被删除。
14.根据权利要求9所述的药盒，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。
15.根据权利要求14所述的药盒，其中所述恶性肿瘤是前胃癌。
16.根据权利要求9所述的药盒，其中所述对象是人。
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