CN114107503A - 一种检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针、构建方法及包含此探针的诊断试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针、构建方法及包含此复合探针的诊断试剂，所述复合锁核酸磁珠探针在同一磁珠中包含三种探针:FAM荧光基团标记的LNA probe‑486‑5p探针、Cy5荧光基团标记的LNA probe‑21探针和TAMRA荧光基团标记的LNA probe‑210探针。本发明通过生物素‑链霉亲和素连接将修饰荧光标记的DNA探针分子固定在磁珠上。DNA探针序列与靶标miRNA相匹配并发生杂交形成双链，在DSN酶作用下，杂合双链中的DNA探针水解为碎片，荧光基团分子悬浮在反应液中，但miRNA却保持完整并再次与DNA探针杂交并发生DSN酶切反应。如此反复，最终体系的荧光基团数量得到显著放大。通过测试上层清液中荧光基团的信号强度即可实现对靶标miRNA浓度的灵敏检测。本发明可便捷且超灵敏地同时检测体液中三种不同的肺癌标志物miRNA，精准诊断肺癌。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和核酸化学领域，具体涉及一种检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针、构建方法及包含此探针的诊断试剂。
背景技术
在我国大、中城市居民的许多死亡原因中，癌症是第一位的。世界卫生组织作出最新权威性结论，癌症患者如能早期发现，治愈率可达80％以上。因此，进行癌症的早期诊断是非常必要的。癌症早发现、早治疗可以减轻患者的痛苦和精神、经济负担。
在癌症患者中，肺癌占20％以上。肺癌的传统早期检测技术包括胸部X线摄影、低剂量计算机断层扫描(LDCT)和肺活检。然而，这些技术在肺癌的早期检测中存在一些局限性，包括高假阳性率、侵袭性、潜在的过度诊断、过高的成本或辐射诱发的癌症。另一方面，标准免疫测定法已成为检测肺癌生物标志物的成熟技术，但到目前为止，还没有找到灵敏度、特异性100％的肿瘤标志物。单一指标、单一因子的检测很难准确的实现肿瘤早期检测、病程监控及预后治疗效果的评估等。如传统的Elisa方法，仅能进行单一蛋白因子的检测。若要提高检测的准确性和特异性，需要进行多个Elisa实验检测不同的蛋白因子。以10个蛋白因子检测为例，需要10个Elisa试剂盒，至少1mL的样本，一周时间才能得到结果。无论从人力、财力还是时间和样本量来说，都不是很好的选择。而且10个因子不是同时检测也可能造成结果的误差。此外，这些免疫测定法大多为单重测定法，对检测疾病早期低浓度的生物标志物不够敏感。所以需要开发一种灵敏度高的早期肺癌检测技术。
近年来，科学家提出了通过标志物来诊断肺癌，其中对微小核糖核酸miRNA的研究较多。miRNA是一种非编码RNA，一般是18-25个碱基长度。研究表明，人类约30％的基因受到miRNA的调控，miRNA的表达水平与人类多种疾病的发生密切相关。传统定量检测miRNA的方法主要包括Northern blotting、原位杂交、微阵列法、滚环扩增和反转录聚合酶链反应等。这些方法大体可以归为无需样本扩增的探针直接杂交法和基于样本miRNAs扩增的检测方法。它们各有优缺点：不经过扩增的方法操作简便，但对样本量需求较大，且灵敏度较低；而基于扩增的方法灵敏度较高，但其受限于无法直接检测miRNAs水平和非特异性扩增。其原因在于miRNAs的序列很短，这些扩增手段及相应的探针设计都是非常精细和复杂的过程。传统PCR技术大都通过检查其前体而进行间接判断，并不能反映真实的miRNAs水平。并且，miRNAs在体液中的表达量远低于其在组织中的表达，因此常规检测组织中miRNAs的技术并不一定适用于体液miRNAs的检测。
而实际临床应用中却需要同时检测得到体液中多种miRNAs标志物的含量水平从而准确诊断肺癌。这是目前现有技术所无法达到的。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针及其构建方法，该探针为复合三种LNA且清交叉杂交的磁珠探针，相对于标准血清，能同时检测到待测样本中与探针对应的三种miRNA表达水平的明显差异。
本发明提供的一种检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针，所述复合锁核酸磁珠探针在同一磁珠中包含三种探针:FAM荧光基团标记的LNA probe-486-5p探针、Cy5荧光基团标记的LNA probe-21探针和TAMRA荧光基团标记的LNA probe-210探针。
本发明还提供上述的检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针的构建方法，所述方法包括步骤：
(1)锁核酸探针分子制备：根据待测标志物miRNA-486-5p，miRNA-21与miRNA-210分子碱基序列，合成对应的锁核酸作为捕获探针LNA probe-486-5p，LNA probe-21与LNAprobe-210，并在LNA probe-486-5p探针两端分别修饰FAM荧光基团和生物素分子，
在LNA probe-21探针两端分别修饰Cy5荧光基团和生物素分子，
在LNA probe-210探针两端分别修饰TAMRA荧光基团和生物素分子，
将三种探针按照1:1:1分子比例混合，制得LNA探针混合物；
(2)锁核酸探针分子固定在磁珠上：所述探针混合物95℃预热清交叉杂交后与链霉亲和素磁珠SMBs悬浊液混合，在室温条件下培育；
(3)清洗：首先将培育后的复合锁核酸磁珠探针液用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的DNA探针，然后用TT缓冲液重复清洗，再将磁珠探针加入到TT缓冲液中进行重悬后在80℃下培育，除去液体中结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到一种检测miRNA标志物的复合磁珠锁核酸探针。
进一步，所述的复合锁核酸磁珠探针的构建方法，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠悬浊液按照如下方法制备：将超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠SMBs，在室温条件下，用1×BW缓冲液清洗并用永久磁铁固定链霉亲和素磁珠后滤掉上层清液，再分散到2×BW缓冲液中制得SMBs悬浊液。
其中，BW缓冲液(探针固定和冲洗缓冲液)按照如下方法配制：先配制0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1mM EDTA溶液，然后将pH值调到8.0。
进一步，步骤(2)中，所述LNA探针复合物与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmol LNA与20μg MBs链霉亲和素磁珠的比例进行混合。
进一步，步骤(2)中，制成的复合锁核酸磁珠探针液中所述每种LNA的浓度为1μM。
进一步，步骤(2)中，所述预热为在95℃下预热5min；所述培育为37℃培育20分钟。
进一步，步骤(3)中，所述NaOH溶液的浓度为0.15M；所述TT缓冲液按照如下方法配制：向250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的
20，并将pH调到8.0；所述培育为80℃培育10分钟。
本发明还提供上述复合锁核酸磁珠探针在检测miRNA标志物方面的应用，所述应用包括步骤：
步骤I：DSN酶切反应：
反应体系：所述复合锁核酸磁珠探针，miRNA待测液，1×DSN主缓冲液，核糖核酸酶抑制剂，DSN酶；在热循环仪中55℃培育120分钟；待测样品miRNA与所述探针发生杂化形成双链，DSN与双链发生酶切反应，DNA水解为片段并分离出荧光基团；释放的miRNA保持完整并再次与未发生反应的DNA杂化，发生新的酶切反应，溶液中荧光基团增加；
步骤II：荧光检测
上述反应完成后，用激发光照射含有荧光分子的液体，以649/670波长检测cy5基团的荧光强度，以545/580检测TAMRA基团的荧光强度、以483/520波长检测FAM基团的荧光强度；进一步得到miRNA待测液中三种miRNA标志物各自的浓度。
进一步，所述步骤II在步骤I反应完成后，为去除连在磁珠上的未参与反应的LNA分子，用强磁铁固定磁珠提取上层清液，再进行荧光检测。
本发明还提供一种包含上述复合锁核酸磁珠探针的诊断试剂，所述诊断试剂包含所述复合锁核酸磁珠探针20μg，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4U DSN酶和标准血清。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供了一种可同时检测体液中三种不同的肺癌标志物miRNA的简单、便捷而且超灵敏的复合锁核酸磁珠探针。该探针基于DSN酶切反应的信号放大机理，结合分子荧光强度测试，可同时检测体液中三种癌症标志物miRNA的浓度，精准诊断肺癌。
2.本发明将肺癌三种标志物探针分子同时修饰到磁珠表面并清除交叉杂交，再用它检测肺癌患者的血清样本，相对于健康者样本，能检测到与探针对应的三种miRNA表达水平非常明显的区别。
3.本发明探针是通过生物素-链霉亲和素结合到磁珠上，结合力非常强，方便有效分离未参与反应的探针分子从而降低背景信号。
4.本发明探针的应用方法引入了双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease,DSN)放大荧光信号强度，并借助磁珠降低背景信号。具体检测原理是：通过生物素-链霉亲和素连接将修饰荧光标记的DNA探针分子固定在磁珠上，DNA探针序列与靶标miRNA相匹配并发生杂交形成双链。在DSN酶作用下，杂合双链中的DNA探针水解为碎片，荧光基团分子悬浮在反应液中，但miRNA却保持完整并再次与DNA探针杂交并发生DSN酶切反应。如此反复，可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程，最终体系的荧光基团数量得到显著放大。反应完成后，在磁场的作用下固定磁珠以及未参与反应的探针分子，分离提取含荧光分子的上层清液，通过测试上层清液中荧光基团的信号强度即可实现对靶标miRNA的灵敏检测。
5.本发明检测技术的优点是能在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该技术无需进行PCR，避免了非特异性扩增，从而提高了检测的特异性。
6.与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升；这种方法能与其他的分子检测放大技术相结合，比如滚动循环放大(已有技术)、杂交链式反应等。
7.本发明实现了同时检测三种miRNA的方案，更多种类的miRNA也可以同时检测。通过实际案例的检测结果显示，肺癌患者体内的miRNA标志物表达水平与健康人体内的表达水平相差3倍以上，不管是患者miRNA表达水平提高还是受到抑制，都能有效检测。
附图说明
图1为待检测miRNA与磁性微球DNA探针杂化成双链、以及DSN酶切反应释放荧光基团的过程；
图2为本发明构建的磁性微球DNA探针对待检测miRNA检测流程；
图3不同的miRNA在检测过程中培育温度从40℃变化到65℃时的荧光强度变化，其中miRNA浓度为1nM；
图4为该方法检测miRNA的浓度校准曲线。DSN为0.4U，miRNA从0.5fM变到1nM，在55℃反应2小时；
图5为浓度为1nM的miRNA与探针分子LNA交叉反应测试结果；
图6用本发明复合探针同时检测肺癌患者和健康人体血清样品，显示肺癌患者体内miRNA-21,miRNA-210表达水平上升，miRNA-486-5p表达水平受到抑制。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例一 最佳培育温度的选择
1.DNA探针制备
根据待测标志物miRNA486-5p分子碱基序列，合成对应的锁核酸(locked nucleicacid,LNA)作为捕获探针LNA probe-486-5p，并在两端分别修饰FAM荧光基团和生物素等分子。
2.DNA探针分子固定在磁珠上
超顺磁性微球与高纯度链霉亲和素共价结合形成链霉亲和素磁珠(streptavidinMBs，SMBs)，在室温条件下，取一定量的SMBs用1×B&W buffer清洗并借助永久磁铁滤掉上层清液，再分散到2×B&W buffer。取适量LNA探测分子95℃预热5分钟清除交叉杂交现象，再与SMBs悬浊液混合，制成的测试液中每一种LNA的浓度为1μM。轻微震荡测试液，37℃培育20分钟，使生物素与链霉亲和素更好地偶连形成磁性微球探针。用0.15M NaOH溶液清洗滤掉非特异性结合或游离的DNA探针分子。接下来用TT缓冲液(250mM Tris-HCl pH 8.0,0.1％
20)将得到的微球探针冲洗两次后，再加入新的TT缓冲液重悬磁珠，于80℃培育10分钟后倒掉液体以进一步去除链霉亲和素-生物素结合不稳定的偶连分子。最后，用DEPC水把复合磁性微球探针清洗3次，为下一步DSN反应做准备。
3.miRNA检测和DSN酶切反应
取20μL反应液放于无菌PCR管内，其中包含偶连有LNA探针的20μg磁珠，浓度为1nM的2μL的miRNA-486-5p，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4U DSN酶。然后在热循环仪中40℃培育120分钟。充分的杂化与酶切反应完成后，提取上层清液，测试溶液中荧光强度。
4.荧光检测
反应完成后，为了去除连在磁珠上的未参与反应的LNA分子，用强磁铁固定磁珠提取上层清液，用649/670nm激发光照射含有FAM荧光分子的液体，荧光强度取决于DSN酶切反应释放的荧光分子数量，进一步反映了待测液中miRNA的浓度。
5.优化培育温度
接下来重复以上实验，除了步骤3中的培育温度分别选为45℃，50℃，55℃，60℃和65℃外，其余条件不变。对于相同的变温范围，我们还对miRNA-21(649/670波长检测cy5)和miRNA-210(545/580检测TAMRA集团)做了相同的测试，荧光强度检测结果如图3所示，其中纵坐标为相对荧光强度，横坐标为温度，可以看出来，对于每一种miRNA，培育温度为55℃时，相对荧光强度单位最大，说明55℃是最佳培育温度。
其中，DSN主缓冲液从Evrogen Joint Stock Company公司购买，商品名称为：DSNmaster buffer。
实施例二 最低检测浓度测试
1.DNA探针制备
根据待测标志物miRNA486-5p分子碱基序列，合成对应的锁核酸(locked nucleicacid,LNA)作为捕获探针LNA probe-486-5p，并在两端分别修饰FAM荧光基团和生物素等分子。
2.DNA探针分子固定在磁珠上
超顺磁性微球与高纯度链霉亲和素共价结合形成链霉亲和素磁珠(streptavidinMBs，SMBs)，在室温条件下，取一定量的SMBs用1×B&W buffer清洗并借助永久磁铁滤掉上层清液，再分散到2×B&W buffer。取适量LNA探测分子95℃预热5分钟清除交叉杂交现象，再与SMBs悬浊液混合，制成的测试液中每一种LNA的浓度为1μM。轻微震荡测试液，37℃培育20分钟，使生物素与链霉亲和素更好地偶连形成磁性微球探针。用0.15M NaOH溶液清洗滤掉非特异性结合或游离的DNA探针分子。接下来用TT缓冲液(250mM Tris-HCl pH 8.0,0.1％
20)将得到的微球探针冲洗两次后，再加入新的TT缓冲液重悬磁珠，于80℃培育10分钟后倒掉液体以进一步去除链霉亲和素-生物素结合不稳定的偶连分子。最后，用DEPC水把复合磁性微球探针清洗3次，为下一步DSN反应做准备。
3.miRNA检测和DSN酶切反应
取20μL反应液放于无菌PCR管内，其中包含偶连有LNA探针的20μg磁珠，浓度为1nM的2μL的miRNA-486-5p，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4U DSN酶。然后在热循环仪中55℃培育120分钟。充分的杂化与酶切反应完成后，提取上层清液，测试溶液中荧光强度。
4.荧光检测
反应完成后，为了去除连在磁珠上的未参与反应的LNA分子，用强磁铁固定磁珠提取上层清液，用激发光照射含有荧光分子的液体，荧光强度取决于DSN酶切反应释放的荧光分子数量，进一步反映了待测液中miRNA的浓度。
5.不同浓度的miRNA检测
接下来重复以上实验，除了步骤3中的miRNA-486-5p浓度从1nM逐渐减小到0.5fM外，其余条件不变。与此相同的miRNA范围，我们还对miRNA-21(649/670波长检测cy5)和miRNA-210(545/580检测TAMRA集团)做了相同的测试，荧光强度检测结果如图4所示，其中纵坐标为相对荧光强度，横坐标为miRNA浓度，可以看出来，当miRNA浓度从0.5fM逐渐增大到1nM时，相对荧光强度单位值也增大。在0.5fM到100pM范围内，相对荧光强度单位值与miRNA浓度的对数值lg(miRNA)呈线性变化，可以用如下公式表示：
RFU％＝35.23lg([miRNA-21])+214.264
RFU％＝31.21lg([miRNA-210])+170.23
RFU％＝24.16lg([miRNA-486-5p])+173.778
对于以上的方法，我们可以测量miRNA-486-5p，miRNA-21，miRNA-210的最低浓度分别可以到3fM，120aM，300aM。
实施例三 交叉反应程度测试
1.DNA探针制备
根据待测标志物miRNA486-5p分子碱基序列，合成对应的锁核酸作为捕获探LNAprobe-486-5p，并在两端分别修饰FAM荧光基团和生物素等分子。
2.DNA探针分子固定在磁珠上
超顺磁性微球与高纯度链霉亲和素共价结合形成链霉亲和素磁珠(streptavidinMBs，SMBs)，在室温条件下，取一定量的SMBs用1×B&W buffer清洗并借助永久磁铁滤掉上层清液，再分散到2×B&W buffer。取适量LNA探测分子95℃预热5分钟清交叉杂交现象，再与SMBs悬浊液混合，制成的测试液中每一种LNA的浓度为1μM。轻微震荡测试液，37℃培育20分钟，使生物素与链霉亲和素更好地偶连形成磁性微球探针。用0.15M NaOH溶液清洗滤掉非特异性结合或游离的DNA探针分子。接下来用TT缓冲液(250mM Tris-HCl pH 8.0,0.1％
20)将得到的微球探针冲洗两次后，再加入新的TT缓冲液重悬磁珠，于80℃培育10分钟后倒掉液体以进一步去除链霉亲和素-生物素结合不稳定的偶连分子。最后，用DEPC水把复合磁性微球探针清洗3次，为下一步DSN反应做准备。
3.miRNA检测和DSN酶切反应
取20μL反应液放于无菌PCR管内，其中包含偶连有LNA探针的20μg磁珠，浓度为1nM的2μL的miRNA-486-5p，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4U DSN酶。然后在热循环仪中55℃培育120分钟。充分的杂化与酶切反应完成后，提取上层清液，测试溶液中荧光强度。
4.荧光检测
反应完成后，为了去除连在磁珠上的未参与反应的LNA分子，用强磁铁固定磁珠提取上层清液，用激发光照射含有荧光分子的液体，荧光强度取决于DSN酶切反应释放的荧光分子数量，进一步反映了待测液中miRNA的浓度。miRNA486-5p与LNA-probe486-5p反应后的荧光强度单位值RFU％约为450，如图5所示。
5.交叉反应测试
接下来重复以上实验，在步骤3中用于测试的核酸分子换成miRNA-21或miRNA210，核酸分子的浓度和培育温度等条件都不变，反应完成后分别记录得到的荧光强度。miRNA-21或miRNA210与LNA probe-486-5p反应后的得到荧光分子的荧光强度值小于50。
与此类似，我们还合成了探针分子LNA probe-21和LNA probe-210，再用它们分别检测三种肺癌标志物核酸分子，从图5的结果可以看出，LNA probe-21和miRNA-21反应后得到的荧光强度为600，LNA probe-210与miRNA-210反应后得到的荧光强度为470。当探针分子与待测核酸分子碱基序列不匹配时，反应液相对荧光强度单位值都在50以下。
以上结果表明，该检测方法中，三种肺癌标志物核酸分子miRNA与对应的探针分子反应强，而与另外两种探针分子之间的交叉反应程度较弱。
实施例四 本发明复合锁核酸磁珠探针制备及体液检测
1.锁核酸探针制备
根据待测标志物miRNA-486-5p，miRNA-21与miRNA-210分子碱基序列，合成对应的锁核酸作为捕获探针LNA probe-486-5p，LNA probe-21与LNA probe-210，并在LNA probe-486-5p两端分别修饰FAM荧光基团和生物素分子、在LNA probe-21两端分别修饰cy5荧光基团和生物素分子、在LNA probe-210两端分别修饰TAMRA荧光基团和生物素分子。三种探针分子数比为1:1:1。
2.锁核酸探针分子固定在磁珠上
超顺磁性微球与高纯度链霉亲和素共价结合形成链霉亲和素磁珠(streptavidinMBs，SMBs)，在室温条件下，取一定量的SMBs用1×B&W buffer清洗并借助永久磁铁滤掉上层清液，再分散到2×B&W buffer。取适量LNA探测分子95℃预热5分钟清交叉杂交现象，再与SMBs悬浊液混合，制成的测试液中每一种LNA的浓度为1μM。轻微震荡测试液，37℃培育20分钟，使生物素与链霉亲和素更好地偶连形成磁性微球探针。用0.15M NaOH溶液清洗滤掉非特异性结合或游离的DNA探针分子。接下来用TT缓冲液(250mM Tris-HCl pH 8.0,0.1％
20)将得到的微球探针冲洗两次后，再加入新的TT缓冲液重悬磁珠，于80℃培育10分钟后倒掉液体以进一步去除链霉亲和素-生物素结合不稳定的偶连分子。最后，用DEPC水把复合磁性微球探针清洗3次，为下一步DSN反应做准备。
3.miRNA检测和DSN酶切反应
取20μL反应液放于无菌PCR管内，其中包含偶连有LNA的所述复合探针的20μg磁珠，分别从健康人或肺癌患者提取血清2μL，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4UDSN酶。然后在热循环仪中55℃培育120分钟。充分的杂化与酶切反应完成后，提取上层清液，测试溶液中荧光强度。
4.荧光检测
反应完成后，为了去除连在磁珠上的未参与反应的LNA分子，用强磁铁固定磁珠提取上层清液，用激发光照射含有荧光分子的液体，以649/670波长检测cy5集团的荧光强度，以545/580检测TAMRA集团的荧光强度、以483/520波长检测FAM集团的荧光强度；荧光强度取决于DSN酶切反应释放的荧光分子数量，进一步反映了待测血清中miRNA的浓度。
图6的测试结果显示，探针分子LNA probe-21和LNA probe-210，与健康人血清反应后，相对荧光强度在50以下，与肺癌患者血清反应后，相对荧光强度在110-140之间，说明肺癌患者体内的miRNA-21和miRNA-210是过表达；探针分子LNA probe-486-5p与健康人血清反应后，相对荧光强度在110-140之间，与肺癌患者血清反应后，相对荧光强度在50-160之间，说明肺癌患者体内的miRNA-486-5p的表达受到抑制。
实施例五 本发明包含复合锁核酸磁珠探针的诊断试剂
本发明的诊断试剂包含所制备的复合锁核酸磁珠探针20μg，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4U DSN酶和标准血清。可以进行实施例四的检测过程，并对肺癌做出精准诊断。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针，其特征在于，所述复合锁核酸磁珠探针在同一磁珠中包含三种探针:FAM荧光基团标记的LNA probe-486-5p探针、Cy5荧光基团标记的LNA probe-21探针和TAMRA荧光基团标记的LNA probe-210探针。
2.根据权利要求1所述的检测miRNA标志物的复合锁核酸磁珠探针的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)锁核酸探针分子制备：根据待测标志物miRNA-486-5p，miRNA-21与miRNA-210分子碱基序列，合成对应的锁核酸作为捕获探针LNA probe-486-5p，LNA probe-21与LNAprobe-210，并在LNA probe-486-5p探针两端分别修饰FAM荧光基团和生物素分子，
在LNA probe-21探针两端分别修饰Cy5荧光基团和生物素分子，
在LNA probe-210探针两端分别修饰TAMRA荧光基团和生物素分子，
将三种探针按照1:1:1分子比例混合，制得LNA探针复合物；
(2)锁核酸探针分子固定在磁珠上：所述探针混合物95℃预热清除交叉杂交后与链霉亲和素磁珠SMBs悬浊液混合，在室温条件下培育；
(3)清洗：首先将培育后的复合锁核酸磁珠探针液用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的DNA探针，然后用TT缓冲液重复清洗，再将磁珠探针加入到TT缓冲液中进行重悬后在80℃下培育，除去液体中结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到一种检测miRNA标志物的复合磁珠锁核酸探针。
3.根据权利要求2所述的复合锁核酸磁珠探针的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠悬浊液按照如下方法制备：将超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠SMBs，在室温条件下，用1×BW缓冲液清洗并用永久磁铁固定链霉亲和素磁珠后滤掉上层清液，再分散到2×BW缓冲液中制得SMBs悬浊液。
4.根据权利要求3所述的复合磁珠锁核酸探针的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述LNA探针复合物与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmol LNA与20μg MBs链霉亲和素磁珠的比例进行混合。
5.根据权利要求4所述的复合锁核酸磁珠探针的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，制成的复合锁核酸磁珠探针液中所述每种LNA的浓度为1μM。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预热为在95℃下预热5min；所述培育为37℃培育20分钟。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述NaOH溶液的浓度为0.15M；所述TT缓冲液按照如下方法配制：向250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的
20，并将pH调到8.0；所述培育为80℃培育10分钟。
8.权7所述复合锁核酸磁珠探针在检测miRNA标志物方面的应用，其特征在于，所述应用包括步骤：
步骤I：DSN酶切反应：
反应体系：所述复合锁核酸磁珠探针，miRNA待测液，1×DSN主缓冲液，核糖核酸酶抑制剂，DSN酶；在热循环仪中55℃培育120分钟；待测样品miRNA与所述探针发生杂化形成双链，DSN与双链发生酶切反应，DNA水解为片段并分离出荧光基团；释放的miRNA保持完整并再次与未发生反应的DNA杂化，发生新的酶切反应，溶液中荧光基团增加；
步骤II：荧光检测
上述反应完成后，用激发光照射含有荧光分子的液体，以649/670波长检测cy5基团的荧光强度，以545/580检测TAMRA基团的荧光强度、以483/520波长检测FAM基团的荧光强度；进一步得到miRNA待测液中三种miRNA标志物各自的浓度。
9.根据权利要求8所述复合锁核酸磁珠探针在检测miRNA标志物方面的应用，其特征在于，所述步骤II在步骤I反应完成后，为去除连在磁珠上的未参与反应的LNA分子，用强磁铁固定磁珠提取上层清液，再进行荧光检测。
10.一种包含权7所述复合锁核酸磁珠探针的诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包含所述复合锁核酸磁珠探针20μg，1×DSN主缓冲液，20U核糖核酸酶抑制剂，0.4U DSN酶和标准血清。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220301 |
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