CN114107071A - 一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，所述仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法包括以下步骤：选取一株发病仙客来的叶柄并剪为多个长5mm的叶柄段；对所述叶柄段进行杀菌消毒；将杀菌消毒后的所述叶柄剪为3‑5mm的组织块放入PDA培养基上培养，直至长出无杂菌；挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养；吸取培养后的菌液到进行稀释10‑5倍，吸取稀释后的菌液涂布到PDA固体培养基上得到纯化的病原菌的单一菌落。本发明提供的方法对病原菌分离的组织消毒彻底，对内生细菌的抑制效果极好，分离纯化率高，降低了目标病原菌与其它微生物的混合机率，大大减少了纯化的次数。
Description
技术领域
本发明属于细菌纯化技术领域，尤其涉及一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法。
背景技术
枯萎病是仙客来主要的一个真菌病害，发病率在35％左右。病菌以菌丝体、分生孢子、厚垣孢子随病株残体在土壤中越冬。菌丝体可在土壤中腐生存活3年，此病具有潜伏隐蔽、发生突然、蔓延迅速、致死率高的特点，但随着仙客来大范围种植及规模化生产，病害发生也逐渐加重，严重影响仙客来欣赏性和商品性。分离纯化该病病原菌获得纯培养物是开展各项研究的基础。
仙客来枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌，通过在植物体内破坏维管束组织，使植物叶片黄化、萎蔫，最终枯萎死亡，需采用传统的组织分离的方法进行病原菌的分离，由于仙客来植株是肉质，组织水分含量高，内生细菌比较多，采用常规的无菌水、75％的酒精进行表面消毒无法彻底杀死内生细菌，植物组织放置在培养基中培养病原菌，植物组织内的细菌污染严重，常常会导致病原菌分离效率低，甚至分离失败。所以在组织分离中，需要开发一种严格的植物组织消毒及内生细菌的抑制技术，从而提高病原菌的分离效率。
因此，有必要提供一种新的仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法解决上述技术问题。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，包括以下步骤：
S1：选取一株发病症状明显且处于发病中期的仙客来，选取其发黄程度为25％-35％的叶子作为样品叶；
S2：将所述样品叶洗净风干后剪去叶片留下叶柄，再将所述叶柄的两端去除，剩下部分剪为多个长5mm的叶柄段；
S3：对所述叶柄段进行杀菌消毒，包括以下步骤：
将所述叶柄段放入烧杯中并加入纯净水；
向所述烧杯中加入洗洁精和消毒液各0.15-0.25ml；
将所述烧杯口用纱布封好；
将封好口的所述烧杯用纯净水不断的冲洗，冲洗时间至少为30min，直至无泡沫产生；
将所述烧杯中的所述叶柄段拿出并放入无菌水清洗；
将清洗后的所述叶柄段用75％酒精浸泡30s；
将酒精浸泡后的所述叶柄段再用无菌水漂洗1min；
将漂洗后的所述叶柄段用0.1％HgCl浸泡1min；
最后用无菌水将所述叶柄段漂洗，完成后晾干备用；
S4：将杀菌消毒后的所述叶柄段两端切去，形成长度为3-5mm的组织块，将所述组织块放入PDA培养基上培养，直至长出无杂菌；
S5：挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了50μg/L细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养；
S6：吸取S5中培养后的菌液进行稀释，将菌液稀释至原先浓度的10-5倍，吸取25μL稀释后的菌液涂布到PDA固体培养基上培养，得到纯化的病原菌的单一菌落。
作为本发明的进一步优化方案，所述S3中用无菌水将所述叶柄段漂洗的次数为4次，每次漂洗持续4min。
作为本发明的进一步优化方案，所述S4中培养的温度为27℃，培养的时间为2-3天。
作为本发明的进一步优化方案，所述S5中放入摇床进行培养，所述摇床以110r/min的速度转动。
作为本发明的进一步优化方案，所述S5中培养的温度为22℃-27℃，培养时间为24h。
作为本发明的进一步优化方案，所述S6中培养的温度为27℃，培养的时间为2-3天。
作为本发明的进一步优化方案，所述S6中得到的纯化的病原菌的单一菌落放置在4℃的环境中冷藏保存。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的方法对病原菌分离的组织消毒彻底，对内生细菌的抑制效果极好，分离纯化率高，降低了目标病原菌与其它微生物的混合机率，大大减少了纯化的次数。
附图说明
图1是感染枯萎病的仙客来盆花图；
图2是普通表面消毒分离得到的病原菌图；
图3是按照本发明提供的方法消毒抑菌后分离得到的病原菌图；
图4是按照本发明提供的方法加入抑菌剂的液体培养基培养后再进行稀释涂平板得到了单一菌落图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
如图1-4所示，一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，包括以下步骤：
S1：选取一株发病症状明显且处于发病中期的仙客来，发病中期是指有25％-50％叶片出现黄化萎焉，如图1所示，选取其发黄程度为25％的叶子作为样品叶；
S2：将所述样品叶洗净风干后剪去叶片留下叶柄，再将所述叶柄的两端去除，剩下部分剪为多个长5mm的叶柄段；
S3：对所述叶柄段进行杀菌消毒，包括以下步骤：
将所述叶柄段放入烧杯中并加入纯净水；
向所述烧杯中加入洗洁精和消毒液各0.15ml；
将所述烧杯口用纱布封好；
将封好口的所述烧杯用纯净水不断的冲洗，冲洗时间为30min，直至无泡沫产生；
将所述烧杯中的所述叶柄段拿出并放入无菌水清洗；
将清洗后的所述叶柄段用75％酒精浸泡30s；
将酒精浸泡后的所述叶柄段再用无菌水漂洗1min；
将漂洗后的所述叶柄段用0.1％HgCl浸泡1min；
最后用无菌水将所述叶柄段漂洗，漂洗4次，每次漂洗持续4min，完成后晾干备用；
S4：将杀菌消毒后的所述叶柄段两端切去，形成长度为3mm的组织块，将所述组织块放入PDA培养基上培养，培养的温度为27℃，培养的时间为2天，直至长出无杂菌；
S5：挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了50μg/L细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养，并将培养基放入摇床，所述摇床以110r/min的速度转动，培养的温度为22℃，培养时间为24h；
S6：吸取S5中培养后的菌液进行稀释，将菌液稀释至原先浓度的10-5倍，吸取25μL稀释后的菌液涂布到PDA固体培养基上进行培养，培养的温度为27℃，培养的时间为2天，得到纯化的病原菌的单一菌落，将培养出的单一菌落放置在4℃的环境中冷藏保存。
实施例2
一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，包括以下步骤：
S1：选取一株发病症状明显且处于发病中期的仙客来，选取其发黄程度为35％的叶子作为样品叶；
S2：将所述样品叶洗净风干后剪去叶片留下叶柄，再将所述叶柄的两端去除，剩下部分剪为多个长5mm的叶柄段；
S3：对所述叶柄段进行杀菌消毒，包括以下步骤：
将所述叶柄段放入烧杯中并加入纯净水；
向所述烧杯中加入洗洁精和消毒液各0.25ml；
将所述烧杯口用纱布封好；
将封好口的所述烧杯用纯净水不断的冲洗，冲洗时间为30min，直至无泡沫产生；
将所述烧杯中的所述叶柄段拿出并放入无菌水清洗；
将清洗后的所述叶柄段用75％酒精浸泡30s；
将酒精浸泡后的所述叶柄段再用无菌水漂洗1min；
将漂洗后的所述叶柄段用0.1％HgCl浸泡1min；
最后用无菌水将所述叶柄段漂洗，漂洗4次，每次漂洗持续4min，完成后晾干备用；
S4：将杀菌消毒后的所述叶柄段两端切去，形成长度为3mm的组织块，将所述组织块放入PDA培养基上培养，培养的温度为27℃，培养的时间为3天，直至长出无杂菌；
S5：挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了50μg/L细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养，并将培养基放入摇床，所述摇床以110r/min的速度转动，培养的温度为27℃，培养时间为24h；
S6：吸取S5中培养后的菌液进行稀释，将菌液稀释至原先浓度的10-5倍，吸取25μL稀释后的菌液涂布到PDA固体培养基上进行培养，培养的温度为27℃，培养的时间为3天，得到纯化的病原菌的单一菌落，将培养出的单一菌落放置在4℃的环境中冷藏保存。
本发明与现有技术相比，普通表面消毒分离得到的病原菌，内生细菌的污染率极高，如图2所示；严格按照本方法进行消毒抑菌后分离得到的病原菌，污染率降低到零，如图3所示，本方法对病原菌分离的组织消毒彻底，对内生细菌的抑制效果极好，通过加入抑菌剂的液体培养基培养后，再进行稀释涂平板得到了单一菌落，如图4所示，分离纯化率高，降低了目标病原菌与其它微生物的混合机率，大大减少了纯化的次数。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：选取一株发病症状明显且处于发病中期的仙客来，选取其发黄程度为25％-35％的叶子作为样品叶；
S2：将所述样品叶洗净风干后剪去叶片留下叶柄，再将所述叶柄的两端去除，剩下部分剪为多个长5mm的叶柄段；
S3：对所述叶柄段进行杀菌消毒，包括以下步骤：
将所述叶柄段放入烧杯中并加入纯净水；
向所述烧杯中加入洗洁精和消毒液各0.15-0.25ml；
将所述烧杯口用纱布封好；
将封好口的所述烧杯用纯净水不断的冲洗，冲洗时间至少为30min，直至无泡沫产生；
将所述烧杯中的所述叶柄段拿出并放入无菌水清洗；
将清洗后的所述叶柄段用75％酒精浸泡30s；
将酒精浸泡后的所述叶柄段再用无菌水漂洗1min；
将漂洗后的所述叶柄段用0.1％HgCl浸泡1min；
最后用无菌水将所述叶柄段漂洗，完成后晾干备用；
S4：将杀菌消毒后的所述叶柄段两端切去，形成长度为3-5mm的组织块，将所述组织块放入PDA培养基上培养，直至长出无杂菌；
S5：挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了50μg/L细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养；
S6：吸取S5中培养后的菌液进行稀释，将菌液稀释至原先浓度的10-5倍，吸取25μL稀释后的菌液涂布到PDA固体培养基上培养，得到纯化的病原菌的单一菌落。
2.根据权利要求1所述的一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：所述S3中用无菌水将所述叶柄段漂洗的次数为4次，每次漂洗持续4min。
3.根据权利要求1所述的一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：所述S4中培养的温度为27℃，培养的时间为2-3天。
4.根据权利要求1所述的一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：所述S5中放入摇床进行培养，所述摇床以110r/min的速度转动。
5.根据权利要求4所述的一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：所述S5中培养的温度为22℃-27℃，培养时间为24h。
6.根据权利要求1所述的一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：所述S6中培养的温度为27℃，培养的时间为2-3天。
7.根据权利要求1所述的一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，其特征在于：所述S6中得到的纯化的病原菌的单一菌落放置在4℃的环境中冷藏保存。
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