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CN114107077B - 一株产酯酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株产酯酵母菌株及其应用 Download PDF

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CN114107077B CN202111509846.4A CN202111509846A CN114107077B CN 114107077 B CN114107077 B CN 114107077B CN 202111509846 A CN202111509846 A CN 202111509846A CN 114107077 B CN114107077 B CN 114107077B
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pichia kudriavzevii
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pichia
phenethyl
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Abstract

本发明提供一株产酯酵母菌株及其应用。本发明提供一株库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株为：库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021124。本发明提供的酵母菌株具有多环境耐受性、底物广谱适用性以及产酯的特点，能够改善传统酿造产品的感官风味，提高产品品质，丰富产品口味。

Description

一株产酯酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株产酯酵母菌株及其应用。
背景技术
白酒酿造过程中原料、工艺、微生物、环境条件会引起酒体中风味物质的种类及含量的差异，其中微生物是最重要的因素，而酵母菌是白酒风味贡献的主要微生物，酵母菌又分为酿酒酵母和非酿酒酵母，其中非酿酒酵母中的产酯酵母对酸、醇具有不同程度的酯化能力，可产生乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸苯乙酯等酯类物质，是改善酒体感官风味，促进酒体风味更加丰满的关键化合物，并且各种粮食原料成分的差异，在发酵过程中微生物的作用下会发生反应生成不同的风味物质，从而让酒体体现出不同的风味特点。
发明内容
酵母在发酵过程中会受到多种环境胁迫的影响，主要包括渗透压、温度、乙醇、低pH等，这些胁迫可以破坏酵母的细胞结构从而影响其生长、代谢和生理功能，导致酵母的生长速率和存活率低，最终影响发酵效率。
因此，酵母菌株在酿造过程中需具备多环境耐受性、广谱底物适应性、产酯等特点才有利于在工业生产中提高发酵效率、降低生产成本以及改善产品质量。
针对现有技术中酵母菌株环境耐受性差、底物适应性差、产酯低的问题，本发明提供一株具有多环境耐受性、对底物广谱适用性及产酯的酵母菌株。
本发明提供一株库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株为：库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)于2021年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021124。
优选地，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株的26S rDNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供一种库德里阿兹威氏毕赤酵母菌剂的发酵制备方法，所述方法包含如下步骤：培养所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株放大培养；
(2)将步骤(1)得到的产物加入到液体培养基中，在26-40℃条件下发酵培养。
本发明还提供一种菌剂，所述菌剂通过所述的发酵制备方法得到。
本发明还提供所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或所述的菌剂在酿酒中的应用。
本发明还提供一种发酵物，所述发酵物通过培养所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或所述的菌剂得到。
优选地，所述发酵物中含有苯乙醇、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、苯乙酸乙酯、辛酸乙酯和合金欢醇；
优选地，所述发酵物中含有苯乙醇浓度为1000-1300ng/g、乙酸苯乙酯浓度为50-100ng/g、乙酸异戊酯浓度为5-20ng/g、苯乙酸乙酯浓度为1-15ng/g、辛酸乙酯浓度为0.5-5ng/g和合金欢醇浓度为0.1-1ng/g；
更优选地，所述发酵物中含有苯乙醇浓度为1160-1170ng/g、乙酸苯乙酯浓度为70-80ng/g、乙酸异戊酯浓度为10-15ng/g、苯乙酸乙酯浓度为5-10ng/g、辛酸乙酯浓度为1-2ng/g和合金欢醇浓度为0.3-0.6ng/g。
本发明还提供所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或所述的菌剂用于酿酒的方法，所述方法包括如下步骤：培养所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或所述的菌剂。
本发明还提供一种酒，所述酒通过采用所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或所述的菌剂加入到酿酒原料中，酿造得到。
本发明提供的酵母菌株具有多环境耐受性、底物广谱适用性以及产酯的特点，能够改善传统酿造产品的感官风味，提高产品品质，丰富产品口味。
本发明提供的酵母菌株能高效利用葡萄糖和棉子糖，能够以蔬菜、水果、稻谷和一些油料作物的籽仁，例如甜菜、小麦、水稻、棉籽、大豆、葵花籽为发酵底物，具有广谱的底物适用性。
本发明提供的酵母菌株能够在pH为3.0、温度为40℃、乙醇含量(V/V) 为14％、乳酸含量(V/V)为6％条件下正常生长繁殖，具有多环境耐受性。
本发明提供的酵母菌株能够产生61种风味物质，总含量达到1959.9327 ng/g。
菌种保藏信息
本发明提供的库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)于2021年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2021124。
附图说明
图1所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌落形态；
图2所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12显微观察图；
图3所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在不同碳源条件下的生长曲线；
图4所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在不同pH条件下的生长曲线；
图5所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在不同温度条件下的生长曲线；
图6所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在不同乙醇浓度条件下的生长曲线；
图7所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在不同乳酸浓度条件下的生长曲线；
图8所示为气相色谱峰图。
具体实施方式
本发明提供一株库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株为：库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)于2021年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021124。
本发明提供的库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)是从农家苞谷酒坊窖泥中分离获得，菌落质地为奶酪状、颜色为乳白色，表面光滑；显微形态呈椭圆形，大小为3.0×7.5μm，显微观察为出芽生殖。库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株的26S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)具有多环境耐受性、底物的广谱适用性、产酯的特点，对产品的感官风味有特别的贡献，能够改善传统酿造产品的风味。
实施例中涉及的培养基成分组成如下：
YNB培养基：硫酸铵5000mg、肌醇2mg、烟酸0.4mg、盐酸硫胺素 0.4mg、硫酸铜0.04mg、磷酸二氢钾1000mg、硼酸0.5mg、盐酸吡哆醇0.4 mg、泛酸钙0.4mg、对氨基苯甲酸0.2mg、硫酸镁500mg、硫酸锰0.4mg、硫酸锌0.4mg、氯化铁0.2mg、核黄素0.2mg、氯化钙100mg、碘化钾0.1mg、钼酸钠0.2mg、生物素0.002mg、叶酸0.002mg、氯化钠100mg、水1000mL，过滤除菌。
YPD培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、水 1000mL，115℃灭菌30min；
碳源培养基：0.67g YNB、2g碳源(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、松三糖、棉子糖、甘油、山梨醇)，水1000mL，过滤除菌。
本发明实施例中所用的试剂和仪器来源如下表1所示。
表1实施例所用试剂及仪器来源信息表
实施例1本发明中酵母菌株的分离鉴定
将湖北恩施农家苞谷酒坊窖泥样品溶于无菌水中混匀，吸取菌悬液以10 倍系列稀释制备10-5、10-6菌悬液，涂布于YPD培养基，30℃培养24-48h，制片于显微镜下观察酵母形态，同时观察平板上单菌落特性，将具有典型酵母菌落特征的菌株分离、划线纯化，接种于YPD斜面培养基，4℃保存。获得一株菌，该菌的菌落质地为奶酪状、颜色为乳白色，表面光滑；显微形态呈椭圆形，大小为3.0×7.5μm，显微观察为出芽生殖。提取该酵母菌株基因组，以NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)、NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)为引物，PCR程序为94℃预变性 5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10min，用于扩增酵母26S rDNA序列，经1％凝胶电泳检测及测序，测得该菌株的26SrDNA序列SEQ ID NO.1如下所示：
结合形态分析及分子鉴定，该菌株为库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichiakudriavzeii)，命名为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeii C4.12)。将该菌株于2021年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2021124。图1所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(Pichia kudriavzeiiC4.12)菌落形态。图2所示为库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株(PichiakudriavzeiiC4.12)酵母显微观察图。
实施例2库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株底物利用特性分析
将库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株接种至装有5mLYPD液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按3％接种量接种至装有300uL碳源液体培养基的100孔培养板中，准备Bioscreen仪器上机测定，设置参数：温度30℃、时间24h，波长600nm，每隔30min测量一次数据，然后进行生长曲线测定，以OD600nm增长率超过50％视为生长。
OD1—起始时OD600nm值；
OD2—结束时OD600nm值；
如图3所示，结果表明库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株能利用上述的15种碳源，且利用葡萄糖和棉子糖时，优先到达对数期及稳定期，即能高效利用葡萄糖和棉子糖，而棉子糖在自然界中广泛存在，包括蔬菜、水果、稻谷和一些油料作物的籽仁中，其中甜菜、小麦、水稻、棉籽、大豆、葵花籽是常见的发酵底物，即该菌株具有广谱的底物适用性，可用作粮食底物及豆粕发酵专用菌株。
实施例3库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株耐受性分析
(1)pH耐受性试验：将库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株接种至装有5mL YPD液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按3％接种量接种至装有300uL YPD液体培养基的100孔培养板中，YPD液体培养基pH分别调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，准备Bioscreen仪器上机测定，设置参数：温度30℃、时间24h，波长600nm，每隔30min测量一次数据，然后进行生长曲线测定。
如图4所示，库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在pH分别为3.0、4.0、 5.0、6.0条件下生长曲线都表现为典型的S型曲线模型，在pH 2.0条件下该菌株生长曲线近似为一条直线，即该菌株在pH为3.0、4.0、5.0、6.0条件下都能正常生长，而在pH 2.0条件下菌株无法正常，因此，该菌株pH最大耐受为3.0。
(2)温度耐受性试验：将库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株接种至装有5mL YPD液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按3％接种量接种至装有300uL YPD液体培养基的100孔培养板中，准备Bioscreen 仪器上机测定，设置参数：温度为30℃、时间24h，波长600nm，每隔30min 测量一次数据，然后进行生长曲线测定；35℃、45℃、50℃的温度耐受性试验与上述步骤一致。
如图5所示，库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在30℃、35℃、40℃温度条件下生长曲线都表现为典型的S型曲线模型，在45℃条件下该菌株生长曲线近似为一条直线，即该菌株在30℃、35℃、40℃条件下都能正常生长，而在45℃菌株无法正常，因此，该菌株温度最大耐受为40℃。
(3)乙醇耐受性试验：将库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株接种至装有5mL YPD液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按3％接种量接种至装有300uL YPD液体培养基的100孔培养板中，使YPD液体培养基中乙醇浓度分别为2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、 20％，准备Bioscreen仪器上机测定，设置参数：温度30℃、时间24h，波长600nm，每隔30min测量一次数据，然后进行生长曲线测定。
如图6所示，库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在乙醇浓度分别为2％、 4％、6％、8％、10％、12％、14％条件下都能正常生长，而在16％、18％、20％条件下菌株无法正常，因此，该菌株乙醇最大耐受(V/V)为14％。
(4)乳酸耐受性：将库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株接种至装有5 mL YPD液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按3％接种量接种至装有300uL YPD液体培养基的100孔培养板中，使YPD液体培养基中乳酸体积浓度(v/v)分别为2％、4％、6％、8％、10％、12％，准备Bioscreen 仪器上机测定，设置参数：温度30℃、时间24h，波长600nm，每隔30min测量一次数据，然后进行生长曲线测定。
如图7所示，库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株在乳酸浓度分别为2％、 4％、6％条件下都能正常生长，而在8％和10％条件下菌株无法正常，因此，该菌株乳酸最大耐受(V/V)为6％。
实施例4发酵液中挥发性成分分析
将库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株接种至装有5mL YPD液体培养基的试管中，30℃、180rpm，培养20h，再按0.6％接种量接种至装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、180rpm、培养20h，离心，收集上清，经0.22μm过滤后，取10mL过滤液，加入20μL内标液(乙酸正丁酯)混匀，按照色谱条件：分流比40:1，进样口温度250℃，检测器温度250℃，色谱柱为AT.LZP-930白酒柱，柱温初始温度50℃保持2min，5℃/min的速率升到110℃，保持时间0min；以3℃/min的速率升到130℃，保持0min；以15℃/min的速率升到230℃保持2min，进行挥发性成分分析，气相色谱峰图如图8所示，主要挥发性成分信息见表2。
表2发酵液中主要挥发性成分信息
结果表明，发酵液中共检测出61种风味物质，总含量为1959.9327ng/g，主要挥发性物质为苯乙醇、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、苯乙酸乙酯、辛酸乙酯、合金欢醇，其中苯乙醇含量最高，特征风味为玫瑰香气，估计浓度为1169 ng/g。
以上实施例仅为对本发明技术方案做进一步的阐述和理解，并不是对本发明的限定，本领域技术人员在此基础上做出的任何非突出实质性特征和非显著进步的改进，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安琪酵母股份有限公司
<120> 一株产酯酵母菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzeii)
<400> 1
ccgcattgcc tcagtagcgg cgagtgaagc ggcaagagct cagatttgaa atcgtgcttt 60
gcggcacgag ttgtagattg caggttggag tctgtgtgga aggcggtgtc caagtccctt 120
ggaacagggc gcccaggagg gtgagagccc cgtgggatgc cggcggaagc agtgaggccc 180
ttctgacgag tcgagttgtt tgggaatgca gctccaagcg ggtggtaaat tccatctaag 240
gctaaatact ggcgagagac cgatagcgaa caagtactgt gaaggaaaga tgaaaagcac 300
tttgaaaaga gagtgaaaca gcacgtgaaa ttgttgaaag ggaagggtat tgcgcccgac 360
atggggattg cgcaccgctg cctctcgtgg gcggcgctct gggctttccc tgggccagca 420
tcggttcttg ctgcaggaga aggggttctg gaacgtggct cttcggagtg ttatagccag 480
ggccagatgc tgcgtgcggg gaccgaggac tgcggccgtg taggtcacgg atgctggcag 540
aacggcgcaa caccgcccgt cttgaacccg gaccaaa 577

Claims (9)

1.一株库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株，其特征在于，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株为：
库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）C4.12菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2021124。
2.根据权利要求1所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株，其特征在于，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母C4.12菌株的26S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种库德里阿兹威氏毕赤酵母菌剂的发酵制备方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：培养权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）将权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株放大培养；
（2）将步骤（1）得到的产物加入到液体培养基中，在26-40℃条件下发酵培养。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂通过权利要求3或4所述的发酵制备方法得到。
6.权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或权利要求5所述的菌剂在酿酒中的应用。
7.一种发酵物，其特征在于，所述发酵物通过培养权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或权利要求5所述的菌剂得到；
所述发酵物中含有权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株；
所述发酵物中含有苯乙醇、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、苯乙酸乙酯、辛酸乙酯和合金欢醇；
所述发酵物中含有苯乙醇浓度为1000-1300ng/g、乙酸苯乙酯浓度为50-100ng/g、乙酸异戊酯浓度为5-20ng/g、苯乙酸乙酯浓度为1-15ng/g、辛酸乙酯浓度为0.5-5ng/g和合金欢醇浓度为0.1-1ng/g。
8.根据权利要求7所述的发酵物，其特征在于，所述发酵物中含有苯乙醇浓度为1160-1170ng/g、乙酸苯乙酯浓度为70-80ng/g、乙酸异戊酯浓度为10-15ng/g、苯乙酸乙酯浓度为5-10ng/g、辛酸乙酯浓度为1-2ng/g和合金欢醇浓度为0.3-0.6ng/g。
9.权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或权利要求5所述的菌剂用于酿酒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求1或2所述的库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株或权利要求5所述的菌剂。
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