CN114085909A

CN114085909A - Top1作为宫颈癌标志物和/或治疗靶点的应用

Info

Publication number: CN114085909A
Application number: CN202111320474.0A
Authority: CN
Inventors: 罗莹; 喻琳; 洪世垣
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-02-25

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及TOP1作为HPV阳性宫颈癌的预后标志物和潜在靶点，在制备宫颈癌诊断工具以及治疗制剂中的应用，所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。本发明提供的针对TOP1靶点的应用的技术方案在本发明实施例中，已经证实沉默TOP1后抑制了肿瘤的增殖和迁移水平，阻碍了宫颈癌的进展，取得良好的技术效果。

Description

TOP1作为宫颈癌标志物和/或治疗靶点的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及TOP1作为宫颈癌标志物和/或治疗靶点的应用。

背景技术

2018年国际癌症研究署公布了世界范围内癌症相关的主要感染性病原体，如幽门螺杆菌(HP)、高危型人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV),它们共同导致了全球90％以上的感染相关癌症。其中，HPV感染主要分布在撒哈拉以南的非洲地区和亚洲地区，该病毒与许多生殖器和皮肤的良性病变及宫颈癌、头颈癌、肛门癌等恶性肿瘤密切相关。作为全球女性第四大常见癌症，宫颈癌也是发展中国家女性癌症死亡的主要原因,世界卫生组织报道全球每年有新增病例57万例，其中31.1万名女性死于宫颈癌。而在中国,每年新增宫颈癌病例约14万,死亡病例约3.7万。

目前，宫颈癌临床治疗现状仍不容乐观，一方面，传统的手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等手段无法完全控制和消除宫颈癌的发生和转移。另一方面，宫颈癌的靶向药物研发尚处于较早期阶段，上市的靶向药物寥寥无几。现有的靶点研究多集中在表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、mTOR、致癌蛋白E6/E7以及免疫检查点PD-1、CTLA-4等。此外，一些研究学者在宫颈癌组织中发现了数种基因的异常表达，可能驱动肿瘤发生发展，深入研究上述异常表达的基因有望成为抗肿瘤治疗的有效靶点。

目前在治疗宫颈癌的分子靶向药物的应用中，主要是针对血管内皮生长因子的单克隆抗体药物贝伐单抗，该药物可改善复发转移宫颈癌患者的生存质量，但贝伐单抗价格昂贵，长期应用可造成药物的敏感性和效力降低。因此，积极探索一种针对不同靶点且疗效力更持久，同时价格相对低廉的药物非常迫切。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种新的诊断和/或治疗宫颈癌的有效靶点，DNA拓扑异构酶1(TOP1)。本发明便是针对该靶点提供了一系列的应用技术方案。通过本发明发现，抑制TOP1的表达可以诱导肿瘤细胞发生DNA损伤及细胞凋亡从而影响宫颈癌的进展，表明靶向TOP1可以作为一种潜在的宫颈癌诊断或治疗药物。

本发明提供一种检测TOP1的试剂在制备宫颈癌诊断试剂或诊断工具中的应用，所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。

进一步，所述检测TOP1的试剂包含检测TOP1基因表达量的试剂，所述TOP1基因包含如sequence NO:2所示的核酸序列。

进一步，所述检测TOP1的试剂包含能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂，和/或能够对TOP1进行定量的试剂。

进一步，所述能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增TOP1基因的引物；所述能够对TOP1进行定量的试剂包括特异性结合TOP1的抗体。

进一步，所述工具包括能够检测TOP1基因表达量的工具。

进一步，所述工具包括能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂，和/或能够对TOP1进行定量的试剂。

进一步，其特征在于，所述能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增TOP1基因的引物，所述能够对TOP1进行定量的试剂包括特异性结合TOP1的抗体。

进一步，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

本发明目的进一步提供TOP活性抑制剂在制备治疗宫颈癌的药物或设备中的应用，所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。

进一步，提供TOP1基因表达抑制剂在制备治疗宫颈癌的药物或设备中的应用，所述TOP1基因包含如sequence NO:2所示的核酸序列。

具体地，所述设备包括一些治疗仪器，或者结合药物的一些治疗设备。

本发明通过对90例正常宫颈上皮组织、宫颈良性病变组织、宫颈癌组织的免疫组化实验检测，发现TOP1表达随着宫颈癌的恶性级别增加而显著升高，表明TOP1蛋白可作为宫颈癌新的诊断标志物。

本发明目的在于还提供一种治疗宫颈癌的药物，所述药物包括以下试剂中的一种或多种：(1)抑制TOP1活性的试剂；或(2)特异性结合TOP1的试剂；或(3)抑制TOP1基因表达的试剂；所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。

进一步，所述药物还包括一些可药物的辅料。

进一步，所述药物还可以与一些常用的抗癌药物进行联用，达到更好的效果。

进一步还提供一种诊断宫颈癌的工具，所述试剂盒包括以下试剂中的一种：(1)检测TOP1的试剂；或(2)检测TOP1基因的试剂；所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列；所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

具体地，DNA拓扑异构酶1(TOP1)是包括酵母、哺乳动物在内的多种生物体内必不可少的细胞核酶，参与DNA复制、重组、修复、基因转录以及维持基因组的完整性等生物学过程。研究报道Top1通过催化单链断裂来发挥正负超螺旋松弛的重要作用，在这个过程中，它通过形成可逆的裂解复合物(Top1CCs)，来改变核酸的拓扑状态，从而调节基因组的稳定。TOP1在多种恶性实体肿瘤中异常表达，如TOP1蛋白高表达与非小细胞肺癌(NSCLC)高复发率等临床不良结局相关。TOP1基因拷贝数增加与高级别(III-IV期)大肠癌(CRC)侵袭性表型相关。而TOP1在HPV相关宫颈癌中的具体功能并不清楚,我们前期研究发现在HPV阳性宫颈癌细胞中DNA断裂水平增加，同时这一增加和TOP1密切相关，TOP1高表达的宫颈癌患者生存期更短，预后更差，表明TOP1在宫颈癌进展中具有不可或缺的作用，有望成为HPV相关宫颈癌的潜在治疗靶点和预后指标。

在某些具体实施例中，本发明结合TCGA来源的GEPIA数据库在线分析，显示TOP1表达量高的宫颈癌患者的预后较差，表明TOP1蛋白在宫颈癌预后诊断试剂盒中的应用价值。

在某些具体实施例中，本发明通过抑制TOP1表达可显著降低宫颈癌细胞的增殖、迁移能力，影响了肿瘤的进展。

本发明有益效果在于

本发明提供的针对TOP1靶点的应用的技术方案在本发明实施例中，已经证实沉默TOP1后抑制了肿瘤的增殖和迁移水平，阻碍了宫颈癌的进展，因此建立敲低TOP1基因的宫颈癌细胞株对于临床机制研究和疾病预测诊断方面都具有重要的指导意义。

本发明提供的TOP1作为宫颈癌恶性进展的诊断和治疗的标志物的应用以及开发为治疗宫颈癌相关药物的应用，证实了TOP1的表达量与宫颈癌发生发展的动态关系，为宫颈癌的治疗、诊断、疗效预测，或预后判断提供了重要的指导意义。

附图说明

图1为免疫组化检测TOP1在宫颈正常组织、癌前病变组织及宫颈癌组织中的表达水平

图2为TOP1在宫颈癌中表达情况。

图3为宫颈患者TOP1表达情况与生存期关系。

图4为TOP1在HPV阴性和HPV阳性宫颈癌细胞中表达水平。

图5为TOP1敲低细胞株的蛋白表达水平。

图6为沉默TOP1与肿瘤细胞增殖关系。

图7为沉默TOP1与肿瘤细胞迁移水平关系。

图8为流式检测的宫颈癌细胞凋亡情况。

图9为免疫荧光检测检测DNA双链断裂情况。

图10为彗星实验检测沉默TOP1的肿瘤细胞DNA损伤情况。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，利用免疫组织化学方法，检测了上述组织标本中TOP1的表达水平，具体步骤如下：

(1)常规石蜡切片制作由附二院病理科完成，蜡块切片厚度为6-8μm。

(2)脱蜡处理和切片的水化：石蜡切片于55℃烘箱中烤片30min,二甲苯浸洗切片2次，每次10min。无水乙醇浸洗切片2次，每次10min，陆续经过95％、85％、75％乙醇浸洗切片1次，每次5min。蒸馏水中漂洗3次，每次5min。

(3)抗原修复：参考TOP1抗体(Proteintech)说明书进行柠檬酸钠修复，水浴锅加热稀释好的柠檬酸钠抗原修复液(50×)，使切片浸泡在上述沸腾的修复液(95-99℃)中维持30min。取出放在实验台上自然冷却30min。

(4)阻断：PBS漂洗3次，每次5min，浸泡在内源性过氧化物酶封闭液中室温孵育10min。

(5)封闭：PBS漂洗3次，每次5min，在切片上滴加30-80μl封闭液，置于湿盒中37℃封闭30min。

(6)一抗孵育：去掉封闭液，切片上加30-80μl稀释的一抗(TOP1 1：200)，4℃孵育过夜。

(7)二抗孵育：切片室温复温30min,去掉抗体稀释液，PBS漂洗3次，每次5min，在切片上滴加30-80μl二抗，37℃孵育30min。

(8)DAB显色：PBS漂洗3次，每次5min，将DAB和底物按说明书的比例配好避光，显微镜下观察染色进展(约30s)，及时将玻片浸入水中终止显色。

(9)苏木素染核:将切片泡在苏木精溶液中复染,显微镜下观察核染色进展，立即用蒸馏水洗两次，每次5min。

(10)脱水：操作与脱蜡顺序相反，即75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇各1次，每次5min、100％乙醇2次，每次10min、二甲苯2次，每次10min。

(11)中性树脂封片与采图：脱水结束后烘干，在载玻片上滴加中性树脂加上盖玻片，排除气泡，自然干燥后可采图。图片采集均在同一台显微镜下，在相同的亮度、放大倍数及软件参数设定下进行。每一例组织切片都在调至清晰视野下随机采集3张图片。

本发明实施例中，利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库分析临床患者预后情况，作为一种TCGA肿瘤数据的分析网站可以用作基因差异表达、相关性、预后等相关研究。操作方法简单,例如输入基因名:TOP1，差异的阈值:Log2FC cut off＝1,qvaluecut off＝0.01,Log scale yes，选择感兴趣的癌症类型:CESC,并点击add，点击plot，得到宫颈癌与正常组织中的TOP1基因表达情况。在研究基因表达与生存之间的关联时，操作方法非常容易。

本发明实施例进行蛋白印迹分析的步骤为：

(1)制备蛋白样品：选择对数生长期的细胞，吸出培养基，PBS洗涤细胞胰酶消化后转移至离心管中，800rpm离心5min吸出上清。加入提前配置好的含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(直径为10cm盘中加500μl)冰上裂解细胞30min。超声处理10–15秒以完成细胞充分裂解并剪切DNA，以降低样品粘度。利用BCA试剂盒将待测蛋白和蛋白标准品经37℃孵育并在562nm处测定吸光度进行蛋白定量，并用5X SDS样品缓冲液于95–100℃下加热5min，瞬时离心备用。

(2)SDS-PAGE：利用SDS-PAGE试剂盒配制8％PAGE胶(待检测目的分子TOP1 91KD，β-actin 43KD),取3-5ul marker,30ug待测样品上样到SDS-PAGE凝胶(10cm x 10cm)上,80V 30min,marker分离开后120V 100min。

(3)转移:PVDF膜甲醇活化后、与PAGE胶浸泡在预冷的转膜液中，按三明治顺序放置后4度层析柜中湿转，恒压100V转膜100min。

(4)封闭：取出转印好的PVDF膜在TBST短暂漂洗后，浸泡在5％脱脂奶粉中室温封闭1h。

(5)一抗孵育：PVDF膜在TBST短暂漂洗后，参照Marker进行裁膜，参考抗体说明书，裁好PVDF膜置于一抗稀释液(proteintech TOP1 1:2000，β-actin 1:5000)4℃孵育过夜。

(6)二抗孵育：TBST漂洗3次，每次10min，选取对应一抗来源的HRP偶联的二抗(Rabbit，1:2000),在室温下摇床上孵育1h。

(7)蛋白质检测：TBST洗涤三次，每次10min。将配好的ECL超灵敏显影液滴加在PVDF膜上在Bio-Rad多功能成像系统显影并拍照保存。

本发明实施例中，慢病毒感染宫颈癌细胞建立TOP1敲低细胞株的步骤为：

(1)慢病毒构建：TOP1-shRNA干扰慢病毒由重庆克必隆生物科技有限公司构建、测序。其中病毒采用psi-LVRU6GP(LV-shRNA-GP)载体，元件顺序：PuroR-WPRE-AmpR，TOP1-shRNA及对照序列见表1。

表1 TOP1-shRNA及对照序列

shRNA	Sequence(5′-3′)
		Shtop1#1	sequence NO:3
shtop1#2	sequence NO:4
		shtop1#3	sequence NO:5
shtop1#4	sequence NO:6
		shNC	sequence NO:7

(2)抽提质粒：采用诺唯赞去内毒素质粒提取试剂盒(大提)，具体流程包含：加入7.5ml Buffer P1将菌液重悬、加入7.5ml Buffer P2进行裂解、加入7.5ml Buffer P4中和P2、加入0.1倍上清体积内毒素清除剂、加入0.5倍体积异丙醇结合、加入10ml Buffer PW进行洗涤，重复两次。最后加入0.8ml无内毒素水洗脱，利用nanodrop测质粒DNA浓度如下:ShTOP1#1＝1262.1ng/ul、shTOP1#2＝1061.4ng/ul、shTOP1#3＝1312.4ng/ul、shTOP1#4＝1366.7ng/ul、shNC＝1033.2ng/ul、PSPAX2＝1421.7ng/ul、PMD2.G＝1850.1ng/ul

(3)细胞铺板：通过胰酶消化收集293T细胞，用适当的完全培养基平铺细胞于100mm培养皿上，将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育,使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80％以上，即可开始转染。转染前2h换成无血清的培养基DMEM。

(4)混匀核心质粒和包装质粒：取无菌1.5ml EP管，准备500μl无血清DMEM，加入7.5μg核心质粒(ShTOP1#1-4、ShNC)和7.5μg病毒包装质粒(PMD2.G和PSPAX2)，同时准备500μl无血清DMEM，加入45μl转染试剂PEI(PEI：质粒＝3:1)，充分混匀，静置15-20min。

(5)孵育:将上述混合液逐滴加入293T细胞的培养基中，轻轻摇动培养皿混匀后置于含5％CO2的37℃培养箱孵育。

(6)收集病毒上清:6-8h后吸去培养基，加入8ml37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置培养箱孵育，48h、72h分别收集病毒上清经离心、0.22uM滤器过滤后分装置于－80℃储存待用(4000rpm离心5min，两次合计可收集到15ml病毒上清)。

(7)病毒感染:将待感染的目的细胞Hela平铺于6cm培养皿，最佳密度为30％－70％。1.5ml病毒上清和1.5ml完全培养基混合,加入3μg/ml polybrene,充分摇匀后37℃温箱孵育。

(8)6-8h后换液，48h长满后传代用抗生素Puro筛选(2ug/ml),2周左右获得稳定细胞株，收集细胞蛋白制样并进行Western Blot鉴定细胞株敲低效果。

本发明实施例中，实时无标记细胞分析技术(RTCA)使用Agilent xCELLLigenceRTCA DP细胞分析仪,该仪器原理为活细胞与检测板孔中微电极相互作用，产生电阻抗改变，将这些信号转化为特定参数细胞指数(Cell Index)，来衡量细胞生长、死亡等状态。通常用来检测细胞增殖、存活、凋亡、形态变化，也用于化合物或抗肿瘤药物细胞毒性检测、细胞增殖、迁移和浸润等实验。具体操作如下：

(1)测基线：增殖板，每个孔加50ul培养基。

(2)板子放到检测仪，检查是否接触良好，在“Message”页面显示Connection OK。

(3)开始检测基线，检测后确定“Message”无警告后者报错信息。

(4)测增殖前，取出板子，每个孔加入100ul细胞悬液(细胞量为4000个细胞/孔)。

(5)室温放置30min(此步非常重要)。

(6)板子放到检测仪，检查是否接触良好，在“Message”页面显示Connection OK。

(7)设置相关参数，包括cell type:Hela、Cell number:4000、Compound：NC、ShTOP1#2、ShTOP1#3、X Axis:Time、Y Axis:Cell index、Time From：0：00：00To 96：00：00，关键参数设置完成后，点击下一步检测。

(8)数据保存与分析：结果以Excel Export,保存后点击进入即可实时观测不同时间段内不同分组的细胞的生长状态。

本发明实施例中，Transwell小室实验步骤如下：

(1)选用Transwell小室(BD公司，8um，24孔板)，提前30min在小室上层加入50ul无血清的培养基DMEM进行水化，置于37℃培养箱备用。

(2)制作细胞悬液：取出对数生长期的贴壁细胞，胰酶消化细胞，转移至离心管离心后弃去培养液，用PBS洗去细胞表面残留的血清培养基，用无血清培养基重悬并计数。

(3)接种细胞：参考文献，调整细胞悬液数目为3×10⁴的200μl，并加入Transwell小室上层。24孔板下室缓慢加入500μl含15％FBS的培养基，防止气泡生成，常规培养24h。

(4)固定染色：取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用不含钙镁的PBS洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，4％的多聚甲醛室温固定30min，PBS洗2遍，将小室适当风干，用结晶紫染色15min，PBS洗3遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。

(5)采图：400倍显微镜下随机取五个视野观察细胞并拍照。

本发明实施例中，利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标，分析沉默TOP1对细胞凋亡的影响，具体步骤如下：

(1)收集细胞：取适量的对数生长期细胞(对照组和TOP1敲低组)接种于6cm培养皿中，待细胞汇合度为80％时，收集漂浮在培养基上的细胞以及无EDTA的消化液消化下来的细胞，1000rpm,离心5min。

(2)清洗细胞：弃上清,用预冷的PBS洗2遍细胞，分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组以及PI和Annexin V双染组，处理组按从低到高进行双染。

(3)染色：加入5μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10min；用PBS稀释4×bindingbuffer缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL稀释好的bindingbuffer，用移液枪充分重悬细胞，避光条件下加入染料,轻轻混匀,不染组不加，单染组加Annexin V或PI 5μL，Annexin V和PI双染组加入Annexin V和PI各5μL，室温避光孵育15min。

(4)离心与重悬：1000rpm离心5min，弃上清,加入Binding Buffer200μl并混匀。

(5)上机检测：避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在流式细胞仪上机检测。

本发明实施例中，免疫荧光(IF)检测DNA双链断裂的步骤为：

(1)细胞样品制备：将生长在培养皿上的贴壁细胞胰酶消化后，接种到共聚焦培养皿中(15mm细胞接种量为2×10⁵)，整个过程将细胞轻柔混匀，防止细胞局部生长过密。待细胞接近长成单层后吸去培养基，PBS浸洗3次，每次3min。

(2)固定：使用4％的多聚甲醛室温固定细胞15min，PBS洗涤3次，每次3min。

(3)通透：0.1％Triton X-100(PBS配制)室温通透15min，以保证抗体能够到达抗原部位。用PBS洗涤3次，每次3min。

(4)封闭：PBS洗涤3次，每次3min。为了减少抗体的非特异性结合，在培养皿中滴加商品化封闭液，室温封闭30min。

(5)一抗结合：吸去封闭液，培养皿中滴加足够量的稀释好的一抗(采用双标：TOP1Bethyl 1:200,γH2AX Millipore 1:500)并放入湿盒，4℃孵育过夜。

(6)荧光二抗结合：吸去一抗，PBST洗涤3次，每次3min。滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温避光孵育1h，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

(7)DAPI抗淬灭剂封片及检测：吸去二抗，PBST洗涤3次，每次3min。在封片时滴加DAPI的抗荧光淬灭剂，避光孵育5min，然后在尼康的共聚焦显微镜下观察并采集图像。

本发明实施例中，利用彗星实验检测肿瘤细胞中沉默TOP1造成DNA损伤情况的步骤为：

(1)制备单细胞悬浮液：取对数生长期的贴壁细胞(对照组和TOP1敲低组)，胰酶消化后离心，用PBS重悬成单细胞悬液，计数调整为2×10⁵/ml。

(2)胶板制备：取100μl于37℃水浴中保温的0.5％NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。室温下凝固。取100μl于37℃水浴中保温的0.5％LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀，立即铺于载玻片上，4度凝固至出现圆形透明环(约30min)。

(3)细胞裂解与电泳：将上述制备好的胶板浸没于4℃预冷的裂解液中孵育过夜，裂解液由去垢剂及高盐溶液组成，可去除多余的细胞膜及组蛋白。取出裂解好的胶板，双蒸水漂洗后置于4℃预冷的解旋液中解旋20min。在专用电泳仪中加入预冷的电泳液850ml,玻片水平放置阳极端附近，4℃电泳(21V，30min)。电泳槽底部含冰袋以保持低温。

(4)中和与染色：电泳结束，将胶板浸泡于预冷的蒸馏水中漂洗两次，然后在预冷的75％乙醇中和2次，每次5min，置于37℃培养箱中使琼脂糖完全干燥后取出胶板，用SYBRGold染料染色，10min。蒸馏水漂洗2次，每次5min，晾干并尽快在荧光显微镜下观察DNA损伤程度并采图。

实施例1免疫组化(IHC)验证

本发明实施例中，在重医附二院病理科收集了90例临床样本，包含宫颈良性病变、宫颈上皮不典型增生及宫颈上皮内瘤变、和宫颈癌组织。利用免疫组织化学方法，检测了上述组织标本中TOP1的表达水平，实验结果如图1所示，病理染色结果显示TOP1的表达随着疾病进程的发展而升高。

实施例2生物信息学软件分析临床患者预后情况

本发明实施例中，利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库分析临床患者预后情况，输入基因名：TOP1，选择Overall Survival还是Disease Free Survival，以及自定义颜色:High group-Red,Low group-Blue，点击add添加感兴趣的癌症类型:CESC，点击plot，就得到TOP1高表达与低表达组宫颈癌患者的生存分析结果。

结果如图2和图3所示，相比TCGA来源的正常组织，TOP1在宫颈癌中表达显著升高(如图2)。生存分析显示，TOP1高表达的宫颈患者比TOP1低表达的患者生存期更短，预后更差(如图3)。

实施例3蛋白印迹(Western Blot)

选择对数生长期的细胞提取蛋白质，并利用SDS-PAGE试剂盒进行蛋白印迹分析，分析结果如图4所示，与HPV阴性的宫颈癌细胞C33A相比，TOP1在HPV阳性宫颈癌细胞Siha、Hela中表达显著升高。

实施例4慢病毒感染宫颈癌细胞建立TOP1敲低细胞株

利用慢病毒感染宫颈癌细胞建立TOP1敲低细胞株(慢病毒能够将靶基因导入到目的细胞并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达，便于进行稳定细胞株的筛选)，然后收集细胞蛋白制样并进行Western Blot鉴定细胞株敲低效果。结果如图5所示，与对照组ShNC相比，ShTOP1#2、ShTOP1#3组细胞中的TOP1蛋白表达显著降低，表明TOP1敲低细胞株构建成功，可用于后续功能实验。

实施例5实时无标记细胞分析技术(RTCA)

本发明实施例使用Agilent xCELL Ligence RTCA DP细胞分析仪检测不同时间段内不同分组的细胞的生长状态。

结果如图6所示，横坐标显示细胞生长监测时间0-96h,纵坐标显示每组细胞指数，相比对照组,敲低TOP1后细胞生长明显减慢，表明沉默TOP1显著抑制肿瘤细胞增殖。

实施例6 Transwell小室实验

本发明实施例通过Transwell小室实验模拟肿瘤细胞的迁移、侵袭转移能力，结果如图7所示，相比对照组，敲低TOP1显著抑制了宫颈癌细胞的迁移能力。

实施例7流式检测细胞凋亡

本发明实施例利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标，分析沉默TOP1对细胞凋亡的影响。

结果如图8所示，细胞可以分为4个象限，位于右下象限和右上象限分别代表早期凋亡和晚期凋亡细胞，相比对照组，敲低TOP1后诱导宫颈癌细胞发生凋亡。

实施例8免疫荧光(IF)

本发明实施例使用免疫荧光识别γH2AX从而检测DNA双链断裂，结果如图9所示，相比对照组，敲低TOP1后促进了宫颈癌细胞DNA损伤的发生，激活了DNA损伤反应。

实施例9彗星实验(Comet assay)

本发明实施例利用彗星实验在单细胞水平上检测肿瘤细胞中沉默TOP1造成DNA损伤情况，结果如图10所示，通过荧光显微镜检测发现相比对照组，敲低TOP1可明显观察到明显拖长的彗星尾部，反映了损伤的DNA片段，。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> TOP1作为宫颈癌标志物和/或治疗靶点的应用

<130> 2021-11-3

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Gly Asp His Leu His Asn Asp Ser Gln Ile Glu Ala Asp Phe

1 5 10 15

Arg Leu Asn Asp Ser His Lys His Lys Asp Lys His Lys Asp Arg Glu

20 25 30

His Arg His Lys Glu His Lys Lys Glu Lys Asp Arg Glu Lys Ser Lys

35 40 45

His Ser Asn Ser Glu His Lys Asp Ser Glu Lys Lys His Lys Glu Lys

50 55 60

Glu Lys Thr Lys His Lys Asp Gly Ser Ser Glu Lys His Lys Asp Lys

65 70 75 80

His Lys Asp Arg Asp Lys Glu Lys Arg Lys Glu Glu Lys Val Arg Ala

85 90 95

Ser Gly Asp Ala Lys Ile Lys Lys Glu Lys Glu Asn Gly Phe Ser Ser

100 105 110

Pro Pro Gln Ile Lys Asp Glu Pro Glu Asp Asp Gly Tyr Phe Val Pro

115 120 125

Pro Lys Glu Asp Ile Lys Pro Leu Lys Arg Pro Arg Asp Glu Asp Asp

130 135 140

Ala Asp Tyr Lys Pro Lys Lys Ile Lys Thr Glu Asp Thr Lys Lys Glu

145 150 155 160

Lys Lys Arg Lys Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Lys Leu Lys Lys Pro

165 170 175

Lys Asn Lys Asp Lys Asp Lys Lys Val Pro Glu Pro Asp Asn Lys Lys

180 185 190

Lys Lys Pro Lys Lys Glu Glu Glu Gln Lys Trp Lys Trp Trp Glu Glu

195 200 205

Glu Arg Tyr Pro Glu Gly Ile Lys Trp Lys Phe Leu Glu His Lys Gly

210 215 220

Pro Val Phe Ala Pro Pro Tyr Glu Pro Leu Pro Glu Asn Val Lys Phe

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Met Lys Leu Ser Pro Lys Ala Glu Glu Val

245 250 255

Ala Thr Phe Phe Ala Lys Met Leu Asp His Glu Tyr Thr Thr Lys Glu

260 265 270

Ile Phe Arg Lys Asn Phe Phe Lys Asp Trp Arg Lys Glu Met Thr Asn

275 280 285

Glu Glu Lys Asn Ile Ile Thr Asn Leu Ser Lys Cys Asp Phe Thr Gln

290 295 300

Met Ser Gln Tyr Phe Lys Ala Gln Thr Glu Ala Arg Lys Gln Met Ser

305 310 315 320

Lys Glu Glu Lys Leu Lys Ile Lys Glu Glu Asn Glu Lys Leu Leu Lys

325 330 335

Glu Tyr Gly Phe Cys Ile Met Asp Asn His Lys Glu Arg Ile Ala Asn

340 345 350

Phe Lys Ile Glu Pro Pro Gly Leu Phe Arg Gly Arg Gly Asn His Pro

355 360 365

Lys Met Gly Met Leu Lys Arg Arg Ile Met Pro Glu Asp Ile Ile Ile

370 375 380

Asn Cys Ser Lys Asp Ala Lys Val Pro Ser Pro Pro Pro Gly His Lys

385 390 395 400

Trp Lys Glu Val Arg His Asp Asn Lys Val Thr Trp Leu Val Ser Trp

405 410 415

Thr Glu Asn Ile Gln Gly Ser Ile Lys Tyr Ile Met Leu Asn Pro Ser

420 425 430

Ser Arg Ile Lys Gly Glu Lys Asp Trp Gln Lys Tyr Glu Thr Ala Arg

435 440 445

Arg Leu Lys Lys Cys Val Asp Lys Ile Arg Asn Gln Tyr Arg Glu Asp

450 455 460

Trp Lys Ser Lys Glu Met Lys Val Arg Gln Arg Ala Val Ala Leu Tyr

465 470 475 480

Phe Ile Asp Lys Leu Ala Leu Arg Ala Gly Asn Glu Lys Glu Glu Gly

485 490 495

Glu Thr Ala Asp Thr Val Gly Cys Cys Ser Leu Arg Val Glu His Ile

500 505 510

Asn Leu His Pro Glu Leu Asp Gly Gln Glu Tyr Val Val Glu Phe Asp

515 520 525

Phe Leu Gly Lys Asp Ser Ile Arg Tyr Tyr Asn Lys Val Pro Val Glu

530 535 540

Lys Arg Val Phe Lys Asn Leu Gln Leu Phe Met Glu Asn Lys Gln Pro

545 550 555 560

Glu Asp Asp Leu Phe Asp Arg Leu Asn Thr Gly Ile Leu Asn Lys His

565 570 575

Leu Gln Asp Leu Met Glu Gly Leu Thr Ala Lys Val Phe Arg Thr Tyr

580 585 590

Asn Ala Ser Ile Thr Leu Gln Gln Gln Leu Lys Glu Leu Thr Ala Pro

595 600 605

Asp Glu Asn Ile Pro Ala Lys Ile Leu Ser Tyr Asn Arg Ala Asn Arg

610 615 620

Ala Val Ala Ile Leu Cys Asn His Gln Arg Ala Pro Pro Lys Thr Phe

625 630 635 640

Glu Lys Ser Met Met Asn Leu Gln Thr Lys Ile Asp Ala Lys Lys Glu

645 650 655

Gln Leu Ala Asp Ala Arg Arg Asp Leu Lys Ser Ala Lys Ala Asp Ala

660 665 670

Lys Val Met Lys Asp Ala Lys Thr Lys Lys Val Val Glu Ser Lys Lys

675 680 685

Lys Ala Val Gln Arg Leu Glu Glu Gln Leu Met Lys Leu Glu Val Gln

690 695 700

Ala Thr Asp Arg Glu Glu Asn Lys Gln Ile Ala Leu Gly Thr Ser Lys

705 710 715 720

Leu Asn Tyr Leu Asp Pro Arg Ile Thr Val Ala Trp Cys Lys Lys Trp

725 730 735

Gly Val Pro Ile Glu Lys Ile Tyr Asn Lys Thr Gln Arg Glu Lys Phe

740 745 750

Ala Trp Ala Ile Asp Met Ala Asp Glu Asp Tyr Glu Phe

755 760 765

<210> 2

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagtgggg accacctcca caacgattcc cagatcgaag cggatttccg attgaatgat 60

tctcataaac acaaagataa acacaaagat cgagaacacc ggcacaaaga acacaagaag 120

gagaaggacc gggaaaagtc caagcatagc aacagtgaac ataaagattc tgaaaagaaa 180

cacaaagaga aggagaagac caaacacaaa gatggaagct cagaaaagca taaagacaaa 240

cataaagaca gagacaagga aaaacgaaaa gaggaaaagg ttcgagcctc tggggatgca 300

aaaataaaga aggagaagga aaatggcttc tctagtccac cacaaattaa agatgaacct 360

gaagatgatg gctattttgt tcctcctaaa gaggatataa agccattaaa gagacctcga 420

gatgaggatg atgctgatta taaacctaag aaaattaaaa cagaagatac caagaaggag 480

aagaaaagaa aactagaaga agaagaggat ggtaaattga aaaaacccaa gaataaagat 540

aaagataaaa aagttcctga gccagataac aagaaaaaga agccgaagaa agaagaggaa 600

cagaagtgga aatggtggga agaagagcgc tatcctgaag gcatcaagtg gaaattccta 660

gaacataaag gtccagtatt tgccccacca tatgagcctc ttccagagaa tgtcaagttt 720

tattatgatg gtaaagtcat gaagctgagc cccaaagcag aggaagtagc tacgttcttt 780

gcaaaaatgc tcgaccatga atatactacc aaggaaatat ttaggaaaaa tttctttaaa 840

gactggagaa aggaaatgac taatgaagag aagaatatta tcaccaacct aagcaaatgt 900

gattttaccc agatgagcca gtatttcaaa gcccagacgg aagctcggaa acagatgagc 960

aaggaagaga aactgaaaat caaagaggag aatgaaaaat tactgaaaga atatggattc 1020

tgtattatgg ataaccacaa agagaggatt gctaacttca agatagagcc tcctggactt 1080

ttccgtggcc gcggcaacca ccccaagatg ggcatgctga agagacgaat catgcccgag 1140

gatataatca tcaactgtag caaagatgcc aaggttcctt ctcctcctcc aggacataag 1200

tggaaagaag tccggcatga taacaaggtt acttggctgg tttcctggac agagaacatc 1260

caaggttcca ttaaatacat catgcttaac cctagttcac gaatcaaggg tgagaaggac 1320

tggcagaaat acgagactgc tcggcggctg aaaaaatgtg tggacaagat ccggaaccag 1380

tatcgagaag actggaagtc caaagagatg aaagtccggc agagagctgt agccctgtac 1440

ttcatcgaca agcttgctct gagagcaggc aatgaaaagg aggaaggaga aacagcggac 1500

actgtgggct gctgctcact tcgtgtggag cacatcaatc tacacccaga gttggatggt 1560

caggaatatg tggtagagtt tgacttcctc gggaaggact ccatcagata ctataacaag 1620

gtccctgttg agaaacgagt ttttaagaac ctacaactat ttatggagaa caagcagccc 1680

gaggatgatc tttttgatag actcaatact ggtattctga ataagcatct tcaggatctc 1740

atggagggct tgacagccaa ggtattccgt acatacaatg cctccatcac gctacagcag 1800

cagctaaaag aactgacagc cccggatgag aacatcccag cgaagatcct ttcttataac 1860

cgtgccaatc gagctgttgc aattctttgt aaccatcaga gggcaccacc aaaaactttt 1920

gagaagtcta tgatgaactt gcaaactaag attgatgcca agaaggaaca gctagcagat 1980

gcccggagag acctgaaaag tgctaaggct gatgccaagg tcatgaagga tgcaaagacg 2040

aagaaggtag tagagtcaaa gaagaaggct gttcagagac tggaggaaca gttgatgaag 2100

ctggaagttc aagccacaga ccgagaggaa aataaacaga ttgccctggg aacctccaaa 2160

ctcaattatc tggaccctag gatcacagtg gcttggtgca agaagtgggg tgtcccaatt 2220

gagaagattt acaacaaaac ccagcgggag aagtttgcct gggccattga catggctgat 2280

gaagactatg agttttag 2298

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggatataa agccattaaa 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgaggatga tgctgattat aa 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggcatca agtggaaatt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttctctag tccaccacaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttctccgaa cgtgtcacgt 20

Claims

1.检测TOP1的试剂在制备宫颈癌诊断试剂或诊断工具中的应用，所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TOP1的试剂包含检测TOP1基因表达量的试剂，所述TOP1基因包含如sequence NO:2所示的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TOP1的试剂包含能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂，和/或能够对TOP1进行定量的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增TOP1基因的引物；所述能够对TOP1进行定量的试剂包括特异性结合TOP1的抗体。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

6.TOP活性抑制剂在制备治疗宫颈癌的药物或设备中的应用，所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。

7.TOP1基因表达抑制剂在制备治疗宫颈癌的药物或设备中的应用，所述TOP1基因包含如sequence NO:2所示的核酸序列。

8.治疗宫颈癌的药物，其特征在于，所述药物包括以下试剂中的一种或多种：(1)抑制TOP1活性的试剂；或(2)特异性结合TOP1的试剂；或(3)抑制TOP1基因表达的试剂；所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列。

9.诊断宫颈癌的工具，其特征在于，所述试剂盒包括以下试剂中的一种：(1)检测TOP1的试剂；或(2)检测TOP1基因的试剂；所述TOP1包含如sequence NO:1所示的氨基酸序列；所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

10.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述检测TOP1的试剂包含能够对TOP1基因的mRNA进行定量的试剂，和/或能够对TOP1进行定量的试剂。