CN114040776B - Tlr激动剂与抗ox40抗体或其抗原结合片段联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途。具体而言，TLR激动剂为式(I)所示化合物或其可药用盐。

Description

TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段联合在制备治疗 肿瘤的药物中的用途

技术领域

本披露中涉及一种TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段联合在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

今人类社会长期面临的严峻健康挑战。但传统的手术、化疗和放疗等疗法往往在治疗已扩散的实体肿瘤时收效甚微，肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域一个持续热点，最近研究已证明，增强抗肿瘤T细胞功能可以用于抵抗癌症，有大量证据表明肿瘤细胞通过诱导主要由调节T淋巴细胞(Treg；Quezda et al.Immunol Rev 2011；241:104-118)介导的主动免疫耐受而“逃避”免疫系统。因此，效应T淋巴细胞(Teff)与耐受原性(tolerogenic)Treg之间的平衡对于有效抗肿瘤免疫治疗至关重要。因此有效抗肿瘤免疫应答可以通过增强肿瘤特异性Teff的效应功能和/或通过减弱肿瘤特异性Treg的抑制功能而获得。CD134(OX40)受体已被证明是介导这些应答的一种关键受体(Sugamura,K,Ishii,N,Weinberg,A.Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory moleculeOX40.Nature Rev Imm 2004；4:420-431)。

Toll样受体(toll-like receptors；TLRs)是参与先天免疫的一类重要蛋白质分子。TLRs是单体跨膜的非催化性受体，通常在岗哨细胞如巨噬细胞和树突状细胞中表达，可以识别由微生物产生的结构保守的分子。一旦这些微生物突破如皮肤或肠道粘膜的物理屏障，就会被TLRs识别，继而激活免疫细胞应答。(Mahla,RS.等人,Front Immunol.4:248(2013))。免疫系统之所以具有广泛识别病原微生物的能力，某种程度上是由于Toll样免疫受体的广泛存在。

在哺乳动物中至少有10种不同的TLRs。一些此类受体的配体和相应的信号级联放大已经被鉴定出。很多疾病、障碍与TLRs的异常有关，比如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)、肾细胞癌、骨髓瘤、变应性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎(COPD)、溃疡性结肠炎、肝纤维化，HBV、黄病毒科(Flaviviridae)病毒、HCV、HPV、RSV、SARS、HIV或流行性感冒的病毒感染等。

TLR7是TLRs(TLRs 3、7、8和9)亚组的成员，局限于专门检测非己核酸的细胞的内涵体隔室。TLR7在通过识别ssRNA抗病毒防御方面起关键作用(Diebold S.S.等,Science,2004:303,1529-1531；和Lund J.M.等,PNAS,2004:101,5598-5603)。目前，已上市的TLR7抑制剂主要用于表面给药，例如imiquimod用于治疗尖锐湿疣等。

WO2018095426A提供了一种TLR7激动剂，结构如下所示：

OX40(又称CD134)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员之一，是一种在细胞表面表达的分子量约50kDa的糖蛋白。OX40的胞外配体结合结构域由4个富含半胱氨酸的结构域(CRD)组成。OX40的天然配体是OX40L(CD252)，3个OX40对应结合三聚体的配体，形成OX40-OX40L复合物。

OX40主要表达在激活的T细胞上，0X40是次级共剌激分子，在激活后24-72小时后表达。OX40的配体OX40L主要表达在在激活的抗原递呈细胞上。表达OX40的T淋巴细胞已被证实存在于各种人恶性肿瘤及癌症患者的引流淋巴结中。在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型中，OX40与OX40L结合结构域相互作用可增强抗肿瘤免疫，导致各种人恶性肿瘤细胞系，如淋巴瘤、前列腺癌、结肠癌及乳腺癌的肿瘤生长抑制。

目前有多家国际制药公司在研发针对OX40的单克隆抗体，它通过特异性刺激免疫激活，提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。相关专利如WO2013038191、WO2015153513、WO2016179517、WO2017096182等。迄今为止，阿斯利康、BMS等公司各自开发的抗OX40抗体已在II期临床试验之中，而基因泰克、GSK等公司的相关产品也已处在临床试验阶段。

WO2017021912A公开一种结合于OX40的抗原结合蛋白与选自TRL7/8调节剂或TRL4调节剂的联用，具体实施例中公开抗OX40抗体OX86与TRL4激动剂在CT-26模型中的实验数据，但是OX40抗体与TRL7/8调节剂联用效果不好。

发明内容

本公开提供一种TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段联合在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

本公开提供的TLR激动剂可选TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂，优选TLR7激动剂或TLR9激动剂，最优选TLR7激动剂。

本公开提供的TLR激动剂可选Heplisav、resiquimod、SD-101,Dynavax、DV-281、imiquimod、cobitolimod、entolimod、lefitolimod、Poly-ICLC、Grass MATA MPL、G-100、AST-008、GSK-1795091、tilsotolimod、KMRC-011、CMB-305、rintatolimod、AZD-1419、influenza-PAL、SAR-439794、MIS-416、MGN-1601、GSK-2245035、VTX-1463、motolimod、GS-9688、LHC-165、BDB-001、PGV-001、AV-7909、DSP-0509、DPX-E7、RG-7854、telratolimod、vesatolimod、poly-ICLC adjuvanted vaccines、MVAME-03、Riboxxim、G-305、PUL-042、litenimod、DRibbles vaccine、TMX-202、ISA-201、PEPA-10、CpG-ODN(K3)、AL-034、Vaxart、CBLB-612、Pseudomonas aeruginosa、IR-103、VAX-161、VAX-125、MEDI19197或式(I)所示化合物或其复合物或其可药用盐，优选TLR7激动剂imiquimod、GSK-2245035、LHC-165、DSP-0509、RG-7854、vesatolimod、TMX-202、AL-034或式(I)所示化合物或其复合物或其可药用盐，

本公开中所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段选自MEDI6469、PF-04518600、KHK4083、BMS986178、MEDI0562、MOXR0916、MEDI6383、INCAGN01949。

本公开所述的抗OX40抗体与人OX40特异性结合，且包含如下所示的CDR：分别如SEQ ID NO：1、2、3氨基酸序列所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3或与SEQ ID NO：1、2、3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别具有3，2或1个氨基酸差异的HCDR变体；和分别如SEQ ID NO：6、7、8氨基酸序列所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3或与SEQ ID NO：6、7、8所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别具有3，2或1个氨基酸差异的LCDR变体，优选含分别如SEQ ID NO：3、4、5氨基酸序列所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3和分别如SEQ ID NO：6、7、8氨基酸序列所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3。

其中上述的各CDR序列如下表所示：

名称	序列	编号
			HCDR1	RYSVH	SEQ ID NO：3
HCDR2	MIWDGGNTDYNSALKS	SEQ ID NO：4
			HCDR3	NPLYFSYAMDY	SEQ ID NO：5
LCDR1	RASQDISNYLN	SEQ ID NO：6
			LCDR2	YTSRLQS	SEQ ID NO：7
LCDR3	QQVNTFPFT	SEQ ID NO：8

在一些实施方式中，所述单克隆抗体或抗原结合片段的CDR(包括3个重链CDR和3个轻链CDR)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR变体是经亲和力成熟方法筛选获得的具有3，2或1个氨基酸差异的CDR变体。

在一种优选的实施方案中，其中所述的OX40抗体的重链HCDR2变体如氨基酸序列SEQ ID NO：12所示。

名称	序列	编号
			HCDR2V1	MIWDGGNTDYNAALKS	SEQ ID NO：12

本公开中所述的抗OX40抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体，优选人源化抗体。

在一种实施方案中，其中所述的人源化抗体包含SEQ ID NO：11氨基酸序列所示或与其具有至少95％序列同一性的重链可变区，优选包含如SEQ ID NO：11氨基酸序列所示的重链可变区。

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDGGNTDYNAALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：11

在一种实施方案中，其中所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO：10氨基酸序列所示或与其具有至少95％序列同一性的轻链可变区，优选包含如SEQ ID NO：10氨基酸序列所示的轻链可变区。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDQSPKLLIIYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQVNTFPFTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO：10

在一种实施方案中，其中所述的人源化抗体包含SEQ ID NO：11氨基酸序列所示的重链可变区和SEQ ID NO：10氨基酸序列所示的轻链可变区。

在一种实施方案中，其中所述的抗OX40抗体包含恒定区；优选地，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体，所述抗体的重链恒定区来源于人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变序列，轻链恒定区来源于人源κ、λ链或其突变序列，优选所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO：13所示或与其具有至少95％序列同一性，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示或与其具有至少95％序列同一性，最优选所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO：13所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

IgG1重链恒定区：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:13

kappa轻链恒定区：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:14

在一个优选的实施方案中，所述抗OX40抗体包含：重链氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示或与其具有至少85％序列同一性和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示或与其具有至少85％序列同一性；优选重链氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

重链：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDGGNTDYNAALKSRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:15

轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDQSPKLLIIYTSRLQSGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCQQVNTFPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:16

在一些实施方案中，TLR激动剂可以与统一剂量或基于重量的剂量一起使用。在其它实施方案中，所述TLR激动剂作为统一剂量施用。在一些实施方案中，将TLR激动剂作为基于重量的剂量施用。为了施用TLR激动剂，所述剂量可以在以下范围内0.1-1000μg/kg、0.5-500μg/kg、1-500μg/kg；具体可以为0.10μg/kg、0.20μg/kg、0.30μg/kg、0.40μg/kg、0.50μg/kg、0.60μg/kg、0.70μg/kg、0.80μg/kg、0.90μg/kg、1.00μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、105μg/kg、110μg/kg、115μg/kg、120μg/kg、125μg/kg、130μg/kg、135μg/kg、140μg/kg、145μg/kg、150μg/kg、155μg/kg、160μg/kg、165μg/kg、170μg/kg、175μg/kg、180μg/kg、185μg/kg、190μg/kg、195μg/kg、200μg/kg、205μg/kg、210μg/kg、215μg/kg、220μg/kg、225μg/kg、230μg/kg、235μg/kg、240μg/kg、245μg/kg、250μg/kg、255μg/kg、260μg/kg、265μg/kg、270μg/kg、275μg/kg、280μg/kg、285μg/kg、290μg/kg、295μg/kg、300μg/kg、305μg/kg、310μg/kg、315μg/kg、320μg/kg、325μg/kg、330μg/kg、335μg/kg、340μg/kg、345μg/kg、350μg/kg、355μg/kg、360μg/kg、365μg/kg、370μg/kg、375μg/kg、380μg/kg、385μg/kg、390μg/kg、395μg/kg、400μg/kg、405μg/kg、410μg/kg、415μg/kg、420μg/kg、425μg/kg、430μg/kg、435μg/kg、440μg/kg、445μg/kg、450μg/kg、455μg/kg、460μg/kg、465μg/kg、470μg/kg、475μg/kg、480μg/kg、485μg/kg、490μg/kg、495μg/kg、500μg/kg；或为了施用TLR激动剂，所述剂量可以在以下范围内0.001-100mg、0.01-50mg、0.1-20mg、0.1-10mg、0.1-5mg，例如：0.001mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.05、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg、0.25mg、0.30mg、0.35mg、0.40mg、0.45mg、0.50mg、0.55mg、0.60mg、0.65mg、0.70mg、0.75mg、0.80mg、0.85mg、0.90mg、0.95mg、1.00mg、1.05mg、1.10mg、1.15mg、1.20mg、1.25mg、1.30mg、1.35mg、1.40mg、1.45mg、1.50mg、1.55mg、1.60mg、1.65mg、1.70mg、1.75mg、1.80mg、1.85mg、1.90mg、1.95mg、2.00mg、2.05mg、2.10mg、2.15mg、2.20mg、2.25mg、2.30mg、2.35mg、2.40mg、2.45mg、2.50mg、2.55mg、2.60mg、2.65mg、2.70mg、2.75mg、2.80mg、2.85mg、2.90mg、2.95mg、3.00mg、3.05mg、3.10mg、3.15mg、3.20mg、3.25mg、3.30mg、3.35mg、3.40mg、3.45mg、3.50mg、3.55mg、3.60mg、3.65mg、3.70mg、3.75mg、3.80mg、3.85mg、3.90mg、3.95mg、4.00mg、4.05mg、4.10mg、4.15mg、4.20mg、4.25mg、4.30mg、4.35mg、4.40mg、4.45mg、4.50mg、4.55mg、4.60mg、4.65mg、4.70mg、4.75mg、4.80mg、4.85mg、4.90mg、4.95mg、5.00mg、5.50mg、6.00mg、6.50mg、7.00mg、7.50mg、8.00mg、8.50mg、9.00mg、9.50mg、10.00mg、10.50mg、11.00mg、11.50mg、12.00mg、12.50mg、13.00mg、13.50mg、14.00mg、14.50mg、15.00mg、15.50mg、16.00mg、16.50mg、17.00mg、17.50mg、18.00mg、18.50mg、19.00mg、19.50mg、20.00mg、20.50mg、21.00mg、21.50mg、22.00mg、22.50mg、23.00mg、23.50mg、24.00mg、24.50mg、25.00mg、25.50mg、26.00mg、26.50mg、27.00mg、27.50mg、28.00mg、28.50mg、29.00mg、29.50mg、30.00mg、30.50mg、31.00mg、31.50mg、32.00mg、32.50mg、33.00mg、33.50mg、34.00mg、34.50mg、35.00mg、35.50mg、36.00mg、36.50mg、37.00mg、37.50mg、38.00mg、38.50mg、39.00mg、39.50mg、40.00mg、40.50mg、41.00mg、41.50mg、42.00mg、42.50mg、43.00mg、43.50mg、44.00mg、44.50mg、45.00mg、45.50mg、46.00mg、46.50mg、47.00mg、47.50mg、48.00mg、48.50mg、49.00mg、49.50mg、50.00mg。

可选的实施方案中，TLR激动剂的剂量选自0.10mg、0.15mg、0.20mg、0.25mg、0.30mg、0.35mg、0.40mg、0.45mg、0.50mg、0.55mg、0.60mg、0.65mg、0.70mg、0.75mg、0.80mg、0.85mg、0.90mg、0.95mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg。

可选的实施方案中，TLR激动剂的剂量选自0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg。

可选的实施方案中，TLR激动剂的剂量选自0.5mg、1mg、2.0mg、3mg、4.0mg、6.0mg、8mg、9mg、12mg。

本公开中TLR激动剂给药频率为每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次；优选每周1次、每2周一次。

可选的实施方案中，TLR激动剂给药频率次为每周一次。

可选的实施方案中，TLR激动剂给药频率次为每2周一次。

可选的实施方案中，TLR激动剂给药频率次为每3天一次。

在某些实施方案中，本公开提供的联合的用途可以与统一剂量或基于重量的剂量一起使用。在一些实施方案中，将所述抗OX40抗体或其抗原结合部分作为统一剂量施用。在一些实施方案中，将所述抗OX40抗体或其抗原结合部分作为基于重量的剂量施用。为了施用抗OX40抗体所述剂量可以在以下范围内：0.01-10.0mg/kg、0.1-5mg/kg、0.1-2mg/kg，例如，剂量可以是0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.2mg/kg、1.4mg/kg、1.6mg/kg、1.8mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.2mg/kg、4.4mg/kg、4.6mg/kg、4.8mg/kg、5.0mg/kg、5.2mg/kg、5.4mg/kg、5.6mg/kg、5.8mg/kg、6.0mg/kg、6.2mg/kg、6.4mg/kg、6.6mg/kg、6.8mg/kg、7.0mg/kg、7.2mg/kg、7.4mg/kg、7.6mg/kg、7.8mg/kg、8.0mg/kg、8.2mg/kg、8.4mg/kg、8.6mg/kg、8.8mg/kg、9.0mg/kg、9.2mg/kg、9.4mg/kg、9.6mg/kg、9.8mg/kg、10.0mg/kg；为了施用OX40抗体所述剂量也可以在以下范围内1-1000mg、1-500mg、1-300mg、1-200mg，具体可选1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg、24mg、25mg、26mg、27mg、28mg、29mg、30mg、31mg、32mg、33mg、34mg、35mg、36mg、37mg、38mg、39mg、40mg、41mg、42mg、43mg、44mg、45mg、46mg、47mg、48mg、49mg、50mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体的剂量选自0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.2mg/kg、1.4mg/kg、1.6mg/kg、1.8mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.2mg/kg、4.4mg/kg、4.6mg/kg、4.8mg/kg、5.0mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自0.03mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自0.1mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自0.3mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自1mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自3mg/kg。

可选的实施方案中，抗OX40抗体剂量选自5mg/kg。

本公开中抗OX-40抗体的给药频率为每周3次、每周2次、每周1次，每2周一次、每3周一次、每4周一次、1个月一次、每3-6个月一次，优选每周3次或每4周一次，最优选每3周一次。

本公开中所述肿瘤是选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌，甲状腺癌、肝癌、肛门癌、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤、脑癌、以及头颈癌，优选结肠癌、非霍奇金淋巴瘤。

本公开中提供一种式(I)所示化合物或其复合物或其可药用盐联合上述抗OX40抗体或者抗原结合片段在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途，所述的肿瘤优选结肠癌。

本公开中TLR激动剂的可药用盐可以是盐酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、戊酸盐、谷氨酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、双羟萘酸盐、水杨酸盐、香草酸盐、扁桃酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐或月桂基磺酸盐等，优选马来酸盐、盐酸盐，最优选二盐酸盐。

本公开提供一种治疗肿瘤的方法，包括给予患者治疗有效量的上述TLR激动剂和治疗有效量的上述抗OX40抗体或者抗原结合片段。

本公开提供一种治疗结肠癌的方法，包括给予患者治疗有效量的式(I)所示化合物二盐酸盐和治疗有效量的上述OX40抗体或者抗原结合片段。

本公开中抗OX40抗体或者抗原结合片段的给药途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。所述“胃肠外施用”是指，通过注射进行的除了肠内和局部施用以外的施用模式，且包括但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、病灶内、以及体内电穿孔。在某些实施方案中，所述抗OX40抗体或者抗原结合片段通过非胃肠外途径施用，在某些实施方案中，口服施用。其它非胃肠外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。

本公开中TLR激动剂的给药途径可以是与上述免疫检查点抑制剂相同或者不同，具体包括包括口服、鼻腔、局部、静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱、病灶内或其它胃肠外施用途径，本公开中TLR激动剂的给药途径优选病灶内给药的瘤内给药方式。

本公开提供一种治疗肿瘤的方法，包括给予患者治疗有效量的上述TLR激动剂和治疗有效量的上述抗OX40抗体或者抗原结合片段。

本公开提供一种治疗肿瘤的方法，包括瘤内给予患者治疗有效量的上述TLR激动剂和肿瘤或者静脉给与患者治疗有效量的上述抗OX40抗体或者抗原结合片段。

本公开提供一种治疗肿瘤的方法，包括瘤内给予患者治疗有效量的式(I)所示化合物二盐酸盐和静脉给予患者治疗有效量的上述OX40抗体或者抗原结合片段。

可以将本披露的抗OX40抗体或者抗原结合片段构成在组合物中，例如，含有抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，用于含有抗体的组合物的载体适合静脉、肌肉、皮下、胃肠外、腹腔、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)，本披露的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、水性和非水性载体，和/或佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。

本公开提供的TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段的联用，具有预料不到的远端效应。

术语

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

术语“统一剂量”的应用是指不考虑患者的重量或体表面积(BSA)施用给患者的剂量。例如，60kg人和100kg人将接受相同剂量的抗体(例如，240mg抗OX40抗体)。

本文提及的术语“基于重量的剂量”是指基于患者的重量计算出的、施用给患者的剂量。例如：10.0mg/kg是指基于给药对象的体重，每kg给药10.0mg。

本披露中所述的“联合”是一种给药方式，是指在一定时间期限内给予至少抗OX40抗体和TLR激动剂，其中两种药物都显示药理学作用。所述的时间期限可以是一个给药周期内，优选4周内，3周内，2周内，1周内，或24小时以内。可以同时或依次给予抗OX40抗体和TLR激动剂。这种期限包括这样的治疗，其通过相同给药途径或不同给药途径给予给予抗OX40抗体和TLR激动剂。

术语“抗OX40抗体”和“结合OX40的抗体”指能够以足够亲和力结合OX40，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向OX40的抗体。

本公开所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

在本公开中，本公开所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体，优选κ恒定区。

在本公开中，本公开所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体，优选IgG1恒定区。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则。

本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

本文中使用的术语“抗体框架(FR)”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“氨基酸差异”是指多肽与其变体之间，在多肽片段上某个或某些氨基酸位点之间的差异，其中变体可以由多肽上某个或某些位点经替换、插入或缺失氨基酸获得。

本公开所述的“突变序列”是指对本公开的核苷酸序列和氨基酸序列进行适当的替换、插入或缺失等突变修饰情况下，得到的与本公开的核苷酸序列和氨基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和氨基酸序列。本公开中所述的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，非限制性实施例包括85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National Center For Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默认设置来进行。

本文中“同源性”、“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

附图说明

图1.治疗后右侧肿瘤组织生长曲线；

图2.治疗后左侧肿瘤组织生长曲线；

图3.受试化合物治疗过程中荷瘤鼠体重变化曲线。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本披露，但这些实施例并非限制本披露的范围。

实施例1.抗OX40抗体(药物A)的制备

1.抗体的制备

本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

抗人OX40单克隆抗体库通过免疫小鼠产生。实验用BalB/C和A/J品系小鼠(扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号：SCXK(苏)2017-007)，雌性，10周龄。

免疫抗原为带Fc标签的人OX40重组蛋白(OX40-Fc：OX40 Leu 29-Ala 216(Accession#NP_003318)与Fc融合)，购自Acro Biosystems公司，货号#OX40-H5255，使用HEK293表达后按常规方法纯化。将OX40-Fc用弗氏佐剂乳化：首次免疫用弗氏完全佐剂(sigma-aldrich，F5881-10ML)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(sigma-aldrich，F5506-10ML)。抗原与佐剂比例为1:1，每次免疫注射25μg蛋白/200μl/只小鼠。详细见下表1。

表1.

第1天	第一次免疫，完全弗氏佐剂。
		第21天	第二次免疫，不完全弗氏佐剂。
第35天	第三次免疫，不完全弗氏佐剂。
		第42天	采血和血清效价检测
第49天	第四次免疫，不完全弗氏佐剂。
		第56天	采血和血清效价检测

用下述的ELISA方法检测小鼠血清，确定小鼠血清的抗体滴度和阻断OX40/OX40L结合的中和活性。选择血清效价、亲和力和配体结合阻断能力强的小鼠进行一次终免疫后处死小鼠。取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞(CRL-1581^TM)融合后铺板获得杂交瘤，通过下述的间接ELISA，捕获ELISA以及基于细胞的功能性筛选选择目标杂交瘤，并通过有限稀释法建株单克隆抗体。

把已建株的19株OX40小鼠单抗进行无血清表达生产，并用protein A亲和层析技术得到纯化的小鼠单抗。通过间接ELISA，捕获ELISA及细胞功能学活性筛选其中的分泌激活型抗OX40抗体的杂交瘤细胞。功能性筛选的简要步骤如下：培养GS-H2/OX40稳定细胞系(购自genscript，cat#M00608)。制备稀释的待测抗体及OX40L(Sino Biological，13127-H04H)溶液添加到处于对数生长期的GS-H2/OX40细胞中，培养后收集细胞上清，测定上清中的IL-8含量(使用human IL-8kit，cisbio，cat#62IL8PEB)。

根据细胞功能性活性，选择活性高的10株进行基因克隆和测序。通过常规RNA抽提技术即可获得细胞总RNA，然后通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得单克隆抗体可变区的PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶分离回收，然后克隆到基因载体，转化大肠杆菌。随机挑选数个转化菌落，PCR扩增单克隆抗体可变区，用于基因测序。获得的示例性的鼠源单克隆抗体的相应序列如下所示。

鼠单克隆抗体m2G3的重链和轻链可变区序列如下：

m2G3重链可变区：

QVQLKESGPGLVASSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWDGGNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：1

m2G3轻链可变区：

DIQMTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIIYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVNTFPFTFGSGTKLEIK

SEQ ID NO：2

鼠单克隆抗体m2G3的CDR区序列如表2：

表2.鼠单克隆抗体m2G3的CDR区序列

名称	序列	编号
			HCDR1	RYSVH	SEQ ID NO：3
HCDR2	MIWDGGNTDYNSALKS	SEQ ID NO：4
			HCDR3	NPLYFSYAMDY	SEQ ID NO：5
LCDR1	RASQDISNYLN	SEQ ID NO：6
			LCDR2	YTSRLQS	SEQ ID NO：7
LCDR3	QQVNTFPFT	SEQ ID NO：8

2.抗体的ELISA鉴定与筛选方法

2.1间接ELISA法：

将20×包被缓冲液用去离子水稀释至1×，用1×包被液(碳酸盐缓冲液)配制抗原human OX40-His(Acro biosytems,OXL-H52Q8)，使其终浓度为2μg/mL，每孔加液100μL，4℃过夜或37℃孵育2h。PBST洗板1次，每孔加入200μL封闭液(含5％脱脂牛奶的PBST)，37℃孵育2h，PBST洗板4次。每孔加入稀释好的一抗100μL(待测抗体浓度从10000ng/ml起5倍倍稀，7个梯度，即10000ng/ml，2000ng/ml，400ng/ml，80ng/ml，16ng/ml，3.2ng/ml，0.64ng/ml，空白孔为纯稀释液即2.5％脱脂牛奶的PBST)，37℃孵育40min。PBST洗板4次，用PBST缓冲液稀释酶标二抗(HRP标记山羊抗小鼠IgG，购自Jackson Immunoresearch,Cat#115036071或HRP标记山羊抗人IgG，购自Jackson Immunoresearch,Cat#109036098)，每孔加100μL，37℃孵育40min。PBST洗板4次，每孔加100μLTMB显色液，室温避光孵育3-15分钟，每孔加入50μl终止液(1M硫酸)。设置酶标仪参数，在450-630nm处读取OD值，保存实验数据。

2.2捕获ELISA：

将20×PBS缓冲液用去离子水稀释至1×，用1×PBS配制GAM二抗(JacksonImmunoresearch,115-006-071)，使其终浓度为2μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜或37℃孵育2h；PBST洗板1次，每孔加入200μL封闭液(含5％脱脂牛奶的PBST)，37℃孵育2h，PBST洗板4次。每孔加入稀释好的一抗100μL(待测抗体浓度从10000ng/ml起5倍倍稀，7个梯度，即10000ng/ml，2000ng/ml，400ng/ml，80ng/ml，16ng/ml，3.2ng/ml，0.64ng/ml，空白孔为纯稀释液即2.5％脱脂牛奶的PBST)，37℃孵育40min。PBST洗板4次，用2.5％脱脂牛奶的PBST稀释human OX40-FC-biotin(Acro biosystem，OX0-H5255，标记Biotin)，每孔加100μl，37℃孵育40min，PBST洗板4次。每孔加100μL TMB显色液，室温避光孵育3-15分钟，每孔加入50μl终止液(1M硫酸)，设置酶标仪参数，在450-630nm处读取OD值，保存实验数据。

2.3配体结合阻断ELISA：

将20×包被缓冲液用去离子水稀释至1×，用1×包被液(碳酸盐缓冲液)配置抗原OX40L-His(Acro biosytems,OXL-H52Q8)，使其终浓度为2μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜或37℃孵育2h；PBST洗板1次；每孔加入200μL封闭液(含5％脱脂牛奶的PBST)，37℃孵育2h；PBST洗板4次；用预先配制好的200ng/ml的human OX40-Fc溶液(配制在2.5％的脱脂牛奶中)梯度稀释小鼠血清/抗体，而后室温预孵育40min后，加到已封闭好的OX40L板子上，100μL/孔，孵育40min；PBST洗板4次；用PBST缓冲液稀释HRP标记的羊抗人二抗(GAH-HRP，Jackson Immunoresearch,109-035-006)，每孔加100μl，37℃孵育40min；PBST洗板4次；每孔加100μL TMB显色液，室温避光孵育3-15分钟；每孔加入50μl终止液(1M硫酸)，设置酶标仪参数，450-630nm处读取OD值，保存实验数据。

3.抗OX40重组嵌合抗体构建表达

将本公开中的鼠源抗体m2G3的重链可变区(VH)加上人免疫球蛋白重链恒定区，轻链可变区(VL)加上人免疫球蛋白Kappa轻链恒定区，分别克隆到真核表达载体上，通过转染细胞生产出鼠-人嵌合抗体。重链载体设计如下：信号肽+重链可变区序列+人的IgG1恒定区序列。轻链载体设计如下：信号肽+轻链可变区序列+人的Kappa恒定区序列。分别将上述序列插入pCEP4载体(Thermofisher，V04450)。得到载体质粒后，大抽质粒，将质粒送测序验证。将验证合格的质粒用PEI转染至人293F细胞中，连续培养，将293F细胞用无血清培养液(上海奥浦迈生物，OPM-293CD03)培养至对数生长期用于细胞转染。将21.4μg嵌合抗体轻链质粒和23.6μg嵌合抗体重链质粒溶解在10ml Opti-I Reduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混匀，然后加入200μg PEI，混匀，室温孵育15min，加入50mL细胞中。细胞培养条件：5％ CO₂，37℃，125rpm/min。培养期间，第1天和第3天加补料，直到细胞活率低于70％，收取细胞上清，离心过滤。将离心过滤后的细胞培养液上样到抗体纯化亲和柱，经磷酸缓冲液洗柱、甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)洗脱、1M Tris盐酸pH 9.0中和、以及磷酸缓冲液透析，最终获得纯化的嵌合抗体Ch2G3。

4.体外结合亲和力和动力学实验

对鼠源抗体和嵌合抗体进行人OX40的亲和力进行检测(方法步骤同2抗体的ELISA鉴定与筛选方法)，其中，m2G3-NC、ch2G3-NC、为阴性对照。结果显示嵌合抗体Ch2G3与人OX40具有很高的亲和力。

5.抗OX40抗体体外细胞报告基因实验

用anti-CD3抗体(Chempartner,A05-001)包被孔板，4度放置过夜，PBS洗3次；收获Jurkat-NF-Kb luc-hOX40细胞(ATCC,TIB-152(稳定细胞系由上海睿智化学构建))和Raji细胞(ATCC,CCL-86)，重悬然后混合两种细胞。添加50μl/孔稀释的待测抗体和50μl/孔已混合的两种细胞到细胞板中，细胞板放在37度5％CO₂孵育箱中孵育5小时。添加100μl one-Glo TM luciferase reagent(Promega,Cat#E6120)到每一孔中，室温孵育3min以上。上机检测发光信号，记录RLU读值，Ch2G3抗体的EC50(nM)为0.6371，显示嵌合抗体Ch2G3有效的激活报告基因。

6.小鼠抗体人源化实验

为了降低可能的免疫原性，将鼠源抗体进行人源化改造。将嵌合抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别做FR(framework region)区域的定点氨基酸突变，根据不同的氨基酸突变组合，设计不同的人源化抗体重链和轻链，将不同的轻重链组合质粒转染细胞可以生产出人源化抗体，简述如下。首先设计表达载体：重链载体设计如下：信号肽+突变的重链可变区序列+人的IgG1恒定区序列。轻链载体设计如下：信号肽+突变的轻链可变区序列+人的Kappa恒定区序列。分别将上述序列插入pCEP4载体(Thermofisher，V04450)。请第三方基因合成公司按照上述设计合成表达载体，得到载体质粒后，大抽质粒，将质粒送测序验证。将验证合格的质粒用PEI转染至人293F细胞中，连续培养，将293F细胞用无血清培养液(上海奥浦迈生物，OPM-293CD03)培养至对数生长期用于细胞转染。将21.4μg人源化抗体轻链质粒和23.6μl人源化抗体重链质粒溶解在10ml Opti-I Reduced SerumMedium(GIBCO,31985-070)中混匀，然后加入200μg PEI，混匀，室温孵育15min，加入50mL细胞中。细胞培养条件：5％ CO₂，37℃，125rpm/min。培养期间，第1天和第3天加补料，直到细胞活率低于70％，收取细胞上清，离心过滤。将离心过滤后的细胞培养液上样到抗体纯化亲和柱，经磷酸缓冲液洗柱、甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)洗脱、1M Tris盐酸pH9.0中和、以及磷酸缓冲液透析，最终获得纯化的人源化抗体。

人源化可变区序列如下：

>hu2G3 VH1

SEQ ID NO：9

>hu2G3 VL1

SEQ ID NO：10

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。

为了获得更好的人源化2G3抗体，对hu2G3 VH1的氨基酸序列进行突变，突变后的重链可变区序列如下：

hu2G3 VH1.1

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDGGNTDYNAALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：11

突变后获得的HCDR2序列如下：

表3.突变后获得的HCDR2序列

名称	序列	编号
			HCDR2V1	MIWDGGNTDYNAALKS	SEQ ID NO：12

将重链可变区hu2G3 VH1.1与轻链可变区hu2G3 VL1组合形成新的优化的人源化抗体，见表4。

表4.突变后获得的新的人源化2G3抗体

抗体	VH	VL
			2G3	hu2G3 VH1.1	hu2G3 VL1

将上述人源化抗体进行亲和力测评(参照实施例2中的capture ELISA)，实验结果表明人源化后的分子可同OX40结合。

将上述轻链可变区与轻链恒定区序列(例如：SEQ ID NO:14所示)组合形成最终的轻链序列，将各重链可变区与重链恒定区(例如SEQ ID NO:13所示的)组合形成最终的重链序列。具体轻、重链恒定区并非作为本公开抗体恒定区的限制，也可选用本领域其它已知的轻、重链恒定区及其突变体来增加抗体的性能。示例性的恒定区如下所示：

IgG1重链恒定区：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:13

kappa轻链恒定区：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:14

示例性的2G3抗体全长氨基酸序列如下：

2G3重链：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDGGNTDYNAALKSRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:15

2G3轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDQSPKLLIIYTSRLQSGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCQQVNTFPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:16

7.人源化抗体体外结合亲和力和动力学试验

Biacore方法是公认的客观检测蛋白相互间亲和力和动力学的检测方法。我们通过Biacore T200(GE)分析本公开待测OX40抗体表征亲和力及结合动力学。

利用由Biacore提供的试剂盒，采用NHS标准氨基偶联法将本公开待测重组抗OX40抗体共价连接至CM5(GE)芯片上。然后将稀释于同样缓冲液中的一系列浓度梯度的人OX40-His蛋白(义翘神州#10481-H08H)于前后各个循环进样，流速30μL/min，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用GE的BIAevaluation软件以1:1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的嵌合抗体ka(kon)、kd(koff)和K_D值显示于下表5。

表5.人源化抗体体外结合亲和力结果

待测抗体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				2G3	4.371E+05	2.023E-03	4.628E-09

结果显示2G3可有效结合OX40。

8.抗体阻断OX40与OX40L结合ELISA试验

用配体OX40 ligand(Acrobiosystem，OXL-H52Q8)包板封闭后，加入梯度稀释待测抗体(抗体稀释在含human Bio-OX40-FC(Acrobiosystem，OX40-H5255，标记Biotin)的溶液中预孵育40min后加板)，孵育40min后，洗板。再加入SA-HRP(Jackson Immunoresearch,016-030-084)，孵育40min后，加入显色液和终止液，测OD值，结果见下表6。

表6.抗体阻断OX40与OX40L结合实验结果

抗体	2G3
		IC50(nM)	1.88

结果显示2G3可阻断OX40同OX40L的结合。

人源化抗体活性数据

用anti-CD3抗体(Chempartner,A05-001)包被plate，4度放置过夜，PBS洗3次；收获Jurkat-NF-Kb luc-hOX40细胞(ATCC,TIB-152(稳定细胞系由睿智化学公司构建)和Raji细胞(ATCC,CCL-86)，重悬然后混合两种细胞。添加50μl/孔稀释的待测抗体，和50μl/孔已混合的两种细胞到plates，细胞板放在37度5％ CO₂孵育箱中孵育5小时。添加one-Glo TMluciferase reagent(Promega,Cat#E6120)到每一孔中，室温孵育3min以上。上机检测发光信号，记录RLU读值。结果见下表，结果表明2G3可有效激活报告基因。

表7.人源化抗体激活报告基因实验结果

抗体	2G3
		EC50(nM)	2.294

10.体外细胞功能试验

分离CD4+记忆T细胞，同待测抗体加入到抗CD3抗体(Chempartner,A05-001)包被的96孔板中，37度共孵育72h，取上清检测IFN-γ，结果如图2所示。GPX4及2G3可显著增强IFN-γ的释放，其中2G3在10ng/mL即可达到最大刺激效果。

11.抗OX40抗体对肿瘤细胞生长的抑制

B-hTNFRSF4(OX40)人源化小鼠(B-hTNFRSF4(OX40)人源化小鼠，百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，雌性，17～20g，6～7周。收集对数生长期MC38肿瘤细胞7(购买于南京银河生物医药有限公司)，用PBS缓冲液调整细胞浓度为5×10⁶/mL，接种0.1mL细胞悬液于OX40小鼠胁腹部。观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长，在接种后第7天时荷瘤小鼠胁腹部平均肿瘤体积达到102.5mm³，按照肿瘤体积大小进行分组和给药观察，具体分组信息如下表:

表8.小鼠分组及给药剂量表

给药组	给药剂量(mg/kg)	给药途径	给药频率
				Vehicle(IgG1)	3	i.p.	Q3D×6
GPX4	3	i.p.	Q3D×6
				2G3	0.3	i.p.	Q3D×6
2G3	1	i.p.	Q3D×6
				2G3	3	i.p.	Q3D×6

检测(OX40)人源化小鼠MC38结肠癌细胞移植瘤的生长抑制作用。肿瘤体积和荷瘤鼠体重测量：使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积计算公式为V＝0.5a x b²，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径；肿瘤生长移植瘤TGI(％)＝[1-T/C]×100。所有荷瘤鼠体重每周测量两次。

给药治疗后第20天，Vehicle(IgG1)对照组的平均肿瘤体积达到了1732.593mm³，受试化合物2G3低剂量给药组(0.3mg/kg)小鼠平均肿瘤体积达到了930.37mm³，中剂量给药组(2G3 1mg/kg)和高剂量给药组(2G3 3mg/kg)组内荷瘤鼠平均肿瘤体积分别为303.49mm³和155.79mm³，中高剂量组抑制肿瘤生长与对照组差异明显(**P<0.01)，并表现出初步的剂量依赖关系，其肿瘤生长抑制率分别达到了49％、88％和97.0％。GPX4 3mg/kg的荷瘤鼠平均肿瘤体积分别为362.47mm³，与Vehicle组比较差异显著，也表现有明显的抑制肿瘤生长的作用(*P<0.05)，其肿瘤生长抑制率分别达到了84％

给药后第20天结束实验，结果见表13和图3。所有治疗小鼠被安乐死处理，剥离荷瘤鼠皮下移植瘤块并进行称量。其中Vehicle组平均肿瘤块重量为1.568g,受试化合物2G3在低剂量组(0.3mg/kg)、中剂量组(1mg/kg)和高剂量组(3mg/kg)，平均肿瘤重量分别为0.926g、0.251g和0.181g，其中中高剂量组与对照组比较差异显著，抑制肿瘤生长作用明显(**P<0.01)。在同一时间，给药组GPX4 3mg/kg平均肿瘤重量为0.372g，与Vehicle组比较差异明显，也表现出明显的抑制MC38肿瘤细胞生长的作用(**P<0.01)。

在实验过程中，所有治疗荷瘤小鼠体重变化无明显异常，同时在药物治疗过程中未见明显异常行为和其他表现。

表9.小鼠体内抑瘤效果

实施例2、临床前评价抗OX40抗体(药物A)和式(Ⅰ)所示化合物二盐酸盐(药物B)和单用或联用药对hOX40转基因小鼠MC38结肠癌移植瘤生长的抑制作用。

1.实验材料

1)肿瘤细胞

MC38肿瘤细胞，购买于南京银河生物医药有限公司。培养于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，细胞按照常规使用含有EDTA的胰蛋白酶消化传代，每周传代两次，放置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。对数生长期的肿瘤细胞被用于进行体内移植瘤模型的建立。

2)实验动物

75只B-hTNFRSF4(OX40)人源化小鼠，雌性，4-5周，体重14-19g，由百奥赛图江苏基因生物技术有限公司提供。

实验动物饲养

所有的小鼠饲养于SPF级动物房IVC恒温恒压系统中，其中温度20～26℃，湿度40～70％，光照周期12小时明12小时暗。每个笼盒内饲养6只小鼠，笼盒大小为325mm x 210mmx 180mm，笼盒内使用垫料每周更换两次。

3)受试样品

药物A：制备方法如实施例1，具体为2G3。

药物B：

制备方法：将式(I)所示化合物(40mg，0.105mmol)溶于0.5mL异丙醇和四氢呋喃的混合溶剂(V/V＝1:1)中，搅拌全溶，升温至50℃，滴加4M氯化氢的异丙醇溶液(0.055mL，0.22mmol)，冷却至室温搅拌16小时，析出白色固体。反应液过滤，收集滤饼，真空干燥，得到药物B。

鼠TLR9激动剂：为ODN-1826，购买自苏州泓迅生物科技股份有限公司。

表10.

4)其他试剂和实验仪器

表11.

物品	品牌	物品	品牌
				RPMI 1640medium	HeClone	PBS	Sigma
FBS	GIBCO	倒置显微镜	OLYMPUS
				PenicillinG	SangonBiotech	CO2培养箱	Thermo
Streptomycin sulfate	SangonBiotech	天平	Acclulab
				0.25％Trypsin-EDTA	SangonBiotech	分析天平	Denver Instrument
Trypan Blue	GIBCO	ABSOLUTE Digimatic	Mitutoyo corp

2.实验方法

收集对数生长期MC38肿瘤细胞P9代，用PBS缓冲液调整细胞浓度为5X10⁶/mL，接种0.1mL细胞悬液于OX40小鼠左侧和右侧双侧胁腹部。观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长，在接种后第9天时荷瘤小鼠右侧胁腹部平均肿瘤体积达到123.7mm³，按照右侧肿瘤体积大小进行分组和给药观察，具体分组信息如下表12。

表12.给药和治疗方法

Note:N:使用动物数量；

i.p.,:腹腔注射；

i.t.,:瘤内注射(仅右侧肿瘤内注射)；

Q3D：每三天给药一次。

给药体积：瘤内注射体积为0.1mL/小鼠，腹腔注射根据荷瘤鼠体重调整给药体积(0.1mL/10g)。

本实验第一组和第四组在分组后第18天结束，第2组、第3组、第5组至第十组在分组后第21天结束。

第1组即为vehicle组。

受试化合物的配置见表13。

表13.

试验指标

主要是检测(OX40)人源化小鼠MC38结肠癌细胞移植瘤的生长抑制作用。肿瘤体积和荷瘤鼠体重测量：使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积计算公式为V＝0.5a x b²，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径；

RTV T/C：相对肿瘤体积RTV(Relative Tumor Volume)＝V_t/V_o，V_o为组内每只小鼠刚开始给药时的肿瘤体积，V_t为给药后，每次测量的肿瘤体积。

T/C(％)＝TRTV/CRTV 100％

TRTV：受试药物组荷瘤小鼠的平均相对肿瘤体积RTV；CRTV：对照组小鼠的平均相对肿瘤体积

肿瘤生长移植瘤TGI(％)＝[1-T/C]×100

所有荷瘤鼠体重每周测量两次。同时计算给药后小鼠体重增长变化比率：BWL(％)＝(BW_i-BW₀)/BW₀×100，BWi为开始给药后的平均体重，BW₀为首次给药时的平均体重。

所有数据均采用Mean±SEM表示，使用统计学分析软件SPSS20.0对数据进行正态分布和方差齐性检验，根据检验结果选择one-way方差分析方法或非参数检验Kruskal-Wallis方法。*P＜0.05将被认为具有统计学意义的显著性差异。

2.实验结果

表14.显示治疗后小鼠右侧肿瘤体积

治疗后小鼠右侧肿瘤体积(Mean±SEM)n＝6

Note：*P＜0.05、**P＜0.01与vehide组比较。

表15.显示治疗后小鼠左侧肿瘤体积

治疗后小鼠左侧肿瘤体积(Mean±SEM)n＝6

Note*p＜0.05、**P＜0.01.与vehicle组比较。

药物A和药物B单用或联用药对hOX40转基因小鼠MC38结肠癌移植瘤模型的肿瘤生长抑制作用见表16(右侧)。

表16.

注释：a.数据以“平均值±标准误差”表示；

b.*P<0.05、**P<0.01，与vehicle组比较；

c.利用单因素方差分析(one-way ANOVA)各治疗组之间的显著性差异。

药物A和药物B单用或联用药对hOX40转基因小鼠MC38结肠癌移植瘤模型的肿瘤生长抑制作用见表17(左侧)。

表17.

注释：a.数据以“平均值±标准误差”表示；

b.*P<0.05、**P<0.01，与vehicle组比较；

c.利用单因素方差分析(one-way ANOVA)各治疗组之间的显著性差异。

表18.肿瘤块重量(g)(Mean±SEM)n＝6

4.实验总结和讨论

本实验检测了抗OX40抗体(药物A)和TLR7激动剂(药物B)单用或联用药对hOX40转基因小鼠MC38结肠癌移植瘤生长的抑制作用。给药治疗后第18天，溶媒对照组的平均肿瘤体积达到了2793.66mm³(右侧)和2794.89mm³(左侧)，同时单药组药物B 25μg/只,治疗组小鼠肿瘤平均体积也达到了2767.03mm³(右侧)和2175.03mm³(左侧)，根据实验方案和动物福利的要求对这两组荷瘤小鼠实施了安乐死。

在同一天，第2组、第3组，第5组、第6组、第7组、第8组、第9组和第10组的荷瘤鼠右侧平均肿瘤体积分别为649.96mm³、768.28mm³、1013.28mm³、824.27mm³、334.23mm³、536.72mm³、231.48mm³和239.03mm³，与Vehicle组比较差异显著，有明显的抑制肿瘤生长的作用(*P<0.05,**P<0.01)(见图1、表14、表16)，其肿瘤生长抑制率分别达到了76.83％、73.75％、63.42％、70.48％、88.03％、81.63％、92.0％和91.69％(见表16)。

荷瘤鼠左侧平均肿瘤体积分别为平均肿瘤体积分别为1084.84mm³、917.22mm³、1470.54mm³、947.32mm³、490.11mm³、644.32mm³、498.02mm³和349.66mm³，与Vehicle组比较差异显著，有明显的抑制肿瘤生长的作用(*P<0.05,**P<0.01)，其肿瘤生长抑制率分别达到了48.48％、69.09％、43.51％、62.62％、76.66％、77.28％、79.44％和90.22％(见图2、表15、表17)。

在实验过程中，第3组1#和第5组48#荷瘤小鼠由于体重降低，第4组23#荷瘤老鼠由于状态差，分别在分组后第7天，第10天和第18天出现死亡，其中1#荷瘤小鼠进行解剖发现其腹腔内有明显血肿组织异物，肿瘤转移。剩余其他治疗荷瘤小鼠体重变化无明显异常，同时在药物治疗过程中未见明显异常行为和其他表现。Vehicle组的20#和32#由于老鼠肿瘤负荷过重(总瘤体积>3000mm³)，分别在分组后第18天出现死亡。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

<120> TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Ser Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Pro Leu Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ile Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Val Asn Thr Phe Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 3

Arg Tyr Ser Val His

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 4

Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 5

Asn Pro Leu Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 6

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 7

Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠(mouse)

<400> 8

Gln Gln Val Asn Thr Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Pro Leu Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ile Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Thr Phe Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 119

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Pro Leu Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 12

Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 330

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 15

<211> 449

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Pro Leu Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ile Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Thr Phe Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (18)

1.一种TLR激动剂与抗OX40抗体或其抗原结合片段联合在制备预防或治疗结肠癌的药物中的用途，所述TLR激动剂为式(I)所示化合物或其复合物或其可药用盐，所述抗OX40抗体或其抗原结合片段含分别如SEQ ID NO：3、4、5氨基酸序列所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3和分别如SEQ ID NO：6、7、8氨基酸序列所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3，

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗OX40抗体的重链HCDR2变体如氨基酸序列SEQ ID NO：12所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的抗OX40抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的抗OX40抗体为人源化抗体。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的人源化抗体包含选自：SEQ ID NO：11氨基酸序列所示或与其具有至少95％序列同一性的重链可变区。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的人源化抗体包含SEQ ID NO：11氨基酸序列所示的重链可变区。

7.根据权利要求3-6任一项所述的用途，其特征在于所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：10氨基酸序列所示或与其具有至少95％序列同一性的轻链可变区。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：10氨基酸序列所示的轻链可变区。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的人源化抗体包含SEQ ID NO：11氨基酸序列所示的重链可变区和SEQ ID NO：10氨基酸序列所示的轻链可变区。

10.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的抗OX40抗体包含恒定区，所述抗体的重链恒定区来源于人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变序列，轻链恒定区来源于人源κ、λ链或其突变序列，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示或与其具有至少95％序列同一性，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示或与其具有至少95％序列同一性。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：13所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

12.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗OX40抗体包含：重链氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示或与其具有至少85％序列同一性和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示或与其具有至少85％序列同一性。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于所述抗OX40抗体包含：重链氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于TLR7激动剂为式(I)所示化合物二盐酸盐。

15.根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗OX40抗体或其抗原结合片段的剂量选自0.01-10.0mg/kg或1-1000mg，给药频率为每周3次、每周2次、每周1次，每2周一次、每3周一次、每4周一次、1个月一次、每3-6个月一次。

16.根据权利要求15所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗OX40抗体或其抗原结合片段的给药频率为每周3次或每4周一次。

17.根据权利要求15或16所述的用途，其特征在于所述TLR激动剂的剂量选自0.1-1000μg/kg或0.001-100mg，给药频率为每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于所述TLR激动剂的给药频率为每周1次、每2周一次。