CN114015805A - 检测盖塔病毒的荧光rt-raa引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测盖塔病毒的荧光RT‑RAA引物、试剂盒及其应用。本发明所保护的基于荧光RT‑RAA的检测盖塔病毒的试剂盒包括检测盖塔病毒的组合物即序列表中序列2所示的引物RT‑RAA‑F2、序列表中序列3所示的引物RT‑RAA‑R2和序列表中序列4所示探针。实验证明，该试剂盒能够快速高效的检测GETV，在39℃恒温反应30min即可完成检测，灵敏度为8拷贝/反应的GETV SC201807病毒质粒转录本和20TCID50/反应的GETV SC201807病毒RNA，特异性好，准确性高，可以为猪盖塔病毒的临床样品的检测提供技术支撑。

Description

检测盖塔病毒的荧光RT-RAA引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测盖塔病毒的荧光RT-RAA引物、试剂盒及其应用。

背景技术

盖塔病毒(Getah virus,GETV)是披膜病毒科甲病毒属的人畜共患病病毒，正链RNA病毒。主要引起猪发生发烧、腹泻和繁殖障碍，导致马出现发热、皮疹和水肿等临床症状。在过去几年中，研究人员先后在野猪、蓝狐、牛等动物中分离到盖塔病毒，并且通过血清学调查发现，鸡和鸭血清内含有GETV特异性抗体，说明鸡和鸭也可能是盖塔病毒的感染宿主。

为了便于临床诊断和流行病学研究，需要建立一种快速有效的盖塔病毒检测方法。目前已经建立了多种方法用于GETV的临床检测，包括病毒分离、酶联免疫吸附试验、血清中和试验、RT-PCR和RT-qPCR等。病毒分离费时费力，血清学检测易与其他甲病毒属成员出现交叉反应，其他方法操作复杂并且需要昂贵的仪器。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速检测盖塔病毒或如何制备检测盖塔病毒的RT-RAA试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了基于荧光RT-RAA用于检测盖塔病毒的试剂盒。所述试剂盒可包括检测盖塔病毒的组合物。所述组合物可包括引物RT-RAA-F2、RT-RAA-R2和探针。所述引物RT-RAA-F2的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述引物RT-RAA-R2的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述探针的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

上文所述试剂盒可为基于荧光RT-RAA技术的试剂盒。

上文所述试剂盒中，所述探针可具有下述任一修饰或其组合：

A1)在序列表中序列4第31核苷酸上标记荧光基团；

A2)在序列表中序列4的第32位核苷酸标记淬灭基团；

A3)在序列表中序列4的第31位碱基和32位碱基中间用四氢呋喃修饰；

A4)在序列表中序列4的第46位核苷酸用C3-spacer标记。

上文所述荧光基团可为I6FAM。所述四氢呋喃修饰基团可为dSpacer(IDSP)。所述淬灭基团可为IBHQ1。

上文所述试剂盒中，所述组合物还可包括RT荧光基础反应单元。所述RT荧光基础反应单元可包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和/或DNA聚合酶。所述RT荧光基础反应单元可来源于荧光型RT-RAA核酸扩增试剂盒。所述RT荧光基础反应单元可为冻干粉。

上文所述试剂盒中，所述组合物还包括镁离子缓冲液。所述镁离子缓冲液可为醋酸镁(浓度280mmol/L)。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的检测盖塔病毒的组合物。

上文所述组合物的各组分可为液体和/或固体粉末。

上文所述组合物的各组分可为单独包装。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了用于检测盖塔病毒的系统。所述系统可含有上文所述的试剂盒和荧光检测仪器。

上文所述系统可为基于荧光RT-RAA技术的系统。所述荧光检测仪器可为荧光定量PCR仪。

上文所述的试剂盒和/或上文所述的组合物在盖塔病毒检测或辅助检测中的应用也属于本发明的保护范围。

上文所述应用中，所述检测或辅助检测的RT-RAA反应条件可为39℃恒温反应30min。

上文所述的组合物在制备盖塔病毒检测或辅助检测产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上文所述盖塔病毒可为猪盖塔病毒。

目前没有使用RAA检测GETV的报道。本发明首次建立了使用荧光RT-RAA(reversetranscription recombinase-aided amplification,反转录重组酶辅助扩增)检测GETV的试剂盒，与现有检测盖塔病毒的方法相比，该试剂盒能够快速高效的检测GETV，在39℃恒温反应30min即可完成检测，灵敏度为8拷贝/反应的GETV SC201807病毒质粒转录本和20TCID50/反应的GETV SC201807病毒RNA，特异性好，准确性高，可以为猪盖塔病毒的临床样品的检测提供技术支撑。

附图说明

图1为RT-PCR结果：M为DL2000 Marker，1-9为引物组合的RT-PCR结果(1-9依次为RT-RAA-F1/RT-RAA-R1，RT-RAA-F1/RT-RAA-R2，RT-RAA-F1/RT-RAA-R3，RT-RAA-F2/RT-RAA-R1，RT-RAA-F2/RT-RAA-R2，RT-RAA-F2/RT-RAA-R3，RT-RAA-F3/RT-RAA-R1，RT-RAA-F3/RT-RAA-R2，RT-RAA-F3/RT-RAA-R3)，10为阴性对照。

图2为引物筛选结果:①-⑨为引物组合(①为RT-RAA-F1/RT-RAA-R1，②为RT-RAA-F1/RT-RAA-R2，③为RT-RAA-F1/RT-RAA-R3，④为RT-RAA-F2/RT-RAA-R1，⑤为RT-RAA-F2/RT-RAA-R2，⑥为RT-RAA-F2/RT-RAA-R3，⑦为RT-RAA-F3/RT-RAA-R1，⑧为RT-RAA-F3/RT-RAA-R2，⑨为RT-RAA-F3/RT-RAA-R3)，⑩为试剂盒阳性对照。

图3为RT-RAA特异性试验结果。1-6依次为GETV、PRRSV、JEV、PEDV、TGEV、SVV病毒RNA。

图4为RT-RAA灵敏度试验结果:A图使用GETV病毒RNA为标准品，1-5依次为2×10⁴TCID50/反应、2×10³TCID50/反应、2×10²TCID50/反应、2×10¹TCID50/反应、2×10⁰TCID50/反应；B图使用GETV质粒转录本为标准品，1-7依次为8×10⁵拷贝/反应、8×10⁴拷贝/反应、8×10³拷贝/反应、8×10²拷贝/反应、8×10¹拷贝/反应、8×10⁰拷贝/反应、8×10^-1拷贝/反应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中盖塔病毒GETV SC201807毒株由四川农业大学分子生物技术中心分离鉴定(相关文献：江朝源,李飞,曾喻兵,彭珂楠,张儒博,杜佩珊,冯宇,殷鑫欢,朱玲,徐志文.四川省猪源盖塔病毒的分离鉴定及遗传进化分析[J].中国人兽共患病学报,2019,35(09):805-814.)。

118份临床样品采集自2020年9月-2021年5月四川地区发生腹泻或流产的猪肾脏、脾脏和肠道等组织。

PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)，由四川农业大学动物生物技术中心保存(相关文献：Zhao J,Zhu L,Huang J,Yang Z,Xu L,Gu S,Huang Y,Zhang R,Sun X,Zhou Y,XuZ.Genetic characterization of a novel recombined porcine reproductive andrespiratory syndrome virus 2among Nadc30-like,Jxa1-like and TJ-likestrains.Vet Med Sci.2021May；7(3):697-704.doi:10.1002/vms3.402.Epub 2020Dec5.PMID:33277984；PMCID:PMC8136965.)。

JEV(日本乙脑病毒)，由四川农业大学动物生物技术中心保存(相关文献：蔡雨函,周远成,朱玲,王赟,徐志文.3株猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及增值特性[J].中国兽医学报,2014,34(06):915-922.)。

PEDV(猪流行性腹泻病毒)，由四川农业大学动物生物技术中心保存(相关文献：付梦瑾,朱玲,吴云飞,等.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及增殖规律[J].中国兽医科学,2013,043(011):1133-1139.)。

SVV(塞内卡病毒)，由四川农业大学动物生物技术中心保存(相关文献：PengKenan et al.Isolation and phylogenomic analysis of two Senecavirus Aisolatesin Sichuan Province,2018.[J].Virus genes,2020.)。

TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)，由四川农业大学动物生物技术中心保存(相关文献：代洪波,陈蕾,朱玲,等.猪传染性胃肠炎病毒四川株的分离鉴定与一步生长曲线的测定[J].中国兽医科学,2012(12):18-23.)。

实施例一、荧光RT-RAA方法检测盖塔病毒的相关试剂和反应条件

1.引物和探针设计

从GenBank上下载不同地区的盖塔病毒的非结构基因NSP1基因序列(序列表中序列1所示，保守区域基因同源性在99.0％-100％)，使用DNAMan软件分析保守区域并设计一对RT-PCR引物(RT-PCR-F4/RT-PCR-R4)以及三对RT-RAA的引物(RT-RAA-F1/RT-RAA-R1、RT-RAA-F2/RT-RAA-R2和RT-RAA-F3/RT-RAA-R3)和探针(RT-RAA-P)(表1)。

表1：引物和探针序列

注：RT-RAA-P探针中，序列4的第31位核苷酸T上标记FAM荧光基团6-羧基荧光素(I6FAMDT)、第32位核苷酸T标记荧光淬灭基团BHQ1(IBHQ1DT)，第31位核苷酸T和32位核苷酸T中间用四氢呋喃(THF)dSpacer修饰(序列4中IDSP所示)第46位核苷酸(3’末端核苷酸)用C3-spacer修饰。

2.RNA提取

使用RNA提取试剂盒提取盖塔病毒GETV SC201807的RNA和118份临床样品的RNA，并放置于-80℃保存。

3.标准品制备

将盖塔病毒GETV SC201807的RNA进行反转录得到cDNA并使用RT-PCR引物对GETV病毒cDNA进行PCR扩增(引物对RT-PCR-F4/RT-PCR-R4见表1)，将扩增产物胶回收后与pEASY-Blunt Zero克隆载体进行连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞培养后提取质粒并测定浓度。质粒使用限制性内切酶(PstⅠ)酶切线性化后使用mMESSAGE mMACHINE^TMT7转录试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，AM1345)进行体外转录获得标准质粒转录本(浓度1.57×10¹⁰拷贝/μL)，纯化分装后于-80℃保存。

4.荧光重组酶辅助扩增技术(RT-RAA)体系和引物筛选

4.1RT-RAA反应体系

荧光RT-RAA使用荧光型RT-RAA核酸扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司，F00001)，包括含有RT荧光基础反应单元冻干粉(包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和DNA聚合酶)的反应管以及含有镁离子缓冲液(醋酸镁，浓度280mmol/L)的启动剂。RT-RAA反应体系总体积为50μL，各试剂成分见表2。体系配制后分装到反应管，反应管中的冻干粉随之被溶解，然后将反应管中的溶液全部转移到荧光定量八连管中，立即将荧光定量八连管转移到预热为39℃的荧光定量PCR仪中，将变性温度、退火温度、延伸温度都设定为39℃，每个循环为1min，设定30个循环，即39℃恒温反应30min。以无核酸酶水做阴性对照。

4.2RT-RAA引物筛选

将RT-RAA的三条正向引物(RT-RAA-F1/RT-RAA-F2/RT-RAA-F3)和三条反向引物(RT-RAA-R1/RT-RAA-R2/RT-RAA-R3)组合为9对引物，1-9依次为RT-RAA-F1/RT-RAA-R1，RT-RAA-F1/RT-RAA-R2，RT-RAA-F1/RT-RAA-R3，RT-RAA-F2/RT-RAA-R1，RT-RAA-F2/RT-RAA-R2，RT-RAA-F2/RT-RAA-R3，RT-RAA-F3/RT-RAA-R1，RT-RAA-F3/RT-RAA-R2，RT-RAA-F3/RT-RAA-R3。

使用9对RT-RAA组合引物进行普通RT-PCR检测，模板为步骤4得到的标准质粒转录本，将扩增条带进行胶回收后与pEASY-Blunt Zero克隆载体连接，将连接产物送生工进行测序，比对测序结果是否是GETV的序列(序列表中序列1所示的NSP1基因的部分序列)。测序结果显示，9对引物的扩增连接产物均含有GETV序列。

使用组合的9对RT-RAA引物对GETV病毒RNA进行RT-RAA检测，模板为步骤4得到的标准质粒转录本，通过荧光值和起峰时间对引物进行筛选。具体反应体系和反应条件见步骤4.1。RT-RAA反应结果显示，RT-RAA-F2和RT-RAA-R2组成的引物对的反应体系中荧光值最大，起峰早(图2中④所示)。以RT-RAA-F2(序列表中序列2)和RT-RAA-R2(序列表中序列3)组合的引物对为RT-RAA反应的引物进行后续试验。

表2：RT-RAA反应体系

实施例二、荧光RT-RAA法检测盖塔病毒的灵敏度和特异性试验

1.灵敏度实验

GETV SC201807毒株病毒液，组织细胞培养半数感染量(TCID50)为10^6.85/0.1mL，使用DMEM(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，12100061)溶液梯度稀释病毒液为10⁶-10²TCID₅₀/0.1mL，具体为：2×10²TCID₅₀/0.1mL、2×10³TCID₅₀/0.1mL、2×10⁴TCID₅₀/0.1mL、2×10⁵TCID₅₀/0.1mL、2×10⁶TCID₅₀/0.1mL和2×10⁰TCID₅₀/0.1mL。

GETV SC201807毒株病毒液的配制方法如下：用1mL DMEM溶液溶解GETV SC201807冻干粉，取200μL加入到BHK21细胞(中国兽医微生物菌种保藏管理中心)单层长满80％的细胞中，37℃孵育1h后弃去液体，加入5mL含2％新生犊牛血清的DMEM溶液，37℃5％CO₂培养箱培养48h后于-80℃进行冻融3次，1000rpm/min离心10min后取上清液，即得到GETV病毒液。

使用含2％新生犊牛血清(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，16010142)的DMEM溶液对GETV病毒液进行十倍梯度稀释，具体为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11，按照100μL/孔将稀释好的病毒液加到BHK21单层长满的96孔细胞板中，每个浓度设置8个重复。于37摄氏度、5％CO₂培养箱培养60h后记录细胞病变孔数，并使用Reed-Muenah法计算得到GETV SC201807株TCID₅₀为10^6.85/0.1mL。

同时使用DMEM溶液梯度稀释实施例一步骤3制备的标准质粒转录本为8×10^-1-8×10⁵拷贝/反应，具体为8×10^-1拷贝/反应、8×100拷贝/反应、8×10¹拷贝/反应、8×10²拷贝/反应、8×10³拷贝/反应、8×10⁴拷贝/反应和8×10⁵拷贝/反应。

使用实施例一中的荧光RT-RAA法检测不同浓度梯度的GETV SC201807毒株病毒液和标准质粒转录本，来评估该方法检测盖塔病毒的灵敏度，各稀释度测定8次以评估该方法的重复性(表3)。结果显示，该方法的最低检测极限为8拷贝/反应的质粒转录本和20TCID50/反应的GETV SC201807病毒RNA。模板浓度越高，荧光值越大，起峰时间越早(图4)。

2.特异性试验使用PRRSV、JEV、PEDV、SVV、TGEV病毒对该方法对盖塔病毒检测的特异性进行检验。5种病毒的病毒液的浓度均为10⁵TCID₅₀/0.1mL，GETV(GETV SC201807)病毒液的浓度也为10⁵TCID₅₀/0.1mL。

结果显示只有GETV产生荧光信号，其他病毒和和阴性对照无核酸酶水均未发出荧光信号(图3)。

表3.重复性试验结果

实施例三、使用RT-RAA法检测盖塔病毒临床样品的准确性

对实施例一中步骤2提取的采集118份临床样品的RNA进行反转录得到cDNA，然后对cDNA进行实施例一中建立的荧光RT-RAA方法的检测，并与实时RT-qPCR盖塔病毒检测方法(GETV SYBR GreenⅠRT-qPCR)进行平行对比。SYBR GreenⅠRT-qPCR体系和反映程序见表4。

RT-qPCR引物序列如下：

RT-qPCR-F：5'-CTTGACGGTAAGGTCACGGG-3'

RT-qPCR-R：5'-GTAAGCTTCGCTAGGTCGGG-3'

表4.RT-qPCR反映体系和反应程序

结果显示，在118份临床样品中，RT-RAA方法检测出13份阳性样品，实时RT-qPCR方法检测出13份阳性样品。两种检测方法的符合率为100％(表5)，使用RT-RAA法检测盖塔病毒的准确性高。

表5.RT-RAA与RT-qPCR用于临床样品GETV检测的对比

综上，本发明建立了一种快速高效的荧光RT-RAA检测GETV的相关的试剂和试剂盒，该试剂盒只需30min就可以准确检测出待测样本中是否含有盖塔病毒，且具有很高的灵敏性和特异性，最低检测极限为8拷贝/反应的质粒转录本和20TCID50/反应的GETVSC201807病毒RNA，可以应用于临床中盖塔病毒快速高效检测。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 四川农业大学，畜科生物工程有限公司

<120> 检测盖塔病毒的荧光RT-RAA引物、试剂盒及其应用

<130> GNCSQ212059

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 盖塔病毒（getah virus）

<400> 1

ccgaatgacc atgctaacgc tagagcattt tcgcatctgg ctactaaact gattgagcaa 60

gaggttccaa caggcgtcac catcctggac gtgggtagtg cacccgcaag gaggttgatg 120

tctgaccaca cctaccactg catctgcccc atgaaaagcg cggaagaccc agagaggctg 180

gcgaattacg ctcgaaagct ggcgaaagca tcggggactg tgctagacaa gaatgtgtcc 240

ggaaagataa cggacctaca agacgtcatg gccactccag acttggaatc cccgactttt 300

tgcctgcata ctgacgagac gtgccgcact agggctgagg tcgccgtgta ccaggacgta 360

tacgctgtgc acgcaccgac gtcactgtac caccaggcca tcaaaggtgt caggacggcg 420

tattggattg ga

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

tgatgtctga ccacacctac cactgcatct g 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

cacgtctcgt cagtatgcag gcaaaaagtc g 31

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

cttgtaggtc cgttatcttt ccggacacat tttgtctagc acagtc 46

Claims (10)

1.基于荧光RT-RAA用于检测盖塔病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测盖塔病毒的组合物；所述组合物包括引物RT-RAA-F2、RT-RAA-R2和探针；所述引物RT-RAA-F2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述引物RT-RAA-R2的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述探针的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针具有下述任一修饰或其组合：

A1)在序列表中序列4第31核苷酸上标记荧光基团；

A2)在序列表中序列4的第32位核苷酸标记淬灭基团；

A3)在序列表中序列4的第31位碱基和32位碱基中间用四氢呋喃修饰；

A4)在序列表中序列4的第46位核苷酸用C3-spacer标记。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括RT荧光基础反应单元；所述RT荧光基础反应单元包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和/或DNA聚合酶。

4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括镁离子缓冲液。

5.权利要求1-4中任一权利要求所述的检测盖塔病毒的组合物。

6.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和/或权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述组合物的各组分为液体和/或固体粉末。

7.用于检测盖塔病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和荧光检测仪器。

8.权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和/或权利要求5所述的组合物在盖塔病毒检测或辅助检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述检测或辅助检测的RT-RAA反应条件为39℃恒温反应30min。

10.权利要求5所述的组合物在制备盖塔病毒检测或辅助检测产品中的应用。

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