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CN114002199B - 碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途 - Google Patents

碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途 Download PDF

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CN114002199B
CN114002199B CN202111275141.0A CN202111275141A CN114002199B CN 114002199 B CN114002199 B CN 114002199B CN 202111275141 A CN202111275141 A CN 202111275141A CN 114002199 B CN114002199 B CN 114002199B
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Abstract

本发明涉及糖酵解检测领域，特别是涉及碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途，所述碳氮荧光量子点为N掺杂石墨烯量子点、C3N4量子点、C2N量子点或C3N量子点中的一种或几种；所述有氧糖酵解检测产品为试剂，以试剂的终体积为基准，所述试剂中包括终浓度为1μg/mL～1mg/mL的碳氮荧光量子点。本发明利用碳氮荧光量子点可实现活细胞中NAD+的荧光标记，进而实现有氧糖酵解的细胞的荧光标记与成像，具有低成本、高效、快速、准确性高等优势。同时该技术有助于实现脱落肿瘤细胞的荧光识别、肿瘤极早期预警、肿瘤转移灶检测、肿瘤增殖与恶性程度评估等系列技术的开发。

Description

碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途
技术领域
本发明涉及糖酵解检测领域，特别是涉及碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途。
背景技术
有氧糖酵解过程是正常细胞和肿瘤细胞的重要代谢差异，因此，在细胞水平实现有氧糖酵解的荧光甄别及成像是实现肿瘤细胞识别、肿瘤风险性评估的潜在重要手段。实现有氧糖酵解的检测主要依赖于NAD+或NADH的检测。随着技术发展，针对糖酵解过程特定靶向代谢物检测这个方向，传统的技术手段有酶循环测定、色谱、质谱和核磁共振波谱，这些检测的局限性为反映的是一个细胞群体的平均代谢状态，无法反映单细胞代谢状态；需要细胞裂解液，无法做到活细胞检测，更无法做到in vivo检测；目前比较前沿的检测技术为“基因编码代谢物传感器Genetically encoded metabolite sensors”，它的原理为荧光蛋白通过与代谢物如NADH、ATP、glucose等结合后改变结构，改变了荧光强度，从而进行标记(参考文献：SoNar,a Highly Responsive NAD+/NADH Sensor,Allows High-ThroughputMetabolic Screening of Anti-tumor Agents)。基因编码代谢物传感器可灵敏的反映细胞内NAD+和NADH的动态变化，但同样具有局限性，例如荧光强度弱、特异性低(全细胞NAD+检测)及极易受pH影响(肿瘤酸性微环境)。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途。
本发明还提供一种检测有氧糖酵解的方法，所述方法包括以下步骤：将包括碳氮荧光量子点的有氧糖酵解检测产品与待测样本共孵育，孵育结束后检测待测样本是否有荧光产生或其荧光强度。
如上所述，本发明的碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途，具有以下有益效果：本发明利用碳氮荧光量子点可实现活细胞中NAD+的荧光标记，进而实现有氧糖酵解的细胞的荧光标记与成像，具有低成本、高效、快速、准确性高等优势。同时该技术有助于实现脱落肿瘤细胞的荧光识别、肿瘤极早期预警、肿瘤转移灶检测、肿瘤增殖与恶性程度评估等系列技术的开发。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1显示为本发明提供的有氧糖酵解检测产品检测常见细胞代谢产物。
图2显示为本发明提供的有氧糖酵解产品主要成分碳氮量子点与代谢产物NAD+的荧光激发波长和荧光发射波长。
图3显示为本发明提供的有氧糖酵解产品检测代谢产物NAD+的荧光定量曲线。
图4显示为本发明提供的有氧糖酵解检测产品检测A375细胞和成纤维细胞的有氧糖酵解。
图5显示为本发明提供的有氧糖酵解检查产品检测PFK15处理的A375细胞和未处理的A375细胞的荧光对照图。
图6显示为本发明提供的有氧糖酵解产品检测动物体内肿瘤的荧光图。
图7显示为本发明提供的有氧糖酵解检测产品检测尿液样本中肿瘤细胞的荧光对照图。
具体实施方式
本发明提供碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途。
所述碳氮荧光量子点(或称为氮掺杂石墨烯量子点，N-CDs)选自C3N4量子点、C2N量子点或C3N量子点中的一种或几种。
所述N-CDs具有均一的尺寸，晶格氮掺杂结构显著提高了N-CDs荧光量子效率，使其在540nm处具有强而稳定的光致发光特性。在生物成像方面，与传统荧光造影剂相比，N-CDs表现出荧光信号强、检测灵敏度高、稳定性好、生物相容性好、可进行长时间动态观测和活体成像等明显优势。
优选的，所述碳氮荧光量子点选自C3N量子点。C3N量子点是一种单层二维半导体量子材料，是一种由碳和氮原子构成的类似石墨烯的蜂窝状无孔有序结构，是一种新型间接带隙半导体。
在一种实施方式中，C3N量子点的本征带隙为0.39eV，带隙可以通过纳米尺寸效应进行调控。基于单层C3N薄膜的FET器件开关比可以高达5.5×1010，载流子迁移率可达220cm2V-1s-1。通过调控C3N量子点的尺寸，可以实现约400-900nm的光致发光。C3N量子点可以通过氢化实现电子注入，并在96K温度以下产生铁磁长程序。带隙的存在弥补了石墨烯没有本征带隙的缺憾，氢化载流子注入为调控该材料的电学特性提供了新的手段，铁磁性预示该材料体系具有丰富的物理内涵。
所述碳氮荧光量子点中N含量为0.5-5at％。所述碳氮荧光量子点中N含量可以是以下任一范围：0.5-1.5at％、1.5-2.5at％、2.5-3.5at％、3.5-4.5at％、4.5-5at％。
所述碳氮荧光量子点的直径为1～100nm。所述碳氮荧光量子点的直径可以选自以下任一范围：1～10nm、10～20nm、20～30nm、30～40nm、40～50nm、50～60nm、60～70nm、70～80nm、80～90nm或90～100nm。
在一种实施方式中，碳氮荧光量子点的量子产率为0.1-0.9。
在一种实施方式中，所述碳氮荧光量子点的激发波长为240-650nm，和/或，发射波长范围为350-950nm。
在一种实施方式中，不需要对碳氮荧光量子点表面进行修饰。
在一种实施方式中，所述用途为在制备活细胞内有氧糖酵解检测产品中的用途。
在一种实施方式中，所述用途为在制备单细胞内有氧糖酵解检测产品中的用途。
进一步的，所述活细胞或单细胞为有氧糖酵解代谢模式的活细胞或单细胞。
更进一步的，所述有氧糖酵解代谢模式的活细胞或单细胞为肿瘤活细胞或肿瘤单细胞。
所述碳氮荧光量子点可与细胞有氧糖酵解代谢中间产物氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)通过荧光共振能量转移实现荧光增强。
所述有氧糖酵解检测产品通过检测NAD+来检测有氧糖酵解。即所述用途为在制备活细胞内的NAD+检测产品中的用途。
更进一步的，所述活细胞或单细胞为能够产生NAD+的肿瘤活细胞或肿瘤单细胞。
所述有氧糖酵解检测产品为试剂，以试剂的终体积为基准，所述试剂中包括终浓度为1μg/mL～1mg/mL的碳氮荧光量子点。
所述试剂中还包括缓冲液，即所述缓冲液作为碳氮荧光量子点的溶剂，所述缓冲液选自生理盐水、水、DMSO、DMF或PBS中的一种或几种。PBS的pH为7.2-7.4。
本发明还提供碳氮荧光量子点在制备NAD+检测产品中的用途。
本发明还提供一种有氧糖酵解检测产品，所述有氧糖酵解检测产品包括所述碳氮荧光量子点。
所述碳氮荧光量子点选自N掺杂石墨烯量子点、C3N4量子点、C2N量子点或C3N量子点中的一种或几种。
所述有氧糖酵解检测产品中还包括缓冲液。所述缓冲液可以作为碳氮荧光量子点的溶剂所述缓冲液选自生理盐水、水、DMSO、DMF或PBS中的一种或几种。
本发明还提供碳氮荧光量子点在制备肿瘤检测或治疗产品中的用途。
所述肿瘤检测产品用于肿瘤早期诊断。具体的，所述肿瘤检测产品用于肿瘤细胞甄别、肿瘤微小病灶检测、临床样本肿瘤细胞筛查或肿瘤可视化研究。
所述肿瘤治疗产品用于肿瘤早期干预。
所述肿瘤细胞检测产品中至少包含碳氮荧光量子点。
本发明提供一种检测有氧糖酵解的方法，所述方法包括以下步骤：将包括碳氮荧光量子点的有氧糖酵解检测产品与待测样本共孵育，孵育结束后检测待测样本是否有荧光产生或其荧光强度。
在一种实施方式中，所述方法还包括以下步骤：孵育结束后离心、弃上清液，用缓冲液重悬沉淀物，重悬后再检测是否有荧光产生或荧光强度。
还包括以下特征中的一种或几种：
1)所述待测样本为包含有氧糖酵解代谢特征的活细胞的样本；优选的，所述待测样本选自细胞、肿瘤组织或非肿瘤组织、胸腹水、血液或尿液；更优选的，所述待测样本为经过前处理后的样本；
2)所述有氧糖酵解检测产品的使用体积为1μL～1mL；
3)孵育时间为5min～2h；
4)孵育温度为4～50℃；优选的，孵育温度为20～40℃；
5)检测荧光强度时，荧光检测激发波长为200～800nm；
6)离心转速为500～1500转/分钟，所述离心的时间为1-30分钟。
在一种实施方式中，待测样本的前处理步骤可以如下：
步骤一：将收集的待测组织剪碎成1mm3体积进行培养，或将收集的细胞、胸腹水、血液或尿液进行离心、弃上清液；
步骤二：加入缓冲液，重悬所述步骤一中得到的组织碎片或沉淀物，得到的重悬液即可用于与有氧糖酵解检测产品混合、孵育；
在一种实施方式中，待测样本前处理时步骤二所用的缓冲液与有氧糖酵解检测产品中的缓冲液相同。
在一种实施方式中，检测是否有荧光产生可以使用荧光显微镜。有氧糖酵解的细胞可发出荧光。
检测荧光强度可以使用荧光分光光度计。可以根据得到的荧光强度对样本进行半定量分析。
在一种实施方式中，荧光显微镜的激发波长为200～800nm。
一般的，所述检测有氧糖酵解的方法包括诊断目的和非诊断目的。优选的，所述检测有氧糖酵解的方法为非诊断目的。所述非诊断目的是指在科学研究中检测有氧糖酵解以实现研究有氧糖酵解的机制、疾病的发生发展机制、细胞的代谢机制等。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
以下实施例中所用的C3N量子点的制备方法如下：80mL 2,3-二氨基吩嗪溶液(2.0mM)加入到100mL高压釜中，加热并保持380℃高温下加热16h后，可得到C3N量子点产物，随后将产物经过0.02μm纳米孔径的氧化铝膜过滤，所得滤液静置12小时，即可得到直接用于生物实验的C3N量子点。前述使用的2，3-二氨基吩嗪(DAP，98％)购买自美国J&K化工技术有限公司。
实施例1
选取多种细胞代谢中间产物的溶液(溶剂均为0.9％的生理盐水)分别作为待测样本，多种细胞代谢中间产物分别为glucose，PKM1，PKM2，Pyr，LDH，Lactate，NADH，NAD+，ADP，O2-，·OH等(浓度均为0.1mM)。选取C3N量子点(直径1nm，浓度1μg/mL，溶剂为生理盐水)作为有氧糖酵解检测产品。在待测样本中加入C3N量子点1μL，样本孵育2h，孵育温度25℃，设置荧光分光光度计激发波长为400nm，发射波长为530nm，读取荧光强度。结果如图1所示，其中，NAD+样品荧光强度增强约7倍，其余样品荧光强度无明显变化。
随后，选取NAD+溶液(浓度为0.1mM)和C3N量子点溶液(1μg/mL)作为待测样本，分别检测两种溶液的荧光发光激发光谱和荧光发射光谱。如图2所示，NAD+溶液的激光波长和发射波长分别为423nm和476nm，C3N量子点溶液的激发波长和发射波长分别为495nm和530nm。因此可知在荧光共振能量转移过程中，NAD+为能量供体，C3N量子点为能量受体。
以上结果表明，C3N量子点可与细胞有氧糖酵解代谢中间产物NAD+通过荧光共振能量转移实现荧光增强。
实施例2
选取NAD+溶液作为待测样本，浓度分别为0(生理盐水)，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25mM，选取C3N量子点(直径1nm，浓度1μg/mL，溶剂为生理盐水)作为有氧糖酵解检测产品。在待测样本中加入C3N量子点1μL，样本孵育2h，孵育温度25℃，荧光分光光度计读取荧光强度。结果如图3所示，可见在一定范围内，C3N量子点荧光强度随着NAD+浓度升高而增强。
实施例3
选取A375细胞(有氧糖酵解代谢模式)和成纤维细胞(氧化磷酸化代谢模式)作为待测样本，两种细胞进行共培养，细胞浓度均为103个。选取C3N量子点(直径1nm，浓度1μg/mL，溶剂为生理盐水)作为有氧糖酵解检测产品，待测样本中加入C3N量子点1μL，样本孵育2h，孵育温度25℃，荧光显微镜(激发波长400nm)下观察样本荧光情况。结果如图4所示，视野中A375细胞荧光明显，成纤维细胞未见明显荧光。虚线圆圈标记的为A375细胞，实线圆圈标记的为成纤维细胞。
实施例4
选取A375细胞作为待测样本，细胞浓度均为105个，在待测细胞样本中加入1-(4-pyridinyl)-3-(2-quinolinyl)-2-propen-1-one(PFK15，20nM)，孵育12h。选取C3N量子点(直径1nm，浓度1μg/mL，溶剂为生理盐水)作为有氧糖酵解检测产品。向待测样本中加入C3N量子点1μL，孵育12h，孵育温度25℃。荧光显微镜(激发波长400nm)下观察荧光情况，经PFK15处理后(PFK15可以阻断细胞有氧糖酵解代谢水平，降低胞质NAD+浓度)的A375细胞荧光相比于未经PFK15处理组下降43％(结果如图5所示)。
实施例5
选用BALB/c裸鼠(4周，雌性)用3％戊巴比妥麻醉。将A375细胞置于浓度为2×108mL-1的悬液中。将肿瘤细胞注射到小鼠的玻璃体下腔，构建眼内原位肿瘤动物模型。注射肿瘤细胞后1周，将配置的C3N量子点溶液注射入玻璃体下腔，孵育12小时，进行小动物活体成像拍照，随后处死老鼠，取眼组织制成切片，进行HE染色和荧光拍照，如图6所示，在HE染色、荧光照片和小动物活体成像中，均可见肿瘤细胞生长的过程。结果提示，碳氮荧光量子点在动物体内，可准确地将有氧糖酵解代谢模式的肿瘤细胞的生长过程进行荧光动态标记与监测。
实施例6
选取膀胱癌患者尿液和健康人尿液作为待测样本。选取C3N量子点(直径1nm，浓度1μg/mL，溶剂为生理盐水)作为有氧糖酵解检测产品。向待测样本中加入C3N量子点1μL，样本孵育2h，孵育温度25℃。荧光显微镜(激发波长400nm)下观察样本荧光情况。结果如图7所示，视野中肿瘤患者尿液细胞荧光明显，健康人尿液未见明显荧光。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (12)

1.碳氮荧光量子点在制备有氧糖酵解检测产品中的用途，所述碳氮荧光量子点为C3N4量子点、C2N量子点或C3N量子点中的一种或几种，所述碳氮荧光量子点中N含量为0.5-5 at%，所述有氧糖酵解检测产品通过检测NAD+来检测有氧糖酵解。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述碳氮荧光量子点的直径为1~100 nm。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为在制备活细胞内有氧糖酵解检测产品中的用途。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为在制备有氧糖酵解定性或半定量检测产品中的用途。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述有氧糖酵解检测产品为试剂，以试剂的终体积为基准，所述试剂中包括终浓度为1 μg/mL~1 mg/mL的碳氮荧光量子点。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂中还包括缓冲液，所述缓冲液选自生理盐水、水、DMSO、DMF或PBS中的一种或几种。
7.碳氮荧光量子点在制备NAD+检测产品中的用途, 所述碳氮荧光量子点为C3N4量子点、C2N量子点或C3N量子点中的一种或几种，所述碳氮荧光量子点中N含量为0.5-5 at %。
8.一种非诊断目的的检测有氧糖酵解的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将包括碳氮荧光量子点的有氧糖酵解检测产品与待测样本共孵育，孵育结束后检测是否有荧光产生或其荧光强度, 所述碳氮荧光量子点为C3N4量子点、C2N量子点或C3N量子点中的一种或几种，所述碳氮荧光量子点中N含量为0.5-5 at %，所述有氧糖酵解检测产品通过检测NAD+来检测有氧糖酵解。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：孵育结束后离心、弃上清液，用缓冲液重悬沉淀物，重悬后再检测是否有荧光产生或荧光强度。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括以下特征中的一种或几种：
1）所述待测样本为包含有氧糖酵解代谢特征的活细胞的样本；
2）所述有氧糖酵解检测产品的使用体积为1μL~1 mL；
3）孵育时间为5 min~2 h；
4）孵育温度为4~50 ℃；
5）检测荧光强度时，荧光检测激发波长为200~800 nm。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本选自细胞、肿瘤组织或非肿瘤组织、胸腹水、血液或尿液。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本为经过前处理后的样本。
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