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CN114008211A - 由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法 - Google Patents

由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法 Download PDF

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CN114008211A CN202080042291.4A CN202080042291A CN114008211A CN 114008211 A CN114008211 A CN 114008211A CN 202080042291 A CN202080042291 A CN 202080042291A CN 114008211 A CN114008211 A CN 114008211A
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Abstract

本发明涉及由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法。更具体地，本发明证明了由聚对苯二甲酸乙二醇酯的化学水解得到的单体对苯二甲酸可以转化为高附加值的芳香族化合物和芳香族衍生化合物，并且聚对苯二甲酸乙二醇酯的另一种单体乙二醇可以转化为乙醇酸，乙醇酸是一种化妆品材料。本发明的特征是将聚对苯二甲酸乙二醇酯废料回收为高附加值的化合物。

Description

由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法
技术领域
本发明涉及由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法。
背景技术
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)的聚酯。PET因其优异的物理性能而在合成纤维和包装材料中得到了广泛的应用。2015年，全球PET年产量达到3300万吨，使PET成为世界上最常生产的聚酯。由于PET不能完全自然分解，因此其会导致严重的环境问题，例如微塑料在陆地生态系统中普遍存在以及废弃的塑料在海洋中积累。然而，目前尚无具有与PET相似的物理性能和经济效率的可生物降解塑料。在不久的将来减少PET产量的可能性不大，因而需要更严格的PET回收，以减少排放在自然界中的废弃的PET。
在各种塑料中，只有PET和聚乙烯(PE)是可物理回收的，并且回收的塑料是由这些废弃的塑料产生的。PET机械回收已经进行了几十年，但是在美国，这种传统回收的比率低于约21％。这种低比率似乎主要是由于与原始PET(1.1至1.3美元/千克PET)相比，回收的PET的质量较低且成本较高(例如，1.3至1.5美元/千克PET)。为了改善作为降级回收的机械回收的高成本和低经济可行性，例如，已经研究了将机械回收的PET与木质素混合以产生碳纤维，作为机械回收的PET的替代性应用。
为了克服通过机械回收对PET进行降级回收的问题，开发了化学回收，其中PET解聚为单体，然后单体重新聚合为PET。然而，通过PET解聚和化学回收来产生PET也没有经济优势。因此，有必要通过将单体转化为比PET更高价值的产品而凭借升级回收来提高PET回收的经济效益。
最近，已经开发出一种通过对PET进行化学改性并用玻璃纤维进行增强，将废弃的PET化学升级回收为高附加值塑料的方法。在这种情况下，PET将生物转化为塑料单体，例如聚羟基链烷酸酯(PHA)。然而，生物转化为PHA的经济可持续性仍然值得怀疑。
因此，本发明首次验证了PET单体的生物价值化，以提高废弃PET的回收的经济效益，制定有效的PET升级回收策略。对于PET的生物价值化，将PET通过化学水解而解聚，TPA和EG单体使用各种代谢工程化全细胞微生物催化剂而转化为各种高附加值化合物。特别地，通过将TPA降解途径引入微生物中，TPA被转化为高附加值的芳香族化合物或芳香族衍生化合物，即原儿茶酸(PCA)、没食子酸(GA)、连苯三酚、儿茶酚、粘康酸(MA)和香草酸(VA)，用于制造药物、化妆品、消毒剂、动物饲料、生物塑料单体等。具体地，通过鉴定能够催化转化TPA所需的反应的关键酶和能够将EG发酵成乙醇酸(GLA)的微生物，并研究它们作为PET价值化的关键组分的潜力，完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供由废弃的PET产生高附加值化合物的方法。
技术方案
本发明一方面提供由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法，所述方法包括：
通过聚对苯二甲酸乙二醇酯的水解来产生对苯二甲酸和乙二醇；和
在生物催化剂存在下，通过对苯二甲酸的生物转化产生选自由没食子酸、连苯三酚、儿茶酚、粘康酸和香草酸组成的组中的一种或多种化合物，其中原儿茶酸是通过生物转化产生的中间体，或
通过乙二醇的发酵来产生乙醇酸。
有益效果
根据本发明，通过利用作为PET水解产物的TPA的羟基化、脱羧、氧化环裂解和甲基化反应中的一种或组合，并使用PCA作为中间体，可以将PET转化为多种高附加值的化合物，如GA、连苯三酚、儿茶酚、MA和VA。
此外，利用能够发酵另一种PET单体EG的微生物，将EG转化为GLA，由此提供了回收废弃的PET的可能性。
附图说明
图1A至1G示出了由PET的化学水解引起PET解聚为TPA和EG，以及PET水解产物中的TPA和EG分别生物转化为PCA和GLA：图1A示出了通过PET的化学水解产生EG和TPA以及从PET水解产物中分离EG和TPA；图1B示出了大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)菌株PCA-1将TPA生物转化为PCA；图1C示出了通过菌株PCA-1由PET水解产物中的TPA产生PCA；图1D是菌株PCA-1产生的PCA的气相色谱-质谱(GC/MS)谱图；图1E示出了通过氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans；G.oxydans)KCCM 40109由PET水解产物中的EG产生GLA；图1F示出了EG全细胞转化为GLA的时间进程，其中数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示；和图1G是氧化葡糖杆菌KCCM 40109产生的GLA的GC/MS谱图。
图2A至2E示出了来自PET的EG和TPA的产生、分离和鉴定：图2A示出了通过PET的化学水解的EG和TPA产生途径以及利用NaOH和HCl从PET水解产物中分离TPA和EG；图2B和2C是来自PET水解产物的TPA的1H NMR和13C NMR谱图，其中试剂级TPA用作参照物；和图2D和2E是来自PET水解产物的EG的1H NMR和13C NMR谱图，其中试剂级EG用作参照物。
图3示出了用于PET升级回收的废弃PET生物精炼厂的总体方案。
图4A至4F是PCA(图4A)、GA(图4B)、连苯三酚(图4C)、MA(图4D)、VA(图4E)和GLA(图4F)的可靠标准品的GC/MS谱图。
图5A到5C示出了TPA向GA的生物转化：图5A示出了用于将TPA转化为GA的生物合成途径和全细胞催化剂；图5B示出系统GA-1、GA-2a和GA-2b中TPA的最高GA收率的比较，其中数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示；和图5C是通过GA-2b系统从TPA产生的GA的GC/MS谱图。
图6A至6D示出了使用全细胞催化剂将TPA生物转化为GA：图6A示出了表达PobA的大肠杆菌菌株HBH-1和表达PobAMut的大肠杆菌菌株HBH-2菌株在锥形管内含有3.4mM PCA的TG-2缓冲液中使PCA全细胞转化为GA的比较；图6B示出了在锥形管内含有2.8mM TPA的TG-2缓冲液中，通过由表达TphAabc、TphB和PobAMut的大肠杆菌菌株GA-1(OD600＝30)组成的GA-1系统将TPA转化为GA；图6C示出了在挡板烧瓶内含有3.1mM TPA的TG-2缓冲液中，通过由表达TphAabc和TphB的大肠杆菌菌株PCA-1(OD600＝20)和表达PobAMut的菌株HBH-2(OD600＝20)组成的GA-2a系统将TPA转化为GA；和图6D示出了在含有2.9mM TPA的TG-2缓冲液中，通过GA-2b系统的菌株PCA-1和HBH-2的细胞密度分别调整为OD600＝10和30的改进型GA-2b系统将TPA转化为GA，其中所有转化均在30℃和250rpm进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图7A和7B示出了PCA与PobA活性位点结合的对接模拟：野生型PobA(图7A)和Y385F/T294A双突变体PobAMut(图7B)，其中对接模拟采用结合黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的PobA结构(PDB代码6DLL)，采用MODELLER软件构建PobAMut结构，采用AutoDockFR软件进行分子对接模拟。
图8A至8D示出了TPA向连苯三酚的生物转化：图8A示出了用于通过系统PG-1a和PG-1b将TPA转化为连苯三酚的生物合成途径和全细胞催化剂；图8B示出了用于通过PG-2a和PG-2b将TPA转化为连苯三酚的生物合成途径和全细胞催化剂；图8C示出了来自菌株PG-1a和PG-1b与系统CTL-1、PG-2a和PG-2b的TPA的最高连苯三酚收率的比较，其中数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示；图8D是通过菌株PG-1a由TPA产生的连苯三酚的GC/MS谱图。
图9A至9E示出了使用微生物催化剂将TPA生物转化为连苯三酚：图9A示出了由表达TphAabc、TphB、PobAMut和LpdC的大肠杆菌菌株PG-1a(OD600＝30)组成的PG-1a系统将TPA转化为连苯三酚；图9B示出了由表达TphAabc、TphB、PobAMut、LpdC和PhKLMNOPQ的大肠杆菌菌株PG-1b(OD600＝30)组成的PG-1b系统将TPA转化为连苯三酚；图9C示出在锥形管中在30℃和250rpm通过表达TphAabc、TphB和AroY的大肠杆菌菌株CTL-1(OD600＝30)将TPA转化为儿茶酚；图9D示出了由表达TphAabc和TphB的大肠杆菌菌株PCA-1(OD600＝10)和表达AroY和PhKLMNOPQ的大肠杆菌菌株PDC-CH-1(OD600＝30)组成的PG-2a系统将TPA转化为连苯三酚；和图9E示出了通过包括表达TphAabc、TphB和AroY的菌株CTL-1(OD600＝10)和表达PhKLMNOPQ的大肠杆菌菌株CH-1(OD600＝30)的PG-2b系统将TPA转化为连苯三酚，其中对于系统CTL-1、PG-1a和PG-1b在含3.0mM TPA的TG-2缓冲液中，对于菌株PG-1和PG-2在3.5mMTPA中，于30℃、250rpm在挡板烧瓶中进行转化，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图10A和10B示出了GA脱羧酶LpdC对于GA的混杂性：图10A示出了通过表达LpdC的大肠杆菌菌株GDC-1将PCA转化为儿茶酚；和图10B示出了通过表达LpdC的菌株GDC-1将GA转化为儿茶酚，其中在30℃和250rpm下于挡板烧瓶内包含3.0mM PCA或3.0mM GA的TG-2缓冲液中进行转化，并且数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图11A至11C示出了用于合成连苯三酚和儿茶酚的酶：图11A示出了在大肠杆菌菌株CH-1中表达的儿茶酚羟化酶PhKLMNOPQ和由儿茶酚产生连苯三酚；图11B示出了在大肠杆菌菌株PDC-1中表达的PCA脱羧酶AroY和由PCA产生儿茶酚；和图11C示出了在大肠杆菌菌株PDC-CH-1中共表达的PCA脱羧酶AroY和儿茶酚羟化酶PhKLMNOPQ以及由PCA产生连苯三酚，其中所有转化于挡板烧瓶内TG-2缓冲液中以30℃和250rpm进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图12A和12B示出了通过儿茶酚的环裂解将TPA生物转化为MA：图12A示出了表达CatA的大肠杆菌菌株CDO-1对儿茶酚的环裂解；和图12B示出了由表达TphAabc、TphB、AroY和CatA的大肠杆菌菌株MA-1组成的MA-1系统将TPA转化为MA，其中所有转化于锥形管内TG-2缓冲液中以OD600＝30以及30℃和250rpm进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图13A至13C示出了TPA至MA的生物转化：图13A示出了用于通过表达TphAabc、TphB、AroY和CatA的大肠杆菌菌株MA-1将TPA转化为MA的生物合成途径和全细胞催化剂；图13B示出了由TPA于锥形管内含有TPA的TG-2缓冲液中以30℃和250rpm获得的最高MA收率，其中数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示；和图13C是通过大肠杆菌MA-1菌株由TPA产生的MA的GC/MS谱图。
图14A至14C示出了来自三种真核来源的O-甲基转移酶(OMT)的蛋白质表达及其PCA至VA的全细胞转化：图14A示出了在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达的OMT的SDS-PAGE结果；图14B示出了通过表达HsOMT的大肠杆菌OMT-1a(OD600＝20)的全细胞转化；和图14C示出了通过表达Sl0MT的大肠杆菌菌株OMT-1b(OD600＝20)的全细胞转化，其中转化于锥形管内含有3.2mM PCA、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的0.1M磷酸钠(pH 7.0)缓冲液中以30℃和250rpm进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。图中：HsOMT，来自智人的OMT；SlOMT，来自番茄(Solanum lycopersicum；S.lycopersicum)的OMT；MsOMT，来自苜蓿(Medicago sativa；M.sativa)的OMT；pET28a，空载体；T，总蛋白；S，可溶性部分；I，不溶部分；和M，标记。
图15A至15D示出了TPA向VA的生物转化：图15A示出了于锥形管内TG-1/YP缓冲液中在使用表达TphAabc、TphB和HsOMT的大肠杆菌菌株VA-1(OD600＝30)的VA-1系统中，以30℃下和250rpm使TPA生物转化为VA；图15B示出了在将表达TphAabc和TphB的大肠杆菌菌株PCA-1(OD600＝10)和大肠杆菌菌株OMT-2His(OD600＝30)同时添加至锥形管内TG-2/YPM缓冲液中的VA-2a系统中，以30℃和250rpm使TPA生物转化为VA；图15C示出了在使用挡板烧瓶代替VA-2a系统中使用的锥形管的改进型VA-2b系统中使TPA生物转化为VA；和图15D示出了在VA-2b系统的菌株PCA-1和OMT-2His的OD600值分别改变为OD600＝20和OD600＝20的改进型VA-2c系统中使TPA生物转化为VA，其中数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图16A至16D示出将TPA转化为VA的各种全细胞转化系统的甘油和甲硫氨酸消耗量：图16A示出了系统VA-1、VA-2a、VA-2b和VA-2c在24小时后的甘油消耗量的比较；图16B示出了系统VA-1、VA-2a、VA-2b和VA-2c在24小时后的甲硫氨酸消耗量的比较；图16C示出了VA-2b系统的甘油消耗量的时间进程；和图16D示出了VA-2b系统的甲硫氨酸消耗量的时间进程，其中分别通过高效液相色谱(HPLC)和GC/MS来分析甘油和甲硫氨酸，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图17A和17B示出了HsOMT蛋白质工程对将PCA生物转化为VA的影响：图17A示出了在TG-1/YP缓冲液中表达HsOMT的大肠杆菌菌株OMT-2；图17B示出了在TG-1/YP缓冲液中表达HsOMTHis的大肠杆菌菌株OMT-2His，其中TG-1/YP缓冲液是指含有100g/L甘油、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的50mM Tris-HCl缓冲液，并且全细胞转化在OD600＝30下于50mL锥形管内以30℃和250rpm进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图18A和18B示出了补充甲硫氨酸对PCA生物转化为VA的影响：图18A示出了在含有20g/L甘油的TG-2/YP缓冲液中的大肠杆菌菌株OMT-2His；图18B示出了在含有20g/L甘油和2.5mM甲硫氨酸的TG-2/YPM缓冲液中的菌株OMT-2His，其中TG-2/YP缓冲液是指含有20g/L甘油、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的50mM Tris-HCl缓冲液，TG-2/YPM缓冲液由TG-2/YP缓冲液通过补充2.5mM甲硫氨酸修改而成，且转化在OD600＝30下于50mL锥形管内以30℃和250rpm进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
图19A至19C示出了TPA向VA的生物转化：图19A示出了用于TPA转化为VA的生物合成途径和全细胞催化剂；图19B示出了来自TPA的最高VA收率的比较，其中对于VA-2a系统，数据以一式两份的实验的平均值±标准偏差表示，对于系统VA-1、VA-2b和VA-2c，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示；图19C是通过VA-2b系统由TPA产生的VA的GC/MS谱图。
图20A至20C示出了氧化葡糖杆菌KCCM 40109将EG生物转化为GLA：图20A示出了自EG起的GLA生物合成途径；图20B和20C示出了以28.6mM(图20B)和67.6mM(图20C)的初始EG使EG全细胞转化为GLA的时间进程，其中在图20B和20C的情况下，全细胞转化在OD600＝30下、以30℃和250rpm，于含有40g/L山梨糖醇、10g/L酵母提取物、2.5g/L(NH4)2SO4、1g/LKH2PO4和2.5g/L MgSO4·7H2O的锥形管内进行，数据以一式三份的实验的平均值±标准偏差表示。
具体实施方式
下文将详细描述本发明的配置。
本发明一方面提供由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法，所述方法包括：
通过聚对苯二甲酸乙二醇酯的水解来产生对苯二甲酸和乙二醇；和
在生物催化剂存在下，通过对苯二甲酸的生物转化产生选自由没食子酸、连苯三酚、儿茶酚、粘康酸和香草酸组成的组中的一种或多种化合物，其中原儿茶酸是通过生物转化产生的中间体，或
通过乙二醇的发酵来产生乙醇酸。
在根据本发明的由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法中，单体对苯二甲酸和乙二醇是通过聚对苯二甲酸乙二醇酯的化学水解产生的，各种高附加值芳香族化合物或芳香族衍生化合物如GA、连苯三酚、儿茶酚、MA和VA是通过作为PET水解产物的TPA的生物转化产生的，而乙醇酸是通过乙二醇的发酵产生的。
可以通过在170℃至230℃的温度施加微波15至50分钟来进行PET的化学水解。PET水解产物可通过过滤分离成TPA固体和含EG的溶液。
对于TPA的生物转化，选择PCA作为第一产物和关键中间体。PCA可以是产生各种高附加值芳香族化合物或芳香族衍生化合物(如GA、连苯三酚、儿茶酚、MA和VA)的前体化合物。
使用TPA 1,2-双加氧酶和1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸(DCD)脱氢酶作为能够将TPA转化为PCA的高效生物催化剂，其中TPA 1,2-双加氧酶将TPA转化为DCD，DCD脱氢酶将DCD转化为PCA。TPA 1,2-双加氧酶和DCD脱氢酶可来源于丛毛单胞菌属E6(Comamonas sp.E6)，它们各自的编码基因名称为TphAabc和TphB。这些酶可以利用NADH和NADPH作为辅助因子。根据本发明的一个实施方案，为了从PET水解产物TPA获得PCA，表达TphAabc和TphB的微生物可用作生物催化剂。
接下来，TPA向GA的生物转化可以通过在PCA间位诱导羟基化来实现，在这种情况下，PCA被转化为GA。可以使用对羟基苯甲酸羟化酶来实现羟基化。对羟基苯甲酸羟化酶可来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida；P.putida)KT2440，其编码基因名称为PobA。此外，根据本发明的一个实施方案，可以构建PobA突变体，即PobAMut(T294A/Y385F)以提高GA产率，并且可以使用表达PobAMut的微生物作为生物催化剂。优选地，为了由TPA产生GA，可以使用表达TphAabc、TphB和PobAMut的微生物或表达TphAabc和TphB的微生物与表达PobAMut的微生物的组合作为生物催化剂。
根据本发明的一个实施方案，为了提高来自TPA的GA产率，表达TphAabc、TphB和PobAMut的微生物(菌株GA-1)的OD600值为30时可以与TPA反应，或表达TphAabc和TphB的微生物(菌株PCA-1)和表达PobAMut的微生物(菌株HBH-2)的OD600值分别为10和30时可以与TPA反应，从而可以在不积累PCA的情况下提高GA产率。
接下来，TPA经由GA生物转化为连苯三酚可以通过两种途径实现：经由通过PCA羟基化合成的GA的脱羧(第一途径)，以及经由可以通过PCA脱羧而合成的儿茶酚的羟基化(第二途径)。
在第一途径的情况下，由于包括用于使通过PCA羟基化合成的GA脱羧的GA脱羧酶(编码基因名称：LpdC)，表达TphAabc、TphB和PobAMut的微生物可用作生物催化剂。根据本发明的一个实施方案，表达TphAabc、TphB、PobAMut和LpdC的微生物(菌株PG-1a)可与TPA反应以产生连苯三酚。
在第二途径的情况下，PCA脱羧酶(编码基因名称：AroY)和用于儿茶酚羟基化的苯酚羟化酶(编码基因名称：PhKLMNOPQ)可用作生物催化剂。根据本发明的一个实施方案，可以使用表达TphAabc、TphB和AroY的微生物(菌株CTL-1)和表达PhKLMNOPQ的微生物(菌株CH-1)的组合在它们的OD600值分别为10和30时与TPA反应，从而可以在最大限度地减少儿茶酚的积累的同时产生连苯三酚。
接下来，由TPA向MA的生物转化可以通过由TPA经PCA而合成的儿茶酚的环裂解来实现，在这种情况下，儿茶酚被转化成MA。儿茶酚的环裂解可以使用源自恶臭假单胞菌KT2440的儿茶酚1,2-双加氧酶(编码基因名称：CatA)来实现。根据本发明的一个实施方案，表达TphAabc、TphB、AroY和CatA的微生物(菌株MA-1)可以与TPA反应以产生MA。
接下来，由TPA向VA的生物转化可以通过OMT将PCA转化为VA来实现。在由OMT催化的O-甲基化反应中，由于腺苷基和甲基由ATP和甲硫氨酸提供，因此S-腺苷甲硫氨酸(SAM)可用作共底物。
作为OMT，可以使用源自真核生物的OMT。例如，可以使用来自智人的HsOMT、来自番茄的SlOMT、来自苜蓿的MsOMT等。为了提高VA产率，优选来自智人的HsOMT。此外，为了增加HsOMT的蛋白质溶解度，可以修饰HsOMT以在N端具有六聚组氨酸。
此外，为了提高VA产率，可以在TPA和生物催化剂的反应过程中增加曝气。曝气增加与甘油和甲硫氨酸消耗量增加有关。也就是说，曝气对于增加由PCA生产VA是至关重要的，因为甘油被有效代谢以生成三磷酸腺苷(ATP)，从而通过提供S-腺苷基团加速由甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
根据本发明的一个实施方案，为了由TPA经PCA产生VA，表达TphAabc和TphB的微生物(菌株PCA-1)以及表达HsOMTHis的微生物(菌株OMT-2His)在OD600值分别为10和30时可以在甘油和甲硫氨酸存在下与TPA反应，同时增加曝气，以增加ATP产量，从而可以提高VA产率。
本发明的方法能够通过发酵由作为PET水解产物的EG产生GLA。发酵可以使用发酵EG的微生物，如氧化葡糖杆菌KCCM 40109、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、恶臭假单胞菌等进行。
本发明的生物转化可以在各种反应缓冲系统中进行。例如，可以使用以下物质：TG-1缓冲液，含有10％(w/v)甘油的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-2缓冲液，含有2％(w/v)甘油的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-1/YP缓冲液，含有10％(w/v)甘油、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-2/YP缓冲液，含有2％(w/v)甘油、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-1/YPM缓冲液，补充有2.5mM L-甲硫氨酸(Sigma-Aldrich)的TG-1/YP缓冲液；和TG-2/YPM缓冲液，补充有2.5mM L-甲硫氨酸的TG-2/YP缓冲液。
如本文所用，术语“生物催化剂”是指参与TPA的生物转化的酶，也用于指表达该酶的微生物。该酶可以以含有编码基因的重组载体的形式引入宿主细胞中并表达。
术语“重组载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的载体，并且是指包括可操作地连接以在体内或体外表达基因插入物的必需调控元件的遗传构建体。在本说明书中，术语“质粒”、“载体”和“表达载体”可互换使用。
上述载体的实例包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体或病毒载体。合适的表达载体包含表达控制元件如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，还包含用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，它们可以根据目的而进行各种制备。载体中的启动子可以是组成型的或诱导型的。此外，表达载体包括用于选择包含载体的宿主细胞的选择标记，并且在可复制的表达载体的情况下，包括复制起点。
术语“可操作地连接”是指合适的核酸分子以能够进行基因表达的这样的方式连接至调控序列。
如本文所用，术语“核酸分子”是指cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA、PNAS或LNA起点的任何单链或双链核酸分子或其组合。“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。
本发明的重组载体优选通过将上述基因插入到用于大肠杆菌菌株表达的通用载体中来制备。作为用于大肠杆菌菌株表达的载体，可以使用任何常用的大肠杆菌表达载体而不受限制。
被重组载体转化的宿主细胞可以表达参与TPA生物转化的酶。实现转化的方法包括能够将核酸引入生物体、细胞、组织或器官中的任何方法，并且转化可以通过选择适用于宿主细胞的标准技术来进行，如本领域所知的。这种方法的例子包括但不限于：电穿孔；原生质体融合；磷酸钙(CaPO4)沉淀；氯化钙(CaCl2)沉淀；使用碳化硅纤维的搅拌；农杆菌介导的转化；以及使用PEG、硫酸葡聚糖、脂质体等。
此外，由于蛋白质的表达水平和修饰因宿主细胞而不同，因此推荐选择和使用对于其目的最合适的宿主细胞。
宿主细胞的实例包括但不限于原核生物，例如大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyce)、假单胞菌(Pseudomonas)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)。此外，可以使用真核生物如真菌(例如曲霉菌(Aspergillus))或酵母(例如毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyce)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa))，但本发明不限于此。
转化体的(大规模)培养可以采用多种培养方法，例如通过分批或连续培养法可以实现由重组微生物大规模生产表达或过表达基因产物。分批和补料分批培养法在本领域中是常规且已知的。微生物工业中已知控制用于连续培养工艺的营养物和生长因子的方法以及使产物形成率最大化的技术。此外，作为培养基，可以使用由碳源、氮源、维生素和矿物质形成的培养基，并且培养基的组成可以如本领域已知的那样配置。
在下文中，将通过根据本发明的实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围不受以下呈现的实施例的限制。
[发明方式]
<实施例1>聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)单体的生物转化
(1)PET的化学水解
将颗粒状PET切片(Sigma-Aldrich)用于化学水解实验。PET水解反应混合物包括在13mL去离子水中的1g颗粒状PET，并投入微波反应器(Monowave 300，奥地利格拉茨AntonPaar)中。在微波辐射下以不同温度和持续时间进行PET水解：170℃、200℃和230℃以及15、20、25、30、40和50分钟。由PET水解的TPA收率按照TPA收率(理论最大TPA％＝产生的TPA(g)/由消耗的PET产生的理论最大TPA(g)×100)计算。由PET产生的TPA的理论最大质量是通过将PET质量乘以PET的TPA收率系数0.864来计算。由于PET的高聚合度，假设通过水解而裂解的酯键总数与TPA和EG单体的总数相同。因此，当假设TPA:EG:H2O摩尔比为1:1:2时，计算出来自PET的TPA的TPA收率系数。TPA收率系数为166.13/(166.13+62.06-2×18.01)＝0.864，其中166.13、62.06和18.01分别为TPA、EG和H2O的分子量(MW)。
(2)PET水解产物中单体的分离
在PET化学水解后，水解产物中的TPA固体通过过滤而与含有EG的溶液分离。将残余物中的TPA固体溶解在1M NaOH中，从而转化为Na-TPA。在Na-TPA溶液中加入2M HCl后，将形成的TPA固体过滤并在80℃的真空烘箱中干燥。将含有EG的溶液通过蒸发而浓缩，并蒸馏以获得纯化的EG。从PET水解产物中纯化的TPA和EG通过核磁共振光谱(NMR；Bruker400MHz，马萨诸塞州比勒利卡)以及1H NMR和13C NMR进行分析，并与可靠的TPA(AlfaAesar，马萨诸塞州黑弗里尔)和EG(Junsei化学，日本东京)标准材料进行比较。
(3)细菌菌株和质粒
使用大肠杆菌DH5α作为用于质粒构建和维持的宿主菌株。使用大肠杆菌BL21(DE3)作为OMT酶筛选的宿主菌株。使用大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene,San Diego,，CA)和大肠杆菌MG1655(DE3)作为全细胞转化的宿主菌株。重组大肠杆菌菌株在含有10g/L胰蛋白胨、5g/LNaCl和5g/L酵母提取物的溶原性肉汤(LB)或LB琼脂平板(2.0％w/v)上生长。制备适当的抗生素(50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL卡那霉素或34μg/mL氯霉素)并补充到培养基中。如上所述构建质粒pKM212、pKE112和pKA312。本实验中使用的所有质粒和细菌菌株均列于表1中。使用氧化葡糖杆菌KCCM 40109(韩国微生物培养中心，韩国首尔)作为用于EG向GLA的生物转化的全细胞生物催化剂。
(4)质粒构建
按照标准程序进行DNA克隆。除pobA和catA基因之外的所有基因均由IDT或GeneArt合成，并通过聚合酶链反应(PCR)从恶臭假单胞菌KT2440中提取。使用C1000热循环仪(Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯市)进行PCR。用于改变限制酶位点的引物和基因分别列于表2和表3。
为了构建质粒pKE112TphAabc和pKM212TphB(PCA合成模块)，分别使用限制酶KpnI/HindIII和EcoRI/KpnI来消化质粒pKE112和pKM212。分别使用KpnI/HindIII和EcoRI/KpnI来消化相应的TphAabc和TphB基因，并连接到质粒pKE112和pKM212中。
为了构建用于表达基因Sl10OMT、HsOMT、MsOMT和HsOMTHis的基于pET28a的质粒，用NdeI/XhoI消化pET28a，并连接相应的基因。通过使用KpnI/BamHI将HsOMT和HsOMTHis连接到质粒pKE112TphB中构建用于将TPA直接转化为PCA的质粒。为了研究PobA和PobAMut的PCA羟基化能力，使用NdeI/XhoI将这些基因连接到质粒pET28a中，以分别构建质粒pET28aPobA和pET28aPobAMut。为了将TPA直接转化为GA，使用SbfI/HindIII将pobAMut连接到质粒pKE112TphB中。为了将TPA直接转化为PG，使用BamHI/SbfI将lpdC基因引入质粒pKE112TphBPobAMut中。为了构建儿茶酚羟基化模块pKA312PhKLMNOPQ，分别使用EcoRI/KpnI、KpnI/BamHI、BamHI/SbfI和SbfI/HindII将phKLMNOPQ基因片段连接到质粒pKA312、pKA312PhKLM、pKA312PhKLMNOP和pKA312PhKLMNOPQ中。
通过使用KpnI/BamHI将aroY连接到pKE112TphB中，构建用于儿茶酚合成的质粒。对于与评估酶LpdC和AroY的优选底物相关的实验，通过利用NdeI/XhoI位点将相应的酶连接到pET28a中来产生相应的质粒pET28aLpdC和pET28aAroY。为了构建用于MA合成的质粒，利用KpnI/BamHI位点将catA引入质粒pKE112和pKE112TphBAroY中。
(5)全细胞生物转化
使用大肠杆菌工程菌株的全细胞转化如下进行。在使用合适的抗生素的5mL LB培养基中过夜制备种子培养物。随后，将种子培养物用于接种2.8L烧瓶中的1L LB培养基，并于37℃和220rpm孵育。当细胞密度达到600nm(OD600)光密度为0.4时，将0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG；密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)加入到培养物中。随后，将孵育温度调节至16℃持续16小时以促进引入基因的可溶性表达。通过在10℃以4300×g离心5分钟来收获大肠杆菌工程菌株。洗涤收获的细胞并用含有2％(w/v)甘油的50mM Tris缓冲液(pH 7.0)重悬。
对于全细胞转化，将微生物细胞团块重悬在含有适当浓度的底物的4mL或20mL反应缓冲液中，并于250rpm和30℃孵育。本实验中用于生物转化的反应缓冲液的组成如下：TG-1缓冲液，含有10％(w/v)甘油的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-2缓冲液，含有2％(w/v)甘油的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-1/YP缓冲液，含有10％(w/v)甘油、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-2/YP缓冲液，含有2％(w/v)甘油、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的50mM Tris缓冲液(pH7.0)；TG-1/YPM缓冲液，补充有2.5mM L-甲硫氨酸(Sigma-Aldrich)的TG-1/YP缓冲液；和TG-2/YPM缓冲液，补充有2.5mM L-甲硫氨酸的TG-2/YP缓冲液。除非另有说明，否则所有实验均以一式三份进行。使用VA-2a系统的全细胞转化以一式二份进行。TPA、PCA、GA、连苯三酚、儿茶酚、MA和VA标准材料购自Sigma-Aldrich。
通过氧化葡糖杆菌KCCM 40109的全细胞生物转化按以下进行。在50mL锥形管内，将种子培养物在5mL培养基中制备过夜。培养基含有80g/L山梨糖醇、20g/L酵母提取物、5g/L(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4和5g/L MgSO4·7H2O。将种子培养物接种在2.8L烧瓶内1L培养基中，并于30℃和220rpm孵育。通过在10℃以6500×g离心8分钟收集细胞，然后洗涤并重悬于磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。通过将适当浓度的全细胞催化剂重悬在4mL或20mL缓冲液中制备全细胞生物转化混合物，并于30℃和250rpm孵育12小时。生物转化缓冲液由40g/L山梨糖醇、10g/L酵母提取物、2.5g/L(NH4)2SO4、1g/L KH2PO4和2.5g/L MgSO4·7H2O组成。生物转化缓冲液补充有不同浓度的EG：11.3mM、28.6mM和67.6mM。
(6)SDS-PAGE分析
使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证了真核OMT酶S1OMT、HsOMT和MsOMT在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中的表达。将含有各质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)细胞在500mL烧瓶内100mL LB培养基中于37℃和220rpm培养。培养物在达到OD600为0.4时补充0.1mM IPTG，并于16℃和180rpm培养16小时。通过在4℃以6500×g离心10分钟来收集细胞团块，并用16mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤。
由细胞悬浮液制备等分试样并用作SDS-PAGE的总蛋白样品。通过超声处理(Branson 450，新罕布什尔州汉普顿Marshall Scientific)获得重组大肠杆菌的细胞裂解物。通过在4℃以16000×g离心20分钟来分离分别含有不溶性蛋白质和可溶性蛋白质的固体部分和液体部分。将分离的固体部分重悬在16mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。将等分的细胞悬浮液以及液体和固体部分与5×SDS缓冲液(韩国城南Biosesang)混合，并在100℃煮沸10分钟。使用预染SDS标准标记(Bio-Rad)，通过12％(w/v)SDS-PAGE分离蛋白质样品。
(7)分析方法
使用分光光度计(xMarkTM，Bio-Rad)测量OD600。使用配备OptimaPak C18柱(RStech，韩国大田)的HPLC(Agilent 1100，加利福尼亚州圣克拉拉Agilent Technologies)以1.0mL/min的流速同时保持柱温在30℃来分析TPA和由TPA转化的产物。
流动相由在去离子水中的0.1％(v/v)三氟乙酸(Sigma-Aldrich)中的10％(v/v)乙腈组成。进样量为5μL，紫外检测在254nm进行。通过配备有折光率(RI)检测器和AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)的HPLC(Agilent1100)在65℃使用0.01N H2SO4流动相以0.5mL/min的流速来测量EG、GLA和甘油的浓度。
使用GC/MS分析以验证TPA向PCA、GA、连苯三酚、儿茶酚、MA和VA的转化以及EG向GLA的转化并对L-甲硫氨酸进行定量。使用配备有RTX-5Sil MS毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm膜厚；宾夕法尼亚州贝尔丰特Restek)加上10m集成保护柱的Agilent 7890A GC/5975C MSD(Agilent Technologies)进行GC/MS分析。以不分流模式注射1微升样品，进样温度为250℃。炉温最初在50℃保持一分钟，然后以20℃/min的速率升至320℃，接着保持25分钟。使用氦气作为载气，流速为1mL/min，通过从50m/z到700m/z扫描来记录质谱。传输线和离子源的温度分别设置为280℃和230℃。
(8)计算机对接模拟
使用Discovery Studio软件(加利福尼亚州圣迭哥BIOVIA)对来自恶臭假单胞菌KT2440的蛋白质结构PobA进行计算建模。在计算的对接模拟中使用结合FAD的PobA结构(PDB编码：6DLL)。野生型PobA结构在其活性位点不具有4-羟基苯甲酸(4-HBA)，表明野生型PobA的晶体结构可能不代表4-HBA和FAD的复杂构象。对于对接模拟，通过将恶臭假单胞菌KT2440 PobA活性位点与复合了4-HBA和FAD(PDB编码：1PBE和1BGN)的荧光假单胞菌PobA的活性位点进行比较，使用MODELER来对FAD在恶臭假单胞菌KT2440 PobA活性位点中的结合构象进行建模。通过MODELER构建PobAMut(T294A/Y385F)的结构。使用AutodockFR进行底物PCA的柔性对接，并选择9个残基(Y386、Y201、T294、L210、S212、R220、W185、Y222和I43)作为柔性残基。所有参数均设置为对接模拟的默认值，并使用PyMOL软件(PyMOL MolecularGraphics System，版本1.4.1；纽约州纽约市
Figure BDA0003399555020000082
)来分析所得结合模式。
[表1]本发明中使用的菌株、策略和质粒
Figure BDA0003399555020000081
Figure BDA0003399555020000091
Figure BDA0003399555020000101
[表2]本发明中使用的引物
Figure BDA0003399555020000102
Figure BDA0003399555020000111
[表3]本发明中使用的基因的核酸序列
Figure BDA0003399555020000112
Figure BDA0003399555020000121
Figure BDA0003399555020000131
Figure BDA0003399555020000141
<实验例1>
为了将PET解聚为单体TPA和EG，将1g PET在13mL水中进行反应，因此使用微波以170℃、200℃和230℃的不同温度下进行了15到50分钟的不同反应时间的PET解聚(图1A)。在初始水解期间，TPA的量因PET随机链裂解为TPA和EG而缓慢增加(图1A)。在这些时期之后，由反应产物TPA引起的自催化作用，PET解聚迅速增加。在各种反应条件中，在230℃下50分钟后获得最高的TPA收率(图1A)。该最高收率被确定为根据反应过程中消耗的PET计算出的理论最大TPA收率的99.9％，其中在23℃下50分钟后通过反应消耗了初始投入的PET中的24.1％(w/w)。这些结果表明，可以从PET水解中获得大量单体形式的TPA而不过度降解。
通过过滤将PET水解产物分离为固体部分和液体部分。首先，为了获得TPA，将含有TPA的固体部分溶解在1M NaOH中，然后在室温下通过2M HCl使Na-TPA沉淀为TPA。过滤沉淀的TPA并于80℃真空干燥(图2A)。为了确认TPA样品的身份，进行了1H和13C NMR分析(图2B和2C)。两个谱图的化学位移与试剂级TPA的化学位移相同。
为了从通过化学水解获得的PET水解产物中分离EG，蒸馏液体部分，并进行1H和13CNMR分析以确认EG样品的身份(图2D和2E)。在这种情况下，化学位移与试剂级EG的化学位移相同。
<实验例2>TPA向PCA的生物转化
为了通过实验验证从废弃的PET中获得的TPA作为用于生产比PET价值更高的化合物的原料的适用性，选择PCA作为第一产物和关键中间体。PCA可作为前体化合物，用于生产各种高附加值的芳香族化合物或芳香族衍生化合物，例如GA、连苯三酚、儿茶酚、MA和VA(图3)。因此，确定能够将TPA转化为PCA的高效生物催化剂是重要的。TPA经DCD向PCA的生物转化仅在体外由将TPA作为唯一的碳源进行代谢的几种细菌的TPA降解途径得以揭示，这些细菌例如丛毛单胞菌属E6、鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)T7和红球菌属(Rhodococcus sp.)DK17。TPA降解途径包括TPA 1,2-双加氧酶和DCD脱氢酶两种酶，其中TPA 1,2-双加氧酶将TPA转化为DCD，DCD脱氢酶将DCD转化为PCA。
在该实验中，TphAabc(即TPA 1,2-双加氧酶)和TphB(即DCD脱氢酶)均来源于丛毛单胞菌属E6，用于在大肠杆菌中从TPA到PCA的生物合成路线。与其他微生物的其他相应酶不同，这两种酶具有对NADH和NADPH均具备双重辅助因子利用能力的优势。为了将TPA溶解在缓冲溶液中，加入NaOH以将pH调节至7，然后制备50g/L的TPA溶液用于进一步的转化反应，其中TPA可以以大于0.5g/L的浓度溶解。当来自PET水解产物的TPA与表达TphAabc和TphB的大肠杆菌菌株PCA-1在TG-1缓冲液中一起孵育时(图1B)，三小时后以81.4％的摩尔收率产生了2.8mM PCA，这类似于试剂级TPA(图1C)。通过GC/MS证实PCA的产生(图1D和4A)。由于尚未报道在体内由TPA产生化合物，因此该实验是在体内由TPA产生PCA的首次实验证明。来自PET水解产物的TPA可用作产生芳香族化合物或芳香族衍生化合物的关键前体PCA的原料。由于PCA是木质素精炼厂中的关键的中间体化合物，因此PCA本身在其他生物转化中具有作为底物的价值。
<实验例3>TPA向GA的生物转化
目前，在制药工业中，使用GA来产生抗菌剂甲氧苄啶和抗氧化剂没食子酸丙酯。当鉴定出对PCA的间位具有羟基化活性的PCA羟化酶时，TPA可以经PCA转化为GA(图5A)。虽然野生型对羟基苯甲酸羟化酶(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PobA)使4-HBA而非PCA(即3,4-二羟基苯甲酸)羟基化，但基于结构的工程化PobA使4-HBA和PCA都羟基化为GA。
在该实验中，在大肠杆菌(菌株HBH-1)中表达来自恶臭假单胞菌KT2440的PobA，以测试来自恶臭假单胞菌KT2440的PobA使PCA间位羟基化的能力。结果，菌株HBH-1在30℃和250rpm下在TG-2缓冲液中于12小时后以40.1％的摩尔收率由PCA产生1.4mM GA(图6A)。为了增强通过PobA的羟基化，按照先前的方法进行了基于结构的酶工程。根据分子对接模拟，Tyr201与野生型PobA的活性位点中的Tyr386和PCA形成两个氢键(图7A)。然而，PCA在建模的双突变体PobAMut(T294A/Y385F)的活性位点处与Tyr201和Ala294形成两个氢键，从而导致底物和FAD辅助因子之间的结合距离更短(图7B)。为了验证建模结果，构建了双突变体PobAMut(T294A/Y385F)并在大肠杆菌菌株HBH-2中表达。使用表达PobAMut的HBH-2菌株，12小时后以74.3％的摩尔收率由PCA产生2.5mM GA(图6A)，与野生型PobA相比增加了83.7％。
首先，测试由表达TphAabc、TphB和PobAMut的大肠杆菌菌株GA-1组成的单一催化剂GA-1系统以由TPA产生GA。在TG-2缓冲液中12小时后，GA-1系统仅以46.6％的摩尔收率由TPA产生1.3mM GA，而剩余1.1mM PCA(图6B)。这可能是由于通过在单一菌株系统GA-1中利用NAD(P)H而由PCA生物合成GA引起的氧化还原不平衡。为了提高由TPA的GA收率，构建了GA-2a系统，其中同时加入菌株PCA-1和HBH-2，以分别催化由TPA合成PCA以及由PCA合成GA。然而，GA合成催化剂使3.1mM TPA仅产生0.5mM GA，摩尔收率为15.9％(图6C)。由于积累了2.1mM的中间体PCA而没有转化为GA，因而GA合成催化剂的第二反应是GA-2a系统中的限速反应。为了促进第二转化步骤，PCA和GA合成催化剂之间的OD600值从GA-2a系统中的20和20变为GA-2b系统中的10和30(图6D)。结果，24小时后，由TPA产生GA的产量和摩尔收率分别增加到2.7mM GA和92.5％(图5B和6D)，而未积累PCA。通过GC/MS来确认GA-2b系统的GA产量(图5C和4B)。
<实验例4>TPA经GA向连苯三酚的生物转化
连苯三酚是可以由TPA经PCA产生的另一种高附加值的化合物。连苯三酚目前在石油工业中用作抗氧化剂。连苯三酚可以通过两种途径进行生物合成：经通过PCA羟基化合成的GA的脱羧(图8A)，以及经可以通过PCA脱羧而合成的儿茶酚的羟基化(图8B)。
为了开发经GA的连苯三酚生物合成路线，将LpdC(在体外被发现是GA脱羧酶)作为GA脱羧模块引入GA生物合成途径。结果，构建了表达TphAabc、TphB、PobAMut和LpdC的大肠杆菌菌株PG-1a(图8A)。PG-1a菌株在TG-2缓冲液中于30℃和250rpm在6小时后以32.7％的摩尔收率由TPA产生1.1mM连苯三酚(图8C和9A)，并且通过GC/MS确认了连苯三酚的产量(图8D和4C)。然而，6小时后也产生了大量的作为副产物的儿茶酚，1.6mM；这是由GA脱羧酶LpdC对PCA的混杂造成的。LpdC不仅将GA转化为连苯三酚，还将PCA转化为儿茶酚。例如，表达LpdC的大肠杆菌菌株GDC-1在8小时后将3.0mM PCA转化为2.9mM儿茶酚，接着在18小时后将3.0mM GA转化为2.8mM连苯三酚(图10A和10B)。这些结果表明LpdC对PCA具有混杂活性，因为LpdC以前被报道为GA脱羧酶。因此，当使用以PCA作为中间体的GA生物合成路线时，儿茶酚的产生是不可避免的。
为了缓解因LpdC混杂性导致的儿茶酚积累，有必要将积累的儿茶酚转化为连苯三酚。尽管能够将儿茶酚转化为连苯三酚的儿茶酚羟化酶尚未有报道，但最近，已发现编码来自施氏假单胞菌OX1的酚羟化酶的PhKLMNOPQ操纵子在将儿茶酚转化为连苯三酚方面表现出混杂活性。24小时后，表达PhKLMNOPQ的大肠杆菌菌株CH-1以67.1％的摩尔收率由儿茶酚产生2.6mM连苯三酚(图11A)。将PhKLMNOPQ儿茶酚羟基化模块加入大肠杆菌菌株PG-1a中，以构建大肠杆菌菌株PG-1b(图8A)。然而，即使将含有PhKLMNOPQ儿茶酚羟基化模块的PG-1b系统应用于由TPA产生连苯三酚时，儿茶酚积累也略有增加，并且12小时后的0.7mM的连苯三酚产量略低(图9B)于由PG-1a系统在六小时后产生的1.1mM(图9B)。比较PG-1a和PG-1b系统之间的GA积累及其向连苯三酚的转化，与PG-1a(图9A)相比，PG-1b积累较少的GA但产生较少的连苯三酚(图9B)。在PG-1b中，儿茶酚羟基化模块似乎是无活性的，没有转化儿茶酚，而是比在PG-1a中(图9A)积累了更大量的儿茶酚(图9B)。这些结果意味着经涉及两种不同羟基化反应的两种生物合成途径合成连苯三酚可能效率低下。这可能是因为两个羟基化模块都需要一个或多个NAD(P)H分子。
<实验例5>TPA经儿茶酚向连苯三酚的生物转化
为了合成连苯三酚而不形成由LpdC混杂性引起的儿茶酚副产物，采用了经儿茶酚的替代性连苯三酚合成途径。基于用于TPA转化为PCA的PCA合成模块(即PCA-1系统)，通过将用于PCA转化为儿茶酚的PCA脱羧模块和用于凭借PhKLMNOPQ进行儿茶酚转化的儿茶酚羟基化模块整合于单菌株或双菌株系统(即分别为PG-2a和PG-2b系统)中，构建连苯三酚合成途径(图8B)。采用在若干微生物中被鉴定为PCA脱羧酶的AroY酶作为PCA脱羧模块。首先，验证了表达AroY的大肠杆菌菌株PDC-1将PCA转化为儿茶酚，其中在五小时后PCA在TG-2缓冲液中以97.8％的摩尔收率转化为2.9mM儿茶酚(图11B)。已使用CH-1菌株验证了儿茶酚羟基化模块用于通过PhKLMNOPQ将儿茶酚转化为连苯三酚的功能(图11A)。为了进一步评估PCA脱羧模块产生儿茶酚以及AroY结合用于将TPA转化为PCA的PCA合成模块的能力，测试了表达TphAabc、TphB和AroY的大肠杆菌菌株CTL-1，并且菌株CTL-1在四小时后，由TPA以90.1％的摩尔收率产生2.7mM儿茶酚而无PCA积累(图9C)。
接下来，在PG-2a系统中，当PCA合成菌株PCA-1以及表达AroY和PhKLMNOPQ的PCA-至-连苯三酚转化菌株PDC-CH-1与3.1mM TPA同时孵育时，仅产生0.2mM连苯三酚，但在TG-2缓冲液中20小时后2.4mM儿茶酚仍未转化(图9D)。为了对PG-2a系统进行故障排除，当以3.2mM PCA作为底物单独测试菌株PDC-CH-1时，PCA似乎在20小时后完全转化为儿茶酚，但仅有1.2mM连苯三酚由儿茶酚以约39.0％的摩尔收率产生(图11C)。24小时后，通过PDC-CH-1菌株由儿茶酚产生的连苯三酚收率是仅表达PhKLMNOPQ的大肠杆菌菌株CH-1产生的2.6mM连苯三酚的1/1.7(图11A和11C)。这些结果表明，单独表达PhKLMNOPQ有利于儿茶酚转化为连苯三酚。这可能是由于在与AroY共表达时生成正确形式的由PhK、Ph(LNO)2、PhP、PhQ和PhM亚基组成的多单元PhKLMNOPQ的不确定性。因此，由菌株PCA-1和PDC-CH-1组成的PGA-2a系统被由表达AroY、TphAabc和TphB的大肠杆菌菌株CTL-1和仅表达PhKLMNOPQ的大肠杆菌菌株CH-1组成的PG-2b系统(图8B)替代(图9E)。PG-2b系统的连苯三酚产量(即0.6mM)是PG-2a系统(即0.2mM)的三倍；这可能归因于PhKLMNOPQ的单独表达。然而，大量的儿茶酚(1.6mM)，仍未转化(图9E)。
<实验例6>TPA至MA的生物转化
由TPA经PCA合成的儿茶酚可以通过儿茶酚的环裂解转化为MA。目前，MA在化学工业中用于生产己二酸，己二酸广泛用于生产塑料。为了开发自TPA起的MA生物合成途径，测试了作为环裂解模块的CatA(源自恶臭假单胞菌KT2440的儿茶酚1,2-双加氧酶)。当4.5mM儿茶酚与表达CatA的大肠杆菌菌株CDO-1一起孵育时，10分钟后其完全转化为MA(图12A)。该MA合成模块与表达TphAabc、TphB和AroY的菌株CTL-1的儿茶酚生物合成途径(图9C)相结合，以构建含有以TPA开始的MA生物合成途径的大肠杆菌菌株MA-1(图13C)。包含MA-1菌株的的MA-1系统在六小时后将3.2mM TPA以85.4％的摩尔转化收率转化为2.7mM MA，而没有积累中间体(图12B和13B)。TPA至PCA的生物合成途径没有表现出氧化还原失衡(图13A)。GC/MS证实Ma是由菌株MA-1产生的(图4D和13C)。
<实验例7>使用单一催化剂系统的TPA向VA的生物转化
在制药工业中，VA用作香草醛的直接前体。PCA在体外和体内都通过OMT转化为VA。为了向由OMT催化的该O-甲基化反应提供甲基，使用SAM作为共底物，腺苷和甲基分别由ATP和甲硫氨酸提供。目前已知的OMT来自真核生物；然而，在本发明中，测试了来自不同来源的OMT在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达以构建VA合成模块。在本发明检测的三种OMT，即来自智人的HsOMT、来自番茄的SIOMT和来自苜蓿的MsOMT中，只有HsOMT和SlOMT以活性形式表达(图14A)。比较了分别表达HsOMT和SlOMT的大肠杆菌菌株OMT-1a和OMT-1b的全细胞转化。通过菌株OMT-1a，在分别含0.94和0.54mM甲硫氨酸并补充有20g/L和10g/L蛋白胨的0.1M磷酸盐缓冲液中，3.2mM PCA以29.4％的摩尔收率转化为1.0mM VA(图14B)；其中菌株OMT-1a的收率是菌株OMT-1b的收率的1.4倍(图14C)。因此，在进一步的实验中，选择HsOMT用于将PCA转化为VA的合成模块。
为了直接由TPA经PCA产生VA，通过构建表达TphAabc、TphB和HsOMT的大肠杆菌菌株VA-1，使用HPAOM将TPA到PCA的生物合成途径连接至PCA到VA的途径(图19A)。当3.3mMTPA与菌株VA-1一起孵育时，TPA被完全消耗；然而，仅产生了0.02mM VA，并且在TG-1/YP缓冲液中72小时后积累了2.3mM PCA(图15A)。PCA至VA的这种低转化由甘油(图16A)和甲硫氨酸(图16B)的低消耗量证实。这种低转化率可能归因于HsOMT的低可溶性表达(图14A)。
为了将由菌株VA-1产生的PCA至VA的低转化提高(图15A)，通过将六聚组氨酸连接到HsOMT的N端(已知这会增加蛋白质溶解度)来增加HsOMT的蛋白质溶解度。尽管表达野生型HsOMT的菌株OMT-2产生了0.65mM VA(图17A)，但表达具有N端六聚组氨酸的HsOMTHis的菌株OMT-2His表现出比菌株野生型HsOMT高10.7％的VA产量(图17A和17B)。因此，在进一步的实验中使用HsOMTHis。
为了使PCA至VA的低转化进一步提高，使用菌株OMT-2His优化转化条件。特别地，由于内源性SAM再生可能效率低下，因此通过在TG-2/YPM缓冲液中补充甲硫氨酸来促进。当菌株OMT-2His在缺乏补充的甲硫氨酸的TG-2/YP缓冲液中孵育时，48小时后，2.9mM PCA仅产生0.9mM VA(图18A)。由于TG-2/YP缓冲液仅包含来自酵母提取物和蛋白胨的0.8mM游离甲硫氨酸，因此将2.5mM甲硫氨酸添加到TG-2/YPM缓冲液中以使甲硫氨酸摩尔浓度与PCA的摩尔浓度平衡。结果，由2.9mM PCA通过菌株OMT-2His在TG-2/YPM缓冲液中的VA摩尔收率为44.5％，比在TG-2/YP缓冲液中的摩尔收率高40.0％(图18B)。
<实验例8>使用双催化剂系统将TPA生物转化为VA
在单一催化剂系统中，由于PCA向VA的转化可以忽略，因而会累积PCA。为了促进PCA向VA的转化，本发明人开发了双催化剂VA-2a系统，其中表达TphAabc和TphB的菌株PCA-1和表达HsOMTHis的菌株OMT-2His(图15B)(分别具有不同的OD600值10和30)同时加入到含有TPA的TG-2/YPM缓冲液中(图19A)。结果，通过VA-2a系统由3.4mM TPA产生的VA在48小时后增加到0.3mM(图15A和15B)，但是来自由TPA转化的PCA的VA的摩尔收率保持在6.4％(图19B)。为了进一步增加PCA向VA的转化，通过增加氧气供应来增强HsOMTHis催化的O-甲基化，因为O-甲基化所需的腺苷基团可以由ATP提供。为了通过提高曝气来增加ATP生成，VA-2b系统使用挡板烧瓶代替VA-2a系统使用的锥形管(图19A)。结果，VA-2b在48小时后产生的VA增加到1.4mM VA，摩尔收率为41.6％(图15C)，是使用锥形管的VA-2a系统产生的VA的4.7倍(图15C和15B)。由于增加曝气而提高的VA产量与增加的甘油和甲硫氨酸消耗量相关(图16A至16D)。因此，曝气对于增加由PCA生产VA的产量至关重要，因为甘油有效代谢以生成ATP，从而通过提供S-腺苷基团使甲硫氨酸合成SAM加速。通过GC/MS确认VA-2b系统的VA产量(图19C和4E)。这些结果表明，通过提高甲硫氨酸和来自ATP的腺苷基团的供应来使SAM再生对于通过OMT使PCA O-甲基化至关重要。
然而，在VA-2b系统中，1.4mM TPA保持未转化(图15C)。通过将VA-2b系统中菌株PCA-1和OMT-2His的OD600值分别从10调整到20和从30调整到20，增加了TPA向PCA的转化以解决这个问题。然而，48小时后VA产量降低至0.4mM VA，而TPA被完全消耗(图15D)。为了提高TPA向VA的转化，需要进一步优化TPA向PCA以及PCA向VA的转化通量。
<实验例9>EG向GLA的生物转化
为了通过实验验证来自废弃的PET的EG作为原料的适用性，使用氧化葡糖杆菌KCCM 40109测试从PET水解产物获得的EG样品以产生GLA(图1E和20)。GLA在化妆品中用作去角质剂(exfoliant)。含有11.3mM、28.6mM和67.6mM EG的试剂级样品在12小时后分别以摩尔收率95.3％、99.7％和89.4％转化为GLA(图20B和20C)。含有来自PET水解产物的10.7mM EG的样品在12小时后以98.6％的摩尔收率转化为GLA(图1F)。通过GC/MS来证实(图1G和4F)氧化葡糖杆菌的GLA产量。
[工业适用性]
本发明适用于PET升级回收领域。
序列表
<110> 高丽大学校产学协力团
<120> 由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法
<130> G21U13C0687P/CN
<150> KR10-2019-0040992
<151> 2019-04-08
<160> 35
<170> PatentIn version 3.2
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<211> 1011
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> tphAa
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atgaaccacc agatccatat ccacgactcc gatatcgcgt tcccctgcgc gcccgggcaa 60
tccgtactgg atgcagctct gcaggccggc atcgagctgc cctattcctg ccgcaaaggt 120
agctgtggca actgtgcgag tacgctgctc gacggaaata ttgcctcctt caatggcatg 180
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tttacggcca aggtgtacag caatacactg gcggcacccg atgtctcgct gctgcgcctg 360
cgcctgcctg tgggcaagcg cgccaaattt gaagccggcc aatacctgct gattcacctc 420
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cgctacattg cagccatcac cgacctaggc gatatgcctg cggatgctca cgcaggtcgg 840
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ggctcaccag ctctggttca atcagtgcgc acagccgctt ccgatatggg cctgcttgca 960
caggacttcc acgcggatgt ttttgcgaca ggcccgactg gtcaccacta g 1011
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> tphAb
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atgcaagaat ccatcatcca gtggcatggg gccactaata cgcgcgtgcc ttttggtatc 60
tataccgaca cagccaatgc tgatcaggaa cagcagcgca tctatcgcgg cgaggtctgg 120
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cgctgcgcgc atcgcggcgc tctcatcgct ctggagaaat cgggccgtac ggatagtttc 300
cagtgcgtct atcacgcctg gagctacaac cgacagggag atctgaccgg cgttgccttc 360
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atgatcaatg aaattcaaat cgcggccttc aatgccgcct acgcgaagac catagacagt 60
gatgcaatgg agcaatggcc aacctttttc accaaggatt gccactattg cgtcaccaat 120
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atgggatcga cagcaaatat ccagttagca acacaatcgg aagacgaaga gcgtaattgc 60
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atgcagaacc cgatcaacga cctgcgctcc gcgatcgcgc tgctgcaacg ccatccgggt 60
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ctggtcgaag acacgcttgt ggtcgatgat tggtttgagc tgactctggt tcagaacatt 660
cttatcgacg gaatgatgta cccgctggtc tacgacaaga tggaccagtg gttcgaaagc 720
cagggtgctg aagatgtgtc catgctcacg gagttcatgc gtgactggta caaggaatcc 780
ctacgctgga ctaatgccat gatgaaagcc gtggccggtg aaagtgagac taaccgtgag 840
ttgcttcaaa aatggatcga tcactgggaa ccgcaggcct acgaagccct gaaacctctg 900
gccgaagcct ccgttggcat cgacgggctg aatgaagccc gggcggaact ctctgcccgc 960
ctgaagaaat tcgaactgca gagccgggga gtctcagcat ga 1002
<210> 14
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phM
<400> 14
atgagccagc ttgtatttat tgtattccag gacaacgacg actcccgcta cctcgcggaa 60
gccgttatgg aagataaccc cgacgccgaa atgcagcacc agccggccat gatccggatc 120
caggcggaaa aacgtctggt gatcaaccgc gaaaccatgg aagaaaagct ggggcgagac 180
tgggatgttc aggaaatgct cataaatgtt atcagcatcg ccggcaacgt cgatgaagac 240
gatgatcact tcattcttga atggaattaa 270
<210> 15
<211> 1536
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phN
<400> 15
atggttagta aaaacaaaaa gcttaacctt aaagacaagt atcaatacct gacccgggat 60
atggcctggg aaccgaccta tcaggacaag aaagatattt ttccggagga ggattttgag 120
ggtatcaaga tcaccgactg gtcccagtgg gaagatccgt tccgcctgac catggatgcc 180
tactggaaat accaggcgga aaaagagaag aagctgtacg ccattttcga tgcatttgcc 240
cagaacaacg gccaccagaa catttcagac gcccgttatg tgaacgcgct aaaactgttc 300
atcagtggta tatctccgct tgaacatgcg gcgttccagg gttattccaa ggtcggtcgc 360
cagtttagcg gcgccggggc gcgggttgcc tgccagatgc aggcaattga cgagctgcgt 420
cattcccaga cccagcaaca cgcgatgagc cactacaaca agcacttcaa cggtctgcac 480
gatggcccgc acatgcacga tcgggtgtgg tacctgtcgg tgccgaaatc gttctttgat 540
gatgcacgct cggctggtcc gttcgagttc ctgacggcca tctcattctc gttcgagtat 600
gtgctcacca acctgttgtt cgtaccgttc atgtcgggcg ctgcctataa cggcgacatg 660
gcgacagtca ccttcggttt ctccgcccag tctgacgaag cccgtcatat gaccctgggc 720
cttgaggtga tcaagttcat cctcgagcag cacgaagata acgtgcccat cgttcagcgc 780
tggatcgaca agtggttctg gcgcggattt cgcctgctta gcctggtcag catgatgatg 840
gactacatgc tgccaaacaa ggtcatgtcc tggtccgagg catgggaagt ctattacgag 900
cagaacggcg gtgctctgtt caaggacctg gagcgatacg gcatccgccc gcccaaatac 960
caggacgtgg ctaacgatgc caaacatcac ctgagccacc agctttggac cactttctac 1020
cagtactgcc aggccaccaa cttccatact tggattccgg agaaggaaga gatggactgg 1080
atgtccgaga agtatccgga cactttcgac aagtactacc gtccgcgtta cgagtacctg 1140
gcgaaagagg ctgccgctgg ccgtcgcttc tacaacaaca ccctgccgca gctgtgccaa 1200
gtgtgtcaga tcccgaccat tttcaccgag aaagatgccc caaccatgct cagccatcgg 1260
cagatagaac atgagggcga acgctatcac ttctgctctg acggctgctg cgacatcttc 1320
aaacacgagc cggagaagta catacaggcc tggctgccgg tgcaccagat ctaccagggc 1380
aactgtgaag gcggggatct cgagaccgtg gtgcagaagt attaccacat caatatcgga 1440
gaggacaatt tcgactacgt tggatcgccc gaccagaaac actggctgtc gatcaagggc 1500
cggaagcctg cagacaagaa ccaggacgcc gcctga 1536
<210> 16
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phO
<400> 16
atgagtgtaa acgcacttta cgactacaag tttgaaccta aagacaaggt cgagaacttc 60
cacggcatgc agctgctgta tgtctactgg cccgatcacc tgctgttctg cgcgcccttc 120
gcgctgctgg tgcagccggg tatgaccttc agtgccctgg tggacgagat tctcaagccg 180
gctaccgccg cgcacccgga ctctgccaag gcggacttcc tgaatgccga gtggttgctg 240
aacgatgaac cgttcacacc caaggctgac gccagcctga aagagcaggg tattgatcac 300
aagagcatgc tgacggtgac cacgccgggc ctgaagggca tggcgaacgc cggttactga 360
<210> 17
<211> 1062
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phP
<400> 17
atgagttaca ccgtcactat tgagccgatc ggcgagcaga ttgaggtaga ggatggccag 60
actatcctcg ccgccgccct gcgccagggt gtctggctgc cctttgcctg cggccacggc 120
acctgtgcta cctgtaaggt tcaggtgctt gaaggtgatg tcgagatcgg aaacgcctcg 180
ccctttgcgc tgatggatat cgaacgtgac gagggcaagg ttctggcctg ctgcgccacg 240
gttgagagcg acgtcaccat tgaggtggac atcgatgtgg atccggattt tgagggctac 300
ccggtggagg actatgccgc catagcgacc gatatcgtcg aactctctcc gaccatcaag 360
ggcattcacc tgaaactgga ccggccgatg acattccagg ccggccagta catcaatatc 420
gaactgccgg gtgttgaagg cgcgagggcc ttctccctgg ccaacccgcc cagcaaagca 480
gacgaagtgg agctgcatgt gcgcctcgtt gagggcggtg ctgccaccac ctacatccac 540
gaacaactga aaacgggtga tgcgctgaac ctttcaggcc cttacggcca gttcttcgtg 600
cgtagttccc aacccggcga tctgattttc atcgccggcg gatccggatt gtccagtccc 660
cagtcgatga tccttgatct gcttgagcag aacgatgagc gcaagatcgt tctgttccag 720
ggtgcccgaa acctggcaga gctttacaac cgggagctgt ttgaggctct ggatcgcgac 780
cacgacaatt tcacctacgt accggcgctt agccaagccg acgaagaccc tgactggaag 840
ggcttccgag gctatgtcca tgaggcggcc aacgcccatt tcgatggccg gtttgccggt 900
aacaaggcat acctgtgcgg cccgcctcca atgatcgatg cggctatcac ggcattgatg 960
caggggcggc tgttcgagcg tgacatcttc atggagaaat tcctgacagc ggcggacgga 1020
gctgaagaca cccagcgttc ggccctgttc aagaagatat ag 1062
<210> 18
<211> 309
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phQ
<400> 18
atgggcatgg gtttcctagt gttcaaccgc acaacgggag gtcactttac ctgccaggag 60
ggccagagtg tgctcaaggc catggagcag aggggcctga agtgtgtccc cgtgggctgc 120
cggggtggtg gttgcggatt ttgtaagatc cgggttctgg aagggtattt cgagtgcggc 180
aagatgagca agcggcacgc cccgcctgaa gccgttgaaa aaggggaagt tctggcctgc 240
cggatctacc cactgactga tctgatcatt gagtgtccgc cgcaaccggc ggcggacttt 300
gcgagctag 309
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> catA
<400> 19
atgaccgtga aaatttccca cactgccgac attcaagcct tcttcaaccg ggtagctggc 60
ctggaccatg ccgaaggaaa cccgcgcttc aagcagatca ttctgcgcgt gctgcaagac 120
accgcccgcc tgatcgaaga cctggagatt accgaggacg agttctggca cgccgtcgac 180
tacctcaacc gcctgggcgg ccgtaacgag gcaggcctgc tggctgctgg cctgggtatc 240
gagcacttcc tcgacctgct gcaggatgcc aaggatgccg aagccggcct tggcggcggc 300
accccgcgca ccatcgaagg cccgttgtac gttgccgggg cgccgctggc ccagggcgaa 360
gcgcgcatgg acgacggcac tgacccaggc gtggtgatgt tccttcaggg ccaggtgttc 420
gatgccgacg gcaagccgtt ggccggtgcc accgtcgacc tgtggcacgc caatacccag 480
ggcacctatt cgtacttcga ttcgacccag tccgagttca acctgcgtcg gcgtatcatc 540
accgatgccg agggccgcta ccgcgcgcgc tcgatcgtgc cgtccgggta tggctgcgac 600
ccgcagggcc caacccagga atgcctggac ctgctcggcc gccacggcca gcgcccggcg 660
cacgtgcact tcttcatctc ggcaccgggg caccgccacc tgaccacgca gatcaacttt 720
gctggcgaca agtacctgtg ggacgacttt gcctatgcca cccgcgacgg gctgatcggc 780
gaactgcgtt ttgtcgagga tgcggcggcg gcgcgcgacc gcggtgtgca aggcgagcgc 840
tttgccgagc tgtcattcga cttccgcttg cagggtgcca agtcgcctga cgccgaggcg 900
cgaagccatc ggccgcgggc gttgcaggag ggctga 936
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-HsOMT-F(forward)
<400> 20
ggtacctttc acacaggaaa cagaccatgg gcgataccaa agaacag 47
<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-HsOMT-R(reverse)
<400> 21
ggatccttaa gttacggacc tgcttcg 27
<210> 22
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-HsOMTHis-F(forward)
<400> 22
ggtacctttc acacaggaaa cagaccatgc atcaccatca ccatcatggc gataccaaag 60
aacagcg 67
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112- HsOMTHis -R(reverse)
<400> 23
ggatccttaa gttacggacc tgcttcg 27
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a- HsOMTHis -F(forward)
<400> 24
catatgcatc accatcacca tcatggcgat accaaagaac agcg 44
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a- HsOMTHis -R(reverse)
<400> 25
ctcgagttaa gttacggacc tgcttcg 27
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-PobA-F(forward)
<400> 26
catatgaaaa ctcaggttgc aattattg 28
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-PobA-R(reverse)
<400> 27
ctcgagtcag gcaacttcct cgaacg 26
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-PobA-F(forward)
<400> 28
cctgcaggtt tcacacagga aacagaccat gaaaactcag gttgcaatta ttg 53
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-PobA-R(reverse)
<400> 29
aagctttcag gcaacttcct cgaacg 26
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-LpdC-F(forward)
<400> 30
catatggcag aacaaccatg ggatt 25
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-LpdC-R(reverse)
<400> 31
ctcgagttac ttcaaatact tctcccagtc 30
<210> 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-AroY-F(forward)
<400> 32
catatgcaga acccgatcaa cgac 24
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-AroY-R(reverse)
<400> 33
ctcgagttac ttcttgtcgc tgaacagc 28
<210> 34
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-CatA-F(forward)
<400> 34
ggtacctttc acacaggaaa cagaccatga ccgtgaaaat ttcccacac 49
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pKE112-CatA-R(reverse)
<400> 35
ggatcctcag ccctcctgca acgc 24

Claims (8)

1.由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法，所述方法包括：
通过聚对苯二甲酸乙二醇酯的水解来产生对苯二甲酸和乙二醇；和
在生物催化剂存在下，通过对苯二甲酸的生物转化产生选自由没食子酸、连苯三酚、儿茶酚、粘康酸和香草酸组成的组中的一种或多种化合物，其中原儿茶酸是通过生物转化产生的中间体，或
通过乙二醇的发酵来产生乙醇酸。
2.权利要求1所述的方法，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯的水解通过施加微波来进行。
3.权利要求1所述的方法，其中使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶和1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶的微生物作为生物催化剂来进行对苯二甲酸向原儿茶酸的生物转化。
4.权利要求1所述的方法，其中使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶、1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶和对羟基苯甲酸羟化酶的微生物作为生物催化剂，或使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶和1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶的微生物与表达对羟基苯甲酸羟化酶的微生物的组合作为生物催化剂，来进行对苯二甲酸向没食子酸的生物转化。
5.权利要求1所述的方法，其中使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶、1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶、对羟基苯甲酸羟化酶和没食子酸脱羧酶的微生物作为生物催化剂，或使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶、1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶和原儿茶酸脱羧酶的微生物与表达酚羟化酶的微生物的组合作为生物催化剂，来进行对苯二甲酸向连苯三酚的生物转化。
6.权利要求1所述的方法，其中使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶、1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶、原儿茶酸脱羧酶和儿茶酚1,2-双加氧酶的微生物作为生物催化剂来进行对苯二甲酸向粘康酸的生物转化。
7.权利要求1所述的方法，其中在含有甘油和甲硫氨酸的培养基中同时使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶和1,2-二羟基-3,5-环己二烯-1,4-二羧酸脱氢酶的微生物与表达人源O-甲基转移酶的微生物的组合作为生物催化剂来进行对苯二甲酸向香草酸的生物转化。
8.权利要求1所述的方法，其中使用选自由氧化葡糖杆菌KCCM 40109、乙二醇梭菌和恶臭假单胞菌组成的组中的一种或多种使乙二醇发酵的微生物来进行乙二醇的发酵。
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