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CN114008206B - 具有增强的细胞色素c活性的l-氨基酸生产微生物及使用其的l-氨基酸生产方法 - Google Patents

具有增强的细胞色素c活性的l-氨基酸生产微生物及使用其的l-氨基酸生产方法 Download PDF

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Abstract

提供了具有增强的细胞色素C活性的L‑氨基酸生产微生物，以及使用该微生物的L‑氨基酸生产方法。

Description

具有增强的细胞色素C活性的L-氨基酸生产微生物及使用其 的L-氨基酸生产方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月23日向韩国知识产权局提交的KR 10-2019-0173087和KR 10-2019-0173088的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
提供了一种具有增强的细胞色素C活性的L-氨基酸生产微生物和使用该微生物生产L-氨基酸的方法。
背景技术
属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物是革兰氏阳性的，并且已广泛用于生产L-氨基酸。L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸，在动物饲料工业以及人类医学和化妆品工业中获得应用。对于工业应用，L-氨基酸大部分是通过使用棒状杆菌属菌株发酵而产生的
已经进行了许多尝试来改进使用棒状杆菌属菌株生产L-氨基酸的方法。其中之一是重组DNA技术的研究，通过该技术可操纵特定基因以敲低或减弱表达从而生产L-氨基酸。另外，已经进行了这样的研究，即扩增并分析了参与L-氨基酸生物合成的每种基因对L-氨基酸生产的影响，从而修饰生产L-氨基酸的棒状杆菌属菌株。
在通过发酵生产赖氨酸的工业中，生产高浓度的赖氨酸和微生物的改善的赖氨酸生产潜力是重要因素。因此，一直在努力增强微生物的赖氨酸生产潜力并在发酵培养过程中稳定地维持改善的赖氨酸生产潜力。然而，由于各种内外因素对微生物活性的抑制，很难将赖氨酸生产潜力维持到培养后期。
因此，仍然需要开发一种L-赖氨酸生产潜力得到提高并且可以稳定保持的菌株。
发明内容
技术问题
一种实施方式提供了具有增强的细胞色素C活性的L-氨基酸生产微生物。例如，细胞色素C活性的增强可以通过引入细胞色素C编码基因来实现。例如，细胞色素C编码基因可以是外源基因。
另一种实施方式提供了一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括培养L-氨基酸生产微生物的步骤。
又一种实施方式提供了用于在微生物中生产L-氨基酸或改善L-氨基酸生产的组合物，该组合物包含细胞色素C编码基因、携带该基因的重组载体或它们两者。
技术方案
根据本文提供的实施方式，基于对棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)微生物中参与赖氨酸生产的基因的扩增如何影响其赖氨酸生产潜力的研究，提出了一种用于氨基酸生产的菌株修饰技术。通常，提高诸如赖氨酸等氨基酸的生产潜力的策略包括提高赖氨酸等氨基酸的生产收率或增加单位时间内诸如赖氨酸等氨基酸的输出量(生产率)。特别地，赖氨酸等氨基酸生产力可能受到多种因素的影响，包括发酵培养基的组分、发酵培养基的渗透压、搅拌速度、供氧速率等。在培养一段时间后，微生物的赖氨酸生产潜力和细胞活性由于诸如以下问题而稳步降低：发酵液中存在的各种物质和代谢物造成的压力、微生物质量增加导致的氧气消耗、诸如温度和搅拌速度等物理条件。根据本公开的实施方式，提供了一种菌株修饰技术，以克服这些各种因素造成的压力，并使微生物在培养后期保持恒定的目标产物生产活性。
下面，将给出本公开的详细描述。
一种实施方式提供了具有增强的细胞色素C活性的L-氨基酸生产微生物。
如本文所用，术语“L-氨基酸生产微生物”可以指具有L-氨基酸生产潜力的微生物，这种L-氨基酸生产潜力通过增强其中的细胞色素C活性而相比之前有所增加和/或通过增强其中的细胞色素C活性而从无活性产生。如本文所用，术语“微生物”可旨在涵盖单细胞细菌，并且可与“细胞”互换使用。
L-氨基酸可以是L-赖氨酸。
在本文中，细胞色素C活性增强之前的微生物可表述为宿主微生物，以区别于具有通过增强细胞色素C活性而增强或产生的L-氨基酸生产潜力的“L-氨基酸生产微生物”。
在具体的实施方式中，宿主微生物可以是具有L-氨基酸(例如，L-赖氨酸)生产潜力的任何微生物。在具体的实施方式中，宿主微生物可以是这样的微生物，其中L-赖氨酸生产潜力天然存在，或者是通过将突变引入原本缺乏L-赖氨酸生产潜力或L-赖氨酸生产潜力显著差的亲本菌株而产生。
在具体的实施方式中，宿主微生物可以是这样的任何革兰氏阳性细菌，其中L-赖氨酸生产潜力天然存在，或者是通过将突变引入原本缺乏L-赖氨酸生产潜力或L-赖氨酸生产潜力显著差的亲本菌株而产生，例如，宿主微生物可选自由棒状杆菌属(Corynebacterium)微生物和埃希氏菌属(Escherichia)微生物组成的组。棒状杆菌属微生物的实例可包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)，但不限于此。例如，棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。
如本文所用，术语“细胞色素C”可指源自细菌的膜结合单体细胞色素C，其具有15kDa或更小的平均分子量例如约8kDa至约15kDa，和/或长度为90至150个氨基酸、100至150个氨基酸、120至150个氨基酸、90至125个氨基酸、100至125个氨基酸或120至125个氨基酸。在一种实施方式中，细胞色素C可以来源于芽孢杆菌属(Bacillus)微生物并且可以是选自蛋白质的细胞色素C家族中的至少一种，其在还原状态下在550-555nm或550-551nm波长处显示最低能量吸收带(吸光度)。在一种实施方式中，细胞色素C可包含选自由均来自芽孢杆菌属微生物的细胞色素C-551(约551nm处的吸光度)和细胞色素C-550(约550nm处的吸光度)组成的组中至少一种，例如一种、两种或三种蛋白质(细胞色素C后缀的数字表示细胞色素C在其还原状态下显示波长时的波长)。芽孢杆菌属微生物可以是选自由假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等组成的组中的一种或多种。
在具体的实施方式中，细胞色素C(例如选自细胞色素C-551和细胞色素C-550中的至少一种)可以包含由cccA或cccB编码的氨基酸序列。在一种实施方式中，细胞色素C可以是选自由以下组成的组中的至少一种：源自假坚强芽孢杆菌(例如假坚强芽孢杆菌OF4等)和/或枯草芽孢杆菌的细胞色素C-551和源自枯草芽孢杆菌的细胞色素C-550等。
更详细地，细胞色素C(例如，枯草芽孢杆菌衍生的细胞色素C-551)可以包含：含有由cccA编码的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:16)的多肽(例如，源自假坚强芽孢杆菌OF4的BpOF4_13740)、含有由cccB编码的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：27)的多肽(例如，源自假坚强芽孢杆菌OF4的BpOF4_05495)、或它们两者。
除非另有定义，本文所述的细胞色素C被解释为指与SEQ ID NO:16或27的氨基酸序列具有20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、82％或更高、85％或更高、87％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高(例如60％至99.5％、70％至99.5％、80％至99.5％、85％至99.5％、90％至99.5％、91％至99.5％、92％至99.5％、93％至99.5％、94％至99.5％、95％至99.5％、96％至99.5％、97％至99.5％、98％至99.5％或99％至99.5％)的序列同一性的任何蛋白质。
因此，具有落入本文所述的细胞色素C范围内的序列同一性的蛋白质可以是具有以下的蛋白质：
(1)细胞色素C的上述特征中的至少一种，例如，选自(a)细菌来源，(b)平均分子量为15kDa或更低，例如约8kDa至约15kDa，和/或长度为90至150、100至150、120至150、90至125、100至125或120至125个氨基酸残基，(c)膜结合特性，和(d)单体特性，和/或
(2)归因于微生物中活性增强的效应，该微生物与未修饰的微生物相比，(e)L-氨基酸(例如L-赖氨酸)生产潜力增加，和/或(f)糖消耗速率增加，其中所述增加等同于具有SEQ ID NO:16或27的氨基酸序列的那些。
在具体的实施方式中，与未修饰以增强细胞色素活性的相同物种的未修饰微生物相比，具有增强的细胞色素C活性的L-氨基酸产生微生物可具有增加的L-氨基酸生产潜力。
如本文所用，术语“细胞色素C活性的增强”可以指在微生物中使细胞色素C活性与微生物的内在活性或操作前活性相比增强的任何操作，包括将细胞色素C活性引入到微生物中。“引入”可以指在原本缺乏细胞色素C活性的微生物中天然或人工产生细胞色素C活性的作用。术语“未修饰的微生物”可以指其中细胞色素C活性未增强的宿主微生物(例如，未修饰以增强细胞色素C活性的宿主微生物)或尚未经历细胞色素C活性增强的宿主微生物。术语“内在活性”可以指由细胞色素C活性未增强的宿主微生物或由尚未经历细胞色素C活性增强的宿主微生物保持的细胞色素C活性。在此上下文中，术语“未修饰的”可用于与未诱导遗传修饰但保持内在活性的状态相同的含义。
例如，细胞色素C活性的增强可以通过引入外源性细胞色素C或通过增强内在细胞色素C活性来实现。在具体的实施方式中，细胞色素C活性的增强可以通过引入外源细胞色素C来实现。
在具体的实施方式中，微生物中细胞色素C活性的增强可解释为，与未增强细胞色素C活性的未修饰微生物相比，微生物中糖消耗速率的增加。特别地，在具体的实施方式中说明的细胞色素C活性增强的微生物在特定生长期内的生长速率(OD值)和/或L-氨基酸(例如L-赖氨酸)生产收率方面可以类似于未修饰的微生物，但与未修饰的微生物相比，糖消耗速率增加，这表明与未修饰的微生物相比，细胞色素C活性增强的微生物在更短的时间内产生了大量的L-氨基酸，从而显示出改善的L-氨基酸生产力。
在一种实施方式中，细胞色素C活性的增强可以通过在基因(mRNA)水平和/或蛋白质水平增加细胞色素C的表达和/或增加细胞色素C蛋白本身的活性来实现，但不限于此。
在一种实施方式中，细胞色素C活性的增强可以通过引入编码细胞色素C的基因来实现。因此，细胞色素C编码基因的引入可增加微生物保持的L-氨基酸生产潜力或产生微生物缺乏的L-氨基酸生产潜力。
在一种实施方式中，细胞色素C或其编码基因可以源自宿主微生物(同源)或不同的微生物(外源)。在具体的实施方式中，细胞色素C活性的增强可以通过将编码细胞色素C的外源基因引入宿主微生物中来进行。细胞色素C如前文所述，例如可以是源自假坚强芽孢杆菌OF4的细胞色素C(细胞色素C-551)，如SEQ ID NO:16(例如由cccA(BpOF4_13740)编码)的氨基酸序列或SEQ ID NO:27(例如由cccB(BpOF4_05495)编码)的氨基酸序列所示。
在一种实施方式中，编码细胞色素C的基因或其中引入了该基因的L-氨基酸生产微生物可以包含编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多核苷酸、编码SEQ ID NO:27的氨基酸序列的多核苷酸、或其组合。在一种实施方式中，L-氨基酸生产微生物可以是包含编码SEQID NO:16的氨基酸序列的多核苷酸、编码SEQ ID NO：27的氨基酸序列的多核苷酸、或其组合的棒状杆菌属微生物，例如谷氨酸棒状杆菌。例如，L-氨基酸生产微生物可以是以保藏号KCCM12640P保藏的微生物。
对于本文中所用的多核苷酸(可与“基因”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”互换使用)，措辞“包含特定核酸或氨基酸序列”，“由特定核酸或氨基酸序列组成”和“表示为特定的核酸或氨基酸序列”是可互换的表述，其等同含义是多核苷酸或多肽基本上包含特定核酸或氨基酸序列。进一步地，这些措辞可被解释为“包含基本上等同的序列”(或“不排除引入以下突变”)，其由以下突变产生，即特定核酸或氨基酸序列在多核苷酸或多肽保持其原始功能和/或期望功能这样的范围内的突变(缺失、取代、修饰和/或添加)。
在一种实施方式中，本文提供的核酸序列或氨基酸序列可包含通过常规突变方法(例如直接进化和/或定点诱变)获得的其突变体，只要该突变体保持该序列的原始功能或期望功能即可。在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸或氨基酸序列或由特定核酸或氨基酸序列组成”的表述可以指基本上包含以下或基本上由以下组成的多核苷酸或多肽：(i)特定核酸或氨基酸序列，或(ii)具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高(例如60％至99.5％、70％至99.5％、80％至99.5％、85％至99.5％、90％至99.5％、91％至99.5％、92％至99.5％、93％至99.5％、94％至99.5％、95％至99.5％、96％至99.5％、97％至99.5％、98％至99.5％或99％至99.5％)的序列同一性的核酸或氨基酸序列，其中该多核苷酸或多肽保持其原始功能和/或期望功能。如本文所用，术语“原始功能”是指细胞色素C功能本身(对于氨基酸序列来说)或编码具有指细胞色素C功能的蛋白的功能(对于核酸序列来说)，术语“期望功能”是指增加微生物中L-氨基酸(例如L-赖氨酸)生产潜力的功能或赋予微生物L-氨基酸(例如L-赖氨酸)生产潜力的功能。
对于本文所述的核苷酸序列，由于密码子的简并性或考虑到要表达蛋白的微生物优选的密码子，可以在编码区进行各种修饰，只要所述修饰不改变编码区表达的蛋白质(细胞色素C)的氨基酸序列和/或功能即可。
如本文所用，术语“同一性”可指给定核酸序列或氨基酸序列之间的同一性程度，其可以百分比(％)表示。对于核酸序列之间的同一性，可以使用例如算法BLAST(参见Karlin and Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或Pearson的FASTA(参见Methods Enzymol.,183,63(1990))来确定。BLASTN和BLASTX程序是在BLAST算法的基础上开发的(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在一种实施方式中，包含本文提供的特定核酸序列的多核苷酸可被解释为包含含有与特定核酸序列互补的核酸序列的多核苷酸以及含有特定核酸序列或与其基本等同的核酸序列的多核苷酸。具体而言，互补多核苷酸可以根据目的在适当可调的Tm值下杂交，例如在55℃、60℃、63℃或65℃的Tm下杂交，并且可以在以下条件下进行分析：这些条件在已知文献中有详细描述。例如，可以提及如下的条件：在该条件下，如果基因的同源性为60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高，则可发生杂交，但是如果同源性低于上述值，或进行DNA杂交(southern hybridization)的典型条件，则不能发生杂交，在所述进行DNA杂交的典型条件下，进行一次或多次，详细来说，两次或三次洗涤，所述洗涤在如下的条件下进行：60℃，1xSSC(盐水-柠檬酸钠缓冲液)和0.1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)；60℃，0.1xSSC，和0.1％SDS；或68℃，0.1x SSC和0.1％SDS，但不限于此。对于杂交，需要两个多核苷酸具有彼此互补的序列。根据杂交严格性，碱基之间可能允许有一个或多个错配。术语“互补”可用于描述可以相互匹配的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。多核苷酸的适当杂交严格性可能会有所不同，这取决于包括多核苷酸长度和互补性在内的各种因素，并且是本领域众所周知的(参见Sambrook et al.,9.50-9.51,11.7-11.8)。
细胞色素C活性的增强可以通过以下策略在细胞色素C基因(mRNA)水平上实现：
1)增加编码细胞色素C的多核苷酸的拷贝数，
2)修饰表达调控元件(序列)以增加多核苷酸的表达，或
3)1)和2)两者，但不限于此。
增加多核苷酸拷贝数的策略1)可以通过将多核苷酸通过载体引入宿主微生物或将多核苷酸整合到宿主微生物的染色体中来进行，但不限于此。举例来说，增加的拷贝数可以通过将编码外源细胞色素C的多核苷酸或针对该多核苷酸进行密码子优化的变体多核苷酸引入宿主微生物中来实现。本公开可以使用任何外源多核苷酸，对其来源或序列没有限制，只要由其编码的多肽表现出与细胞色素C相同或相似的活性即可。对于引入，本领域技术人员可以适当地采用和/或修改本领域已知的转化方法。多核苷酸一旦被引入宿主微生物中，则表达以产生外源细胞色素C。
修饰表达调控序列以促进多核苷酸表达的策略2)可以应用于内源和外源多核苷酸两者。为了增强表达调控序列的表达调控活性，可以通过核苷酸的缺失、添加、保守或非保守取代或其组合来进行修饰。可替代地，表达调控序列可以被更有效的取代基替代，但不限于此。表达控制序列可以是选自由启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和控制转录和/或翻译终止的序列组成的组中的至少一种。在一种实施方式中，有效的外源启动子而不是内源启动子可操作地连接在多核苷酸表达单元的上游。有效启动子的实例包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子和aceA或aceB启动子。更具体地，有效启动子可以是lysCP1启动子(WO2009/096689)或CJ7启动子(WO2006/065095)，两者均来自棒状杆菌属，但不限于此。
在下文中，将详细描述编码细胞色素C的基因通过载体引入宿主微生物或整合到微生物染色体中的情况。本文所述的基因引入可以通过以下进行：i)将外源基因(源自与宿主微生物异源和/或同源但不同于宿主微生物的物种)通过携带与其可操作连接的基因的重组载体引入宿主细胞，或ii)将外源基因整合(例如，随机整合)到宿主细胞的染色体(基因组)中。在ii)整合到宿主细胞的染色体(基因组)的情况下，可以在与宿主细胞生长无关的位点(例如，非转录间隔区(NTS)等)和/或可以增加随机整合的效率的位点(例如，反转录转座子等)进行整合，但不限于此。
对于基因或载体的整合，本领域技术人员可以适当地采用本领域已知的转化方法。如本文所用，术语“转化”可以指这样的作用，通过该作用将携带编码靶蛋白(细胞色素C)的多核苷酸的载体引入宿主微生物以在宿主细胞中表达由该多核苷酸编码的蛋白。所引入的多核苷酸可以位于宿主微生物的染色体内部或外部，只要该多核苷酸在宿主微生物中表达即可。另外，该多核苷酸包含编码靶蛋白的DNA和/或RNA。可以采用任何递送手段，只要该递送手段能够在宿主微生物中引入和表达多核苷酸。例如，多核苷酸可以采取包含自主表达必需的所有元件的表达盒的形式，以便将多核苷酸引入宿主细胞中。表达盒可常规地包含可操作地连接至多核苷酸的表达调控元件，例如启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号。表达盒可以是可自身复制的表达载体。另外，多核苷酸本身可以被引入宿主细胞中并且可以可操作地连接至在宿主细胞中表达所必需的序列。如本文所用，术语“可操作地连接”指表达调控元件(例如启动子)和多核苷酸之间的功能性连接，使得该表达调控元件可以控制(例如起始)多核苷酸的转录。可以使用本领域已知的遗传重组技术来实现可操作的连接，所述遗传重组技术例如典型的位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。
可以采用任何引入方法，只要该方法允许将多核苷酸转化到宿主微生物中即可。可根据宿主微生物适当地选择本领域已知的转化技术。本领域已知的转化技术的实例可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)介导的摄取、DEAE-葡聚糖介导的递送、阳离子脂质体法、脂质体转染和乙酸锂-DMSO法，但不限于此。
本领域技术人员可以选择合适的方法将基因整合到细胞的基因组(染色体)中。例如，可以使用RNA引导的核酸内切酶系统来完成整合，但不限于此，所述RNA引导的核酸内切酶系统例如选自由以下组成的组中的至少一种：(a)RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9蛋白等)、其编码基因或携带该基因的载体；和(b)向导RNA(即单链向导RNA(sgRNA)等)、其编码DNA或携带该DNA的载体(例如RNA引导的核酸内切酶蛋白和向导RNA的混合物)、复合物(例如核糖核蛋白(RNP))和携带重组载体(例如RNA引导的核酸内切酶编码基因和编码向导RNA的DNA等)的载体。
根据另一种实施方式提供了细胞色素C编码基因、携带(包含)该基因的重组载体和/或锚定(包含)该重组载体的细胞在增强微生物中L-氨基酸生产潜力和/或赋予微生物的L-氨基酸生产潜力和/或制备具有L-氨基酸生产潜力的微生物中的用途。
另一种实施方式提供用于生产L-氨基酸的组合物，该组合物包含编码细胞色素C的基因、携带该基因的重组载体或锚定该重组载体的细胞。
另一种实施方式提供用于生产L-氨基酸的组合物，该组合物包含编码细胞色素C的基因、携带该基因的重组载体或其组合。用于生产L-氨基酸的组合物可用于允许微生物生产L-氨基酸、增加L-氨基酸生产潜力和/或被赋予L-氨基酸生产潜力。
另一种实施方式提供了一种用于增强微生物中L-氨基酸生产潜力或将L-氨基酸生产潜力赋予微生物的方法，该方法包括将细胞色素C编码基因或携带该基因的重组载体引入(转化)到微生物中的步骤。
细胞色素C、编码细胞色素C的基因和微生物如上所述。
如本文所用，术语“载体”可以指含有编码靶蛋白的核苷酸序列的DNA构建体，该核苷酸序列可操作地连接至能够影响靶蛋白在合适宿主中表达的合适控制序列。这样的控制序列包含引发转录的启动子，任选的控制这样的转录的操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和/或控制转录和/或翻译终止的序列。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以独立于宿主基因组复制并用于表达靶蛋白，或者可以整合到其自身的基因组中。
本文中可以使用任何载体，只要该载体在宿主细胞中复制，则不对其进行特别限制。所述载体可以选自常用的载体。这样的常用的载体的实例可以包括可以是天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，噬菌体载体或粘粒载体以pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A为例。质粒载体可以衍生自pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系和pET系。载体的实例可以包括但不限于pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC。
本文可用的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸整合到宿主细胞的染色体中的载体。可以使用本领域已知的任何方法将多核苷酸整合到宿主细胞的染色体中，所述方法例如同源重组，但不限于此。载体可以进一步携带选择标记以用于确定目的基因是否被整合到染色体中。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即确定多肽的整合，并且可以选自赋予选择性表型的基因，所述选择性表型例如耐药性、营养缺陷型、细胞毒性耐药性和表达表面蛋白。在将选择剂应用于细胞的情况下，只有能够表达选择标记的细胞可以存活或表达独特的表型，从而可以选择转化的细胞。
另一种实施方式提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养生产L-氨基酸的微生物的步骤。该方法可以进一步包括在培养步骤之后，从培养的微生物、培养基或这两者中回收L-氨基酸的步骤。
在该方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养方法、连续培养方法、分批补料培养方法等进行，但不特别限制于此。在此，可以将培养条件使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)维持在最佳pH(例如pH为5至9，特别地pH为6至8，最特别地pH为6.8)，或通过向细胞培养物中供应氧气或含氧气体混合物将培养条件维持在需氧条件，但不特别限制于此。培养温度可以维持在20至45℃，特别是25至40℃，并且细胞可以培养约10至160小时，但不限于此。通过培养产生的L-氨基酸(即L-赖氨酸)可以输出到培养基中或保留在细胞内。
可用于培养的培养基可以包含：选自糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)中的至少一种作为碳源；选自含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉和尿素)、无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)中的至少一种作为氮源；选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐中的至少一种作为磷源；和选自其他必需的促进生长的物质，如金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和/或维生素中的至少一种，但不限于此。
在回收L-氨基酸(即L-赖氨酸)的步骤中，可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法从培养基、培养物或微生物中收集期望氨基酸。举例来说，可以使用选自离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC中的至少一种方法进行回收步骤，并且可以使用本领域已知的任何合适的方法从培养基或微生物中回收期望的丙烯酸。该方法可以进一步包括在回收步骤之前、同时或之后的纯化步骤。
有益效果
外源基因的引入使赖氨酸生产菌株的赖氨酸生产活性增加，并将增加的赖氨酸生产活性保持到生长后期，从而提高赖氨酸生产潜力。
附图说明
图1是解释一种实施方式中制备的文库载体的核酸序列的分析结果的示意图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开，但是这些实施例仅用于说明性目的，并不旨在限制本公开的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本公开的精神的情况下修改以下描述的实施例。
实施例1：基因递送载体文库的构建
为了研究用于提高谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸生产潜力的基因，构建了源自嗜极细菌(extremophile bacteria)的基因组DNA文库，这些细菌适应各种极端环境并在各种极端环境中生存。作为可在高渗透压、高温、低氧及不同氢离子浓度的极端条件下生长的嗜极细菌，使用了四种代表性微生物，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)(ATCC 49337)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(KCTC 1030)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)(KCTC 3112)和假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4(ATCCBAA2126)。
首先，使用QIAamp DNA Micro试剂盒(QIAGEN)从四种菌株中提取基因组DNA。如此获得的基因组DNA用限制性酶Sau3A1(NEB)在37℃下消化10分钟，然后在65℃下消化30分钟，得到不完整的基因片段，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。仅切除5至7kb条带处的凝胶部分。使用GeneAll Expin GEL SV试剂盒(首尔，韩国)从凝胶中洗脱用于插入的基因片段。
将由此获得的基因片段与限制性酶BamHI-HF(NEB)在37℃下孵育1小时，然后与CIP(NEB)在37℃下孵育30分钟，然后连接到pECCG117载体(韩国专利号0057684)。将所得重组载体转化到大肠杆菌DH5α中，然后将大肠杆菌DH5α涂在含有卡那霉素(25mg/l)的LB平板上。使用下表1中所示的SEQ ID NO：1和2的引物，通过PCR扩增来自单菌落的基因。PCR首先在95℃下变性10分钟，然后95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，以及72℃延伸4分钟，进行30个循环，最后在72℃下延伸10分钟。
[表1]
描述 序列(5'->3') SEQ ID NO:
F引物 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 1
R引物 CAA TTA ACC CTC ACT AAA 2
PCR产物的检测证实，大小为3至5kb的嗜极细菌来源的基因组DNA片段以99％或更高的比率成功插入到pECCG117载体中。每种菌株获得多达10,000个转化体菌落。使用质粒制备试剂盒(QIAGEN)从转化体中提取质粒。文库载体被称为P117-Lib.Bat(源自萎缩芽孢杆菌)，P117-Lib.Bli(源自地衣芽孢杆菌)，P117-Lib.Lfe(源自发酵乳杆菌)，和P117-Lib.Bps(源自假坚强芽孢杆菌OF4)。
实施例2：其中引入了载体文库的菌株的产生和筛选
通过电脉冲方法(Van der Rest等人，Appl.Microbiol.Biotecnol.52:541-545,1999)将实施例1中构建的四个文库载体(P117-Lib.Bat、P117-Lib.Bli、P117-Lib.Lfe和P117-Lib.Bps)转化到赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国专利号10-0159812)中并将细菌涂布在含有卡那霉素(25mg/l)的复合平板培养基上。最后，每个文库载体获得了大约5,000个菌落，并分别命名为LYS_Lib.Bat、LYS_Lib.Bli、LYS_Lib.Lfe和LYS_Lib.Bps。用携带没有gDNA来源的基因片段的pECCG117载体转化的KCCM11016P菌株作为针对文库菌株的对照，并命名为LYS_117对照。
所用复合平板培养基的组成如下：
<复合平板培养基(pH 7.0)>
葡萄糖10克、蛋白胨10克、牛肉提取物5克、酵母提取物5克、脑心浸液18.5克、氯化钠2.5克、尿素2克、山梨糖醇91克、琼脂20克(每升蒸馏水)
使用菌落挑选仪(SINGER,PIXL)将获得的四个基于KCCM11016P的文库菌株分别接种到含有400μl筛选培养基的96孔深孔圆底板(Bioneer)中，并在32℃下平板振荡培养箱(TAITEC)中以12,000rpm的速度振荡孵育15小时。
种子培养基具有以下组成：
<筛选培养基(pH 7.0)>
葡萄糖45g、甜菜来源的糖蜜10g、大豆浸液10g、(NH4)2SO4 24g、MgSO4·7H2O 0.6g、KH2PO4 0.55g、尿素5.5g、生物素0.9mg、盐酸硫胺素4.5mg、泛酸钙4.5mg、烟酰胺30mg、MnSO4·5H2O 9mg、ZnSO4·5H2O 0.45mg、CuSO4·5H2O 0.45mg、FeSO4·5H2O 9mg、卡那霉素25mg(每升蒸馏水)
在培养过程中，借助酶标仪(BioTek)监测细胞的生长情况。分别使用糖分析仪(YSI)和HPLC仪(Shimadzu)测量培养基中葡萄糖和产生的赖氨酸的浓度。
通过实验，最终选择了与对照相比表现出优异生长和高葡萄糖消耗速率的三种菌株(表2)。发现三个选择的菌株将LYS_Lib.Bps文库载体锚定在此。这些菌株尽管在收率和OD值方面与LYS_117对照相似，但发现这些菌株具有优异的生产力，因为它们在采样点部分的每小时葡萄糖消耗速率(g/小时)，相对于LYS_117对照的100％，增加了118％。
[表2]
实施例3：gDNA文库的碱基测序
为了鉴定引入实施例2中选择的三个菌落LYS_Lib.Bps#257、#881和#4213的基因序列，使用实施例1的表1中显示的SEQ ID NO：1和2的引物通过PCT扩增该菌落所含的gDNA文库基因片段。PCR在与实施例1相同的条件下进行。使用GeneAll Expin GEL SV试剂盒(首尔，韩国)分离PCR片段并分析碱基序列。基于分析结果，通过BLAST获得基因信息(NCBI参考序列NC_013791.2)。
分析结果示于图1。如图1所示，碱基测序结果表明，菌落LYS_Lib.Bps#257中存在4794bp基因片段，菌落881中存在3985bp基因片段，菌落4213中存在4483bp基因片段。发现这三个菌落具有BpOF4_13735和BpOF4_13740作为彼此共同的完整基因ORF。随后，对这两个基因的影响进行了额外的实验。
实施例4：其中引入了有单个基因的载体和菌株的构建
为了研究实施例3中鉴定的两种单个基因的影响，构建了基因组插入载体。为了作为用于基因插入的基础载体使用，首先靶向作为转座酶之一的Ncgl2284构建了pDZ_Δ2284载体。
具体来说，使用ATCC13032 gDNA作为PCR的DNA模板。参照NCBI碱基序列(NC_003450.3)制备引物。在SEQ ID NO:3和4的引物存在下，PCR从95℃变性10分钟开始；95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃下延伸4分钟，进行30个循环；然后在72℃下最终延伸10分钟，得到约900bp长的5'DNA片段。类似地，在与前述相同的条件下使用SEQ ID NO：5和6的引物进行PCR以扩增3'DNA片段。使用GeneAll Expin GEL SV试剂盒(首尔，韩国)纯化这两种DNA扩增子，并用限制性内切酶XbaI(NEB)进行消化。使用无缝克隆试剂盒(infusioncloning kit)，将消化物连接到已在65℃下热处理20分钟的pDZ(韩国专利号2009-0094433)。将由此形成的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，然后将大肠杆菌DH5α涂布在含有卡那霉素(25mg/l)的LB平板培养基上。将插入pDZ载体中的基因进行碱基测序，最终制备pDZ_Δ2284载体。
通过用限制性酶NdeI和CIP(NEB)消化基础载体pDZ_Δ2284，在65℃下热处理消化的载体20分钟，纯化热处理过的载体，然后借助无缝克隆试剂盒，将启动子和每个基因DNA片段连接到载体中，构建单个基因的额外富集(表达)载体。作为额外基因表达的启动子，使用了SEQ ID NO：13的gapA基因启动子。为了获得启动子，使用SEQ ID NO：7和8的引物，以ATCC13032gDNA(NC_003450.3)作为模板进行PCR。在pfu聚合酶存在下，PCR从95℃变性10分钟开始；95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环；然后在72℃下最终延伸10分钟。两个基因BpOF4_13735和BPOF4_13740的DNA片段以与启动子相同的方式从假坚强芽孢杆菌OF4gDNA中扩增，不同之处在于，对于BpOF4_13735(SEQ ID NO：14)使用SEQID NO：9和10的引物，对于BpOF4_13740(SEQ ID NO：15)使用SEQ ID NO：11和12的引物。由此获得的DNA片段使用GeneAll Expin GEL SV试剂盒(首尔，韩国)进行纯化，然后连接到pDZ_Δ2284，最终提供两种不同的载体：pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13735和pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740。
使用电脉冲法，将两个载体构建体分别转化入赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国专利号10-0159812)中。二次DNA交叉丰富了菌株中的单个基因。由此构建的两个最终菌株分别命名为KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13735和KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740。
本文所用的BpOF4基因的引物、启动子、核酸序列和由该基因编码的氨基酸序列总结于下表3中：
[表3]
实施例5：锚定单个基因的菌株的赖氨酸生产潜力的测定
以下列方式培养实施例4中制备的两个菌株以测量OD值、赖氨酸生产收率和糖消耗速率(g/小时)。首先，将每个菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在30℃下以150rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的种子培养物接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以150rpm振荡培养40小时。种子培养基和生产培养基的组成如下，培养结果见下表4。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素10μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2000μg(每升蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖45g、甜菜来源的糖蜜10g、大豆浸渍液10g、(NH4)2SO4 24g、MgSO4·7H2O0.6g、KH2PO4 0.55g、尿素5.5g、CaCO3 30g、生物素0.9mg、盐酸硫胺素4.5mg、泛酸钙4.5mg、烟酰胺30mg、MnSO4·5H2O 9mg、ZnSO4·5H2O0.45mg、CuSO4·5H2O 0.45mg、FeSO4·5H2O 9mg、卡那霉素25mg(每升蒸馏水)
[表4]
与亲本菌株KCCM11016P_Δ2284相比，作为从gDNA文库中产生的两个基因之一的BpOF4_13735过表达的菌株在赖氨酸生产收率和糖消耗速率方面没有表现出显著改善的效果。相比之下，KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740菌株虽然在最终OD和收率方面与亲本菌株KCCM11016P_Δ2284相似，但发现其在中间培养部分(17至24小时)，每小时糖消耗速率与亲本菌株相比增加了31％。
最后，发现实施例2中揭示的菌落LYS_Lib.Bps#257、#881和#4213的作用归因于BpOF4_13740的增强。
实施例6：BpOF4_13740增强菌株中赖氨酸生产潜力的增强
为了对实施例5中证实的BpOF4_13740基因的作用进行二次验证，在用不同的启动子进行增强后测定BpOF4_13740基因。并且还测定BpOF4_05495基因的作用，并通过NCBIBLAST分析进一步证实了其作为相同的功能蛋白。
为此，以与实施例3中构建的载体相同的方式额外构建基因表达载体。
用SEQ ID NO：17和18的引物，以ATCC13032的gDNA作为模板，通过PCR扩增sigB启动子。使用SEQ ID NO:19和12的引物，对假坚强芽孢杆菌OF4 gDNA的模板进行PCR，以扩增BpOF4_13740基因。将这两个基因片段与pDZ_Δ2284连接，构建pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740载体。
BpOF4_05495基因的增强也以相同的方式实现，以构建pDZ_Δ2284::PsigBBpOF4_05495和pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_05495载体。使用SEQ ID NO：20和21的引物以及SEQ ID NO：22和21的引物获得BpOF4_05495基因片段。还检测了同时富集这两种基因时获得的效果。在这方面，另外合成了设计为含有核糖体结合序列(RBS)的SEQ ID NO:23和24的引物，以构建pDZ_Δ 2284::PsigB BpOF4_13740_05495和pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495。
通过电脉冲方法，将五种额外的载体构建体(pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740载体，pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_05495载体，pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_05495载体，pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495载体，和pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495载体)分别转化到赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国专利号10-0159812)中，并进行二次DNA交叉，以制备其中具有增强的单个基因的菌株。
将由此得到的五种菌株分别命名KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740，KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_05495，KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_05495，KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495，和KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495。
本文所用的BpOF4_05495的引物、启动子、核酸序列和由该基因编码的氨基酸序列总结于下表5中：
[表5]
在培养瓶中，以与实施例5相同的条件下评估五种菌株，即KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740、KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_05495、KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_05495、KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495和KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495，结果在下表6中给出。
[表6]
与对照KCCM11016P_Δ2284相比，在sigB启动子和gapA启动子控制下，BpOF4_13740基因的表达导致每小时糖消耗速率分别增加7.1％和42.1％。此外，当在sigB和gapA启动子的控制下额外引入编码类似蛋白质的BpOF4_05495基因时，糖消耗速率分别增加了20.2％和36.6％。这两个结果表明糖消耗速率(g/小时)随着基因在启动子控制下的增强而增加。此外，观察到糖消耗速率在基因BpOF4_13740和BpOF4_05495同时表达时达到峰值。具体而言，与对照KCCM11016P_Δ2284相比，菌株KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495每小时的糖消耗速率增加了45.9％。
具有增强的赖氨酸生产潜力的菌株KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495(称为谷氨酸棒状杆菌CM03-885)于2019年12月13日保藏在位于韩国首尔西大门区弘济洞的韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM 12640P。
实施例7：BpOF4_13740_05495-增强菌株的赖氨酸生产潜力测定
用实施例6中选择的基因分别增强均产生L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)和KCCM11347P(韩国专利号10-0073610)。为此，以与实施例6中相同的方式引入基因。最后，将三种载体pDZ_Δ2284，pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495和pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495分别转化到两种菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P和KCCM11347P中，以制备总共六种菌株KCCM10770P_Δ2284、KCCM10770P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495、KCCM10770P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495、KCCM11347P_Δ2284、KCCM11347P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495和KCCM11347P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495。
将如此获得的基因增强菌株以与实施例5相同的方式培养并测量OD、赖氨酸生产收率和相对的每小时糖消耗速率(当KCCM10770P_Δ2284和KCCM11347P_Δ2284每小时糖消耗速率设置为100％时)，结果在下表7中给出。
[表7]
如表7所示，虽然在OD、FN赖氨酸浓度和赖氨酸生产收率方面与对照相似，但本实施例中制备的基因增强菌株由于提高了糖消耗速率，因此发酵时间更短。
实施例8：引入BpOF4_13740_05495的CJ3P菌株的制备及其赖氨酸生产潜力的测定
检测是否不同的谷氨酸棒状杆菌变体表现出与前文相同的生产L-赖氨酸的效果。在这方面，将通过引入三个突变[pyc(P458S)、hom(V59A)和lysC(T311I)]到野生型中而具有L-赖氨酸生产潜力的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)以与实施例7相同的方式用BpOF4_13740_05495增强。由此获得的增强菌株分别命名为CJ3_Δ2284、CJ3_Δ2284::PsigB PpOF4_13740_05495和CJ3_Δ22apJ3 BpOF4_13740_05495。将对照CJ3P菌株(未用BpOF4_13740_05495增强)和三种制备的菌株以与实施例5相同的方式培养并测量OD、赖氨酸生产收率和相对的每小时糖消耗速率(当每小时糖消耗速率在KCCM10770P_Δ2284和KCCM11347P_Δ2284均设为100％)，结果在下表8中给出：
[表8]
如表8所示，发现虽然在OD、FN赖氨酸浓度和赖氨酸产收率方面与对照相似，但BpOF4_13740_05495增强菌株每小时的糖消耗速率增加了60％或更多。
根据以上描述，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式来体现。在这方面，应当理解，上述实施方式在所有方面都是说明性的，而非限制性的。本申请的范围应被解释为在本申请的范围之内，所有改变或修改均源自所附权利要求书的含义和范围以及其等同物而非具体实施方式。
(中文译文)
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约收件人：CJ第一制糖株式会社
韩国首尔市中区东湖路330号
CJ第一制糖中心
(邮编)100-400
上述翻译文本与原文没有相违之处

Claims (8)

1.一种具有增强的细胞色素C活性的L-氨基酸生产微生物，其中，所述细胞色素C是来源于假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4的细胞色素C-551，其中，所述细胞色素C-551包含由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的多肽、由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的多肽或其两者，并且
其中，所述L-氨基酸生产微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
2.根据权利要求1所述的L-氨基酸生产微生物，其中，所述由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的多肽由cccA编码，并且
所述由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的多肽由cccB编码。
3.根据权利要求1所述的L-氨基酸生产微生物，其与细胞色素C活性没有增强的同源微生物相比，具有增加的糖消耗速率。
4.一种用于生产L-氨基酸的方法，所述方法包括以下步骤：
在培养基中培养权利要求1至3中任一项所述的L-氨基酸生产微生物；和
从培养的微生物、培养基或其两者中回收L-氨基酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
6.一种组合物用于生产L-氨基酸的用途，所述组合物包含：
编码细胞色素C-551的基因，其中，所述细胞色素C-551包含由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的多肽、由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的多肽或其两者，并且其中，所述细胞色素C-551来源于假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4，
携带所述基因的重组载体，并且
包含所述基因或所述重组载体的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的多肽由cccA编码，并且
所述由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的多肽由cccB编码。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其中，所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
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