CN103998057A - 利用CotH的毛霉菌病的免疫疗法和诊断 - Google Patents

Abstract

本发明提供了毛霉菌CotH多肽和编码核酸分子。该毛霉菌CotH多肽和编码核酸能够有利地用于诊断、治疗或预防真菌病症，尤其是毛霉菌病。

Description

利用CotH的毛霉菌病的免疫疗法和诊断

本专利申请主张2011年9月15日提交的美国临时专利申请序列号No.61/535257的优先权权益，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。

本发明是在NIAID授予的NIH基金号011671和013377的政府支持下做出的。政府对本发明具有一定的权利。

背景技术

本发明总体上涉及用于检测、治疗和预防患者中传染性疾病的组合物和方法，并且更具体地，涉及靶向引起毛霉菌病的真菌所特有的特异性蛋白或核酸的组合物和方法。

在250,000种已知的真菌种中，约有180种被认为会在人和动物中引起疾病(霉菌病)。一些真菌能够在所有暴露的受试者中导致感染，例如，全身性病原体荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)和粗球孢子菌(Coccidioides immitis)。其他真菌，如念珠菌种(Candida)、曲霉菌种(Asergillus)和接合菌(Zygomycetes)是机会致病病原体，其通常仅在受损宿主中引起疾病。毛霉菌目接合菌类的真菌能够引起毛霉菌病，它是人中潜在的致命性真菌感染。属于毛霉菌目的真菌分为至少六个科，它们全部都能引起毛霉菌病(Ibrahim等人,Zygomycosis，第241-251页，W.E.Dismukes,P.G.Pappas和J.D.Sobel主编的ClinicalMycology,Oxford University Press,New York(2003)；Kwon-Chung,K.J.和J.E.Bennett,Mucormycosis,第524-559页,Medical Mycology,Lea&Febiger,Philadelphia(1992)和Ribes等人，Zygomycetes in Human Disease,Clin Microbiol Rev13:236-301(2000))。然而，到目前为止属于毛霉菌科的真菌，并且尤其是米根霉种(the species Rhizopus oryzae)(少根根霉(Rhizopus arrhizus))是最常见的感染原因(Ribes等人，如上)。还报道了由于小克银汉霉科(Cunninghamellaceae family)中小克银汉霉种(Cunninghamella spp.)的感染所引起的毛霉菌病情况的增加(Cohen-Abbo等人，Clinical Infectious Diseases17:173-77(1993)；Kontoyianis等人，Clinical Infectious Diseases18:925-28(1994)；Kwon-Chung等人，American Journal of Clinical Pathology64:544-48(1975)和Ventura等人，Cancer58:1534-36(1986))。毛霉菌目的其余四个科是不太常见的疾病病因(Bearer等人，Journal of Clinical Microbiology32:1823-24(1994)；Kamalam和Thambiah，Sabouraudia18:19-20(1980)；Kemna等人，Journal of Clinical Microbiology32:843-45(1994)；Lye等人，Pathology28:364-65(1996)和Ribes等人(如上))。

毛霉菌病试剂几乎同等地影响免疫力低下的宿主(Spellberg等人，Clin.Microbiol.Rev.18:556-69(2005))。毛霉菌病的主要风险因素包括表现为酮症酸中毒的不受控制的糖尿病(被称为糖尿病酮症酸中毒(DKA))、其他形式的代谢性酸中毒、使用皮质类固醇的治疗法、器官或骨髓移植、中性白细胞减少、创伤和灼伤、恶性血液病症和接受血液透析的受试者中的去铁胺螯合疗法。

最近的报道显示，与过去二十年相比，所报道的毛霉菌病的病例数目显著增加(Gleissner等人，Leuk.Lymphoma45(7):1351-60(2004))。在主要的移植中心，毛霉菌病发病率的上升也已向人们提出警告。例如，在弗雷德哈钦森癌症中心(Fred Hutchinson Cancer Center)，Marr等人已描述了从1985-1989至1995-1999病例数目翻了超过一番(Marr等人，Clin.Infect.Dis.34(7):909-17(2002))。类似地，Kontoyiannis等人已描述了在相似的时间段内移植受试者中毛霉菌病的发病率翻了超过一番(Kontoyiannis等人，Clin.Infect.Dis.30(6):851-6(2000))。考虑到美国老龄化群体中糖尿病、癌症和器官移植发病率的提高，预期在可预见的将来毛霉菌病发病率将持续不断升高。

因此，仍需要能够降低毛霉菌病病理学的风险并提供无副作用的有效疗法的化合物和方法。本发明满足了这种需要并且也提供了相关优势。

发明概述

根据本发明，提供了毛霉菌CotH多肽和编码核酸分子。毛霉菌CotH多肽和编码核酸能够有利地用于诊断、治疗或预防真菌病症，尤其是毛霉菌病。此外，毛霉菌CotH多肽和编码核酸可用于产生或筛选能够改变毛霉菌CotH活性或表达的药剂，该药剂能够进一步用于治疗或预防真菌病症。

本发明还提供了含有毛霉菌CotH核酸的载体、含有这些载体的宿主细胞、毛霉菌CotH反义核酸和相关组合物。本发明另外还提供了可用于杂交至或扩增毛霉菌CotH核酸的毛霉菌CotH寡核苷酸。还提供了抗毛霉菌CotH的特异性抗体。还提供了含有毛霉菌CotH核酸或毛霉菌CotH特异性抗体的试剂盒。这些试剂盒和试剂可用于诊断由毛霉菌目生物引起的真菌感染。还提供了药物和疫苗组合物。

附图说明

图1示出了预测为细胞表面蛋白的四个开放阅读框(ORF)的远端免疫印迹(FAR-western blot)。

图2示出了GRP78结合至米根霉(R.oryzae)的幼殖体，但不能结合至孢子。

图3示出了预测作为GRP78配体的四个糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的表达。

图4A和图4B示出了与内皮细胞一起培育的米根霉(R.oryzae)幼殖体中CotH基因的表达。

图5示出了4个假定的GPI锚定蛋白彼此之间的同源性以及CotH3中预测的N-和O-糖基化位点的个数。

图6A示出了米根霉(R.oryzae)粘附至人脐内皮细胞但不能粘附至塑料制品的能力。此外，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不粘附至内皮细胞。图6B示出了米根霉(R.oryzae)CotH2和CotH3使得酿酒酵母(S.cerevisiae)能够结合表达GRP78的内皮细胞。

图7示出了CotH3在多个毛霉菌中是保守的，所述毛霉菌包括米根霉(R.oryzae)99-880、米根霉(R.oryzae)99-892、毛霉属菌种(Mucorsp.)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholetiae)和小孢根霉(R.microsporus)。

图8A和图8B示出了表达CotH2或CotH3的酿酒酵母(S.cerevisiae)粘附至并侵袭内皮细胞或过表达GRP78的CHO细胞，但不能粘附至并侵袭CHO亲代细胞。

图9示出了来自米根霉(R.oryzae)的CotH1的氨基酸序列(SEQ IDNO.1)和核酸编码序列(SEQ ID NO.2)。

图10示出了来自米根霉(R.oryzae)的CotH2的氨基酸序列(SEQID NO.3)和核酸编码序列(SEQ ID NO.4)。

图11示出了来自米根霉(R.oryzae)的CotH3的氨基酸序列(SEQID NO.5)和核酸编码序列(SEQ ID NO.6)。

图12示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)和核酸编码序列(SEQ ID NO.8)。

图13示出了使用具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通过PCR对加入米根霉(R.oryzae)的绵羊血液中CotH3的检测。

图14示出了使用具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通过PCR对加入毛霉属菌种(Mucor sp.)或伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的绵羊血液中CotH3的检测。

图15示出了使用具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通过PCR对加入巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholetiae)或小孢根霉(R.microsporus)的绵羊血液中CotH3的检测。

图16示出了使用具有SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通过PCR在加入烟曲霉(Aspergillus fumigate)或白色念珠菌(Candida albicans)的绵羊血液中未检测出CotH3。

图17示出了具有来自橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)(ZP_01460584)的蛋白质(SEQ ID NO：65)的氨基酸序列的任何CotH预测蛋白(在这种情况下，CotH3[R03G_11882]SEQ ID NO：5)的最高同源性。

图18示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)ATCC10500(EED23986)蛋白(SEQ ID NO：67)之间的氨基酸序列比对。

图19示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)ATCC18224(XP_002144175)蛋白(SEQ ID NO：68)之间的氨基酸序列比对。

图20示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和黑曲霉(Aspergillus niger)(XP_001392236)蛋白(SEQ IDNO：69)之间的氨基酸序列比对。

图21示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(XP_658934)蛋白(SEQID NO：70)之间的氨基酸序列比对。

图22示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(XP_760027)蛋白(SEQ IDNO：71)之间的氨基酸序列比对。

图23示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和粗球孢子菌(Coccidioides immitis)(XP_001243211)蛋白(SEQ ID NO：72)之间的氨基酸序列比对。

图24示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(XP_956792)蛋白(SEQID NO：73)之间的氨基酸序列比对。

图25示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)(XP_775558)蛋白(SEQ ID NO：74)之间的氨基酸序列比对。

图26示出了来自米根霉(R.oryzae)的RO3G_16295蛋白(SEQ IDNO：66)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)(EFD65170)蛋白(SEQ ID NO：75)之间的氨基酸序列比对。

图27示出了来自米根霉(Rhizopus oryzae)99-880的CotH3的核酸序列(包括来自数据库的内含子)(SEQ ID NO：9)。

图28示出了来自米根霉(Rhizopus oryzae)99-880的CotH3的核酸序列(仅来自数据库的外显子)(SEQ ID NO：10)。

图29示出了来自米根霉(Rhizopus oryzae)99-880的CotH3的氨基酸序列(预测的氨基酸)(SEQ ID NO：11)。

图30示出了来自米根霉(Rhizopus oryzae)99-880的CotH3的核酸序列(包括来自测序数据的内含子)(SEQ ID NO：12)。

图31示出了来自米根霉(Rhizopus oryzae)99-892的CotH3的核酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO：13)。

图32示出了来自米根霉(Rhizopus oryzae)99-892的CotH3的核酸序列(包括来自测序数据的内含子)(SEQ ID NO：14)。

图33示出了来自米根霉(R.oryzae)99-892的CotH3的预测氨基酸序列(不包括内含子)(SEQ ID NO：15)。

图34示出了来自米根霉(R.oryzae)99-892的CotH3的预测氨基酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO：16)。

图35示出了来自毛霉属菌种(Mucor sp.)99-932的CotH3序列的核酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO：17)。

图36示出了来自毛霉属99-932的CotH3的预测氨基酸序列(仅AA外显子)(SEQ ID NO：18)。

图37示出了来自毛霉属99-932的CotH3的核酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO：19)。

图38示出了来自毛霉属99-932的CotH3的预测氨基酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO：20)。

图39示出了来自伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的核酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO：21)。

图40示出了来自伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的预测氨基酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO：22)。

图41示出了来自伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的核酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO：23)。

图42示出了来自伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的预测氨基酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO：24)。

图43示出了来自巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3序列的核酸序列(仅外显子)(SEQ ID NO：25)。

图44示出了来自巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3的预测氨基酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO:26)。

图45示出了来自巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3的核酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO：27)。

图46示出了来自巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3的预测氨基酸序列(包括来自测序数据的内含子)(SEQ ID NO:28)。

图47示出了来自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的核酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO:29)。

图48示出了来自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的预测氨基酸序列(仅来自测序数据的外显子)(SEQ ID NO:30)。

图49示出了来自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的核酸序列(包括内含子，仅具有一个内含子)(SEQ ID NO:31)。

图50示出了来自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的预测氨基酸序列(包括内含子)(SEQ ID NO:32)。

图51A和图51B示出了结合至GRP78的米根霉(R.oryzae)表面蛋白的远端免疫印迹(部分A)以及显示CotH2和CotH3预测蛋白之间密切同一性以及CotH蛋白从真菌中广泛存在的第四个鉴别的ORF处偏离(divergence)而无鉴别的功能(即RO3G_16295)的树状图(图52B)。

图52A-图52C示出了对萌发和对宿主细胞相互作用响应的CotH基因和RO3G_16295的表达。所有CotH基因均在休眠孢子中表达，但是仅有CotH3在生长在37℃的YPD中的米根霉(R.oryzae)幼殖体中表达。米根霉(R.oryzae)幼殖体对内皮细胞的暴露仅引起了CotH2和CotH3基因的表达，如通过RT-PCR确定的(图52B)。通过qRT-PCR对米根霉(R.oryzae)幼殖体在内皮细胞上的CotH基因的基因表达的定量表明相对于非表达的CotH1，CotH3和CotH2的表达分别提高了16和4倍。在任何测试条件下，RO3G_16295不表达。通过维尔克松秩和检验，相对于CotH1表达*P<0.001，和相对于CotH1和CotH2表达**P<0.001(图52C)。三个独立实验中N＝9。

图53示出了抗肽GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO:39)的抗体识别CotH2和CotH3但不能识别酿酒酵母(S.cerevisiae)异源表达的CotH1蛋白。将肽偶联至KLH并用于产生商用兔抗体。用所述抗体对异源表达CotH蛋白的酿酒酵母(S.cerevisiae)染色，然后在通过共聚焦显微镜检查使细胞显像前用FITC标记的抗兔山羊抗体复染。

图54A-图54C示出了内皮细胞表面GRP78结合至异源表达CotH2或CotH3的酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞但是不能结合异源表达CotH1的细胞，并且表达CotH2或CotH3的酿酒酵母(S.cerevisiae)粘附并侵袭内皮细胞或过表达GRP78的CHO细胞，但是表达CotH1或空质粒的酿酒酵母(S.cerevisiae)不粘附和侵袭。用NHS-生物素标记内皮细胞表面蛋白，然后用含有Ca²⁺和Mg²⁺的N-辛基-β-d-果聚糖在PBS中的溶液和蛋白酶抑制剂进行提取。将标记的蛋白(250mg)与酵母细胞(2×10⁸)一起孵育，然后通过用含有Ca²⁺和Mg²⁺的PBS大量清洗以除去未结合的蛋白。用6M脲洗脱保持结合在生物上的膜蛋白，在10％SDS-PAGE上分离，并通过用抗GRP78Ab的免疫印迹法鉴别(图54A)。使用在12mm玻璃盖玻片上分裂的内皮细胞(图54B)或者CHO亲代细胞或过表达GRP78的那些(图54C)进行粘附和胞吞(通过差异荧光确定)测定。通过维尔克松秩和检验，相对于表达空质粒或CotH1的酿酒酵母(S.cerevisiae)，*P<0.001，并且相对于CotH1和CotH2表达，**P<0.001。三个独立实验中N＝9。数据表示为中值±四分位间距。

图55A和图55B示出了抗CotH3Ab(抗肽GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39))阻断米根霉(R.oryzae)的内皮细胞胞吞和通过米根霉(R.oryzae)的损害。使用在12mm玻璃盖玻片上分裂的进行粘附和胞吞(通过差异荧光确定)测定，而使用96孔板⁵¹Cr释放法进行损害。在加入米根霉(R.oryzae)幼殖体之前，将内皮细胞与50μg/ml抗CotH3或者与来自接种前的相同兔的血清(对照)一起培育1小时。CotH3和CotH2的阻断(由于抗体对CotH2蛋白反应)终止了内皮细胞对米根霉(R.oryzae)的胞吞(数据来源于>700个与约200个内皮细胞/每组/次实验相互作用的真菌细胞，其中在对照中平均59％的细胞被胞吞)(图55A)，并且降低了真菌导致内皮细胞损害的能力(图55B)。通过维尔克松秩和检验，与接种前的血清或无血清相比，*P<0.01。对于胞吞，3个独立实验中，n＝6个载玻片每组，对于损害测定，2个独立实验中，n＝6孔每组。数据表示为中值±四分位间距。

图56A-图56C示出了靶向CotH2和CotH3的RNA-i构件抑制两种基因的表达，并且降低了CotH2和CotH3在细胞表面上的蛋白质合成并且对米根霉(R.oryzae)的生长或萌发类型无影响。用靶向CotH2和CotH3表达的RNA-i构件(pRNAi)或用空质粒转化米根霉(R.oryzae)。相对于用空质粒转化的细胞，两种转化体显示出具有>80％的CotH2和CotH3表达的减少，如通过qRT-PCR所确定的(图56A)。使用抗CotH抗体的流式细胞测试显示与用空质粒转化的那些、野生型细胞或阴性对照(即用商品化IgG而不是抗CotH抗体染色的野生型米根霉(R.oryzae))相比，CotH蛋白在用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)细胞上的细胞表面表达减少(图56B)。CotH2和CotH3表达减少的两种转化体具有与野生型细胞或用空质粒转化的细胞相似的生长速率(图56C)。

图57A-图57C示出了CotH2和CotH3表达的抑制损害了米根霉(R.oryzae)侵袭和损害内皮细胞和过表达GRP78的CHO细胞的能力。使用在12mm玻璃盖玻片上分裂的进行粘附和胞吞(通过差异荧光确定)测定，而使用96孔板⁵¹Cr释放法进行损害。与用空质粒转化的细胞相比，用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)幼殖体导致对内皮细胞的侵袭(图57A)和损害(图57B)较少。与CHO亲代细胞相比，使用靶向CotH2和CotH3的RNA-i的转化体导致了对过表达GRP78的CHO细胞相当的损害。相反，相比于CHO亲代细胞，用空质粒或野生型米根霉(R.oryzae)转化的米根霉(R.oryzae)幼殖体导致对过表达GRP78的CHO细胞显著更大的损害(图57C)。通过维尔克松秩和检验，与空质粒相比，*P<0.005，与野生型或空质粒相比，**P<0.01，并且与CHO亲代细胞相比对于胞吞，3个独立实验中，n＝6个载玻片每组，对于损害测定，3个独立实验中，n＝9孔每组。数据表示为中值±四分位间距。

图58A-图58C示出了CotH2和CotH3表达的抑制减弱了糖尿病酮症酸中毒小鼠中米根霉(R.oryzae)的毒力。图58A示出了用三种菌株之一气管内感染的小鼠(对于野生型n＝10，或者对于RNA-i或空质粒转化体n＝9)的存活率。对于野生型、空质粒或RNA-i细胞，吸入接种物分别为2.4×10³、2.8×10³和2.5×10³个孢子。通过对数秩和检验，相对于野生型或空质粒感染的小鼠，*P<0.003。图58B示出了气管内感染野生型(1.7×10³)、空质粒(3.0×10³)或RNA-i(3.1×10³)细胞的糖尿病酮症酸中毒小鼠(n＝9每组)的肺和脑的真菌载菌量。在相对于感染的+2天，处死小鼠，并处理它们的器官以用于使用SYBR绿测定的组织真菌载菌量。数据表示为中值±四分位间距。通过维尔克松秩和检验，相对于野生型或空质粒感染的小鼠，*P<0.001。图58C示出了从野生型、空质粒或RNA-i构件感染的小鼠收获的肺和脑中CotH基因的体内表达，如使用对每个CotH基因特异的引物通过qRT-PCR所确定的。数据表示为平均值±标准差。相对于野生型或空质粒，*P<0.001。

图59示出了从野生型或者空质粒或RNA-i转化的米根霉(R.oryzae)感染的糖尿病酮症酸中毒小鼠收获的肺的组织病理学检查。过碘酸雪夫氏(PAS)染色的切片显示了来自从野生型或空质粒转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠采集的器官的大量菌丝元素(箭头)，但是未显示出用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠。

图60示出了用抗肽GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)(A)或肽MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)(B)的抗CotH抗体的被动免疫保护小鼠不被米根霉(R.oryzae)感染。在用2.4×10³个米根霉(R.oryzae)99-880孢子(野生型)气管内感染前2小时，对糖尿病酮症酸中毒小鼠给予1mg抗CotH IgG或接种前血清(对照)。在相对于感染的+3天，给予第二剂量的多克隆抗体或接种前血清。相对于接受接种前血清的小鼠，*P<0.03。

图61示出了不同真菌种的CotH3分子信标检测的特异性。在StepOnePlus实时PCR仪(Applied Biosystems)中产生了扩增图。x轴是从扩增开始时的时间；y轴是荧光的增加(ΔRn)；用加粗水平线显示阈值荧光(对于水阴性对照样品，它等于平均值加2倍SD)。可以从添加10⁵个米根霉(R.oryzae)孢子的水样品(0.5mL)放大信号，但是添加了白色念珠菌(Candida albicans)或烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的不行。

图62示出了添加不同米根霉(R.oryzae)99-880接种物的水样品(0.5mL)的CotH3分子信标检测的灵敏度。在StepOnePlus实时PCR仪(Applied Biosystems)中产生了扩增图。x轴是从扩增开始时的时间；y轴是荧光的增加(ΔRn)；用加粗水平线显示阈值荧光(对于水阴性对照样品，它等于平均值加2倍SD)。

图63示出了在血液中米根霉孢子的检测中CotH3分子信标探查的灵敏度和特异性。在StepOnePlus实时PCR仪(Applied Biosystems)中产生了扩增图。x轴是从扩增开始时的时间；y轴是荧光的增加(ΔRn)；用加粗水平线显示阈值荧光(对于水阴性对照样品，它等于平均值加2倍SD)。血液是接种的对照。R：不同接种量(例如，R10＝用米根霉(R.oryzae)的10个孢子添加350ml血液)的米根霉(R.oryzae)99-880，A：A.fumigants，C：白色念珠菌(C.albicans)，每个均以10⁵个细胞用于添加350ml血液。

图64示出了根霉检测中CotH3分子信标探查的特异性。在StepOnePlus实时PCR仪(Applied Biosystems)中产生了扩增图。x轴是从扩增开始时的时间；y轴是荧光的增加(ΔRn)；用加粗水平线显示阈值荧光(对于水阴性对照样品，它等于平均值加2倍SD)。血液：未接种的血液样品；99-892：米根霉(R.oryzae)99-892；ATCC62417：小孢根霉(R.microspores)ATCC62417；R1000：米根霉(R.oryzae)99-880。所有菌株以10³个孢子用于添加血液(350ml)。

发明详述

本文所公开的组合物和方法至少部分基于对由毛霉菌目真菌独特表达并且在真菌感染期间可以有利于内皮细胞结合的细胞表面蛋白的鉴别和鉴定。主要由米根霉(Rhizopus oryzae)所引起的毛霉菌病的特征在于血管侵袭(angioinvasion)和血管血栓形成。毛霉菌和内皮细胞之间的相互作用是真菌病症确立的重要因素。最近鉴别的葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是通过米根霉(R.oryzae)幼殖体介导人脐静脉内皮细胞的侵袭和后续损害的新型宿主受体，它提供了侵袭期间米根霉(R.oryzae)及其他毛霉菌种结合的可能靶标配体(Liu等人,J.Clin.Invest.120:1914-24(2010))。

根据本发明，提供了编码本文所公开的毛霉菌CotH多肽及其他多肽或其功能性多肽片段的核酸。

如本文所使用的，术语“毛霉菌CotH”是指CotH蛋白家族的亚家族成员，其中毛霉菌CotH蛋白包括参与宿主细胞(如内皮细胞)的粘附和侵袭过程的毛霉菌目中真菌所表达的细胞表面蛋白。因为毛霉菌CotH蛋白是毛霉菌所特有的，因此毛霉菌CotH核酸或多肽的存在与否或者毛霉菌CotH核酸或多肽表达的变化可用作毛霉菌种感染(例如，毛霉菌病)的标志物。因此，本发明包括能够用于筛选真菌病症和/或开发用于治疗真菌病症的候选药物的毛霉菌CotH核酸和/或多肽。

当在本文中用作毛霉菌CotH多肽或其多肽片段的修饰语时，术语“功能性”是指显示出类似于本文所公开的CotH1、CotH2和CotH3的功能特征的多肽。例如，当CotH3或CotH2在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达时，酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞粘附至并侵袭内皮细胞或过表达GRP78的CHO细胞。因此，毛霉菌CotH的一个功能是前粘附(pro-adherance)和/或前侵袭(pro-invasion)功能。在另一个方面，功能性毛霉菌CotH多肽或其片段还可以包括体内或体外结合至GRP78蛋白、其变体或片段。

当将本文所述的核酸引入到本领域技术人员已知的多种蛋白表达系统中时，这些核酸分子可用于产生本发明的蛋白。另外，能够用可容易地检测的取代基标记这些核酸分子或其片段，并用作测定给定样品中是否存在本发明的毛霉菌CotH基因或mRNA转录本和/或存在量的杂交探针。本文所述的核酸分子及其片段还用作用于扩增编码本文所述的本发明的蛋白的PCR反应中的引物和/或模板。

术语“核酸”，也称为多核苷酸，它涵盖了核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)、探针、寡核苷酸和引物并且可以是单链或双链的。DNA可以是互补DNA(cDNA)或基因组DNA，并且可以表示有义链、反义链或两者。核酸的实例为RNA、cDNA或编码毛霉菌CotH多肽的分离的基因组DNA。这些核酸包括(但不限于)包含如2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的基本相同的核苷酸序列的核酸。一般地，本发明的基因组序列包括调控区，如启动子、增强子，和位于编码毛霉菌CotH的外显子之外的内含子，但是不包括不编码毛霉菌CotH的近端基因(proximal gene)。

在本说明书和权利要求中术语“分离的”和/或“纯化的”作为DNA、RNA、多肽或蛋白质的修饰语的使用是指已通过人产生了处于这种形式的所指明的DNA、RNA、多肽或蛋白质，并因此与它们天然的体内细胞环境分离。

术语基本相同的核苷酸序列是指与参比多核苷酸具有足够同一性的DNA，从而它将在中等严格杂交条件下杂交至所述参比核苷酸。在一种实施方式中，具有与所述参比核苷酸序列基本相同的核苷酸序列的DNA编码了如SEQ ID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中任一个所示的基本相同的氨基酸序列。在另一种实施方式中，具有与所述参比核苷酸序列基本相同的核苷酸序列的DNA相对于所述参比核苷酸序列具有至少65％的同一性。具有基本相同的核苷酸序列的DNA可以相对于所述参比核苷酸序列具有至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性。

如本文所使用的，核酸的“修饰”还可以包括相对于参比序列的一个或几个核苷酸的添加、缺失或取代。核酸的修饰可以包括由于遗传密码的简并度而不改变所编码的氨基酸序列的取代。这些修饰可以对应于故意做出的改变，或者作为核酸复制期间的突变发生。

所列举的毛霉菌CotH序列的示例性修饰包括对应于其他物种的同源染色体的序列，所述物种包括毛霉菌目中的种，如伞枝拟青霉(A.corymbifera)、雅致放射毛霉(A.elegans)、淀粉丝菌(A.rouxii)、巴克斯毛霉(B.circina)、B.multispora、布雷丝枝霉(C.brefeldii)、安地卷霉(C.angarensis)、屈弯科克霉(C.recurvatus)、D.fulva、E.anomalus、雅致卷枝霉(H.elegans)、H.assamensis、K.cordensis、M.amphibiorum、寄生疫霉(P.parasitica)、P.agaricina、异常毕赤酵母(P.anomala)、旋枝霉(P.circinans)、内生根毛霉(R.endophyticus)、R.javensis、伞拟小孢霉(S.umbellata)、大孢联轭霉(S.megalocarpus)、T.elegans、T.indicae-seudaticae、Z.californiensis、无接合孢子根霉(R.azygosporus)、R.caespitosus、同合根霉(R.homothallicus)、米根霉(R.oryzae)、小孢根霉(R.microspores)、小孢根霉须状变种(R.microsporus var.rhizopodiformis)、希伯来根霉(R.schipperae)，或者本文所公开的毛霉菌目的任何其他种。可以通过本领域中已知的方法确定毛霉菌种相应的毛霉菌CotH序列，如通过PCR或通过筛选基因组、cDNA或表达文库。

本发明的毛霉菌CotH的另一种示例性修饰可对应于毛霉菌CotH核苷酸序列的剪接变体形式。另外，核苷酸序列的修饰可以包括一个或多个非天然核苷酸，其具有(例如)对碱基、糖或磷酸酯部分的修饰或者具有修饰的磷酸二酯键。这些修饰能够有利地提高核酸分子的稳定性。

本发明还涵盖了不同于SEQ ID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示核酸但具有相同表型的核酸。表型相似的核酸也称为功能等效核酸(functionally equivalent nucleic acid)。如本文所使用的，短语功能等效核酸涵盖了其特征为微小并且非结果序列变化的核酸，它将以基本相同的方式起作用以产生和本文所公开的核酸相同的蛋白产物。具体地，功能等效核酸编码了与本文所公开的核酸所编码的那些相同或者具有保守氨基酸变化的多肽。例如，保守变化包括用另一种非极性残基取代非极性残基，或者用类似的带电残基取代带电残基。这些变化包括技术人员所认识到的不会显著改变蛋白质三级结构的那些。

本文还提供了编码毛霉菌CotH多肽的核酸，根据遗传密码的简并性，所述核酸在指定的杂交条件下不必需杂交至本发明的核酸。如本文所使用的，术语简并是指至少一个核苷酸与参比核酸不同但是编码了与参比核酸相同的氨基酸的密码子。编码本发明的毛霉菌CotH多肽的核酸可以由编码与SEQ ID NO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列基本相同的核苷酸组成。

在一种实施方式中，本发明提供了编码如本文所公开的多肽的分离的核酸，所述多肽包括毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。本发明还提供了编码毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段的分离的核酸，其包括选自下列的核酸：(a)编码SEQ ID NO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列的核酸，或(b)在低、中等或高严格条件下杂交至(a)的核酸的核酸，其中所述核酸连续编码生物学活性毛霉菌CotH多肽，或(c)相对于以上(a)或(b)简并的核酸，其中所述核酸编码生物学活性毛霉菌CotH多肽。在一个方面，本发明所述的核酸在高严格条件下杂交。

杂交是指核酸互补链通过类似于染色体DNA中天然存在的键的氢键的彼此结合，例如，正义链:反义链或探针:靶标-核酸。本领域技术人员能够容易地改变用于将给定探针与靶标-DNA杂交的严格性水平。

短语“严格杂交”在本文中用于表示多聚核酸杂交物稳定的条件。如本领域技术人员已知的，杂交物的解链温度(Tm)反映了杂交物的稳定性。一般地，杂交物的稳定性是钠离子浓度和温度的函数。通常，杂交反应是在较低的严格性条件下进行的，然后在不同但更高的严格性下清洗。对杂交严格性的提及涉及这些清洗条件。

如本文所使用的，短语“中等严格杂交”是指允许靶标核酸与互补核酸结合的条件。杂交的核酸一般将具有至少约60％的同一性，至少约75％的同一性，或至少约85％的同一性；或至少约90％的同一性。中等严格条件是相当于在50％甲酰胺、5×登哈特溶液(Denhart's solution)、5×SSPE、0.2％SDS中于42EC进行杂交，随后在0.2×SSPE，0.2％SDS中于42EC进行洗涤的条件。

短语“高严格杂交”是指仅允许在0.018M NaCl中于65EC形成稳定杂交物的那些核酸序列杂交的条件，例如，如果杂交物在0.018M NaCl中于65EC是不稳定的，那么它在高严格条件下将是不稳定的，如本文所考虑的。可以通过(例如)在50％甲酰胺、5×登哈特溶液(Denhart'ssolution)、5×SSPE、0.2％SDS中于42EC杂交，随后在0.1×SSPE和0.1％SDS中于65EC洗涤来提供高严格条件。

短语“低严格杂交”是指相当于在10％甲酰胺、5×登哈特溶液(Denhart's solution)、6×SSPE、0.2％SDS中于22EC进行杂交，随后在1×SSPE，0.2％SDS中于37EC进行洗涤的条件。登哈特溶液含有1％聚蔗糖(Ficoll)、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其他适合的中等严格和高严格杂交缓冲液和条件对于本领域技术人员是熟知的并且描述于(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。编码多肽的核酸在中等严格或高严格条件下杂交至基本整个序列或大部分序列，例如，通常SEQ ID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核酸序列的至少15-30个核苷酸。

本发明还提供了在中等严格条件下杂交至毛霉菌CotH核酸分子的毛霉菌CotH核苷酸序列的修饰，所述核酸分子例如SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核酸分子。还提供了毛霉菌CotH核苷酸序列的修饰，其中所述修饰具有与毛霉菌CotH核苷酸序列至少65％的同一性。本发明还提供了毛霉菌CotH核苷酸序列的修饰，所述修饰具有至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性。本发明还提供了毛霉菌CotH核苷酸序列的修饰，其中所述修饰的核酸所编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每条序列中可以出于比较的目的进行比对的位置来确定同源性。当所比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸所占据，那么该分子在该位置是同源的。序列间的同源性程度是所述序列共有的匹配或同源位置的个数的函数。“不相关”或“非同源”序列与本发明所述序列之一共有小于40％的同一性，或者作为另外一种选择小于25％的同一性。

多核苷酸或多核苷酸区(或者多肽或多肽区)对另一条序列具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指当比对时，所比较的两条序列中相同的碱基(或氨基酸)的百分比。可以使用本领域中已知的软件程序(例如，Ausubel等人中所述的那些，如上)确定这种比对和百分比同源性或序列同一性。优选地，将缺省参数用于比对。使用缺省参数，一种比对程序是BLAST。具体地，程序是使用以下缺省参数的BLASTN和BLASTP：Genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细内容可见于国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)。生物学相当的多核苷酸是具有指定百分比同源性并且编码具有相同或相似生物活性的多肽的那些。

分离编码毛霉菌CotH多肽的核酸的一种方式是利用本领域公知的方法用天然或人工设计的核酸探针探查cDNA文库或基因组文库。对于该目的来说，来源于毛霉菌CotH基因的核酸探针是特别有用的。通过本领域中熟知的方法，编码毛霉菌CotH多肽的DNA和cDNA分子可用于从多种毛霉菌种来源中获得互补基因组DNA、cDNA或RNA，或用于通过筛选cDNA或基因组文库来分离相关cDNA或基因组克隆(参见，例如，Sambrook等人，如上，1989；Ausubel等人，如上，1999)。

本发明还提供了包含SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31或其反义链的15至300个连续核苷酸的毛霉菌CotH寡核苷酸。如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指包含来自参比核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸分子，并且所述核酸分子可以包括来自参比核苷酸序列的至少16、17、18、19、20或至少25个连续核苷酸，并且通常包括至少30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、多至350个连续核苷酸。参比核苷酸序列可以是有义链或反义链。因此，在本发明的一个方面，CotH寡核苷酸可以包含以下核酸序列ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO:34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO:36)、AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO:37)或本文所公开的寡核苷酸。

本发明所述的毛霉菌CotH寡核苷酸含有参比毛霉菌CotH核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，它能够在中等严格杂交条件下杂交至毛霉菌CotH，并因此能够有利地用作(例如)探针以检测样品中的毛霉菌CotH DNA或RNA，和检测其剪接变体；作为测序或PCR引物；作为反义试剂以阻止细胞中毛霉菌CotH RNA的转录；或在本领域技术人员所知的其中与毛霉菌CotH核酸分子的杂交是所期望的其他应用中使用。

本发明所述的分离的毛霉菌CotH核酸分子可以在多种诊断和治疗应用中使用。例如，本发明所述的分离的毛霉菌CotH核酸分子可以用作探针，如上所述；用作毛霉菌CotH多肽重组表达的模板；或者用于筛选测定以鉴别结合毛霉菌CotH的细胞分子。

用于产生本发明的毛霉菌CotH核酸分子的另一种有用的方法包括使用PCR和毛霉菌CotH寡核苷酸扩增所述核酸分子，并且可选地通过凝胶电泳纯化所得产物。PCR或RT-PCR可用于产生具有任何所需核苷酸边界的毛霉菌CotH核酸分子。通过选择具有一个或多个添加、缺失或取代的适合的寡核苷酸引物，可以将所需的修饰引入到所述核酸序列中。能够从来自所关心的任何细胞、组织或物种的少至单个基因或mRNA拷贝开始，指数扩增这些核酸分子。

因此，本发明提供了用于检测样品中毛霉菌CotH核酸的方法。根据需要，检测样品中毛霉菌CotH核酸的方法可以是定性的或定量的。例如，根据用于杂交的测定形式和探针或者选择用于应用的引物对，根据需要，可以确定毛霉菌CotH的存在、丰度、完整性或结构。

基于使用分离的毛霉菌CotH核酸分子的特异性杂交，对于检测毛霉菌CotH核酸有用的测定在本领域中是熟知的并且包括(例如)原位杂交，根据所使用的测定形式，它可以用于检测核酸分子改变的染色体位置、改变的基因拷贝数和RNA丰度。其他杂交测定包含(例如)RNA印迹和RNA酶保护测定，它可以用于确定不同RNA剪接变体的丰度和完整性，和DNA印迹，它可以用于确定DNA的拷贝数和完整性。可以用任何适合的可检测部分标记毛霉菌CotH杂交探针，如放射性同位素、荧光物质、化学发光标志物、生物素或本领域中已知的通过分析法可检测的其他可检测部分。

基于使用两种或更多种毛霉菌CotH寡核苷酸来扩增毛霉菌CotH核酸，对检测样品中毛霉菌CotH核酸有用的测定在本领域中也是公知的，并且包括(例如)定性或定量聚合酶链反应(PCR)；反转录PCR(RT-PCR)；单链构象多态性(SSCP)分析，基于在非变性凝胶电泳上产生改变的电泳迁移率的单链DNA二级结构的差异，它可以容易地鉴别DNA中单个点突变；和结合的PCR、转录和翻译测定，如蛋白截短检测，其中通过电泳凝胶上改变的蛋白质产物确定了DNA中的突变。另外，可以对扩增的毛霉菌CotH核酸测序以检测突变和突变热点，并且可以开发用于大规模筛选样品以鉴别这些突变的特异性测定。

本发明还提供了通过本发明的毛霉菌CotH核酸所编码的分离的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。例如，本发明提供了包含如SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的相同或基本相同的氨基酸序列的多肽。还提供了由包含如SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31所示的相同或基本相同的核苷酸序列的核苷酸序列所编码的毛霉菌CotH多肽。

如本文所使用的，术语基本相同的氨基酸序列是指相对于参比氨基酸序列具有至少约65％的同一性并且保留了相当的参比氨基酸序列所定义的蛋白功能和生物活性特征的氨基酸序列。在一个方面，具有基本相同的氨基酸序列的蛋白质将具有至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性。然而，已认识到含有小于所述序列同一性水平的作为剪接变体出现的或者通过保守氨基酸取代或通过简并密码子取代修饰的多肽或编码核酸也涵盖在本发明的范围内。

术语毛霉菌CotH还涵盖了其功能性片段或多肽类似物。术语“功能性片段”是指全长毛霉菌CotH蛋白的一部分的肽片段，只要所述部分具有作为相应全长蛋白质的特征的如本文所定义的生物活性。例如，在本发明的方面中，本发明的功能性片段可以结合至GRP78蛋白，或者更具体地，本发明的功能性片段可以结合至上皮细胞所表达的GRP78蛋白。因此，本发明还提供了本发明的毛霉菌CotH蛋白的功能性片段，它可以使用结合和常规方法鉴别，如本文所述的生物测定。

如本文所使用的，当用于表示毛霉菌CotH时，术语“多肽”旨在表示具有两种或更多种氨基酸的肽或多肽。术语多肽类似物包括具有与本文具体所述的序列基本相同的氨基酸残基序列的任何多肽，其中一个或多个残基已被功能相似的残基保守取代，并且其显示了在功能上模拟如本文所述的毛霉菌CotH的能力。毛霉菌CotH多肽的“修饰”还涵盖了毛霉菌CotH多肽氨基酸序列的保守取代。所编码的氨基酸的保守取代包括(例如)属于以下组的氨基酸：(1)非极性氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu和Ile)；(2)极性中性氨基酸(Cys、Met、Ser、Thr、Asn和Gln)；(3)极性酸性氨基酸(Asp和Glu)；(4)极性碱性氨基酸(Lys、Arg和His)；和(5)芳香族胺基酸(Phe、Trp、Tyr和His)。只要所述多肽保留了如本文所述的其功能的一些或全部，那么毛霉菌CotH多肽内也包括了其他微小的修饰。

本发明的功能性片段或多肽类似物的氨基酸长度可以在本发明的毛霉菌CotH的约5个氨基酸多至全长蛋白序列的范围内。在某些实施方式中，氨基酸长度包括(例如)至少约10个氨基酸、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约75、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250或更多个氨基酸长度，多至全长毛霉菌CotH蛋白序列。所述功能性片段可以是毛霉菌CotH多肽的连续氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示的连续氨基酸序列。

在另一种实施方式中，本发明提供了本文所公开的毛霉菌CotH多肽的免疫原性片段。本发明所述的免疫原性片段可以包括免疫原性表位，其可以使用本领域中熟知的实验方法来鉴别。另外，还可以使用计算模型来鉴别免疫原性表位。参见，例如，Tong等人(Brief Bioinform.8(2):96-108(2006))和Ponomarenko等人(2008)“B-cell epitopeprediction”，Structural Bioinformatics，Bourne PE和Gu J主编，Wiley-Liss；第2版，第849-879页。一旦鉴别了对抗完整蛋白的抗体具有反应性的表位，那么可以通过在每个位置的氨基酸取代和/或在C和/或N末端的延伸来测试所述多肽的特异性。这些具有表位的多肽通常含有至少6至14个氨基酸残基，并且可以(例如)通过使用本领域中熟知的方法的多肽合成或通过将已有的蛋白断裂来产生。因此，在本发明的一些方面，本文所公开的毛霉菌CotH多肽的免疫原性片段可以包括氨基酸序列GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)或MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)。

相对于用作依照本发明的免疫原的分子，本领域技术人员将认识到可以将所述蛋白质截短或断裂而不会损失作为免疫原性疫苗的基本质量。例如，可以通过从C末端截短将蛋白质截短以产生N末端片段，同时保持了所述分子作为免疫原的功能性。类似地，可以通过从N末端截短来产生C末端片段，同时保持了所述分子作为免疫原的功能性。依照本发明，可以根据本文所提供的教导和指导做出其他修饰以产生其他多肽功能性片段、免疫原性片段、它们的变体、类似物或衍生物，从而实现本文所述的天然蛋白质的治疗有用的性质。

因此，如本文所使用的，术语“免疫原性片段”是指T细胞和/或B细胞抗原受体识别的蛋白质部分。所述免疫原性部分一般包含至少5个氨基酸残基，或可替代地至少6个，或可替代地至少7个，或可替代地至少8个，或可替代地至少9个，或可替代地至少10个，或可替代地至少11个，或可替代地至少12个，或可替代地至少13个，或可替代地至少14个，或可替代地至少15个，或可替代地至少16个，或可替代地至少17个，或可替代地至少18个，或可替代地至少18个，或可替代地至少19个，或可替代地至少20个，或可替代地至少25个，或可替代地至少30个，或可替代地至少50个，或可替代地至少100个本文所公开的CotH多肽的氨基酸残基。可替代地，所述免疫原性部分可以包含至多5个氨基酸残基，或可替代地至多6个，或可替代地至多7个，或可替代地至多8个，或可替代地至多9个，或可替代地至多10个，或可替代地至多11个，或可替代地至多12个，或可替代地至多13个，或可替代地至多14个，或可替代地至多15个，或可替代地至多16个，或可替代地至多17个，或可替代地至多18个，或可替代地至多18个，或可替代地至多19个，或可替代地至多20个，或可替代地至多25个，或可替代地至多30个，或可替代地至多50个，或可替代地至多100个本文所公开的CotH多肽的氨基酸残基。在一些方面，免疫原性部分可以含有小的N和/或C末端片段(例如，5-30个氨基酸，优选10-25个氨基酸)。

多肽的修饰还可以包括其衍生物、类似物和功能性模拟物，只要这些多肽表现出毛霉菌CotH的生物活性。例如，衍生物可以包括多肽的化学修饰，如烷基化、酰基化、氨甲酰化、碘化或使多肽衍生化的任何修饰。这些衍生化分子包括(例如)其中自由氨基已衍生化形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或醛基的那些分子。自由羧基能够衍生化形成盐、甲酯和乙酯或者其他类型的酯或酰肼。自由羟基能够衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生化形成N-咪唑-苄基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。作为衍生物或类似物，还包括含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽，所述衍生物例如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸或羧基谷氨酸，并且可以包括未通过肽键连接的氨基酸。只要维持毛霉菌CotH活性，则本发明的多肽还包括相对于序列如本文所示的多肽序列具有一个或多个残基添加和/或缺失的任何多肽。

本发明提供了分离的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。本发明的毛霉菌CotH多肽可以通过本领域中熟知的多种方法分离，例如，重组表达系统、沉淀、凝胶过滤、离子交换、反相和亲和色谱法等。其他熟知的方法描述于Deutscher等人,Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology,Vol.182,(Academic Press,(1990))。作为另外一种选择，可以使用熟知的重组方法获得本发明的分离的多肽(参见，例如，Sambrook等人，同上，1989；Ausubel等人，同上，1999)。本领域技术人员可以选择用于本发明多肽的生物化学纯化的方法和条件，并且通过(例如)免疫学测定或功能性测定来监控纯化。

制备本发明多肽的方式的实例是使用本领域中熟知的方法在适合的宿主细胞(如细菌细胞、酵母细胞、两栖动物细胞(如卵母细胞)或哺乳动物细胞)中表达编码毛霉菌CotH的核酸，并且再次使用如本文所述的熟知的纯化方法回收所表达的多肽。可以直接从已用如本文所述的表达载体转化的细胞中分离本发明的多肽。还可以将本发明的重组表达的多肽表达为具有适当亲和标记的融合蛋白，所述标记如谷胱甘肽S转移酶(GST)或多组氨酸，并亲和纯化。还可以通过化学合成产生本发明的多肽、生物学功能性片段及其功能等效物。例如，可以使用AppliedBiosystems,Inc.430A或431A型自动肽合成仪(Foster City,CA)并使用该生产商所提供的化学品产生合成多肽。

本发明还提供了单独或彼此结合地含有可接受的载体和任何分离、纯化的毛霉菌CotH成熟蛋白或其功能性多肽片段的组合物。这些多肽或蛋白可以重组得到，化学合成或纯化自天然来源。如本文所使用的，术语“可接受的载体”包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳化液，如油水乳化液，和多种类型的润湿剂。

因此，本发明提供了药物组合物，其包含可药用载体和化合物，所述化合物选自如本文所述的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段、如本文所述的反义核酸或如本文所述的抗毛霉菌CotH抗体。本发明还提供了通过施用治疗有效量的药物组合物来治疗或预防对其有需要的受试者中毛霉菌病的方法，所述药物组合物包含可药用载体和化合物，所述化合物选自如本文所述的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段、如本文所述的反义核酸或如本文所述的抗毛霉菌CotH抗体。本发明还提供了通过施用治疗有效量的如本文所公开的疫苗组合物来治疗或预防对其有需要的受试者中毛霉菌病的方法。

还提供了具有能够与编码毛霉菌CotH多肽的mRNA的全长或任意部分特异性结合从而防止所述mRNA翻译的序列的反义核酸。所述反义核酸可以具有能够与编码毛霉菌CotH多肽的cDNA的序列的任意部分特异性结合的序列。如本文所使用的，短语特异性结合涵盖了核酸序列识别互补核酸序列并通过互补碱基对之间氢键的形成与之形成双螺旋部分的能力。反义核酸的实例是包含核苷酸化学类似物的反义核酸。

本发明提供了通过重组表达抑制编码这些多肽的mRNA翻译的毛霉菌CotH反义核酸或使用合成的反义核酸组合物(在下文称为SANC)来调节毛霉菌CotH多肽表达水平的方式。构建了设计用于识别和选择性结合至mRNA的合成寡核苷酸或其他反义核酸化学结构从而与毛霉菌CotH编码链的全长或部分互补，所述毛霉菌CotH编码链包括SEQ IDNO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核苷酸序列。

SANC设计在血流中是稳定的以用于通过注射施用于受试者，或者在实验室细胞培养条件下是稳定的。根据SANC的物理和化学性质，SANC设计能够穿过细胞膜以进入到细胞的细胞质中，这使得它能够(例如)通过设计小的疏水性SANC化学结构或者根据识别并将SANC转运到细胞中的特异性转运系统而穿过细胞膜。另外，通过靶向SANC从而被仅在所选细胞群体内结合并吸收SANC的特异性细胞吸收机制所识别，可以将SANC设计成仅施用至某些所选的细胞群体。在具体的实施方式中，SANC是反义寡核苷酸。

例如，SANC可以设计结合至仅在某些细胞类型中存在的受体，如以上所讨论的。SANC还设计成识别并选择性结合至靶标mRNA序列，所述序列对应于包含在SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31所示的序列内的序列。SANC设计使靶标mRNA序列失活，所述失活是通过与之结合并通过(例如)RNA酶I消化引起mRNA降解，或者是通过与翻译调节因子或核糖体结合的干扰或包含其他化学结构(如降解或化学修饰靶标mRNA的核糖酶序列或反应性化学基团)来抑制mRNA靶标序列翻译。已显示当针对mRNA靶标时，SANC能够胜任这些性质(参见Cohen等人，TIPS,10:435(1989)和Weintraub,Sci.American,January(1990),pp.40)。

本文还提供了组合物，其包含对于通过进入细胞并特异性结合至编码毛霉菌CotH多肽的mRNA以防止翻译从而减少毛霉菌CotH多肽表达有效的量的本发明所述的反义核酸和能够穿过细胞膜的可接受的疏水性载体。适合的疏水性载体描述于(例如)美国专利No.5334761；4889953；4897355等。能够穿过细胞膜的可接受的疏水性载体还可以包含结合至对所选细胞类型特异的受体并借此被所选细胞类型的细胞吸收的结构。

反义核酸组合物对于抑制编码本发明多肽的mRNA的翻译是有用的。合成寡核苷酸或其他反义化学结构设计结合至编码毛霉菌CotH多肽的mRNA并抑制mRNA的翻译，并且作为抑制组织样品或受试者中毛霉菌CotH相关基因表达的组合物是有用的。

本发明还提供了通过在适合于毛霉菌CotH表达的条件下培养含有毛霉菌CotH核酸的细胞来表达毛霉菌CotH多肽的方法。因此，提供了通过在适合的宿主细胞中表达编码毛霉菌CotH的核酸序列来重组产生本发明的毛霉菌CotH的方法。适合产生本文所述的毛霉菌CotH的重组DNA表达系统是本领域熟知的(参见，例如，Ausubel等人，如上，1999)。例如，可以将上述核苷酸序列引入到载体中以用于进一步操作。如本文所使用的，载体是指重组DNA或RNA质粒或含有用于将异源DNA引入到细胞中以用于它的表达或复制的分离的元件的病毒。

本发明还提供了含有本发明所述的毛霉菌CotH核酸的载体。适合的表达载体是本领域中熟知的并且包括能够表达操纵性连接至调控序列或元件(如能够调节该核酸的表达的启动子区或增强子区)的核酸的载体。适合的表达载体包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些和仍保持游离的那些或整合至宿主细胞基因组的那些。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”表示通过它可以将核酸引入到宿主细胞的载体。载体可以用于增殖或携带核酸或用于编码序列的多肽表达。多种载体在本领域中是已知的并且包括(例如)质粒、噬菌体和病毒。示例性载体可见于，例如，Sambrook等人，如上；Ausubel等人，如上。

根据调控性质，启动子或增强子可以是组成型的或调控的。调控序列或调控元件操纵性地连接至本发明的核酸，从而使得所述核酸和所述调控序列之间的物理和功能关系允许所述核酸的转录。

适合于在原核或真核细胞中表达的载体对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Ausubel等人，如上，1999)。用于在真核细胞中表达的载体可以包括(例如)调控元件，其包括SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)类固醇可诱导启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)启动子等。本发明所述的载体对于亚克隆和扩增毛霉菌CotH核酸分子和对于重组表达毛霉菌CotH多肽是有用的。本发明的载体可以包括(例如)病毒载体，如噬菌体、杆状病毒或反转录病毒；粘粒或质粒；并且具体对于克隆大核酸分子，细菌人工染色体载体(BAC)和酵母人工染色体载体(YAC)。这些载体是可商购的，并且它们的使用在本领域中是熟知的。本领域技术人员将了解或可以容易地确定用于在具体的宿主细胞中表达的适合的启动子。

本发明还提供了含有本发明的毛霉菌CotH核酸的重组细胞。重组细胞是通过向宿主细胞引入含有毛霉菌CotH核酸分子的载体产生的。将重组细胞转导、转染或遗传修饰。可以用于表达重组毛霉菌CotH分子的示例性宿主细胞包括哺乳动物原代细胞；既定的哺乳动物细胞系，如COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HEK293和PC12细胞；两栖动物细胞，如非洲爪蛙胚胎和卵母细胞；和其他脊椎动物细胞。示例性宿主细胞还包括昆虫细胞如果蝇(Drosophila)，酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces Pombe)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一种实施方式中，本发明提供了具有免疫原性量的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或所述多肽的变体的疫苗组合物。所述疫苗组合物还可以包含佐剂。本发明的疫苗组合物的制剂在通过刺激特异性体液(中和抗体)和效应细胞介导的抗毛霉菌CotH多肽免疫应答来引起受试者中保护性免疫中是有效的。本发明所述的疫苗组合物还在真菌感染(如(例如)毛霉菌病)的治疗或预防中使用。

本发明所述的疫苗将含有免疫保护量的毛霉菌CotH多肽抗原，并且它是通过本领域中公知的方法制备的。疫苗的制备一般性地描述于(例如)M.F.Powell和M.J.Newman主编，"Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach),”Plenum Press(1995)；A.Robinson,M.Cranage和M.Hudson主编，“Vaccine Protocols(Methods in Molecular Medicine),”Humana Press(2003)；和D.Ohagan主编，“Vaccine Ajuvants:PreparationMethods and Research Protocols(Methods in Molecular Medicine),”Humana Press(2000)。

毛霉菌CotH多肽及其肽片段或变体可以包含免疫原性表位，并且可以使用本领域中已知且描述于(例如)Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998(1984)中的方法来鉴别所述免疫原性表位。简言之，可以合成覆盖靶标多肽(即毛霉菌CotH)整个氨基酸序列的数以百计的重叠短肽(例如，六肽)。当肽仍连接在用于它们合成的固体载体上时，使用多种抗血清通过ELISA法测试所述肽的抗原性。可以通过已知技术获得抗毛霉菌CotH蛋白的抗血清，Kohler和Milstein，Nature256:495-499(1975)，并且可以将其人源化以减少抗原性，参见，例如，美国专利No.5693762，或者在留下未重排人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生，参见，例如，美国专利No.5877397。一旦鉴别了对抗完整蛋白的抗体具有六肽反应性的表位，就可以通过在每个位置的氨基酸取代和/或在C和/或N末端的延伸来进一步测试所述肽的特异性。这些具有表位的多肽通常含有至少6至14个氨基酸残基，并且可以(例如)通过使用本领域中熟知的方法的多肽合成或通过将毛霉菌CotH多肽断裂来产生。相对于用作依照本发明的免疫原的分子，本领域技术人员将认识到可以将毛霉菌CotH多肽截短或断裂而不会损失作为免疫原性疫苗的基本质量。例如，可以通过从C末端截短将毛霉菌CotH多肽截短以产生N末端片段，同时保持了所述分子作为免疫原的功能性。类似地，可以通过从N末端截短来产生C末端片段，同时保持了所述分子作为免疫原的功能性。依照本发明，可以根据本文所提供的教导和指导做出其他修饰以产生其他毛霉菌CotH多肽功能性片段、免疫原性片段、它们的变体、类似物或衍生物，从而实现本文所述的天然蛋白质的治疗有用的性质。

本发明所述的疫苗组合物还含有常规的药物载体。适合的载体对于本领域技术人员是熟知的。这些疫苗组合物可以制备成液体单位剂量形式。本领域技术人员可以容易地选择其他任选的组分，例如，药品级稳定剂、缓冲剂、防腐剂、赋形剂等。然而，在使用之前，所述组合物可以冷冻干燥和复原。作为另外一种选择，所述疫苗组合物可以以适合于所选施用形式(例如，鼻内施用、口服施用等)的任何方式制备。充分考虑pH、等渗性、稳定性等，药物可用的疫苗的制备在本领域的技术范围内。

如果疫苗还包含佐剂物质，则本发明所述的疫苗组合物的免疫原性可以进一步提高。实现疫苗的佐剂效果的多种方法是已知的。一般原理和方法详细描述于"The Theory and Practical Application of Adjuvants",1995,Duncan E.S.Stewart-Tull主编，John Wiley&Sons Ltd,ISBN0-471-95170-6以及"Vaccines:New Generationn Immunological Adjuvants",1995,Gregoriadis G等人主编,Plenum Press,New York,ISBN0-306-45283-9，两篇文献均作为参考并入本文。

优选的佐剂有利于通过抗原递呈细胞(APC)(如树突状细胞)的疫苗分子吸收，并且激活了这些细胞。非限制性实例选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；胶束形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合基质(基质)；粒子；DDA(双十八烷基二甲基溴化铵)；铝佐剂；DNA佐剂；和包囊佐剂。脂质体制剂也已知会赋予佐剂作用，并因此根据本发明包括了脂质体佐剂。

除了对真菌感染(如毛霉菌病)敏感的受试者接种疫苗外，本发明的疫苗组合物可以用于免疫治疗性地治疗患有多种真菌感染的受试者。因此，含有与佐剂结合的本文所述的一种或多种毛霉菌CotH多核苷酸、多肽和/或抗体组合物并且起到预防或治疗使用目的疫苗也在本发明的范围内。在一种实施方式中，本发明的疫苗将诱导身体自身的免疫系统去找到并抑制毛霉菌CotH分子。

如本文所使用的，术语“疫苗”是指可以施用于受试者以保护个体抵抗传染病的组合物。疫苗通过引起或提高动物中对传染病的免疫应答来保护不受疾病影响。受使用本发明所述疫苗的治疗法的作用的示例性传染病是毛霉菌病。当受试者受(例如)毛霉菌CotH或其免疫原性部分或片段的攻击时，疫苗介导的保护可以是在宿主中引起的体液和/或细胞免疫。

术语“佐剂”旨在表示一般通过与抗原一起递送到抗原位点处或附近并具有提高对抗原的免疫应答的能力的组合物。通过免疫介导的保护的提高来显示提高免疫应答的能力。可以通过(例如)抗体抗抗原的滴度的提高来确定体液免疫的提高。可以通过(例如)阳性皮试、细胞毒T细胞测定、用于IFN-γ或IL-2的ELISPOT测定来测量细胞免疫的提高。佐剂在本领域中是熟知的。示例性佐剂包括(例如)弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝佐剂、MF59和QS21。

如本文所使用的，术语“治疗”旨在表示指示真菌病症的临床症状的改善。临床症状的改善包括(例如)与治疗前水平相比或与患有真菌病症的个体相比，受治疗的个体中真菌病症的至少一种症状的减少或减轻。术语“治疗”还旨在包括与真菌病症有关的病理病症、慢性并发症或机会致病菌真菌感染的严重性的降低。以下对于毛霉菌病举例说明了这些病理学病症、慢性并发症或机会致病菌感染。毛霉菌病及其他这些病理学病症、慢性并发症和机会致病菌感染还可见于(例如)Merck Manual，第16版，1992和Spellberg等人，Clin.Microbio.Rev.18:556-69(2005)。

如本文所使用的，术语“预防”旨在表示指示真菌病症的临床症状的预防。这种预防包括(例如)在发展出明显病症症状之前或在病症诊断之前在具有真菌感染风险的个体中维持正常的生理学指示物。因此，术语“预防”包括个体的预防性治疗以保护他们不会发生真菌病症。个体中真菌病症的预防还旨在包括抑制或中止真菌病症的发展。抑制或终止所述病症的发展包括(例如)抑制或终止异常生理学指征或临床症状的发生，如以上所述和/或在本领域中公知的那些。因此，真菌病症的有效预防将包括在对真菌病症易感的个体中正常体温、体重、心理学状态的维持以及病变或不具有其他病理表现。对真菌病症易感的个体包括免疫受损的个体，例如，但不限于，患有AIDS、氮血症、糖尿病、糖尿病性酮酸中毒、嗜中性白血球减少症、支气管扩张、肺气肿、TB、淋巴瘤、白血病或烧伤的个体，或者经历化疗、骨髓、干细胞和/或固体器官移植的个体或者具有对真菌病症敏感史的个体。抑制或终止病症的发展还包括，例如，抑制或终止与真菌病症有关的一种或多种病理学病症、慢性并发症或对机会致病菌感染的敏感性的发展。

在本文中“受试者”、“个体”或“患者”可互换使用，并且是指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人。哺乳动物包括(但不限于)鼠、大鼠、兔、猴、牛、羊、猪、犬、猫、农畜、运动动物、宠物、马和灵长类，具体地人。

如本文所使用的，术语“真菌病症”是指真菌疾病、感染或定殖，其包括浅部真菌病(即，皮肤、毛发、指甲和粘膜的真菌疾病；例如，癣或酵母感染)、皮下真菌病(即皮下组织、筋膜和骨的真菌疾病；例如，足分枝菌病、着色真菌病或孢子丝菌病)和全身性真菌病(即一般由吸入病因霉菌所产生的空气传播的孢子所造成的深层真菌感染；例如，接合菌病、曲霉病、隐球菌病、念珠菌病、组织胞浆菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、镰刀菌病(明色丝菌病)、芽生菌病、青霉病或孢子丝菌病)。

如本文所使用的，术语“接合菌病”旨在表示由接合菌纲的真菌(包括毛霉菌目和虫霉目)所造成的真菌病症。虫霉目是造成被称为虫霉病的皮下和粘膜皮肤感染的原因，它在很大程度上使发展中国家具有免疫能力的宿主痛苦。接合菌病也被称为毛霉菌病，并且这两个术语可互换使用以表示相似类型的真菌感染。

如本文所使用的，术语“毛霉菌病”旨在表示由毛霉菌目真菌所引起的真菌病症。毛霉菌病是危急生命的真菌感染，它几乎同样地影响了发展中国家和工业化国家中免疫能力受损的宿主。将属于毛霉菌目的真菌分为至少6类，它们全部可以导致皮肤和深层感染。相比于任何其他科，从患有毛霉菌病的患者中更经常分离出属于毛霉菌科的种。在毛霉菌科中，米根霉(少根根霉)是常见的感染原因。引起相似感染谱的毛霉菌科的其他示例性种包括(例如)小孢根霉须状变种(Rhizopusmicrosporus var.rhizopodiformis)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、Apophysomyces elegans、毛霉菌种(Mucor species)、微小根毛霉(Rhizomucor Pusillus)和小坎宁安霉种(Cunninghamella spp)(小克银汉霉科(Cunninghamellaceae family))。毛霉菌病在本领域中是熟知的并且包括，例如，鼻脑毛霉菌病、肺毛霉菌病、胃肠毛霉菌病、播散性毛霉菌病、骨毛霉菌病、纵隔毛霉菌病、气管毛霉菌病、肾毛霉菌病、腹膜毛霉菌病、上腔静脉毛霉菌病或外耳炎毛霉菌病。

目前，将属于毛霉菌目的真菌分为弃霉科(Choanephoraceae)；小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)；毛霉科(Mucoraceae)；Mycotyphaceae科(Mycotyphaceae)；Phycomycetaceae科(Phycomycetaceae)；水玉霉科(Pilobolaceae)；瓶霉科(Saksenaeaceae)；共头霉科(Syncephalastraceae)；和Umbelopsidaceae科(Umbelopsidaceae)。这些真菌科分别由一个或多个属组成。例如，属于毛霉菌目毛霉菌科的真菌进一步分类为以下属：犁头霉属(例如，伞枝拟青霉(A.corymbifera))；放射毛霉属(例如，雅致放射毛霉(A.elegans))；淀粉霉属(例如，淀粉丝菌(A.rouxii))；囊托霉(Apophysomyces)；巴克斯霉属(例如，巴克斯毛霉(B.circina))；Benjaminiella属(例如，B.multispora)；丝枝霉属(例如，布雷丝枝霉(C.brefeldii))；卷霉属(例如，安地卷霉(C.angarensis))；科克霉属(例如，屈弯科克霉(C.recurvatus))；Dicranophora属(例如，D.fulva)；Ellisomyces属(例如，E.anomalus)；卷枝霉属(例如，雅致卷枝霉(H.elegans))；生丝毛霉属(例如，H.assamensis)；Kirkomyces属(例如，K.cordensis)；毛霉属(例如，M.amphibiorum)；寄生霉属(例如，寄生疫霉(P.parasitica))；Philophora属(例如，P.agaricina)；Pilaira属(例如，P.anomala)；小梨形菌属(例如，旋枝霉(P.circinans))；根毛霉属(例如，内生根毛霉(R.endophyticus))；Rhizopodopsis属(例如，R.javensis)；根霉属；拟小孢霉属(例如，伞拟小孢霉(S.umbellata))；联轭霉属(例如，大孢联轭霉(S.megalocarpus))；枝霉属(例如，T.elegans)；Thermomucor属(例如，T.indicae-seudaticae)；和接霉属(例如，Z.californiensis)。根霉属(例如)包括无接合孢子根霉(R.azygosporus)；R.caespitosus；同合根霉(R.homothallicus)；米根霉(R.oryzae)；小孢根霉(R.microsporus)、小孢根霉须状变种(R.microsporus var.rhizopodiformis)和希伯来根霉(R.schipperae)种。

如本文所使用的，术语“免疫原性的量”是指本发明的多肽或其片段或变体的特定表位可以引起宿主针对所述多肽或表达所述多肽的传染物的免疫应答的有效量。这个量通常在20μg到10mg抗原每剂量疫苗的范围内并取决于要治疗的受试者，受试者免疫系统合成抗体的能力和所需的保护程度。所需的免疫原的精确量可以通过多种方法来计算，如(例如)抗体滴度。术语有效量是指化合物或组合物足以提供所需效果的量。因此，如用于描述疫苗，有效量是指化合物或组合物(例如，抗原)足以产生或引起保护性免疫应答的量。相对于免疫组合物的有效量是足以引起免疫应答的量，而不管所述应答是否是保护性的。

“治疗有效量”将基于多肽、多核苷酸、抗体、抗体片段或组合物、疾病及其严重程度和要治疗的患者的年龄、体重等而改变，所有这些均在主治临床医师的技术范围内。已考虑与没有进行治疗的相比，治疗有效量的一种或多种本文所述的多核苷酸、多肽、抗体、抗体片段或组合物将改变患者中真菌病原体的渗透通过以及内皮细胞的损害。照此，真菌的病理发生会减少。治疗有效量与具有生物学作用的量(“生物学有效量”)是可区分的。本发明的多肽、多核苷酸、抗体、抗体片段或组合物可以具有一种或多种体外或甚至体内生物学作用，如降低毛霉菌CotH多肽的功能。然而，生物学作用可能不会导致任何如本文所述的临床可测量的治疗作用，如通过主治临床医师技术范围内的方法所确定的。

在一种实施方式中，可以使用本领域熟知的适合的载体将编码本发明的毛霉菌CotH多肽的核酸体内或体外递送到哺乳动物细胞中。适合于将毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段递送至哺乳动物细胞的载体包括病毒载体如反转录病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、疱疹病毒和非病毒载体，如质粒载体。这些载体对于提供治疗或免疫原性量的毛霉菌CotH多肽是有用的(参见，例如，1995年3月21日授权的美国专利申请No.5399346)。当靶向肌肉细胞、骨髓细胞或B细胞时，毛霉菌CotH多肽或核酸的治疗性递送可以是特别有用的，借此提供所编码的毛霉菌CotH多肽用于发展免疫应答。这种提供通常在本领域中作为DNA疫苗是已知的。

病毒基系统提供了能够将相对高水平的异源核酸引入到多种细胞中的优势。用于将本发明的编码毛霉菌CotH蛋白的核酸引入到哺乳动物细胞中的适合病毒载体在本领域中是熟知的。这些病毒载体包括，例如，单纯疱疹病毒载体(Geller等人，Science,241:1667-1669(1988))；牛痘病毒载体(Piccini等人，Meth.Enzymology,153:545-563(1987))；巨细胞病毒载体(Mocarski等人，Viral Vectors,Y.Gluzman和S.H.Hughes,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988,pp.78-84))；莫洛尼小鼠白血病病毒载体(Danos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:6460-6464(1988)；Blaese等人，Science,270:475-479(1995)；Onodera等人，J.Virol.,72:1769-1774(1998))；腺病毒载体(Berkner,Biotechniques,6:616-626(1988)；Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6094-6098(1992)；Graham等人，Meth.Mol.Biol.,7:109-127(1991)；Li等人，Human Gene Therapy,4:403-409(1993)；Zabner等人，NatureGenetics,6:75-83(1994))；腺病毒相关病毒载体(Goldman等人，HumanGene Therapy,10:2261-2268(1997)；Greelish等人，Nature Med.,5:439-443(1999)；Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:3906-3910(1999)；Snyder等人，Nature Med.,5:64-70(1999)；Herzog等人，NatureMed.,5:56-63(1999))；反转录病毒载体(Donahue等人，Nature Med.,4:181-186(1998)；Shackleford等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9655-9659(1988)；美国专利No.4405712、4650764和5252479和WIPO公开WO92/07573、WO90/06997、WO89/05345、WO92/05266和WO92/14829；和慢病毒载体(Kafri等人，Nature Genetics,17:314-317(1997))。

对于核酸的毛霉菌CotH多肽的治疗性施用有用的载体可以含有提供操纵性连接的核酸的组织特异性或可诱导表达的调控元件。本领域技术人员可以容易地确定允许毛霉菌CotH多肽或核酸在所需组织或细胞中表达的适当的组织特异性启动子或增强子。任何多种可诱导启动子或增强子还可以包括在用于毛霉菌CotH多肽或核酸的可调控表达的载体中。这些诱导系统包括，例如，四环素诱导系统(Gossen&Bizard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Gossen等人，Science,268:1766-1769(1995)；Clontech,Palo Alto,CA)；重金属诱导的金属硫蛋白启动子；对蜕皮激素或相关类固醇响应的昆虫类固醇激素，如米乐甾酮(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)；Yao等人，Nature,366:476-479(1993)；Invitrogen,Carlsbad,CA)；通过类固醇(如糖皮质激素和雌激素)诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)(Lee等人，Nature,294:228-232(1981))；和通过温度改变可诱导的热冲击启动子。

对于治疗性施用特别有用的诱导系统使用了可诱导启动子，可以调节所述启动子从而对施用于个体的给定水平的药物响应来递送一定水平的治疗性产品并且在不存在所述药物时所述治疗性产品很少表达或不表达。一个这种系统使用了修饰的腺病毒载体中的通过抗孕酮(如米非司酮)可诱导的Gal4融合蛋白(Burien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:355-360(1999))。另一种这种诱导系统使用药物雷帕霉素来诱导腺病毒相关病毒载体中含有FKBP12和FRAP的雷帕霉素结合域的转录激活因子的重建(Ye等人，Science,283:88-91(1999))。应理解可以将诱导系统的任意组合合并在任何适合的载体中，包括本文所公开的那些。这种可调控的诱导系统是有利的，这是因为可以通过施用于所述个体的药物的量来控制治疗性产品的表达水平，或者如果需要，可以通过终止所述药物的施用来终止治疗性产品的表达。

本发明另外提供了分离的抗毛霉菌CotH抗体，所述抗体对毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段具有特异反应性。例如，本发明的抗毛霉菌CotH抗体可以对具有氨基酸序列GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)或MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)的多肽具有特异反应性。抗毛霉菌CotH抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还提供了产生对毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段具有特异反应性的单克隆抗体的细胞系。

因此，本发明提供了特异性结合毛霉菌CotH多肽的抗体。如本文所使用的，术语“抗体”以其最广泛的含义用于包括多克隆和单克隆抗体以及这些抗体的抗原结合片段。对于本发明的抗毛霉菌CotH抗体，术语“抗原”表示天然或合成的毛霉菌CotH多肽或其片段。抗毛霉菌CotH抗体或这种抗体的抗原结合片段的特征在于对毛霉菌CotH多肽或其肽部分具有至少约1×10⁵M^-1的特异结合活性。因此，抗毛霉菌CotH抗体的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段保留了对毛霉菌CotH多肽的特异结合活性，并且它们包括在抗体的定义内。本领域技术人员可以容易地确定毛霉菌CotH多肽的特异结合活性，例如，通过将抗毛霉菌CotH抗体对毛霉菌CotH多肽的结合活性与非毛霉菌CotH多肽的对照多肽相比较。制备多克隆或单克隆抗体的方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988))。

另外，本发明的抗体可以是天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体及其抗原结合片段。可以使用固相肽合成构造，可以通过重组产生或者可以通过(例如)由可变重链和可变轻链组成的组合筛选文库(如通过Huse等人所述(Huse等人，Science246:1275-1281(1989)))获得这些非天然存在的抗体。制备(例如)嵌合抗体、人源化抗体、CDR接枝抗体、单链抗体和双功能抗体的这些及其他方法对于本领域技术人员来说是熟知的(Winter和Harris,Immunol.Today14:243-246(1993)；Ward等人，Nature341:544-546(1989)；Harlow和Lane，如上，1988)；Hilyard等人，Protein Engineering:A practical approach(IRL Press1992)；Borrabeck,Antibody Engineering,第2版，(Oxford University Press1995))。

可以使用毛霉菌CotH免疫原，如具有SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示的氨基酸序列的分离的毛霉菌CotH多肽或其免疫原性片段(其可以从天然来源制备或通过重组产生)或毛霉菌CotH多肽的肽部分来产生抗毛霉菌CotH抗体。如果抗原肽可以用于产生毛霉菌CotH特异性抗体，则毛霉菌CotH多肽的这些肽部分是功能性抗原片段。可以通过将半抗原与载体分子，如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝素(KLH)偶联来使得非免疫原性或弱免疫原性毛霉菌CotH多肽或其部分具有免疫原性。因此，在本发明的一些方面，本文所公开的CotH多肽的免疫原性片段可以结合至载体分子，如，但不限于KLH或BSA。多种其他载体分子和用于将半抗原偶联至载体分子的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，Harlow和Lane，如上，1988)。还可以通过将所述肽部分表达为与(例如)谷胱甘肽S转移酶(GST)、多聚组氨酸等的融合蛋白来产生免疫原性毛霉菌CotH多肽片段。用于表达肽融合蛋白的方法对于本领域技术人员来说是熟知的(Ausubel等人，如上)。

本发明还提供了检测样品中毛霉菌目生物存在的方法，该方法是通过将样品与毛霉菌CotH特异性抗体接触并检测抗体与样品的特异性结合的存在，借此检测样品中毛霉菌CotH多肽的存在进行的。毛霉菌CotH特异性抗体可以在诊断方法和系统中使用以检测样品中存在的毛霉菌CotH的水平。如本文所使用的，术语“样品”旨在表示包含或可能包含毛霉菌CotH核酸或多肽的任何生物流体、细胞、组织、器官或其部分。该术语包括存在于个体中的样品以及得自或来源于所述个体的样品。例如，样品可以是通过活组织检查获得的样品的组织切片或者是放置在或适应于组织培养的细胞。样品还可以是亚细胞部分或提取物，或者是粗的或基本纯化的核酸或蛋白质制备物。

毛霉菌CotH特异性抗体还可以用于本发明的毛霉菌CotH的免疫亲和或亲和色谱法纯化。另外，在本文中考虑了用于检测细胞中本发明的毛霉菌CotH蛋白的存在的方法，其包括在允许抗体与毛霉菌CotH多肽结合的条件下将细胞与特异性结合至毛霉菌CotH多肽的抗体接触，检测结合至毛霉菌CotH多肽的抗体的存在，并借此检测细胞中本发明的多肽的存在。就这些多肽的检测而言，所述抗体可以用于体外诊断或体内成像方法。

用于样品中靶标毛霉菌CotH多肽的体外检测的免疫学程序包括使用可检测的抗体的免疫测定。这些免疫测定包括，例如，免疫组织化学、免疫荧光、ELISA测定、放射免疫测定、FACS分析、免疫沉淀、免疫印迹分析、Pandex微量荧光测定、凝集测定、流式细胞术和血清诊断测定，它们在本领域中是公知的(Harlow和Lane，如上，1988；Harlow和Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1999))。

通过本领域中熟知的多种方式可以使抗体是可检测的。例如，可以直接将可检测的标志物连接到抗体上或者使用(例如)识别毛霉菌CotH特异性抗体的第二试剂间接连接。有用的标志物包括(例如)放射性核苷酸、酶、结合蛋白，如生物素、荧光团、发色团和化学发光标记物。

如本文所使用的，术语标记物以及在它们多种语法形式中的指示方式表示直接或间接参与可检测信号产生的单个原子和分子。任何标记物或指示方式可以与本发明的核酸探针、所表达的蛋白质、多肽片段或抗体分子有关。这些原子或分子可以单独使用或与其他试剂一起使用。这些标记物本身在临床诊断化学中是熟知的。

标记方式可以是荧光标记剂，所述荧光标记剂化学结合至抗体或抗原而不发生变性从而形成作为有用的免疫荧光示踪剂的荧色物(染料)。免疫荧光分析技术的说明可见于DeLuca,"ImmunofluorescenceAnalysis",Antibody As a Tool,Marchalonis等人主编，John Wiley&Sons,Ltd.,pp.89-231(1982)，该文献作为参考并入本文。

在一种实施方式中，指示组是酶，如辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶等。在另一种实施方式中，使用放射性元素作为标记剂。标记物与底物的连接，即核酸探针、抗体、多肽和蛋白质的标记在本领域中是熟知的。例如，可以通过培养基中所提供的放射性标记的氨基酸的代谢掺入来标记本发明的抗体。参见，例如，Galfre等人，Meth.Enzymol.,73:3-46(1981)。通过活化的官能团的蛋白质结合或偶联的传统方法是特别适用的。参见，例如，Aurameas等人，Scand.J.Immunol.,Vol.8,Suppl.7:7-23(1978)，Rodwell等人，Biotech.,3:889-894(1984)和美国专利No.4493795。

本发明的核酸、寡核苷酸，包括反义寡核苷酸、含有本发明的核酸的载体、转化的宿主细胞、多肽及其组合以及本发明的抗体，可以用于筛选化合物以确定化合物是否起到本发明多肽的可能的激动剂或拮抗剂的作用。这些筛选测定提供了有关本发明的多肽的功能和活性的信息，它可以导致能够与一种或多种类型的多肽、肽或蛋白质特异性相互作用的化合物的鉴别和设计。

因此，本发明提供了鉴别结合至毛霉菌CotH多肽的化合物的方法。本发明的蛋白质可以在竞争性结合测定中使用。这种测定可以接受多个化合物的快速筛选以确定能够结合至毛霉菌CotH多肽的化合物(如果有)。随后，可以对发现结合的那些化合物进行更详细的测定，以进一步确定这些化合物是否作为本发明的毛霉菌CotH多肽的调节剂、激动剂或拮抗剂。结合至和/或调节本发明的毛霉菌CotH多肽的化合物可以用于治疗通过本发明的毛霉菌CotH多肽介导的多种病理。

鉴别与蛋白结合域相互作用的细胞蛋白质的多种结合测定是本领域中已知的，并且包括(例如)酵母双杂交筛选测定(参见，例如，美国专利No.5283173、5468614和5667973；Ausubel等人，如上，1999；Luban等人，Curr.Opin.Biotechnol.6:59-64(1995))和使用细胞提取物的亲和柱色谱法。通过合成或表达含有多个毛霉菌CotH序列或缺失的多肽片段，可以容易地鉴别毛霉菌CotH的结合界面。

在本发明的另一种实施方式中，提供了鉴别调节本发明的毛霉菌CotH多肽活性的化合物的生物测定。根据该方法，在(例如)存在对毛霉菌CotH信号通路响应的报告基因构建体的情况下，使本发明的多肽与“未知”或测试物质接触，在与“未知”或测试物质接触后监控所述多肽的活性，并且将导致报告基因构建体表达的那些物质鉴别为毛霉菌CotH多肽的功能性配体。这些报告基因测定和系统对于本领域技术人员来说是公知的(Ausubel等人，如上，1999)。另外，可以使用毛霉菌CotH的启动子区来产生报告基因构建体并且筛选提高或降低毛霉菌CotH基因启动子活性的化合物。这些化合物还可以用于改变毛霉菌CotH的表达。

根据本发明的另一种实施方式，重组表达本发明的多肽的转化的宿主细胞可以与测试化合物接触，并且然后可以通过比较毛霉菌CotH介导的响应(例如，通过在存在和不存在测试化合物的情况下报告基因的表达或者通过比较测试细胞或对照细胞对化合物的存在的响应)来评价它的调节作用。

如本文所使用的，调节本发明多肽活性的化合物或信号是指改变毛霉菌CotH多肽活性从而使得本发明多肽的活性在存在所述化合物或信号时与不存在所述化合物或信号时相比不同的化合物或信号。具体地，这些化合物或信号包括激动剂和拮抗剂。激动剂涵盖了激活毛霉菌CotH蛋白表达或生物活性的化合物或信号。作为另外一种选择，拮抗剂包括干扰毛霉菌CotH表达或生物活性的化合物或信号。通常，拮抗剂的作用观察为阻止激动剂诱导的蛋白的激活。拮抗剂包括竞争性和非竞争性拮抗剂。

鉴别调节毛霉菌CotH多肽表达的化合物的测定可以包括检测毛霉菌CotH多肽丰度对所述细胞与调节毛霉菌CotH活性的化合物接触响应的变化。用于检测多肽表达变化的测定包括(例如)使用毛霉菌CotH特异性毛霉菌CotH抗体的免疫测定，如免疫印迹法、免疫荧光法、免疫组织化学法和免疫沉淀测定，如以上所述的。

如本领域技术人员所理解的，用于鉴别调节毛霉菌CotH活性的化合物的测定方法通常需要与对照进行比较。一种类型的“对照”是与暴露于所述化合物的测试细胞或试验培养物基本相同地处理的细胞或培养物，其区别在于“对照”细胞或培养物不暴露于所述化合物。另一种类型的“对照”细胞或培养物可以是与测试细胞相同的细胞或培养物，除了“对照”细胞或培养物不表达毛霉菌CotH多肽之外。因此，将转染细胞对化合物的响应与相同反应条件下“对照”细胞或培养物对相同化合物的响应或缺少响应相比较。

本发明还提供了通过将毛霉菌CotH多肽与有效调节量的调节毛霉菌CotH活性的试剂接触来调节毛霉菌CotH多肽介导的活性的方法。毛霉菌CotH活性可以是(例如)与GRP78的结合。本发明还提供了调节与细胞粘附的水平的方法。

在一些实施方式中，本发明提供了检测样品中毛霉菌CotH核酸分子的方法。本发明的这些方法可以包括以下步骤：将样品与本文所公开的两种或更多种寡核苷酸接触，扩增核酸分子，并且检测所述扩增。应理解用于扩增核酸的方法对于本领域技术人员来说是公知，可以容易地选择所述方法并将其应用于本发明所述的方法。例如，在一些方面，使用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。在本发明的一些方面，在本发明所述的方法中使用的两种或更多种寡核苷酸中的至少一种包括具有以下核酸序列的寡核苷酸：ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ IDNO：33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO：34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO：35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO：36)、AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO：37)，或者本文所公开的任何寡核苷酸。

本发明还提供了通过检测来自患者的样品中是否存在毛霉菌目生物来诊断受试者中毛霉菌病感染的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供来自受试者的测试样品；(b)使所述样品与可以在适合的条件下结合本发明的核酸或多肽的试剂接触，其中所述条件允许所述试剂与所述核酸或多肽特异性结合；和(c)将测试样品中特异性结合的量与对照样品中特异性结合的量相比较，其中与对照样品相比，测试样品中特异性结合的量的增加或减少是对毛霉菌病感染的诊断。在本发明的一些方面，所述试剂选自如本文所述的抗毛霉菌CotH抗体或CotH寡核苷酸。

根据本发明的另一种实施方式，提供了诊断系统，优选地以试剂盒形式提供，其包含处于适合的包装材料中的至少一种本发明的核酸或抗体。含有核酸的诊断试剂盒来源于本文所述的毛霉菌CotH编码核酸。在一种实施方式中，例如，所述诊断核酸来源于SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中的任一种并且可以是本发明的寡核苷酸。在本发明的一些方面，至少一种寡核苷酸包括选自下列的核酸序列：ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQID NO：33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO：34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO：35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO：36)、AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO：37)，或者本文所公开的任何寡核苷酸。本发明的诊断系统对于测定基因组DNA或mRNA中编码毛霉菌CotH的核酸存在与否是有用的。

适合的诊断系统包括以足以进行至少一种测定的量作为单独包装的化学试剂的至少一种本发明的核酸或抗体。对于含有本发明的核酸的诊断试剂盒，所述试剂盒通常含有两种或更多种核酸。当所述诊断试剂盒将在PCR中使用时，所述试剂盒将含有可以用作PCR引物的至少两种寡核苷酸。本领域技术人员可以容易地将本发明的核酸探针和/或引物或本发明的抗体与用于实践如本文所述的本发明方法的适合的缓冲液和溶液结合来合并到试剂盒形式。含有毛霉菌CotH抗体的试剂盒可以含有提供进行测定(例如，ELISA或其他免疫测定)的适合条件的反应混合物以用于确定样品中毛霉菌CotH多肽的表达水平，并且所述试剂盒可以含有对照样品，所述对照样品含有已知量的毛霉菌CotH多肽以及(如果需要)对抗毛霉菌CotH抗体特异的第二抗体。

本发明的试剂盒的内容物，例如，毛霉菌CotH核酸或抗体包含在包装材料中，优选地以提供无菌、无污染的环境。另外，包装材料含有显示可以如何使用试剂盒内材料来检测特定毛霉菌CotH序列或毛霉菌CotH多肽的存在与否或者诊断与毛霉菌病有关的病症的存在或易患性的说明。使用说明通常包括描述试剂浓度或者至少一种测定方法参数的明确表达，如要混合的试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物的维持时间、温度、缓冲条件等。

应理解在本文所提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明的多个实施方式的活动的修改。因此，以下实施例旨在说明但不限制本发明。

实施例1

细胞表面CotH3蛋白有利于在内皮细胞的真菌侵袭期间结合至宿主GRP78

从米根霉(R.oryzae)幼殖体的原生质体的上清液收集细胞壁材料。通过使用抗Grp78Ab的远端免疫印迹分析分离结合至rGrp78的米根霉(R.oryzae)配体并通过MALDI-TOF-MS/MS分析鉴别(图1)。简言之，切下所关心的蛋白质斑点并送至UCLA W.M.Keck蛋白质组学中心进行鉴定，该鉴定是在配备有Eksigent(Dublin,CA)NanoLiquid色谱-1D plus系统和Eksigent自动取样器的Thermo LTQ-Orbitrap XL质谱仪(San Jose,CA)上进行的。将斑点内的蛋白质胶内胰蛋白酶消化，如Shevchenko等人所述(Shevchenko等人,(1996).Proc Natl Acad Sci U S A93:14440-14445；Shevchenko等人,Anal.Chem.,68(5):850-8(1996))。将洗脱的肽加载到CVC Microtech(Fontana,CA)35mm长，100μm ID的C18预捕集柱上，并用100％缓冲液A(含有0.1％甲酸的2％乙腈)以5μl/min的流速清洗10分钟。使用300nl/min的流速，将肽在15cm NewObjective ProteoPep IntegraFrit柱(Woburn,MA)上分离。使用了以下洗脱梯度：0-15分钟，0-30％缓冲液B(含有0.1％甲酸的98％乙腈)，15-20min30-80％缓冲液B，和20-22分钟80％缓冲液B。然后，将柱用缓冲液A再平衡13分钟。使用2300V的电喷雾电离电压，45V的毛细管电压，130V的管镜电压和200℃的毛细管温度，将洗脱分析物以正离子模式喷雾到LTQ-Orbitrap MS中。进行了信息关联采集(Informationdependent acquisition)，其中使用60K分辨率的FTMS扫描在300-1600的m/z范围内选择了6个最强烈的离子，并使用归一化碰撞能源为35的宽带碰撞诱导裂解和LTQ检测对它们进行MS-MS。从进一步的MS-MS的60秒的一段时间内排除了峰。

使用Matrix Science MASCOT Daemon搜索引擎(Boston,MA)，对米根霉(Rhizopus oryzae)99-880数据库(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/rhizopus_oryzae/multihome.html)查询所得的MS/MS光谱。使用了以下查询参数：肽容差：±10ppm，MS/MS容差：±0.3Da，最大漏切位点：2，固定修饰：羧甲基(C)和可变修饰：脱酰胺(ND)和氧化(M)。在特定项目内鉴别的蛋白质包括具有排名第1的最少两种唯一的肽的那些和离子得分p<0.05的那些。

通过RT-PCR检测了与内皮细胞培育的米根霉(R.oryzae)中假定配体的表达(图4)。通过在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中异源表达配体确认了配体与GRP78的相互作用(图6)，并且将它对内皮细胞和过表达GRP78的CHO细胞的粘附和侵袭与用空质粒转化的酿酒酵母(S.cerevisiae)(对照)相比较(图8)。

三种ORF与来自几株菌的与孢壁形成有关的CotH蛋白家族具有同源性：

○RO3G_05018，CotH1

○RO3G_08029，CotH2

○RO3G_11882，CotH3

第四种ORF(RO3G_16295)广泛存在于其他病原真菌中，但是看起来这些ORF中无一编码具有鉴别功能的蛋白。已鉴别的CotH多肽及其他细菌CotH蛋白之间的序列比较显示了极小的序列同一性(图17和表1)。

表1.根霉菌属CotH和细菌CotH的序列相似性(不同大小)

RO3G_16295似乎是常见蛋白，在多种不同的真菌以及少数细菌中可见其同源物(通常氨基酸具有～25％的同一性)(图18-26)。所有这些蛋白质均未鉴定。仅举几个例子：

-柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)ATCC10500(EED23986)；

-马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)ATCC18224(XP_002144175)；

-黑曲霉(Aspergillus niger)(XP_001392236)；

-构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(XP_658934)；

-玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(XP_760027)；

-粗球孢子菌(Coccidioides immitis)(XP_001243211)；

-粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(XP_956792)；

-新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(XP_775558)；和

-浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)(EFD65170)。

在与人脐静脉内皮细胞相互作用的米根霉(R.oryzae)幼殖体中表达了CotH3和较小程度的CotH2(图4)。米根霉(R.oryzae)孢子表达了CotH1，但是与内皮细胞相互作用的幼殖体不表达(图3)。尽管远端免疫分析鉴别了第四种ORF(RO3G_16295)，但是与内皮细胞相互作用的米根霉(R.oryzae)幼殖体不表达该基因。表达CotH3和较小程度的CotH2的酿酒酵母特异性结合内皮细胞GRP78(图6)。非粘附酿酒酵母中CotH3的异源表达促进内皮细胞和过表达GRP78的CHO细胞的粘附和后续侵袭(图58)。来自多个毛霉菌种的CotH3多肽之间的序列对比显示多个种之间>90％的序列同一性(图7和表2)。

这些结果显示结合至GRP78的CotH3或CotH2辅助了内皮细胞的米根霉(R.oryzae)侵袭。

实施例II

CotH3和CotH2是结合至内皮细胞GRP78的唯一的毛霉菌侵袭素。

米根霉(R.oryzae)和培养条件

在本文所公开的实验中使用了几种临床毛霉菌分离株。例如，米根霉(R.oryzae)99-880和毛霉菌种99-932分离自感染患者的大脑样品，而米根霉(R.oryzae)99-892和根霉菌种99-1150分离自感染患者的肺样品(样品得自Fungus Testing Laboratory,University of Texas Health Science Centerat San Antonio)。Cunninghamella bertholletiae182也是临床分离株，它是Tomas Walsh博士(NIH)赠送的。伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)也是得自DEFEAT毛霉菌临床研究的临床分离株(Spellberg等人，(2102),JAntimicorbiol Chemother67(3):715-22)。

毛霉菌在37℃在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA,BD Diagnostic)板上生长3-5天，而烟曲霉(A.fumigatus)和白色念珠菌(C.albicans)在37℃分别在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)板上生长2周和48小时。在不含内毒素的含有0.01％吐温80的达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(PBS)中收集孢囊孢子，用PBS清洗，并用血球计数器计数以制备最终接种物。对于白色念珠菌(C.albicans)，生物在30℃在YPD培养基[1％酵母提取物(Difco Laboratories)，2％细菌蛋白胨(Difco)和2％葡萄糖(Sigma)]中生长过夜后在PBS中收集芽生孢子。要形成幼殖体，根据研究中的测定，将孢子在37℃在液体YPD培养基中振荡培育1-3小时。除了其中用PBS(加Ca²⁺和Mg²⁺)清洗幼殖体两次的分离内皮细胞受体实验外，对于所有所使用的测定，用不含谷氨酰胺的RPMI1640(Irvine Scientific)将幼殖体清洗两次。

CotH基因在酿酒酵母中的异源表达

通过使用Phusion高保真度PCR试剂盒(New England Biolabs)和表3中所列的引物，从提取自生长在PDA板上的米根霉(R.oryzae)孢子的cDNA将CotH1、CotH2和CotH3的整个ORF通过PCR扩增。将pESC-LEU酵母双表达载体(Stratagene)用于克隆并在Gal1启动子下表达这些基因。用BamHI和SalI消化载体。根据生产商的说明，通过使用In-Fusion2.0Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories)将来自每个CotH基因的PCR扩增插入物克隆到pESC-LEU中。通过聚乙二醇-LiOAc法，将所产生的酵母表达载体单独转化至酵母菌株LL-20，并在缺少亮氨酸的固体合成葡萄糖基本培养基上筛选转化体。用空质粒转化的酿酒酵母用作对照。

抗CotH抗体产生和细胞表面定位

针对预测为抗原性的两种肽产生了兔多克隆抗体。肽GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)和MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)与KLH偶联并用于商业化接种兔(ProMabBiotechnologies Inc.,Richmond,CA)。将从所接种的兔纯化的IgG用于检测CotH蛋白在与内皮细胞相互作用的酿酒酵母和米根霉(R.oryzae)上的细胞表面定位(Liu等人，J.Clin.Invest.,120:1914-1924(2010))。

对于CotH蛋白向酿酒酵母细胞表面的定位，将表达单个CotH基因的芽生孢子先以1:50与抗CotH IgG培育，随后以1:100与异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的山羊抗兔IgG培育。用Leica共聚焦显微镜对染色细胞成像，并且用微分干涉差显微镜(DIC)使整个酵母细胞显象。

对于检测CotH蛋白在米根霉(R.oryzae)上的表达，孢子在37℃在YPD中萌发3小时。用抗CotH IgG以1:50对幼殖体染色，然后以1:100用FITC-标记的山羊抗兔IgG染色。将配备有以488nm发射的氩激光器的FACSCaliber(Becton Dickinson)仪用于流式细胞分析。用515/40带通滤波器读取荧光发射。用对数放大器采集荧光数据。使用CELLQUEST软件计算10⁴次事件的平均荧光强度。

内皮细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞

通过Jaffe等人所述的方法从脐静脉内皮细胞采集内皮细胞(Jaffe等人，J.Clin.Invest.52:2745-2756(1973))。通过使用胶原酶收获细胞，并将收集的细胞在富含10％胎牛血清、10％精制小牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(所有均来自Gemini Bio-Products,CA)的M-199(Gibco BRL)中生长。第二代细胞在96孔组织培养板(Costar,Van Nuys,CA)中在纤连蛋白(BD Biosciences)上生长至汇合。所有培育均在37℃在5％CO₂中。使用生色鲎阿米巴样细胞溶解物测定(BioWhittaker,Inc.,Walkersville,MD)测试试剂的内毒素，并且内毒素浓度小于0.01IU/ml。内皮细胞采集经过了Harbor-UCLA Medical Center的Los Angeles Biomedical Research Institute的机构审查委员会的批准。来源于工程设计以过表达GRP78的亲代DHFR缺陷性CHO细胞的CHO细胞系C.1是Randall Kaufman博士赠送的(Morris等人，J.Biol.Chem.,272:4327-4334(1997)；Reddy等人，J.Biol.Chem.,278:20915-20924(2003))。

内皮细胞膜蛋白的提取

根据Isberg和Leong所述的方法提取内皮细胞膜蛋白(Isberg和Leong,Cell60:861-871(1990))。简言之，将100mm直径的组织培养盘中汇合的内皮细胞用含有Ca²⁺和Mg²⁺的温DPBS(PBS-CM)清洗两次，然后在37℃，5％CO₂中在PBS-CM中与Ez-Link Sulfo-NHS-LS生物素(0.5mg/ml,Pierce)一起培育12分钟。然后，用冷PBS-CM大量清洗细胞并从组织培养盘中刮下。通过在4℃，以500×g离心5分钟来采集内皮细胞，然后通过在含有5.8％正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(w/v)(Cal BioChem)和蛋白酶抑制剂(1mM苯甲基磺酰氟、1μg/ml胃酶抑素A、1μg/ml亮肽素和1μg/ml抑肽酶)(Sigma)的PBS-CM中在冰上培育20分钟来溶解细胞。通过在4℃以5000×g离心5分钟来除去细胞碎片。采集上清液，并在4℃以100000×g离心1h。使用Bradford法(Bio-Rad)确定所得上清液中内皮细胞蛋白的浓度。

CotH2/CotH3的RNA干扰

使用先前所述的RNA干扰(RNAi)技术(Ibrahim等人，Mol.Microbiol.,77:587-604(2010))来抑制米根霉(R.oryzae)中CotH2和CotH3的表达。将CotH2和CotH3ORF中共有的450bp片段通过PCR扩增并在根霉菌表达载体pPdcA-Ex的控制下作为倒位重复克隆(Mertens等人，Archives ofmicrobiology186:41-50(2006))。另外，在重复之间包含来自根霉菌pdcA基因的内含子(Skory,Curr.Microbiol.,47:59-64(2003))以用作稳定预期dsRNA结构的接头(Nakayashiki等人，Fungal Genet.Biol.,42:275-283(2005)；Wesley等人，Plant J.,27:581-590(2001))。使用biolistic传递系统(Skory,Mol.Genet.Genomics268:397-406(2002))(BioRad)将所产生的质粒转化到米根霉(R.oryzae)pyrF突变体中，并在缺少尿嘧啶的基本培养基上选择转化体。

表达CotH的酿酒酵母的GRP78结合

将表达CotH1、CotH2、CotH3的酿酒酵母细胞(8×10⁸)或空质粒在冰上与250μg生物素-标记的内皮细胞表面蛋白一起在PBS-CM加1.5％正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和蛋白酶抑制剂中培育1h。通过用该缓冲液清洗三次洗去未结合的内皮细胞蛋白质。用6M脲(Fluka)将保持结合至真菌细胞的内皮细胞蛋白洗脱两次，并且将上清液合并，并用Microcon离心过滤器(10000MWCO，Millipore)浓缩至适当的体积。然后，在10％SDS-PAGE上分离所述蛋白，并转移至PVDF-plus膜上(GE Water&ProcessTechnologies)。然后用Western封闭试剂(Roche)处理所述膜，并且分别用兔抗GRP78抗体(Abcam)，接着用HRP-结合的山羊抗兔IgG(Pierce)第二抗体探测。在与SuperSignal West Dura持久性底物(Pierce)一起培育后，使用CCD照相机检测信号。

真菌与内皮细胞或CHO细胞的相互作用

使用先前所述的差异荧光测定的改变形式确定了内皮细胞或CHO细胞内吞的生物数目(Ibrahim等人，Infect.Immun.,63:4368-4374(1995))。简言之，将24孔细胞培养板中的12mm玻璃盖玻片用纤连蛋白涂覆至少4小时，并且接种内皮细胞或CHO细胞直至汇合。用预热的HBSS清洗2次后，用在RPMI1640培养基中已萌发1小时的10⁵个表达CotH的酿酒酵母细胞或米根霉(R.oryzae)细胞感染所述细胞。培育3小时后，将细胞固定在3％多聚甲醛中并用1％Uvitex(由Jay Isharani,Ciba-Geigy,Greensboro,N.C.赠送)将细胞染色1小时，Uvitex特异性结合至真菌细胞壁的几丁质。用PBS清洗3次后，将盖玻片固定在具有一滴ProLong金防褪色试剂(Molecular Probes)的玻璃载玻片上并用指甲油密封。通过相差显微镜确定细胞相关生物(即粘附至单层的幼殖体)的总数。通过表荧光显微镜法检查相同视野，并且确定未内化的幼殖体(它是明亮的荧光)的数目。通过用可见生物的总数减去荧光生物的数目来计算胞吞生物的数目。在每个载玻片上的20-40个不同的视野中对至少400个生物计数。将每组两个载玻片用于每个实验，并且在不同天将实验重复进行三次。

通过使用铬(⁵¹Cr)释放测定对米根霉(R.oryzae)引起的内皮细胞或CHO细胞受损进行定量(Ibrahim等人，J.Infect.Dis.,198:1083-1090(2008))。简言之，将在含有可拆卸孔的96孔组织培养板中生长的内皮细胞或CHO细胞与1μCi/孔的Na₂ ⁵¹CrO₄(ICN,Irvine,CA)在M-199培养基(用于内皮细胞)或α伊格尔基础培养基(用于CHO细胞)中培育16h。在实验当天，吸出未掺入的⁵¹Cr，并用热汉克斯平衡盐溶液(IrvineScientific,Irvine,CA)将孔清洗两次。用悬浮在150ml补充有谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Irvine Scientific)中的真菌幼殖体(1.5×10⁵个，萌发1h)感染细胞。通过在补充有谷氨酰胺但没有米根霉(R.oryzae)的RPMI1640培养基中培育内皮细胞或CHO细胞来确定自发⁵¹Cr释放。在37℃，在5％CO₂培育箱中培育3小时后，从每个孔中吸出50％的培养基并转移到玻璃管中，并且手动将细胞分离并放置在另一套管中。通过γ计数确定吸出物中⁵¹Cr的量和分离的孔。每个孔中内皮细胞掺入的⁵¹Cr的总量等于吸出培养基中每分钟的放射性计数与相应分离的孔中的放射性计数之和。将数据对掺入每个孔中的示踪剂的量的变化修正后，通过以下公式计算⁵¹Cr的特异性内皮细胞释放百分比：[(实验释放×2)-(自发释放×2)]/[总掺入-(自发释放×2)]。每个试验条件至少重复测试三次并且实验至少重复1次。

对于抗体阻止由米根霉(R.oryzae)所引起的粘附、胞吞或受损，除了在加入米根霉(R.oryzae)幼殖体前1小时，将内皮细胞与50μg抗CotH抗体(纯化的IgG)或与得自用预测为抗原性的CotH3肽接种前的相同的兔的血清培育之外，如上所述进行测定。

体内毒力研究

对于体内研究，在真菌攻击前10天通过单次腹膜内注射190mg/kg链脲佐菌素在0.2ml柠檬酸缓冲液中的溶液使ICR雄性小鼠(>20g)(TaconicFarms)获得DKA(Ibrahim等人，Antimicrob.Agents Chemother.,47:3343-3344(2003))。在链脲佐菌素处理后7天，在所有小鼠中确认了糖尿和酮尿。在用氯胺酮(66mg/kg)和赛拉嗪(4.8mg/kg)使小鼠镇静后，以2.5×10⁵个孢子的靶标接种物通过气管内途径用真菌孢子感染糖尿病酮症酸中毒小鼠。为了确认接种物，将来自接种后立即处死的三只小鼠的肺在PBS中均质化并在含有0.1％triton的PDA板上定量培养，并且在37℃在24h培育期后对菌落计数。主要效力终点是濒死时。在一些实验中，作为第二终点，通过如前所述的qPCR测定确定了感染后+2天肺和脑(主要靶标器官)中的真菌载量(Ibrahim等人，Antimicrob.Agents Chemother.,49:721-727(2005))。值表示为log10孢子当量/g组织。在10％锌-福尔马林中固定后，对所采集器官的切片进行组织病理学检查。将固定的器官包埋在石蜡中，并且用苏木精和伊红(H&E)或者过碘酸-希夫氏染色剂对5mm切片染色以检测米根霉(R.oryzae)菌丝(Ibrahim等人，J.Clin.Invest.,117:2649-2657(2007))。

对于CotH基因的体内表达，从用野生型米根霉(R.oryzae)气管内感染后48h的小鼠采集肺和脑，或者将用空质粒或用RNA-i构件的转化体在液氮中急冻并处理用于使用Tri Reagent溶液(Ambion)的RNA提取。使用表3中所列的引物，用RETROscript(Ambion)进行反转录。对于定量RT-PCR，进行了SYBR绿测定。将组成型表达的ACT1用作所有反应的对照。使用ABI PRISM7000序列检测系统用户手册2(Applied Biosystems)进行计算和统计分析。

被动免疫

为了检测抗CotH蛋白的抗体是否保护小鼠不受毛霉菌病的影响，在如上所述气管内感染小鼠前2小时，通过腹膜内注射用1mg纯化的针对GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)或者MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)所产生的兔抗CotH IgG使糖尿病酮症酸中毒小鼠免疫。类似地感染对照小鼠，但对照小鼠接受了来自用CotH3肽接种前的相同兔的类似剂量。感染后3天，引入重复剂量的抗体或对照血清(接种前)。主要效力终点是濒死时。

统计学分析

通过非参数维尔克松秩和检验比较了CotH表达中的差异和真菌-内皮细胞的相互作用。将非参数log-秩和检验用于确定存活时间中的差异。认为P值<0.05的比较是显著的。

结果

结合至内皮细胞GRP78的假定的米根霉(R.oryzae)配体的分离

为了鉴别结合至内皮细胞GRP78的米根霉(R.oryzae)配体，从米根霉(R.oryzae)幼殖体的原生质体的上清液中收集了细胞壁材料(Michielse等人，Mol.Genet.Genomics,271:499-510(2004))。在存在渗透压稳定剂(例如山梨糖醇)的情况下培育原生质体能够使细胞壁再生，并且在再生期间，细胞壁成分释放到上清液中(Pitarch等人，Mol.Cell.Proteomics,5:79-96(2006)；Pitarch等人，Electrophoresis,20:1001-1010(1999))。2h培育期后，(Michielse等人，Mol.Genet.Genomics,271:499-510(2004))将原生质体成粒，并将上清液在存在蛋白酶抑制剂的情况下灭菌。浓缩上清液，并测量蛋白质浓度。除了没有原生质体外，类似地处理阴性对照样品。使用重组人Grp78和抗Grp78Ab的远端免疫印迹分析(Wu等人，Nat.protoc.,2:3278-3284(2007))显示从结合至Grp78p的米根霉(R.oryzae)原生质体的上清液采集的4条条带的存在。切下这些条带，并通过MALDI-TOF-MS/MS分析进行蛋白鉴定。在C-末端用GPI锚序列，在N-末端用信号肽仅鉴别出预测为细胞表面蛋白的4个ORF，并且鉴别出多个预测的N-和O-糖基化位点。3个ORF(即RO3G_05018、RO3G_08029和RO3G_11882)在氨基酸水平上与来自几种菌的与芽孢外被形成有关的CotH蛋白家族具有17％的有限同源性(Giorno等人，J.Bacteriol.,189:691-705(2007)；Naclerio等人，J.Bacteriol.,178:6407(1996))。这些命名为CotH1(RO3G_05018)、CotH2(RO3G_08029)和CotH3(ro3g_11882)。第4个ORF RO3G_16295广泛存在于多种真菌和一些细菌中，而无鉴别的功能。CotH2和CotH3在氨基酸水平上具有77％的特异性，它们彼此密切相关，而CotH1的相关性则相距较远(图51b)。第4个ORF在氨基酸水平上与三种CotH蛋白的整体同一性为10％。通过搜索米根霉(R.oryzae)(delemar)99-880基因组数据库，发现了两种更相关的ORF(在氨基酸水平上具有66％的同源性)并且预测它们编码GPI锚蛋白。这两种ORF(RO3G_09276；和RO3G_01139)与CotH1、CotH2、CotH3蛋白具有较远的同源性(在氨基酸水平上20-24％)。这些ORF分别命名为CotH4和CotH5。

还检查了在已知会导致人毛霉菌病的其他毛霉菌中这类基因存在的可能性。使用覆盖整个CotH3ORF(1.9kb)的引物，从临床分离物扩增了条带，所述临床分离物包括米根霉(R.oryzae)99-892、毛霉菌种99-932、伞状毛霉菌、Cunninghamella bertholletiae和根毛霉。这些PCR扩增条带的序列分析显示了在核苷酸和预测氨基酸水平上与米根霉(R.oryzae)99-880CotH3大于90％的同一性。总体而言，这些研究显示了CotH基因家族对于毛霉菌病试剂的唯一性。

在米根霉(R.oryzae)与内皮细胞相互作用期间表达了CotH2和CotH3。

基于本文所公开的结果，假设如果任何分离的蛋白代表GRP78的真菌配体，那么所述蛋白必须在米根霉(R.oryzae)与内皮细胞相互作用期间表达。由于在幼殖体中米根霉(R.oryzae)结合内皮细胞GRP78，因此研究了孢子或幼殖体中这四种ORF的表达。所有CotH基因在孢子形式中表达，仅有CotH3在米根霉(R.oryzae)幼殖体中表达。重要地，当米根霉(R.oryzae)幼殖体与内皮细胞培育时，CotH2和CotH3均表达(图52B)，其中与CotH1和CotH2相比，CotH3分别提高了16倍和4倍(图52C)。最终，在米根霉(R.oryzae)孢子或幼殖体中(图52A)或者在与内皮细胞相互作用的米根霉(R.oryzae)幼殖体中(图52B)，第四ORF RO3G_16295不表达。这些结果显示CotH3和较小程度的CotH2是人细胞侵袭期间与GRP78相互作用的假定候选。

表达CotH2和CotH3的酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞结合GRP78并且粘附至并侵袭内皮细胞和过表达GRP78的CHO细胞。

为了研究CotH1、CotH2和CotH3在与GRP78受体的相互作用中的作用，在无粘附无侵袭的酿酒酵母中异源表达CotH2或CotH3。测试了转化的酵母细胞特异性结合内皮细胞GRP78的能力。预测为抗原性的和表面表达的抗两种CotH3肽的抗体(GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)和MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40))识别表达CotH3和较小程度的CotH2的酿酒酵母(S.cerevisiae)，但不能识别表达CotH1的细胞(图53)。表达CotH3的酿酒酵母细胞主要结合来自内皮细胞膜蛋白提取物的GRP78。表达CotH2的酵母细胞也结合来自相同提取物的GRP78，但是表达CotH1的酿酒酵母不结合(图54A)。这些结果显示在内皮的米根霉(R.oryzae)侵袭期间，CotH3和较小程度的CotH2与内皮细胞GRP78相互作用。为了确认该假设，检验了转化的酵母细胞体外粘附和侵袭内皮细胞的能力。

与空质粒相比，表达CotH1的酿酒酵母在内皮细胞的粘附或胞吞(侵袭)中没有提高。相反，与表达CotH1的酿酒酵母或用空质粒转化的那些相比，表达CotH2或CotH3的酵母细胞在内皮细胞的粘附和侵袭中提高多倍(图54B)。重要地，与表达CotH2的酵母细胞相比，表达CotH3的细胞具有显著更高的粘附和侵袭内皮细胞的能力。为了检验这种对内皮细胞提高的粘附和侵袭是否是由于与GRP78的相互作用，将表达CotH1、CotH2、CotH3或空质粒的酿酒酵母粘附和侵袭亲代CHO细胞的能力与过表达GRP78的CHO细胞进行比较(Morris等人，J.Biol.Chem.,272:4327-4334(1997)；Reddy等人，J.Biol.Chem.,278:20915-20924(2003))。

仅表达CotH2或CotH3的酵母细胞在粘附和侵袭过表达GRP78的CHO细胞中具有显著提高(图54C)。表达CotH1、CotH2或CotH3的酵母细胞显示结合和侵袭亲代CHO细胞的能力未提高。总体而言，这些数据显示CotH3和较小程度的CotH2代表了与内皮细胞GRP78相互作用期间米根霉(R.oryzae)的粘附素/侵袭素。

CotH3蛋白是米根霉(R.oryzae)侵袭素。

因为先前表明真菌的胞吞是米根霉(R.oryzae)导致内皮细胞受损的必要条件，(Ibrahim等人，Infect.Immun.73:778-783(2005)；Liu等人，J.Clin.Invest.,120:1914-1924(2010))，因此研究了阻断CotH3的功能或表达来保护内皮细胞不受米根霉(R.oryzae)引起的胞吞和后续的损害。通过添加兔抗CotH3多克隆抗体终止了米根霉(R.oryzae)幼殖体的胞吞，但是不能终止粘附，但添加采集自相同动物的免疫前血清不能(图55A)。使用抗CotH3抗体，米根霉(R.oryzae)幼殖体所引起的内皮细胞损伤降低了>40％(图55B)。

为了补充抗体阻断研究，研究了CotH3和CotH2表达抑制以确定它们对粘附、胞吞和内皮细胞受损的影响。使用先前所述的RNA-i法(Ibrahim等人，Mol.Microbiol.,77:587-604(2010))，将～400bp的片段用于抑制一个构件中的两个基因。与用空质粒转化的米根霉(R.oryzae)pyrf突变体相比，在用将PyrF锚定为选择标志物的RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)pyrf突变体的两个克隆中(即Trans2和Trans6)(Skory和Ibrahim，Curr.Genet.52:23-33(2007))，CotH2和CotH3的表达几乎完全终止(图56A)。

然后，使用如本文所述的抗CotH3多克隆抗体通过流式细胞术测定了CotH2和CotH3在所构建的突变体上的细胞表面表达。与野生型或用空质粒转化的米根霉(R.oryzae)相比，用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)表达较少的细胞表面CotH2和CotH3蛋白(图56B)。与野生型或空质粒转化的细胞相比时，这些RNA-i转化体在生长速率、细胞大小或萌发方面无差异。然而，CotH2和CotH3的米根霉(R.oryzae)细胞表面表达的减少导致米根霉(R.oryzae)幼殖体的内皮细胞胞吞和后续的内皮细胞损害显著减少(图57A和57B)。这些结果表明对于通过米根霉(R.oryzae)的内皮细胞的最大侵袭来说，CotH3和CotH2是需要的。

为了进一步证明CotH3和CotH2起到通过结合至GRP78的侵袭素的作用，将具有CotH3和CotH2RNA-i构件的米根霉(R.oryzae)幼殖体导致过表达GRP78的CHO细胞或亲代CHO细胞(不过表达GRP78)的损害的能力与用空质粒转化的米根霉(R.oryzae)或野生型米根霉(R.oryzae)细胞进行比较(Morris等人，J.Biol.Chem.,272:4327-4334(1997)；Reddy等人，J.Biol.Chem.,278:20915-20924(2003))。如前所示(Liu等人，J.Clin.Invest.,120:1914-1924(2010))，当与CHO亲代细胞相比时，野生型米根霉(R.oryzae)导致过表达GRP78的CHO细胞明显更大的伤害。通过用空质粒转化的米根霉(R.oryzae)幼殖体所引起的类似类型的细胞损伤进一步确认了这些结果。相反，过表达GRP78的CHO细胞和CHO亲代细胞对由CotH3和CotH2的细胞表面表达减少的米根霉(R.oryzae)幼殖体所引起的损伤具有相同的敏感性(图57C)。总体而言，这些结果显示CotH3和CotH2是介导通过结合至GRP78的内皮细胞的侵袭(胞吞)的细胞表面蛋白。

米根霉(R.oryzae)体内完全毒力需要CotH2和CotH3。

由于CotH3和CotH2起到内皮细胞侵袭素的作用，因此假设这两种基因是毒力的关键决定因素。为了测试该假设，使用气管内感染的糖尿病酮症酸中毒小鼠模型将CotH2和CotH3的细胞表面表达减少的米根霉(R.oryzae)的毒力与野生型或用空质粒转化的米根霉(R.oryzae)进行比较。尽管最初的感染是通过在该模型中对肺接种所引起的，但是这种感染血性传播至其他靶标器官，如脑。携带空质粒的细胞与野生型米根霉(R.oryzae)细胞同样有毒力(野生型和空质粒感染的小鼠的中值存活时间分别为3和4天，P＝0.33)。相反，RNAi转化体感染的小鼠的毒力减弱，这通过10天的中值存活时间以及1/3小鼠在致死感染中存活显示(P＝0.003)(图58A)。另外，当与从野生型细胞感染的小鼠或空质粒转化体感染的那些回收的相同器官相比，RNA-i转化体感染的小鼠在肺和脑(第一和第二靶标器官)中具有显著较少的真菌载量(图58B)。

为了进一步证明对用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠所观察到的毒力减弱是由于CotH2和CotH3的确实抑制所造成的，将这些基因的体内表达类型在从小鼠靶标器官回收的真菌菌丝中进行评价。CotH1在野生型米根霉(R.oryzae)或者用空质粒或RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠中不表达。相反，与CotH1相比，CotH2显示在用野生型米根霉(R.oryzae)或空质粒转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠的肺和脑中表达分别提高了4倍和2倍。另外，在野生型和空质粒转化体感染的小鼠的肺中CotH3具有显著高于CotH2的表达，但在脑中不是。最终，从用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠回收的真菌细胞对任何CotH基因均无表达(图58C)。这些结果显示CotH2和CotH3在体内表达，并且用RNA-i转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠中毒力的降低是由于缺少任何CotH基因的表达所造成的。

为了比较感染的严重程度，对感染了三种不同菌株的小鼠器官进行了组织病理学检查。与采集自野生型或用空质粒转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠的肺(其具有大量特征为吞噬细胞浸润和显著水肿的真菌脓肿)相比，收获自用RNA-i构件转化的米根霉(R.oryzae)感染的小鼠的肺具有正常的组织结构(图59)。

抗CotH3p抗体保护糖尿病酮症酸中毒小鼠不受米根霉(R.oryzae)感染。

由于以上数据显示CotH2和CotH3蛋白对哺乳动物细胞体外起到侵袭素的作用，并且由于在由气管内接种所引起的血性传播的鼠模型感染中CotH2和CotH3对于米根霉(R.oryzae)的完全毒力是所需的，因此研究了抗肽GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)或肽MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)的抗CotH3和CotH2抗体用于抵抗疾病的保护性作用(抗这两种肽的抗体识别表达CotH2或CotH3蛋白的酿酒酵母)。在用米根霉(R.oryzae)孢子气管内感染前2小时和感染后3天，将1mg多克隆抗体施用于糖尿病酮症酸中毒小鼠。与接受来自相同兔的接种前血清的小鼠相比，接受抗CotH2和抗CotH3兔IgG的小鼠具有显著提高的存活时间。在感染后21天，接受抗肽GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)抗体的小鼠的存活率为44％，相比之下，接受对照接种前IgG的小鼠的存活率为0％(图60A)。另外，在感染后14天，接受抗肽MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)抗体的小鼠的存活率为75％，相比之下，接受对照接种前IgG的小鼠的存活率为0％(图60B)。这些结果表明靶向CotH蛋白的抗体可以用于治疗毛霉菌病。

实施例III

检测毛霉菌病的诊断方法

进行了一系列实验以确定基于核酸序列的扩增(NASBA)的检测能力。使用米根霉总RNA作为模板，NASBA引物对设计扩增127bp的CotH3。

CotH3正向引物5’-GATGACAATTATATTCCCAGC-3’(SEQ ID NO:35)，CotH3反向引物5’-GAGTAGACGTAATTAGATCCAA-3’(SEQ IDNO:36)，分子信标探针：5’-CGCGATCAAACGTACCTGCTGACCGAATCGATCGCG-3’(SEQ IDNO:38)

根据生产商的说明，使用植物迷你试剂盒(Qiagen)从烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、白色念珠菌(Candida albicans)和米根霉(Rhizopus oryzae)分离了RNA。将从四种不同米根霉(R.oryzae)孢子(分别为10、100、1000、10000个孢子)中分离的总RNA加入到NASBA反应中。

为了测试分子信标对根霉种(Rhizopus spp.)的特异性，将分离自白色念珠菌(C.albicans)和烟曲霉(A.fumigatus)的RNA用作对照。将300ng总RNA加入到每个反应中。根据生产商的说明，使用NucliSENS EasyQ基本试剂盒v2(bioMerieux bv,Boxtel,NL)进行NASBA反应。简言之，NASBA反应体积为在96孔反应板(Applied Biosystems)中的20μl(每次反应)，并且含有5.4μl无菌水、0.4μl每种引物、0.2μl探针、4μl的5×NASBA缓冲液。然后，将5μl纯化的RNA(300ng)或水(制备无模板对照时)加入到预混合物中。随后，将反应混合物在65℃孵育5分钟，冷却至41℃5分钟，然后加入5μl来自NucliSENS EasyQ基本试剂盒v2的酶混合物。该混合物含有T7RNA聚合酶、AMV-RT(禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶)、RNA酶H和BSA(牛血清白蛋白)。将反应在41℃孵育90分钟。用StepOnePlus实时PCR仪(Applied Biosystems)测量荧光信号。

使用如上所述的NASBA扩增测定，CotH3分子信标引物/探针显示了真菌种对米根霉(R.oryzae)的差异检测，即特异性。来自加入米根霉(R.oryzae)的样品的应用产物容易地显示出扩增，而未检测到来自加入A.fumigants或白色念珠菌(C.albicans)的样品的扩增产物(图61)。

CotH3分子信标引物/探针显示出米根霉(R.oryzae)的高灵敏度检测。真菌孢子在YPD肉汤中在37℃的震荡器上萌发3小时。将10μl含有10至10⁵个幼殖体的样品等分至250μl绵羊血液中。用RNeasy植物微型试剂盒(Qiagen)从添加的血液样品中分离了总RNA，并在30μl洗脱缓冲液中洗脱。将5微升总RNA加入到每个NASBA反应中。在所有样品中检测到了应用产物，包括仅用10个幼殖体接种的样品(图62)。

CotH3分子信标引物不但显示出米根霉(R.oryzae)的高灵敏度检测，而且还显示出稳健的特异性。收集新鲜的米根霉(R.oryzae)、烟曲霉(A.fumigatus)和白色念珠菌(C.albicans)孢子，计数并分别等分到10μl YPD肉汤中。将350μl绵羊血液加入到每根管中并在37℃震荡器上培育24小时。用RNeasy植物微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，并在30μl洗脱缓冲液中洗脱。将5微升RNA加入到每个NASBA反应中。在接种了10⁶个烟曲霉(A.fumigatus)或白色念珠菌(C.albicans)孢子的样品中未检测到扩增产物，而接种了10至10⁴个米根霉(R.oryzae)孢子的每个样品均是可检测的(图63)。

CotH3分子信标引物/探针显示出多个根霉种的检测。将新鲜的米根霉(R.oryzae)(99-880和99-892分离株)和小孢根霉(R.microsporus)孢子(分别为1000个孢子)等分到10μl YPD肉汤中。将350μl绵羊血液加入到每根管中并在37℃震荡器上培育24小时。用RNeasy植物微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，并在30μl洗脱缓冲液中洗脱。将5微升RNA加入到每个NASBA反应中。不但含有米根霉(R.oryzae)99-892孢子的样品是可检测的，而且含有米根霉(R.oryzae)99-880(R1000)和小孢根霉(R.microspores)(ATCC62417)的样品显示出扩增(图64)。这些结果显示根据米根霉(R.oryzae)CotH基因设计的引物可以检测其他米根霉(R.oryzae)菌株以及其他根霉种，从而确认了毛霉菌中CotH基因的保守性。

在整个发明申请中，参考了多篇文献。在本发明申请中，这些文献的公开内容以它们的全部内容作为参考并入本文，以更充分地描述本发明所属领域当前的技术水平。尽管本发明已参考以上所提供的实施例进行了说明，但是应理解在不背离本发明的精神的情况下可以做出多种改变。

Claims (41)

1.一种编码毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段、或其功能性片段的分离的核酸。

2.一种编码毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段、或其功能性片段的分离的核酸，包含选自下列的核酸：

(a)编码SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列的核酸，或

(b)在中等严格条件下杂交至所述核酸的核酸，其中所述核酸连续编码生物学活性的毛霉菌CotH多肽，或

(c)相对于上述(a)或(b)简并的核酸，其中所述核酸编码生物学活性的毛霉菌CotH多肽。

3.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述核酸在高严格条件下杂交。

4.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

5.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述氨基酸序列由SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列或其修饰组成。

6.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述核酸是cDNA。

7.含有根据权利要求2所述的核酸的载体。

8.含有根据权利要求2所述的核酸的重组细胞。

9.一种CotH寡核苷酸，包含SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31或其反义链的15至300个连续核苷酸。

10.根据权利要求9所述的CotH寡核苷酸，其中，寡核苷酸包含ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO：33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO：34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO：35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO：36)或AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO：37)的核酸序列。

11.一种反义核酸，能够特异性结合至由权利要求2所述的核酸编码的mRNA。

12.一种用于检测是否存在毛霉菌CotH核酸序列的试剂盒，所述核酸序列包含根据权利要求9所述的至少一种寡核苷酸。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述至少一种寡核苷酸包含选自ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO：33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO：34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO：35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO：36)或AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO：37)的核酸序列。

14.一种分离的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。

15.根据权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽与SEQID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

16.根据权利要求15所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列。

17.根据权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述功能性片段结合至GRP78。

18.根据权利要求17所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述功能性片段结合至内皮细胞表达的GRP78。

19.根据权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽是由包含与SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列所编码的。

20.根据权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽是由包含SEQ ID NO：2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核酸序列的核苷酸序列所编码的。

21.根据权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述免疫原性片段基本上由氨基酸序列GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)或MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)组成。

22.根据权利要求21所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述免疫原性片段结合至载体蛋白。

23.根据权利要求22所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽所述载体蛋白是钥孔血蓝素(KLH)。

24.一种表达毛霉菌CotH多肽的方法，所述方法包括在适合于所述毛霉菌CotH表达的条件下培养权利要求8所述的细胞。

25.一种分离的抗毛霉菌CotH抗体，其与权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽具有特异反应性。

26.根据权利要求25所述的抗体，其中，所述抗体是单克隆抗体。

27.产生根据权利要求26所述的单克隆抗体的细胞系。

28.根据权利要求25所述的抗体，其中，所述抗体是多克隆抗体。

29.根据权利要求25所述的抗体，其中，所述抗体与基本上由氨基酸序列GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO：39)或MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO：40)组成的多肽具有特异反应性。

30.一种组合物，包含对抑制毛霉菌CotH多肽表达有效的量的根据权利要求11所述的反义核酸和能够将所述反义核酸递送至细胞的可接受的载体。

31.一种用于鉴别编码毛霉菌CotH多肽的核酸的方法，包括使含有核酸的样品与权利要求9所述的一种或多种寡核苷酸接触和鉴别杂交至所述寡核苷酸的核酸，其中所述接触是在高严格杂交条件下实施的。

32.一种检测样品中毛霉菌CotH核酸分子的方法，包括使所述样品与权利要求9所述的两种或更多种寡核苷酸接触，扩增核酸分子，和检测所述扩增。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述扩增是利用聚合酶链反应进行的。

34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述两种或更多种寡核苷酸中的至少一种包含ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO:34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO:36)或AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO:37)的核酸序列。

35.一种用于检测样品中是否存在毛霉菌目生物的方法，包括使样品与权利要求25所述的抗体接触，并检测是否存在所述抗体与所述样品的特异性结合，从而检测所述样品中是否存在毛霉菌目生物。

36.一种包含可药用载体和化合物的药物组合物，所述化合物选自权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段、权利要求11所述的反义核酸或者权利要求25所述的抗毛霉菌CotH抗体。

37.一种用于受试者抗真菌病症免疫的疫苗组合物，包含免疫原性量的毛霉菌CotH多肽，或所述多肽的免疫原性片段，和可药用载体。

38.根据权利要求37所述的疫苗组合物，还包含佐剂。

39.一种治疗或预防对其有需要的受试者中毛霉菌病的方法，包括施用治疗有效量的权利要求36所述的药物组合物或权利要求37所述的疫苗组合物。

40.一种诊断受试者中毛霉菌病感染的方法，包括以下步骤：

(a)提供来自所述受试者的测试样品；

(b)在适合条件下使所述样品与能够结合权利要求1所述的核酸或权利要求14所述的毛霉菌CotH多肽的试剂接触，其中所述条件允许所述试剂与所述核酸或多肽特异性结合；和

(c)将所述测试样品中所述特异性结合的量与对照样品中特异性结合的量相比较，其中与所述对照样品相比，所述测试样品中所述特异性结合的量的增加或减少是对毛霉菌病感染的诊断结果。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述试剂选自权利要求25所述的抗毛霉菌CotH抗体或权利要求9所述的CotH寡核苷酸。