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CN103981166B - 一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体 - Google Patents

一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体，属于生物工程技术领域。本发明将源于Bacillus？sp.WSHB04-02的碱性果胶酶的第325位的异亮氨酸I点突变为苯丙氨酸F。突变后50℃保温2h后，残留酶活是突变前的4.27倍；这说明突变后的碱性果胶酶I325F在50℃下的耐热性明显提高，I325F在50℃下可以较长时间的维持稳定结构。突变后的碱性果胶酶I325F在55℃下的半衰期是突变前的1.89倍；Km、Vmax、kcat和kcat/Km等都有改善。本发明提供的PGL的酶学性质有大幅度提高，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。

Description

一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体
技术领域
本发明涉及一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体，属于生物工程技术领域。
背景技术
碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2，简称PGL)，全称聚半乳糖醛酸裂解酶，在碱性条件下具有高活性，可以利用反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，将果胶质分解为不饱和的寡聚半乳糖醛酸。该酶广泛存在于细菌、酵母菌、真菌、植物以及和某些寄生线虫。不同来源的碱性果胶酶同源性差异较大。碱性果胶酶广泛应用于食品、纺织、造纸、环境、生物技术等各个领域，在茶和咖啡发酵、纺织和植物纤维加工、油提取、含果胶工业废水处理等发挥巨大作用。
在棉纤维初生细胞壁的最表面含有很多伴生杂质，如：果胶质、蜡质、含氮物质以及蛋白质等非纤维素类物质，互相包结成为复杂庞大的疏水网状结构。纺织工业中包含精炼步骤，其目的就是去除棉纤维上的杂质，提高棉织物的吸湿功能性，再进行后续加工。传统的化学纺织精炼方法即热碱法，其需要消耗大量的化学品与水资源，环境污染严重，据统计，印染过程中约70％的废水是在这个步骤中产生的。除此之外，热碱处理将对纤维造成严重损伤，机械强度将大幅下降。
近十几年来，随着分子生物学与工业微生物研究的迅猛快速发展，研究者开始采用基因工程手段构建重组菌，以期实现碱性果胶酶的过量重组表达。目前，已相继出现了利用Escherichiacoli、Bacillussubtilis和Pichiapastoris等作为宿主表达不同来源果胶酶基因的报道。现在对碱性果胶酶的研究主要集中于合成碱性果胶酶工程菌与发酵过程控制。尽管PGL的表达量很高，但是酶的催化效率耐热性等酶学特性还有待进一步改进，而目前所做的分子改造也只是尝试不同宿主异源表达，提高酶活、耐热性、催化效率等酶学性质方面的研究，目前国内做的甚少。近十年，国外碱性果胶酶的研究方向集中到酶的分离纯化、酶学特性及其蛋白质结构特征研究等方面，我国对碱性果胶酶的研究主要集中在菌种选育、发酵工艺和应用工艺的改良方面，而我国尚缺效价很高的商品碱性果胶酶，为进一步实现工业化铺垫，这方面的研究不容忽视。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体。所述突变体是以氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的碱性果胶酶(野生型)为基础，将第325位的异亮氨酸I点突变为苯丙氨酸F。
本发明要解决的第二个技术问题是提供构建所述碱性果胶酶突变体的方法，是通过设计引物对编码碱性果胶酶的基因进行定点突变后表达。
所述构建方法，优选以质粒pET-20b(+)-pgl为模板设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入E.coliJM109进行扩增，然后以E.coliBL21(DE3)表达含突变基因的重组质粒，得到热稳定性增强的碱性果胶酶突变体。
所述pET-20b(+)-pgl的构建方法参见文献：OverproductionofalkalinepolygalacturonatelyaseinrecombinantEscherichiacolibyatwo-stageglycerolfeedingapproach.2011,ShuyingFangetal.Volume102,Issue22,p10671–10678。
所述用于定点突变的引物是：
pglI325Fprimer1：5'-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3'
pglI325Fprimer2：5'-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3'。
本发明要解决的第三个技术问题是提供应用基因工程菌发酵生产所述碱性果胶酶突变体的方法，是将含有编码突变碱性果胶酶的基因的重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-20b(+)-pglI325F)活化培养后接种到含有100μgmL-1氨苄青霉素的发酵培养基中，装液量为50mL/500mL，于37℃，200rmin-1培养；菌体生长到OD600＝0.6，加入终浓度0.4mMIPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，诱导发酵48h。
所述活化培养是将重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-20b(+)-pglI325F)接种于含有100μgmL-1氨苄青霉素的种子培养基中，装液量为20mL/250mL，培养温度37℃，200rpmmin-1摇床上振荡培养10h。
所述种子培养基组成(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，葡萄糖20，pH7.0。
所述发酵培养基组成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HPO472mmolL-1，KH2PO417mmolL-1。
本发明通过定点突变改造碱性果胶酶基因，使所编码的PGL耐热性增强；相比突变前，在经过30℃保温24h，50℃保温2h，55℃下保温1h后，突变后的碱性果胶酶(I325F)残留酶活较突变前有所提高。50℃保温2h后，突变后的残留酶活是突变前的4.27倍；这说明突变后的碱性果胶酶I325F在50℃下的耐热性明显提高，I325F在50℃下可以较长时间的维持稳定结构。突变后最适反应温度提高了5℃，突变后碱性果胶酶可以更好地在高温条件下表现出最优酶活；突变后的碱性果胶酶I325F在55℃下的半衰期是突变前的1.89倍；Km、Vmax、kcat和kcat/Km等都有改善。本发明提供的碱性果胶酶更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。
附图说明
图1为本发明构建的突变株以及原始菌株不同温度下的稳定性，WT：突变前的酶；I325F：突变体。
图2为本发明构建的突变株以及原始菌株结构变化，WT：突变前的酶；I325F：突变体。
具体实施方式
碱性果胶酶酶活力检测：取一定量发酵液，8000rpm离心10min，胞外碱性果胶酶即包含于发酵上清液之中。碱性果胶酶反应体系为：酶稀释液20μL，含0.2％PGA的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2molL-1，0.44mmolL-1的CaCl2，pH9.4)2mL，无活性的酶液为空白对照。碱性果胶酶反应条件为：45℃水浴15min，使用3mL磷酸溶液(0.03molL-1)终止反应，235nm处测定反应物吸光度值。
碱性果胶酶酶活单位定义为：1分钟裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol不饱和聚半乳糖醛酸所对应酶量。
碱性果胶酶酶活计算方法：
(OD235×106×体系体积×稀释倍数)/(103×比色杯厚度×4600×酶反应线性范围内的酶促反应时间×酶液体积)
碱性果胶酶纯化条件：A液：甘氨酸-NaOH，pH7.5；B液：甘氨酸-NaOH，2M硫酸铵，pH7.5；5mL疏水柱[HiTrapPhenvl(highsub)FF]，3mL/min，30％B液洗脱得到目的蛋白；30kDamillipore超滤离心管浓缩，透析得到SDS-PAGE电泳纯。
碱性果胶酶热稳定性检测：在不同温度下按照标准方法测定酶活力，以处理前酶活定为100％.，将酶液分别在30℃保温24h，40℃保温2h，50℃保温2h，55℃下保温1h，利用冰浴迅速冷却后，按上述方法测残余酶活力，考察其耐热性。
碱性果胶酶Km、Vmax检测：在0.05-2g/L不等的底物浓度下测定，由GraphPadPrism5预测得到。
实施例1突变表达质粒的构建及重组枯草芽孢杆菌的获得
1、以pET-20b(+)-pgl质粒为模板构建突变表达载体
编码野生型碱性果胶酶及由21个氨基酸组成的信号肽的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，野生型成熟碱性果胶酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通过比对耐热果胶酶序列：Bacilluslicheniformis的CAD56882，来自Bacillussp.strainP-4-N的BAA96478，以及来自ThermotogamaritimaMSB82的AAD35518，最适温度分别为69℃，70℃和90℃。结合碱性果胶酶的三维结构，推测325位的异亮氨酸I对碱性果胶酶的热稳定性有较大影响，设计突变实验，将325位的异亮氨酸I突变成其他三个耐热序列的相同氨基酸——苯丙氨酸F。
以pET-20b(+)-pgl质粒为模板，设计引物将第325位的异亮氨酸I突变为苯丙氨酸F。用于定点突变的引物：
pglI325Fprimer1：5'-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3'
pglI325Fprimer2：5'-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3'。
PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)
PCR反应条件：94℃预变性10min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。将通过PCR得到的突变表达载体pET-20b(+)-pglI325F利用DpnI核酸内切酶进行酶切消化DNA模板。
质粒pET-20b(+)-pgl的构建方法参见文献：OverproductionofalkalinepolygalacturonatelyaseinrecombinantEscherichiacolibyatwo-stageglycerolfeedingapproach.2011,ShuyingFangetal.Volume102,Issue22,p10671–10678.
2、突变表达载体的转化
(1)感受态细胞的制备
将E.coliBL21(DE3)在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到LB培养基中。37℃振荡(200rpm)培养。测定OD600值，当OD600值达到0.35～0.5时(约培养5小时)放置冰中停止培养(如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率)。取上述菌体培养液1ml于1.5mlMicrotube中(根据需要量确定Microtube数量)。1,500×g(一般的微型离心机约4000rpm)4℃离心5分钟，弃上清(注意尽量除尽上清)。在每个Microtube中加入100l冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡1,500×g(一般的微型离心机约4000rpm)4℃离心5分钟，弃上清(注意尽量除尽上清)。在每个Microtube中加入100μL冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。
(2)突变表达载体的验证扩增
感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。感受态细胞的DNA转化将-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化10分钟。取100μL的感受态细胞移至新的转化管中。向感受态细胞中加入0.1ng～10ng(3μL～10μL)的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。42℃水浴中放置90秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。加入890μL37℃预温的LB培养基。37℃振荡培养1小时。取适量涂平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。确认培养菌落，进行下步实验。
实施例2突变PGL的表达
种子培养基组成(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，葡萄糖20，pH7.0。
发酵培养基组成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HPO472mmolL-1，KH2PO417mmolL-1。
从甘油管中将含有突变表达载体pET-20b(+)-pglI325F的重组菌E.coliBL21(DE3)接种于含有100μgmL-1氨苄青霉素的种子培养基中，装液量为20mL/250mL。培养温度37℃，200rpm摇床上振荡培养10h。
将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入含有100μgmL-1氨苄青霉素的发酵培养基中，装液量为50mL/500mL，于37℃，200rmin-1培养。菌体生长到一定阶段(OD600＝0.6)，加入终浓度0.4mMIPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，诱导发酵48h。
实施例3突变前后PGL的酶学性质
按照实施例2所述的方法分别以含未经突变的表达载体pET-20b(+)-pgl的E.coliBL21(DE3)及突变株E.coliBL21(DE3)(pET-20b(+)-pglI325F)进行发酵，将发酵液中的酶纯化后进行耐热性等酶学性质分析。所得碱性果胶酶突变体命名为I325F。
由图1可以看出，突变前碱性果胶酶(WT)在经过30℃保温24h，50℃保温2h，55℃下保温1h后酶活损失比较明显；突变后的碱性果胶酶(I325F)做相同处理后，残留酶活较突变前有所提高，尤其是50℃保温2h。50℃保温2h后，突变后的残留酶活是突变前的4.27倍；这说明突变后的碱性果胶酶I325F在50℃下的耐热性明显提高，I325F在50℃下可以较长时间的维持稳定结构。
由表1可以看出，突变后最适反应温度提高了5℃，突变后碱性果胶酶可以更好地在高温条件下表现出最优酶活；突变后的碱性果胶酶I325F在55℃下的半衰期是突变前的1.89倍；Km、Vmax、kcat和kcat/Km等都有些许改善。说明突变后碱性果胶酶的整体酶学性质都得到改善。
表1突变株以及原始菌株酶学参数
分析I325F的结构变化，发现I325F中的InteractionAromatic-Aromatic(芳香族作用力)由之前的27对增加至28对(331TRP-346PHE)，DiscoveryStudio2.5结构分析显示，将346ILE替换成PHE，直接导致了新键的形成(图2)。在图中可以看出，TRP和PHE两个氨基酸的苯环非常相近，突变使得该区域比之前连接更为紧密。耐热性稳定性，同时与底物的结合牢固性都得到了很大提高。
结果表明，通过序列比对与结构结合方式在关键位点突变氨基酸，可以使该酶酶学性质明显提升，这种策略可以广泛应用于酶学性质的改进。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的碱性果胶酶的第325位异亮氨酸I点突变为苯丙氨酸F。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述碱性果胶酶突变体的方法，是通过设计引物对编码碱性果胶酶的基因进行定点突变后表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，是以质粒pET-20b(+)-pgl为模板设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入E.coliJM109进行扩增，然后以E.coliBL21(DE3)表达含突变基因的重组质粒，得到耐热性增强的碱性果胶酶突变体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用于定点突变的引物是：
pglI325Fprimer1：5'-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3'
pglI325Fprimer2：5'-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3'。
7.应用基因工程菌发酵生产权利要求1所述碱性果胶酶突变体的方法，其特征在于，是将含有突变碱性果胶酶基因的重组菌活化培养后接种到含有100μg·mL-1氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃，200r·min-1培养；菌体生长到OD600＝0.6，加入IPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，诱导发酵48h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化培养是将含有pET-20b(+)-pglI325F的重组菌E.coliBL21(DE3)接种于含有100μg·mL-1氨苄青霉素的种子培养基中，培养温度37℃，200rpm摇床上振荡培养10h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基组成：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HPO472mmolL-1，KH2PO417mmolL-1。
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