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CN103959057A - 用于蛋白质纯化的基于烯丙胺及其衍生物的新型色谱介质 - Google Patents

用于蛋白质纯化的基于烯丙胺及其衍生物的新型色谱介质 Download PDF

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CN103959057A
CN103959057A CN201280033253.8A CN201280033253A CN103959057A CN 103959057 A CN103959057 A CN 103959057A CN 201280033253 A CN201280033253 A CN 201280033253A CN 103959057 A CN103959057 A CN 103959057A
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B.西亚嘉拉简
W.郭
N.多尔卡
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Anwantuo Spcial Materials Co Ltd
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Abstract

由在所述颗粒表面用烯丙胺或聚烯丙胺衍生化的多孔介质颗粒制成的色谱介质，所述聚烯丙胺直接获得或通过分子间聚合而获得，且该介质进一步被官能团官能化。该介质尤其用于分离生物分子。

Description

用于蛋白质纯化的基于烯丙胺及其衍生物的新型色谱介质
技术领域
本发明涉及一系列新型色谱介质的制备和该介质分离和纯化生物分子的用途，更具体地用于分离和纯化抗体和其它相关的蛋白质。本发明公开了新型色谱介质，其基于作为主要配体的烯丙胺和聚烯丙胺，并公开了使用不同的官能团进行的修饰以制备具有独特的分离特征的离子交换、疏水和其它功能性的色谱介质。本发明由于其独特的配体结构、制备方法和独特的分离性能而不同于可商购的色谱介质。
背景技术
色谱方法通常为分离和纯化生物分子中最重要的工具。随着上游技术的快速发展，目前的治疗性生物分子可大量的并以高浓度进行制备。用于下游加工的起始材料的杂质的性质取决于多种因素，例如表达体系、生长介质类型和滴定浓度。这导致了加工和产物相关的多种杂质，其必须通过具有最少步骤的稳健的纯化方法去除。然而，在下游改善方面，还不存在就该容量与分离效率的共同提高。为了满足这些需求，正积极地研发具有高蛋白质结合容量和分离效率的色谱介质。
通常，大多数色谱介质基于具有一些功能性配体的二氧化硅或聚合物材料，该配体提供不同种类的吸附和分离。例如，阴离子配体如磺酸或羧酸将吸附带正电荷的溶质，并因此基于阳离子交换机理进行分离；而阳离子配体如胺在合适的pH将吸附带负电荷的溶质，并因此基于阴离子交换机理进行分离。基本上，所述配体的性质决定该分离机理，而所述配体的密度在该介质容量方面起到重要作用。而且，该介质容量被许多其它因素控制，如表面积和孔隙容积，且如疏水性和配体结构的因素决定结合容量，并因此决定分离性质。此外，连接所述配体和所述介质的主链表面的间隔基的性质也影响分离，其取决于间隔基的亲水性或疏水性。可商购的色谱介质如离子交换载体(Bio-Rad)、(Applied Biosystems)、Sepharose(GE HealthcareLife Sciences)、(Tosoh Bioscience)、PolyPEI和PolyCSx(AvantorPerformance Materials，Inc.formerly Mallinckrodt Baker，Inc.)，其包含连接至表面的不同的功能性离子交换和疏水基团，且具有不同类型的间隔基或涂层。例如，在美国专利公开号No.2002/0134729描述的色谱介质中已使用了多胺；且在美国专利4,551,245描述的色谱介质产物中已使用了聚乙烯亚胺。
在2002/0134729中，阴离子交换剂是通过用高分子量的多胺，优选为聚乙烯亚胺(分子量至少为50,000)来修饰所述聚合物表面而制备。在美国专利号2005/0203029中，聚合物表面用聚乙烯亚胺修饰以得到用于色谱分离所需的表面性质。在该方法中，伯氨基和仲氨基也被引入至聚合物表面。那些氨基还被用于与多种色谱配体反应以制备不同的介质如强的阳离子交换剂、弱的阳离子交换剂和疏水性介质。该修饰的聚合物的总的氮含量通常的范围为4至7%。
在之前的美国专利公开号2008/003922和2005/094581中，聚合物主链表面用含乙烯基的分子或用聚乙烯亚胺修饰以得到用于色谱分离所需的介质的表面性质。在那些介质中，伯氨基和仲氨基也被引入至聚合物表面的主链。这些伯氨基或仲氨基还用于与多种色谱配体反应以制备不同的介质如强的阳离子交换剂、弱的阳离子交换剂和疏水性介质。
因此，仍然需要改良的色谱介质及其制备方法，以及其在分离生物分子中合适的用途。
发明内容
本发明提供色谱介质及制备新型色谱介质的方法，该方法通过将包含环氧基或包含卤代烷基的固体多孔介质载体，例如，环氧化或卤代烷基化的聚甲基丙烯酸酯，与烯丙胺或其聚烯丙胺衍生物反应而进行，该聚烯丙胺衍生物直接通过将分子量为25000或更少的聚烯丙胺反应而获得，或通过接枝的烯丙胺的分子间聚合而获得。然后可将所得的在其主链表面上具有烯丙胺或聚烯丙胺的固体色谱介质载体进一步通过其它合适的试剂官能化以提供多种功能的离子交换或疏水性介质。该烯丙胺衍生物包括有或没有取代的聚烯丙胺。该多孔固体介质载体，如含环氧基或卤代烷基的聚合物，可为球状聚合物，特别是聚甲基丙烯酸酯或类似聚合物，其平均直径为35至110微米。其它适用于本发明的具有环氧基或卤代烷基的多孔固体载体包括例如基于环氧化或卤代烷基化的聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二乙烯基苯、二氧化硅、壳聚糖、纤维素和琼脂糖的珠。用于蛋白质色谱分离的聚合物材料优选具有一些性质，例如，
1)该孔径足够大，以允许与进出树脂颗粒的蛋白质一样大的分子快速扩散;
2)该树脂颗粒为刚性的，使其在色谱操作受到压力下避免压缩和损失流速；和
3)该树脂在分离过程中遇到的所有条件下应为化学稳定的。
在本发明中已发现烯丙胺及其分子量少于25000的聚烯丙胺衍生物(直接获得或通过分子间聚合获得)可用作主配体，且也可被修饰以用作弱阴离子、弱阳离子和具有不同特征的疏水性色谱介质。该使用烯丙胺或聚烯丙胺配体制备的弱阴离子介质可直接用于蛋白质分离，或可进一步修饰以制备强的阳离子交换介质、强的阴离子交换介质或疏水性色谱介质。基本上，烯丙胺或聚烯丙胺的所述氨基与聚合物中的环氧基或卤化基团反应，该环氧基或卤化基团如果直接使用可提供弱阴离子交换。此外，剩余的氨基可进一步与不同的官能化试剂反应以制备具有不同功能如阳离子交换、阴离子交换或疏水的色谱介质。而且，如果烯丙胺用作反应物，该双键提供了进一步修饰的可能性，如分子间聚合和进一步官能化以提供新的离子交换或疏水性介质。
为更好地理解本发明以及其它目的和优点，结合所附实施例，可参考以下发明详述，且本发明的范围将在所附权利要求中指出。以下发明详述不是通过如上所述的优点来限制本发明的范围。
附图简述
图1为UV检测器所记录的，根据实施例2的步骤，使用实施例1制备的介质来分离蛋白质的洗脱曲线的图;
图2为UV检测器所记录的，根据实施例4的步骤，使用实施例3制备的介质来分离蛋白质的洗脱曲线的图;
图3为UV检测器所记录的，根据实施例6的步骤，使用实施例5制备的介质来分离蛋白质的洗脱曲线的图;
图4为UV检测器所记录的，根据实施例8的步骤，使用实施例7制备的介质来分离蛋白质的洗脱曲线的图;
图5为根据实施例9测定的结合容量的图;
图6为根据实施例10测定的结合容量的图;
图7为根据实施例11测定的结合容量的图；和
图8为根据实施例12测定的结合容量的图。
发明详述
本发明涉及由具有环氧基或卤代烷基的球状固体多孔介质制成的新型色谱介质的制备和使用。根据本发明，烯丙胺或其聚烯丙胺衍生物用于修饰所述多孔介质，且随后使用具有合适的官能团的不同配体进一步官能化。根据本发明，强的阳离子交换介质可通过以下制备：(1)将烯丙胺与含环氧基或卤代烷基的多孔固体介质珠反应，和任选地(2)将所得的经烯丙胺修饰的介质进一步与其它官能团(例如，马来酸酐)反应，且然后(3)将该产物与焦亚硫酸钠(Na2S2O5)反应。该反应的温度和持续时间可分别为40℃至80℃和约3小时至约16个小时。适合与烯丙胺或聚烯丙胺-衍生化的介质颗粒反应的其它合适的官能化试剂为，例如，酸酐如环状羧酸酐如戊二酸酐和琥珀酸酐、不饱和羧酸酐如马来酸酐，磺化试剂如亚硫酸氢盐和焦亚硫酸钠，烷基氯或酸酐如丁酰氯和乙酸酐或丁酸酐，以及包含季铵官能团的烷基氯如(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵，以及这些官能化试剂的混合物。
在一个实施方案中，主配体的制备是通过将分子量少于25000的聚烯丙胺与包含可与胺官能团反应的环氧基或卤代烷基(例如氯甲基、溴甲基)的固体多孔颗粒反应而进行。或者，类似的烯丙胺主配体可通过以下方法制备：将烯丙胺与含环氧基或卤代烷基的固体多孔颗粒反应，然后使用典型的自由基聚合或其它聚合方法，通过任一分子间聚合将所连接的烯丙胺聚合。
在另一实施方案中，主配体的制备是通过烯丙胺的分子间聚合进行的，其首先通过将烯丙胺与含环氧基或卤代烷基(如氯甲基，溴甲基)或其它合适的反应性部分的固体多孔颗粒反应，然后将所接枝的烯丙胺与过量的烯丙胺聚合，然后与胺反应以得到多种官能团。
在另一实施方案中，具有烯丙胺主配体的介质的制备通过将烯丙胺与含环氧基或卤代烷基或其它合适的反应性部分(其可与胺反应以得到多种官能团)的固体多孔颗粒反应而进行。
在另一实施方案中，其它功能性介质如弱的阳离子交换介质、强的阳离子交换介质和疏水性介质是用具有如以下实施例给出的其它合适的官能团的功能性配体从烯丙胺主配体制备的。
本发明其它方面包括以下各个方面。本发明一方面包括在所述颗粒的表面上具有用烯丙胺或聚烯丙胺衍生化的多孔介质颗粒的色谱介质。另一方面包括如下色谱介质，其中所述多孔介质颗粒包括选自环氧化或卤代烷基化的二氧化硅、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯和聚二乙烯基苯的颗粒。另一方面包括如下色谱介质，其中所述多孔介质颗粒包括环氧化或卤代烷基化的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯聚合物。另一方面包括如下色谱介质，其中在颗粒表面用烯丙胺或聚烯丙胺衍生化的所述多孔介质颗粒被进一步官能化，其是通过在所述聚合物树脂的表面上将至少一种其它官能化试剂与所述烯丙胺或聚烯丙胺的末端氨基反应。另一方面包括如下色谱介质，其中该至少一种其它官能化试剂选自:酸酐、磺化试剂、烷基氯和包含季铵官能团的烷基氯及其混合物。另一方面包括如下色谱介质，其中该官能化试剂选自环状羧酸酐、不饱和羧酸酐、亚硫酸氢盐、烷基氯、烷基酸酐、含季铵官能团的烷基氯及其混合物。另一方面包括如下色谱介质，其中所述至少一种其它的官能化试剂选自：戊二酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、焦亚硫酸钠、丁酰氯、乙酸酐、丁酸酐、(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵及其混合物。
本发明的其它方面包括用上述任一种色谱介质填充的色谱柱。本发明的另一方面为分离溶液成分的方法，其包括将所述溶液通过该色谱柱并洗脱所述溶液的成分。本发明的另一方面为如上方法，其中所述溶液为包含生物分子的溶液。
在本发明的另一方面，提供了制备色谱介质的方法，该方法包括将包含环氧基或卤代烷基的固体多孔介质颗粒与烯丙胺或聚烯丙胺衍生物反应。在该制备方法的另一方面，该聚烯丙胺通过将烯丙胺或分子量为25000或更少的聚烯丙胺反应而获得，或通过接枝的烯丙胺的分子间聚合而获得。
在另一方面，该色谱介质可通过以下制备：i)将包含环氧基或卤代烷基的固体多孔介质颗粒与烯丙胺反应以形成经烯丙胺接枝的聚合物，和ii)引发所述经烯丙胺接枝的聚合物的分子间聚合。在另一方面，该分子间聚合步骤是通过自由基引发剂和过量的烯丙胺而引发的，且在另一方面，自由基引发剂选自偶氮二异丁腈、过氧化乙酰或过氧化苯甲酰。
本发明提供的烯丙胺及其聚合物，例如直接获得或通过分子内或分子间聚合获得的分子量少于25000的聚烯丙胺，可用作主配体，其可被修饰以用作具有不同特征的弱阴离子、弱阳离子和疏水性介质。本发明制备的色谱介质在化学和性能方面完全不同于现有技术。聚乙烯亚胺的使用提供了伯、仲和叔胺，而聚烯丙胺仅提供伯胺。该主链也是不同的。所述聚烯丙胺具有含侧链(hanging)胺基团的直链烷基链。我们已发现本发明的方法和组合物得到的该特征提供了具有独特特性的不同产物。例如，该修饰的聚合物的总的氮含量通常的范围为1.0至3.5%。该生成的弱的阴离子交换剂可直接用于蛋白质分离，或进一步修饰以制备强的阳离子交换剂、强的阴离子交换剂或疏水性色谱介质。该配体可通过以下方法进行固定，将烯丙胺或聚烯丙胺的氨基与提供弱阴离子交换色谱介质的聚合物中的环氧基反应。
此外，所述剩余的氨基可进一步与不同的试剂反应以制备具有不同功能如阳离子交换、阴离子交换或疏水性的色谱介质。而且，烯丙胺中的所述烯丙基提供进一步修饰的可能，如分子间聚合，并且进一步官能化以提供新的离子交换介质或疏水性介质。
实施例
本发明通过以下代表性实施例进一步举例说明(但不限于此)，这些实施例用来解释本发明而不应被理解为用于限制。
实施例1：使用聚烯丙胺制备主配体和离子交换色谱介质
将100ml15(w/w)%的聚烯丙胺(分子量为15,000)水溶液和300ml去离子水装入配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的1升的3颈烧瓶。将25克含活性环氧基的聚甲基丙烯酸酯聚合物(中值颗粒尺寸为35微米)缓慢加入至反应器，同时搅拌。然后将该烧瓶加热至80℃并反应16个小时。该反应产物用去离子水洗涤一次，然后用1-甲氧基-2-丙醇洗涤四次。元素分析：C，58.3%，H，7.3%，N，1.1%。
然后将通过上述反应得到的聚合物转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的干燥的1升3颈烧瓶。在氮气下将400ml1-甲氧基-2-丙醇和14.5g马来酸酐加入至烧瓶。然后将该烧瓶加热至60℃并反应3个小时。该产物用去离子水洗涤四次。
将通过上述反应得到的马来酸化的聚合物转移回到同样的反应设备中，并向其中加入400ml0.01M NaOH溶液和56g焦亚硫酸钠。然后将该烧瓶加热至80℃并反应4个小时。产物用去离子水洗涤四次。元素分析：C，55.8%；H，7.2%；N，1.0%；S，1.0%。
实施例2:使用实施例1的介质进行分离
将实施例1的产物装入100X7.75mm ID柱。将该柱用50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH5.6缓冲液(结合缓冲液)进行平衡。平衡后，以0.9ml/min向该柱注入含2.0mg/ml卵清蛋白、2.0mg/ml兔IgG和2.0mg/ml溶菌酶的结合缓冲液100ul。然后将该柱在26分钟内用50mM MES pH5.6缓冲液与1.0M NaCl的0至100%线性梯度溶液(洗脱缓冲液)洗脱，然后用100%洗脱缓冲液再洗脱12分钟。使用实施例1的介质，根据实施例2进行分离，其结果如图1所示。
实施例3：通过分子间聚合制备主介质
将10g烯丙胺溶于400ml1-甲氧基-2-丙醇且将所述溶液转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的1升3颈烧瓶。将25g含活性环氧基的聚甲基丙烯酸酯聚合物(中值颗粒尺寸为35微米)缓慢加入至该反应器。然后将该烧瓶加热至80℃并反应16个小时。反应产物用去离子水洗涤，随后用醇洗涤四次。
然后将通过上述反应得到的用烯丙胺接枝的聚合物转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的干燥的1升3颈烧瓶。氮气吹扫后，向该烧瓶中加入400ml乙醇。将该烧瓶加热至80℃并加入0.6g AIBN，然后通过注射器泵以0.2ml/min的流速加入15g烯丙胺，并反应6个小时。该产物用去离子水洗涤，然后用1-甲氧基-2-丙醇洗涤三次。元素分析:C，59.0%；H，7.7%；N，3.1%。
然后将通过上述反应得到的聚合物转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的干燥的1升3颈烧瓶。在氮气下向该烧瓶中加入400ml1-甲氧基-2-丙醇和14.5g马来酸酐。然后将烧瓶加热至80℃并反应3个小时。产物用去离子水洗涤四次。
将通过上述反应得到的马来酸化的聚合物转移回到同样的反应设备中。向其中加入400ml0.01M NaOH溶液和56g焦亚硫酸钠。然后将该烧瓶加热至80℃并反应4个小时。该产物用去离子水洗涤四次。元素分析：C，54.5%；H，7.8%；N，3.0%；S，2.0%。
实施例4：使用实施例3的介质进行分离
将实施例3的产物装入100X7.75mm ID柱。将该柱用50mM MES pH5.6缓冲液(结合缓冲液)进行平衡。平衡后，以0.9ml/min向该柱注入含2.0mg/ml卵清蛋白、2.0mg/ml兔IgG和2.0mg/ml溶菌酶的结合缓冲液100ul。然后将该柱在26分钟内用50mM MES pH5.6缓冲液与1.0M NaCl的0至100%线性梯度溶液(洗脱缓冲液)洗脱，然后用100%洗脱缓冲液再洗脱12分钟。使用实施例3的介质，根据实施例4进行分离，其结果如图2所示。
实施例5：用烯丙胺制备主介质
将5g烯丙胺溶于200ml1-甲氧基-2-丙醇，且将该溶液转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的1升3颈烧瓶。在搅拌下，将12.5g含活性环氧基的聚甲基丙烯酸酯聚合物(中值颗粒尺寸为35微米)缓慢加入至反应器。然后将该烧瓶加热至80℃并反应6个小时。该反应产物用去离子水洗涤，随后用1-甲氧基-2-丙醇洗涤四次。元素分析:C，58.9%；H，7.3%；N，2.5%。
然后将通过上述反应得到的该聚合物转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的干燥的1升3颈烧瓶。在氮气下向该烧瓶中加入200ml1-甲氧基-2-丙醇和7.3g马来酸酐。然后将该烧瓶加热至80℃并反应3个小时。该产物用去离子水洗涤四次。
将通过上述反应得到的马来酸化的聚合物转移回到同样的反应设备中，并向其中加入200ml0.01M NaOH溶液和28g焦亚硫酸钠。然后将该烧瓶加热至80℃并反应4个小时。该产物用去离子水洗涤四次。元素分析:C，52.4%；H，6.8%；N，2.3%；S，2.0%。
实施例6:用实施例5的介质进行分离
将实施例5的所述产物装入100X7.75mm ID柱。将该柱用50mM MESpH5.6缓冲液(结合缓冲液)进行平衡。平衡后，以0.9ml/min向该柱注入含2.0mg/ml卵清蛋白、2.0mg/ml兔IgG和2.0mg/ml溶菌酶的结合缓冲液100ul。然后将该柱在26分钟内用50mM MES pH5.6缓冲液与1.0M NaCl的0至100%线性梯度溶液(洗脱缓冲液)洗脱，然后用100%洗脱缓冲液再洗脱12分钟。使用实施例5的介质，根据实施例6进行分离，其结果如图3所示。
实施例7:用聚烯丙胺制备主配体和离子交换色谱介质
将100ml15(w/w)%的聚烯丙胺(分子量为1000)水溶液和300ml去离子水装入配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的1升3颈烧瓶。在搅拌下，将25g含活性环氧基的聚甲基丙烯酸酯聚合物(中值颗粒尺寸为35微米)缓慢加入至反应器。然后将该烧瓶加热至80℃并反应16个小时。该反应产物用去离子水洗涤，然后用1-甲氧基-2-丙醇洗涤四次。元素分析：C，58.3%；H，7.9%；N，1.7%。
然后将通过上述反应得到的聚合物转移至配有搅拌器、冷凝器、氮气入口和温度控制器的干燥的1升3颈烧瓶。在氮气下向该烧瓶加入400ml1-甲氧基-2-丙醇和14.5g马来酸酐。然后将该烧瓶加热至80℃并反应3个小时。该产物用去离子水洗涤四次。
将通过上述反应得到的马来酸化的聚合物转移回到同样的反应设备中，并向其中加入400ml0.01M NaOH溶液和56g焦亚硫酸钠。然后将该烧瓶加热至80℃并反应4个小时。该产物用去离子水洗涤四次。元素分析：C，54.3%；H，7.3%；N，1.5%；S，1.2%。
实施例8：使用实施例7的介质进行分离
将实施例7的产物装入100X7.75mm ID柱。将该柱用50mM MES pH5.6缓冲液(结合缓冲液)进行平衡。平衡后，以0.9ml/min向该柱注入含2.0mg/ml卵清蛋白、2.0mg/ml兔IgG和2.0mg/ml溶菌酶的结合缓冲液100ul。然后将该柱在26分钟内用50mM MES pH5.6缓冲液与1.0M NaCl的0至100%线性梯度溶液(洗脱缓冲液)洗脱，然后用100%洗脱缓冲液再洗脱12分钟。使用实施例7的介质，根据实施例8进行分离，其结果如图4所示。
实施例9：使用实施例7的介质的容量测试
将实施例7的产物装入VersaTen(100X7.75mmID)柱。将该柱用50mMMES pH5.0缓冲液进行平衡，该缓冲液的电导率通过NaCl调节为3mS/cm(结合缓冲液)。为制备该IgG样品溶液，将360mg人的γ球蛋白(Sigma PNG4386)溶于180ml结合缓冲液中。过滤并超声处理后，将该样品溶液以1.0ml/min的流速注入该柱。注入样品后，该柱用结合缓冲液洗涤20分钟；且结合的IgG用NaCl于50mM MES pH5.0缓冲液中的1.0M溶液以相同的流速洗脱。该滤液在UV280nm进行监测。在突破10%(10%breakthrough)时计算的动态结合容量为66.5mg/ml。根据实施例9，实施例7的介质的容量测试结果如图5所示。
实施例10：实施例1的介质的容量测试
将实施例1的产物装入VersaTen(100X7.75mmID)柱。将该柱用50mMMES pH5.0缓冲液进行平衡，该缓冲液的电导率通过NaCl(结合缓冲液)调节为3mS/cm。为制备该IgG样品溶液，将360mg人的γ球蛋白溶于180ml结合缓冲液中。过滤并超声处理后，将该样品溶液以1.0ml/min的流速注入该柱。注入样品后，该柱用结合缓冲液洗涤20分钟；且所述结合的IgG用NaCl于50mM MES pH5.0缓冲液中的1.0M溶液以相同的流速洗脱。该滤液在UV280nm进行监测。在突破10%时计算的动态结合容量为52.1mg/ml。根据实施例10，实施例1的介质的容量测试结果如图6所示。
实施例11：实施例5的介质的容量测试
将实施例5的产物装入VersaTen(100X7.75mmID)柱。将该柱用50mMMES pH5.0缓冲液进行平衡，该缓冲液的电导率通过NaCl(结合缓冲液)调节为3mS/cm。为制备该IgG样品溶液，将400mg人的γ球蛋白溶于200ml结合缓冲液。过滤并超声处理后，将该样品溶液以2.0ml/min的流速注入该柱。注入样品后，该柱用结合缓冲液洗涤20分钟；且所述结合的IgG用NaCl于50mM MES pH5.0缓冲液中的1.0M溶液，以相同的流速洗脱。该滤液在UV280nm进行监测。在突破10%时计算的动态结合容量为54.3mg/ml。根据实施例11，实施例5的介质的容量测试结果如图7所示。
实施例12：实施例3的介质的容量测试
将实施例3的产物装入VersaTen(100X7.75mmID)柱。将该柱用50mMMES pH5.0缓冲液进行平衡，该缓冲液的电导率通过NaCl(结合缓冲液)调节为3mS/cm。为制备该IgG样品溶液，将400mg人的γ球蛋白溶于200ml结合缓冲液。过滤并超声处理后，将该样品溶液以2.0ml/min的流速注入该柱。注入样品后，该柱用结合缓冲液洗涤20分钟；且所述结合的IgG用NaCl于50mM MES pH5.0缓冲液中的1.0M溶液，以相同的流速洗脱。该滤液在UV280nm进行监测。在突破10%时计算的动态结合容量为55.6mg/ml。根据实施例12，实施例3的介质的容量测试结果如图8所示。
上述实施例提供了本发明的实际工作实施方案的具体描述。且图中所述的结果证明了使用本发明的独特和高效的分离特点。
因此尽管已描述了目前认为是本发明优选的实施方案，本领域技术人员应理解可在不偏离本发明实质的情况下进行改变和修饰，且要求保护在本发明真实范围内的所有这些变化和修饰。

Claims (23)

1.色谱介质，其包含在颗粒表面用烯丙胺或聚烯丙胺衍生化的多孔介质颗粒。
2.根据权利要求1的色谱介质，其中所述多孔介质颗粒包括选自以下的颗粒：环氧化或卤代烷基化的二氧化硅、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯和聚二乙烯基苯。
3.根据权利要求2的色谱介质，其中所述多孔介质颗粒包括环氧化或卤代烷基化的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯聚合物。
4.根据权利要求1的色谱介质，其中所述在颗粒表面用烯丙胺或聚烯丙胺衍生化的多孔介质颗粒进一步通过至少一种其它官能化试剂与所述聚合物树脂表面上的烯丙胺或聚烯丙胺的末端氨基的反应而官能化。
5.根据权利要求3的色谱介质，其中所述在颗粒表面用烯丙胺或聚烯丙胺衍生化的多孔介质颗粒进一步通过至少一种其它官能化试剂与所述聚合物树脂的表面上的烯丙胺或聚烯丙胺的末端氨基的反应而官能化。
6.根据权利要求4的色谱介质，其中所述的至少一种其它官能化试剂选自:酸酐、磺化试剂、烷基氯和包含季铵官能团的烷基氯及其混合物。
7.根据权利要求6的色谱介质，其中所述官能化试剂选自环状羧酸酐、不饱和羧酸酐、亚硫酸氢盐、烷基氯、烷基酸酐、包含季铵官能团的烷基氯及其混合物。
8.根据权利要求7的色谱介质，其中所述至少一种其它官能化试剂选自:戊二酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、焦亚硫酸钠、丁酰氯、乙酸酐、丁酸酐、(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵及其混合物。
9.根据权利要求1的色谱介质，其中所述多孔介质颗粒用分子量少于2500的聚烯丙胺衍生化。
10.一种色谱柱，其用权利要求1的色谱介质进行填充。
11.一种色谱柱，其用权利要求3的色谱介质进行填充。
12.一种色谱柱，其用权利要求5的色谱介质进行填充。
13.一种色谱柱，其用权利要求8的色谱介质进行填充。
14.分离溶液成分的方法，其包括将所述溶液通过权利要求10的色谱柱并洗脱该溶液的成分。
15.分离溶液成分的方法，其包括将所述溶液通过权利要求11的色谱柱并洗脱该溶液的成分。
16.分离溶液成分的方法，其包括将所述溶液通过权利要求12的色谱柱并洗脱该溶液的成分。
17.分离溶液成分的方法，其包括将所述溶液通过权利要求13的色谱柱并洗脱该溶液的成分。
18.根据权利要求14的方法，其中所述溶液为包含生物分子的溶液。
19.制备色谱介质的方法，其包括将包含环氧基或卤代烷基的固体多孔介质颗粒与烯丙胺或聚烯丙胺衍生物反应。
20.根据权利要求19的方法，其中所述聚烯丙胺通过将烯丙胺或分子量为25000或更少的聚烯丙胺反应而获得，或通过接枝的烯丙胺的分子间聚合而获得。
21.制备色谱介质的方法，其包括
i)将包含环氧基或卤代烷基的固体多孔的介质颗粒与烯丙胺反应以形成经烯丙胺接枝的聚合物，和
ii)引发所述经烯丙胺接枝的聚合物的分子间聚合。
22.权利要求21所述的方法，其中所述引发分子间聚合步骤是通过自由基引发剂和过量烯丙胺而引发。
23.权利要求22所述的方法，其中所述自由基引发剂选自偶氮二异丁腈、过氧化乙酰或过氧化苯甲酰。
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