CN103933569A

CN103933569A - 一种抗肺癌药物组合物及其应用、药盒和包装件

Info

Publication number: CN103933569A
Application number: CN201310753527.7A
Authority: CN
Inventors: 郑媛婷; 蔡卫民; 李涛; 邵腾飞; 周宁; 杨慧莹
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103933569B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗肺癌用药物组合物及应用、药盒和包装件。所述药物组合物、药盒及包装件含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和治疗有效量的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI，包括但不仅限于厄洛替尼、吉非替尼；其中，所述阿米洛利与EGFR-TKI的摩尔比为500:1～1:50。本发明所述的药物组合物、药盒及包装件用于治疗肿瘤时，能获得优于EGFR-TKI单独使用的药效，并且对由于K-ras突变而导致EGFR-TKI耐药的肿瘤也有疗效。

Description

一种抗肺癌药物组合物及其应用、药盒和包装件

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗肺癌用药物组合物及其应用、药盒和包装件。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重要疾病之一，其中肺癌已经取代肝癌成为我国发病率最高的恶性肿瘤；据统计，仅2008年就有52.2万人被确诊为肺癌，其中超过85%的患者为难治疗的非小细胞肺癌（Non-small-cell lung carcinoma,NSCLC）。相对于小细胞肺癌，所述NSCLC对化疗不敏感，因此如何提高NSCLC术后化疗的效果成为延长患者生存期的关键,也是我国医药研究工作者的重要任务。

当前已知，表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)信号通路在NSCLC中高度活化，活化的EGFR可激活下游Ras/raf、PI3K/AKT和STAT3/5等信号通路，作用于肿瘤细胞的存活、增殖、凋亡、迁移等过程。目前，针对上述EGFR靶点开发的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR TKI），具有高靶向性、疗效显著、不良反应较小的特点，提高了患者的生存质量，尤其对女性、不吸烟者、腺癌患者和亚洲人群益处明显，临床上已用于肺癌临床治疗的EGFR TKI有厄洛替尼(erlotinib,商品名易瑞沙)、吉非替尼（gefitinib，商品名特罗凯）和埃克替尼。

所述K-RAS基因突变广泛存在恶性肿瘤中，21～43%的非小细胞肺癌（NSCLC）存在K-RAS的基因突变，K-RAS突变主要为G12，G13和Q61位点的点突变，发生在K-RAS的GAPs(GTPase-activating proteins)区域，使GTPase丧失水解GTP能力，导致K-RAS不依赖胞外信号的作用下持续结合GTP而呈过度激活状态，持续性激活c-Raf/MEK/ERK（而不是B-RAF）和PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致细胞恶性转化和促进肿瘤细胞的生存、增殖以及转移等。临床研究显示，K-RAS突变后，可不依赖EGFR激活而持续性活化EGFR下游信号通路，导致EGFR抑制剂的耐药或无反应。

所述盐酸阿米洛利是一种临床应用很久的口服保钾利尿药，具有保钾排钠作用强、起效快、作用持续时间长、副反应轻、用量少等优点，且有降压及改善新功能的作用。盐酸阿米洛利常和氢氯噻嗪、呋塞米合用，因不经肝代谢，肝功能损害者仍可应用，其临床应用安全性较好。随着后续研究发现，所述阿米洛利也有其他靶点的抑制作用，包括调节肿瘤细胞内pH值的Na⁺-H⁺交换体1（Na⁺-H⁺exchanger1，NHE1）、介导肿瘤迁移、入侵以及转移的尿激酶型纤溶酶原激活物(the urokinase-type plasminogen activator,uPA)，因而具有一定的抗肿瘤作用；但其体外抗肿瘤作用的起效浓度均在几个毫摩尔的范围，为体内很难达到的浓度，因此，阿米洛利是否具有体内抗肿瘤的应用前景以及深入的机制阐述仍有待进一步研究。

迄今为止，尚未见有关联合盐酸阿米洛利与EGFR TKI的药物组合应用于抗肺癌治疗的报道。

发明内容

本发明的目的是提供阿米洛利及其衍生物的新的药用用途，同时为以表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药提供一种增强疗效的新药物组合物以及应用；具体涉及一种抗肺癌用药物组合物及其应用、药盒和包装件。

本发明的抗肺癌用药物组合物，含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）；

该组合物含有的阿米洛利和EGFR-TKI，两者的摩尔比为500:1～1:50；

所述的阿米洛利可以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐等；

上述药物组合中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪(dimethyl amiloride,DMA)、5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利(5-ethylisopropyl amiloride,EIPA)、甲基异丁基阿米洛利(methylisobutyl amiloride,MIBA)和5-N,N-环己烷阿米洛利(5-N,N-hexamethylene amiloride,HMA)等；

所述的药物组合物中以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

本发明中，所述阿米洛利和EGFR-TKI的组合可用于制备抗肺癌药物；所述药物组合中含有阿米洛利和EGFR-TKI，两者的摩尔比为500:1～1:50；

其中，阿米洛利可以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐等；

该阿米洛利和EGFR-TKI的药物组合中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪(dimethyl amiloride,DMA)、5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利(5-ethylisopropyl amiloride,EIPA)、甲基异丁基阿米洛利(methylisobutyl amiloride,MIBA)和5-N,N-环己烷阿米洛利(5-N,N-hexamethylene amiloride,HMA)等；

所述的阿米洛利和EGFR-TKI药物组合中以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

本发明还提供了一种抗肺癌用药盒，包括含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元和含有EGFR-TKI的第二药盒单元；

所述的药盒中，含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，含有EGFR-TKI的第二药盒包括临床有效剂量的EGFR-TKI；

该盐酸阿米洛利和EGFR-TKI的组合中，以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼；

本发明同时提供了一种包装抗肺癌药物用的包装件，包括包装空间彼此独立的含有阿米洛利的第一包装单元和含有EGFR-TKI的第二包装单元；

所述的包装件中，含有盐酸阿米洛利的第一包装单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，含有EGFR-TKI的第二包装单元包括临床有效剂量的EGFR-TKI；

该阿米洛利和EGFR-TKI的组合中，以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

本发明中，所述的药盒或包装件中，还包括说明书；所述说明书中规定，所述含有临床有效剂量盐酸阿米洛利的单元和所述含有临床有效剂量的EGFR-TKI的单元，作为联合应用于抗肺癌治疗的制剂。

本发明进行了盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼(Erlotinib，a)、吉非替尼(Gefitinib，b)对Calu-6细胞的短期生长抑制试验，盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼、吉非替尼的长期生长抑制试验，并采用Western Blot法检测盐酸阿米洛利联用盐酸厄洛替尼、吉非替尼对EGFR磷酸化及其下游p-STAT3、p-AKt、p-Erk的影响，实验结果表明，盐酸阿米洛利在无明显细胞毒作用的浓度下，能显著增加EGFR TKI厄洛替尼和吉非替尼的抗肿瘤作用；

本发明的实验中，将盐酸阿米洛利与厄洛替尼或吉非替尼的组合物用于K-ras突变的人非小细胞肺癌calu-6细胞，结果显示，与单独使用厄洛替尼或吉非替尼相比，抑制肿瘤细胞短期生长以及长期生长的作用效果更明显；

实验结果还显示，所述的药物组合物与单用厄洛替尼或吉非替尼达到相同抗肿瘤效果时，明显降低了厄洛替尼或吉非替尼的使用量，其增效作用随阿米洛利用量的增加而增加；

此外，实验结果还表明，盐酸阿米洛利能显著增加厄洛替尼或吉非替尼对其靶点EGFR磷酸化的抑制作用。

本发明提供了了盐酸阿米洛利的制药新用途，即作为肿瘤化疗增敏剂，和EGFR TKI联用增加其抗肺癌的作用；尤其是对由于K-ras突变而对EGFR TKI耐药的肺癌，可增加肿瘤对其的敏感性，提高临床化疗的效果。

附图说明

图1盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼(Erlotinib，a)、吉非替尼(Gefitinib，b)对Calu-6细胞的短期生长抑制试验，其中，细胞存活率（Survival）采用MTT法测定，^*，p<0.05VS阿米洛利0组，^**，p<0.01VS阿米洛利0组；

盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼、吉非替尼对HCC-827、NCI-H292、H1975细胞的短期生长抑制试验，其中，细胞存活率采用MTT法测定，^*，p<0.05VS阿米洛利0组，^**，p<0.01VS阿米洛利0组。

图2盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼、吉非替尼的长期生长抑制试验，

其中，给药14天的细胞用吉姆萨染液染色后拍照；

盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼、吉非替尼对HCC-827、NCI-H292和H1975细胞的长期生长抑制作用，其中，给药14天的细胞用吉姆萨染液染色后拍照。

图3Western Blot法检测盐酸阿米洛利联用盐酸厄洛替尼、吉非替尼对EGFR磷酸化及其下游p-STAT3、p-AKt、p-Erk的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。但并不意味着本发明仅限于此。

实施例1 MTT法检测盐酸阿米洛利与厄洛替尼、吉非替尼联合用药对人非小细胞肺癌Calu-6的细胞毒作用

实验材料：

人非小细胞肺癌细胞calu-6（中科院上海细胞库）于37℃，5%CO₂条件下常规培养，培养基为含10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI-1640（Gibco）。盐酸阿米洛利标准品购自中国药品生物制品检定所，母液50mM由DMSO配制。盐酸厄洛替尼、吉非替尼原料药由轩鸿医药（济南）提供，母液10mM DMSO配。MTT购自Sigma（美国）。实验方法：

1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5×10⁴细胞/ml。100μl/孔接种于96孔培养板中，于培养箱中培养过夜。

2.次日更换培养基，10μl/孔加入工作液，使单独用药组盐酸阿米洛利的终浓度分别为100，200，400μM(加入的系列工作液由PBS稀释，DMSO的浓度小于1.3%)，盐酸厄洛替尼和吉非替尼的终浓度分别为10，30，100μM，联合用药组则10μl/孔分别加入两种药物上述浓度的工作液。空白对照组含DMSO 1.3%。

3.将给药后的细胞于37℃，5%CO₂条件下培养48小时。

4.每孔加入10μl MTT(5mg/ml)溶液，继续在培养箱中培养4小时。

5.洗去培养基，加入100μl DMSO，置于摇床上37℃使充分溶解，以检测波长570nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。N=4，实验平行三次。

实验结果：

选取代表性的实验结果如图1所示，结果显示，在calu-6细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼及吉非替尼对肿瘤细胞的短期抑制作用。

实施例2 MTT法检测盐酸阿米洛利与厄洛替尼、吉非替尼联合用药对人非小细胞肺癌HCC-827、NCI-H292、H1975的细胞毒作用

实验材料：

人非小细胞肺癌细胞HCC-827、NCI-H292、H1975（中科院上海细胞库）于37℃，5%CO₂条件下常规培养，培养基为含10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI-1640（Gibco）。盐酸阿米洛利标准品购自中国药品生物制品检定所，母液50mM由DMSO配制。盐酸厄洛替尼、吉非替尼原料药由轩鸿医药（济南）提供，母液10mM DMSO配。MTT购自Sigma（美国）。

实验方法：

2.次日更换培养基，加入相应浓度的单独用药或联合用药的药物，给药后的细胞于37℃，5%CO₂条件下培养48小时。

4.每孔加入10μl MTT(5mg/ml)溶液，继续在培养箱中培养4小时。

实验结果显示，在HCC-827、NCI-H292、H1975细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼及吉非替尼对肿瘤细胞的短期抑制作用（如图1所示）。

实施例3 盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼、吉非替尼的长期生长抑制试验

实验材料：

吉姆萨染液购自Sigma-Aldrich(071M4343)；其余材料同实施例1。

实验方法：

1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为1×10³细胞/ml。600μl/孔接种于6孔培养板中（培养板预先放1.9mL培养基），于培养箱中培养过夜。

2.72h后更换含药培养基，使单独用药组盐酸阿米洛利的终浓度为100μM，盐酸厄洛替尼和吉非替尼的终浓度分别为10μM，联合用药组含有上述两种相同终浓度的药物。空白对照组含DMSO 0.3%。

3.将给药后的细胞于37℃，5%CO₂条件下培养6天。

4.去掉含药培养基，加入新鲜空白培养基，继续在培养箱中培养6天。

5.去掉培养基，PBS洗一遍。加入吉姆萨染液染色1小时，数码相机拍照。

实验结果：

选取代表性的实验结果如图2所示，结果显示，在calu-6细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼及吉非替尼对肿瘤细胞的长期抑制作用。

实施例4 盐酸阿米洛利增敏盐酸厄洛替尼、吉非替尼对HCC-827、NCI-H292和H1975细胞的长期生长抑制试验

实验材料：

吉姆萨染液购自Sigma-Aldrich(071M4343)；其余材料同实施例1。

实验方法：

2.72h后更换含药培养基，将给药后的细胞于37℃，5%CO₂条件下培养21天，每4天更换一次含药培养基。

3.去掉培养基，PBS洗一遍。加入吉姆萨染液染色1小时，数码相机拍照。

实验结果显示，在HCC-827、NCI-H292和H1975细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼及吉非替尼对肿瘤细胞的长期抑制作用（如图2所示）。

实施例5 盐酸阿米洛利联用盐酸厄洛替尼、吉非替尼对EGFR磷酸化及其下游信号通路的影响

实验材料：

RIPA裂解液、PMSF购自碧云天生物生物技术研究所（江苏）。Protease InhibitorCocktail购自Merck公司（德国）。抗P-EGFR一抗购自Invitrogen，抗P-STAT3、P-Akt、P-Erk一抗购自cell Signaling Technology，抗β-actin一抗、抗小鼠及抗兔二抗均购自SantaCruze；其余材料同实施例1。

实验方法：

1.细胞培养及给药

分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5×103细胞/孔接种于6孔培养板中。

培养48h后加入含药培养基，使盐酸阿米洛利的终浓度为400μM，盐酸厄洛替尼的终浓度为30μM，空白对照组含DMSO 1.1%。

将给药后的细胞于37℃，5%CO2条件下培养24小时。

2.蛋白提取：

临用前将PMSF（100mM，1:100）及Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ（1:200）加入RIPA裂解液；

6孔板培养的细胞倒去培养基后，用PBS清洗一遍，加入150μl裂解液冰浴裂解20min；

裂解后转移至EP管中，9000g离心5min；

吸取上清进行定量，同时取部分上清，加入1/4体积的上样缓冲液（5×），90-95℃煮8min；

变性后的蛋白保存于-80℃冰箱中。

3.Western Blot检测P-EGFR、p-STAT3、P-Akt、P-Erk的表达

上样量：BCA蛋白定量药盒对各组提取的蛋白样品进行定量，校正后蛋白样品上样量为60μg；

电泳方法：60V恒压电泳50分钟进行样品的浓缩；120V电泳1小时进行样品的分离，根据marker判断电泳程度；

转膜：采用湿转，200mA，横流转膜2小时；

抗体杂交：首先用5%的BSA（封闭液）在37℃摇床上封闭1小时；用封闭液将一抗按说明书稀释，将转好的膜在杂交袋中4℃杂交过夜；TBST洗膜四次（37℃摇床，每次5mL，5min）；用封闭液将二抗稀释，在杂交袋中37℃摇床杂交1小时；TBST洗膜四次后进行化学发光检测；

化学发光检测：采用增强型化学发光法（ECL法）进行目的蛋白的检测。

实验结果：

选取代表性的实验结果如图3所示，结果显示，在calu-6细胞上盐酸阿米洛利增加了盐酸厄洛替尼及吉非替尼对p-EGFR的抑制作用。

Claims

1.一种抗肺癌药物组合物，其特征在于，含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的阿米洛利和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，其含有的阿米洛利和EGFR-TKI，两者的摩尔比为500:1～1:50。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述阿米洛利以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐。

4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪、5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利、甲基异丁基阿米洛利和5-N,N-环己烷阿米洛利。

5.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

6.阿米洛利和EGFR-TKI的组合在制备抗肺癌药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述阿米洛利和EGFR-TKI的组合中含有阿米洛利和EGFR-TKI，两者的摩尔比为500:1～1:50。

8.根据权利要求6或7用途，其特征在于，所述阿米洛利以碱基形式或者盐的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐。

9.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述阿米洛利和EGFR-TKI的组合中，以阿米洛利为母核的衍生物，包括但不限于二甲基氨氯吡咪、5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利、甲基异丁基阿米洛利和5-N,N-环己烷阿米洛利。

10.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述阿米洛利和EGFR-TKI的组合中，以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

11.一种抗肺癌用药盒，包括含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元和含有EGFR-TKI的第二药盒单元。

12.根据权利要求11所述的药盒，其特征在于，所述含有盐酸阿米洛利的第一药盒单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，所述含有EGFR-TKI的第二药盒包括临床有效剂量的EGFR-TKI。

13.根据权利要求11或12所述的药盒，其特征在于，所述盐酸阿米洛利和EGFR-TKI的组合中，以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

14.一种包装抗肺癌药物用的包装件，其特征在于，包括包装空间彼此独立的含有阿米洛利的第一包装单元和含有EGFR-TKI的第二包装单元。

15.根据权利要求14所述的包装件，其特征在于，所述含有阿米洛利的第一包装单元包括临床有效剂量的盐酸阿米洛利，所述含有EGFR-TKI的第二包装单元包括临床有效剂量的EGFR-TKI。

16.根据权利要求14或15所述的包装件，其特征在于，所述含有阿米洛利和含有EGFR-TKI的组合中，以抑制表皮生长因子酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼。

17.根据权利要求11-13中任一项所述的药盒或权利要求14-16中任一项所述的包装件，其特征在于，还包括说明书，该说明书中规定，所述含有临床有效剂量盐酸阿米洛利的单元和所述含有临床有效剂量的EGFR-TKI的单元，作为联合应用于抗肺癌治疗的制剂。