CN103937810B

CN103937810B - 超富集植物龙葵金属硫蛋白基因（mt‑l3）序列及其克隆方法

Info

Publication number: CN103937810B
Application number: CN201310027038.3A
Authority: CN
Inventors: 张倩茹; 魏树和; 焦洪静
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2033-01-22
Also published as: CN103937810A

Abstract

本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种超富集植物龙葵金属硫蛋白基因（MT‑L3）序列及其克隆方法。超富集植物龙葵金属硫蛋白基因序列为3型金属硫蛋白基因，其基因序列为SEQ ID NO.1中核苷酸序列所示。本发明超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因的成功克隆和测序，为进一步分析MT‑L3影响下生物抗逆能力，为MT‑L3其它功能的筛选及应用奠定了基础。

Description

超富集植物龙葵金属硫蛋白基因（MT-L3）序列及其克隆方法

技术领域

本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种超富集植物龙葵金属硫蛋白基因（MT-L3）序列及其克隆方法。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein,MTs)是一类低分子量、高Cys含量、具有金属结合能力的多肽,最早在蓄积镉的马肾组织中发现,而在植物中分离的与动物MTs同源的蛋白被称为植物类金属硫蛋白(Metallothionein Like,MT-L)。最早是由Casterline和Barnett于1977年从大豆根中发现的。根据Cys的位置与排列方式,植物类金属硫蛋白被分为三类。MT-L1具有6个Cys-X-Cys单元，C端和N端结构域各含3个，2个结构域之间是由约40个氨基酸残基组成的不含Cys的间隔区，间隔区氨基酸残基较多是绝大多数植物MT的共同特征；MT-L2与MT-L1类似，但第一和第二个Cys以Cys-Cys形式出现，而且通常位于多肽链的第三和第四位，N端多有一个高度保守的序列MSCCGGNCGCG，C端结构域有3个Cys-X-Cys单元，MT-L1与MT-L2的最大区别在于前者的Cys集中分布在肽链的N端和C端,中间由一段不含Cys的间隔区相连,后者的Cys则散布在整个肽链中；MT-L3为非基因编码产物,是以谷胱甘肽为底物酶促合成的多聚物，在N端有4个Cys,前面3个多以Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys方式排列，第四个Cys通常包含Gln-Cys-X-Lys-Lys-Gly单元中，C端结构域有6个Cys。MT-L4包含3个富含Cys的结构域，每个都包含5-6个Cys残基，结构域之间为10-15个氨基酸残基组成的间隔区，多数Cys以Cys-X-Cys的形式存在。MT-L通过Cys残基上的-SH可以与Cd、Zn等重金属离子螯合形成无毒或低毒的络合物，还可以与重金属等胁迫条件诱发产生的自由基、ROS发生氧化还原反应，从而降低氧化损伤。植物MT-L基因家族的成员大多数以单拷贝或两个拷贝的方式分散在整个基因组中。植物MT-L基因表达具有组织器官特异性和发育阶段特异性，目前研究最多的是金属离子对植物MT-L基因表达的影响，已有研究报道植物MT-L基因与重金属Cd的耐受性有一定相关性，但金属离子影响MT-L基因表达的机理仍不十分清楚，特别是在重金属超富集植物中MT-L基因究竟扮演何等角色是目前该领域的研究热点。

由ZL200410021546.1专利中可知龙葵（Solanum nigrum L.）为具有Cd超富集特征的植物，经分析表明：龙葵在土壤中Cd含量为20-110mg/kg条件下，其植物叶片或茎中Cd含量范围为110-496mg/kg,超过100mg/kg这一Cd超富集植物应达到的临界含量标准，并且具有超富集植物的其它特征；植物盆栽试验表明：在Cd污染水平为25.0和50.0mg/kg时，该植物茎和叶中Cd含量超过100mg/kg这一Cd超富集植物应达到的临界含量标准；小区试验和污染区采样试验也表明：该植物也表现出Cd超富集植物的基本特征。因此，可以确定该专利所用植物为Cd超富集植物。此外，研究表明：龙葵生育期较短，通常只有80天左右，在沈阳地区采取花期收获方式一年可收获两季，吉林和黑龙江地区至少可生长一季。其株高一般为80-150cm，生物量较大，根系分布广，株型紧凑，非常适合作为重金属Cd污染土壤的修复植物。因此，研究超富集植物龙葵金属硫蛋白基因为揭示和利用其解毒防御系统功能具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超富集植物龙葵金属硫蛋白（MT-L3）基因序列及其克隆方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种超富集植物龙葵金属硫蛋白基因序列，超富集植物龙葵金属硫蛋白基因序列为3型金属硫蛋白基因，其基因序列为SEQ ID NO.1中核苷酸序列所示。

超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因序列编码蛋白，超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因序列编码蛋白为SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。

超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因序列的克隆方法，首先从鲜活的龙葵叶片中提取总RNA;然后利用反转录酶AMV和反转录引物合成第一链cDNA；而后以合成的第一链cDNA为模板，利用兼并引物MT-L3-F（5’-ATGTCGGACAAGTGYRGYARTTG-3’）和MT-L3-R（5’-TTAATGAGCACAAGTGCAGTTAAC-3’）进行PCR扩增；将PCR产物克隆至pMD-18T载体后，取阳性克隆经测序最终获得超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因序列SEQ ID NO.1。

本发明具有如下优点：

1.采用本发明对超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因的成功克隆和测序，首次确定其全部编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。

2.超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因的成功克隆和测序，为进一步分析MT-L3影响下生物抗逆能力，为MT-L3其它功能的筛选及应用奠定了基础；

3.利用本发明所得MT-L3基因对不同浓度污染物的表达情况来作为重金属超富集植物筛选工具提供了方法学的指导。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因PCR的电泳图。

图2为本发明实施例3提供的Cd胁迫处理能够显著诱导MT-L3表达的效果图。

具体实施方式

本发明通过对GeneBank中龙葵3型金属硫蛋白基因序列进行比对分析，利用ABI公司的Primer Express Software v2.0软件分析所有龙葵3型金属硫蛋白基因序列的同源性区域设计简并引物；其克隆方法包括：（1）通过分析龙葵3型金属硫蛋白基因的同源性区域设计简并引物MT-L3-F和MT-L3-R；（2）从鲜活的超富集植物龙葵叶片中提取总RNA；（3）利用反转录酶AMV和反转录引物（随机引物）合成第一链cDNA；（4）以合成的第一链cDNA为模板，利用兼并引物MT-L3-F和MT-L3-R进行PCR扩增，扩增片段大小约为200bp；此外，所述兼并引物还可以为序列表中SEQ ID NO.1核苷酸序列片段；（5）克隆及测序最终获得超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因核苷酸序列SEQ ID NO.1。

本发明首次从超富集植物龙葵中克隆到一种3型金属硫蛋白基因，该序列cDNA全长200bp，其中开放阅读框位于1-198位核苷酸，编码65个氨基酸残基。

实施例1

龙葵MT-L3基因如SEQ ID NO.1所示：

atgacggaca agtgtagcaa ttgcgattgc gctgatgtca gccaatgcgtgaggaaggagagccaatatg atgtcgtcat cgtcgaaaag agctacatcg agacggtggtgatgatggacgttggagcgg aagaacatga tggaaaatgc aaatgcggca gcagctgcgcctgtgttaactgcacttgtg ctcattaaaa

（a）序列特征：

●长度：200bp 1-198位核苷酸

●类型：核苷酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：双链DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：龙葵

实施例2龙葵MT-L3基因的克隆方法

从龙葵中克隆上述MT-L3基因的方法为：

（1）从鲜活的超富集植物龙葵叶片中提取总RNA；

（2）以总RNA为模板，利用反转录酶AMV和随机引物（Random Primers，Invitrogen，美国）合成第一链cDNA；

（3）以合成的第一链cDNA为模板，利用兼并引物MT-L3-F和MT-L3-R进行PCR扩增，扩增片段大小约为200bp（见图1）；

（4）将PCR产物克隆至pMD-18T载体后，取阳性克隆经测序最终获得超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因序列。

其中所述引物包括：

MT-L3-F：5’-ATGTCGGACAAGTGYRGYARTTG-3’

MT-L3-R：5’-TTAATGAGCACAAGTGCAGTTAAC-3’

具体操作条件如下：

1．RNA提取步骤

（1）总RNA提取：

称取1.5g叶片组织放入用液氮预冷过的碾钵中，在液氮中研磨至粉末状，转至无RNA酶、无热源的1.5ml Eppendorf管中，加1ml Trizol，用QIAGEN Tissue Ruptor匀浆；室温放置10分钟，加200μl氯仿，充分混匀，15000rpm离心5分钟；取上清，至1.5ml Eppendorf管加600μl氯仿，混匀，15000rpm离心5分钟；取上清，至1.5ml Eppendorf管加500ul异丙醇，混匀，15000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的75％乙醇1ml冲洗，13000rpm离心5分钟；弃上清，RNA沉淀于空气中干燥3分钟；将干燥后的RNA溶解于DEPC处理水中，至完全溶解。将总RNA作适当稀释后，紫外分光光度计测OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，并定量。定量公式：RNA浓度（μg/ml）=OD₂₆₀值×40×稀释倍数（本实验为400倍）

2．反转录反应

（1）按下列顺序在1.5ml离心管中加入下列组份：

注：总RNA与DEPC水的总体积是8μl，其中总RNA量为2μg；

（2）上述反应液65℃水浴5分钟，室温静置10分钟，10000rpm离心5秒。

（3）按下列顺序向上述离心管中加入下列组份：反应物(加入之后总体积为20ul)：

水浴40℃下反应1小时后，90℃处理10分钟，冰浴5分钟，10000rpm离5秒。

3．按下列组份配制PCR反应体系：

PCR反应条件：1个循环，95℃变性2min；40个循环，94℃变性10sec；60℃退火10sec；72℃延伸40sec；1个循环，72℃延伸1min；4℃保温。

4．PCR产物的克隆

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物；将回收片段与pMD-18T载体连接；将全部连接产物转化到大肠杆菌DH-5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素（100μg/ml）和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-ga l0.2μg/ml）的平板过夜，挑取白斑，在LB液体培养基（5ml，含100μg/ml氨苄青霉素）过夜培养。

5．质粒纯化及测序

取过夜培养菌液1-2ml，10000rpm离心1分钟，收集细胞，用微量DNA纯化试剂盒纯化质粒，步骤按说明书操作。将质粒送与测序公司测序。

按照上述PCR产物克隆、质粒纯化及测序步骤得到目的基因的cDNA序列，cDNA全长200bp，其中开放阅读框位于1-198位核苷酸，编码65个氨基酸残基。MT-L3的氨基酸具有SEQID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.2

MTDKCSNCDC ADVSQCVRKE SQYDVVIVEK SYIETVVMMD VGAEEHDGKC KCGSSCACVNCTCAH

（a）序列特征：

●长度：65aa

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：龙葵

实施例2MT-L3的cDNA同源性序列比较

用本发明得到的超富集植物龙葵（Solanum nigrum L.）3型金属硫蛋白的cDNA序列及其编码的蛋白质序列，在GenBank数据库中用BLAST软件（http://www.ncbi.nim.nih.gov/）进行核苷酸和蛋白同源性比对，比对结果为：

根据两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0.005，则两个序列之间具有绝对同源性，即证明序列为同一种基因序列。从比对结果看龙葵的基因序列与其他物种的MT-L3基因的E值均小于0.005，同源性大于67％，所以证明所克隆目的基因是MT-L3基因的同源序列。

蛋白质结构特征包括：分子量为7061.0道尔顿（Da），等电点（pI）为4.67。氨基酸组成中半胱氨酸（Cys）和缬氨酸（Val）所占比例较高，分别占15.4％和13.8％；含有极少量芳香族氨基酸，酪氨酸（Tyr）占3.1％，组氨酸（His）占3.1％，无苯丙氨酸（Phe）。结构包括α螺旋占9.2％，随机卷曲占63.1％，延伸链占27.7％。由核苷酸序列推导出的氨基酸序列中共含有10个半胱氨酸（Cys，缩写为C）,它们与邻近的氨基酸组成了若干个金属硫蛋白的保守性结构C-X_n-C,其中4个C-X-C结构，2个C-X-X-C结构，1个C-X-X-X-C结构，还有1个C-X-X-X-X-X-C结构。SEQ ID NO.2所示序列在N端有4个Cys,C端结构域有6个Cys。因此，该氨基酸序列是龙葵的3型金属硫蛋白。

实施例3超富集植物龙葵3型金属硫蛋白在不同浓度Cd胁迫下的表达

将具有上述序列表SEQ ID NO.1中所示龙葵幼苗栽种于投加不同浓度Cd（2.5mg/kg，5mg/kg和40mg/kg）和无添加Cd的土壤中至成熟期，取不同处理组（2.5mg/kg，5mg/kg和40mg/kg）和对照组（无Cd处理）龙葵叶片的总RNA，总RNA提取方法参见上述实施例，利用荧光定量PCR仪（ABIStep-One Plus Real Time PCR System，美国）做表达差异分析，定量PCR引物为MT-L3-F和MT-L3-R。结果表明，Cd胁迫处理能够显著诱导MT-L3的表达，分别是对照的2.4倍、3.7倍和31.3倍（见图2），与龙葵能够耐受并大量积累重金属Cd的能力密切相关，因此该基因可以日后用于植物基因工程以及重金属土壤植物修复。

Claims

1.一种超富集植物龙葵金属硫蛋白基因，其特征在于：超富集植物龙葵金属硫蛋白基因为3型金属硫蛋白基因，其基因序列为SEQ ID NO.1中核苷酸序列所示。

2.一种权利要求1所述的超富集植物龙葵金属硫蛋白基因编码蛋白，其特征在于：超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因编码蛋白为SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。

3.一种权利要求1所述的超富集植物龙葵金属硫蛋白基因的克隆方法，其特征在于：首先从鲜活的龙葵叶片中提取总RNA；然后利用反转录酶AMV和反转录引物合成第一链cDNA；而后以合成的第一链cDNA为模板，利用兼并引物MT-L3-F和MT-L3-R进行PCR扩增；将PCR产物克隆至pMD-18T载体后，取阳性克隆经测序最终获得超富集植物龙葵3型金属硫蛋白基因序列SEQ ID NO.1；

其中，引物MT-L3-F为5’-ATGTCGGACAAGTGYRGYARTTG-3’，引物MT-L3-R为5’-TTAATGAGCACAAGTGCAGTTAAC-3’。