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CN103866401A - 一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素b1纳米抗体2014afb-g15 - Google Patents

一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素b1纳米抗体2014afb-g15 Download PDF

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CN103866401A CN201410121842.2A CN201410121842A CN103866401A CN 103866401 A CN103866401 A CN 103866401A CN 201410121842 A CN201410121842 A CN 201410121842A CN 103866401 A CN103866401 A CN 103866401A
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pcantab
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王妍入
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张兆威
丁小霞
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Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
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Abstract

本发明涉及黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。所述黄曲霉毒素纳米抗体基因库是通过提取免疫黄曲霉毒素B1抗原后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体可变区基因得到黄曲霉毒素纳米抗体VHH基因，然后与pCANTAB5E（his）载体连接后转化得到。本发明筛选得到的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15具有耐有机试剂、耐高温等特性，稳定性好；对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC50为0.66ng/mL，对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为22.6%、0.95%、32.1%和26%。

Description

一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。
背景技术
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，在各种食物及农产品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黄曲霉毒素的污染。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
现有黄曲霉毒素的检测方法包括化学分析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中化学分析法是早期检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素的抗体。
随着抗体技术的发展，重组抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。与传统的多克隆抗体、单克隆抗体相比较而言，重组抗体具有其独特的优势，可以在原核表达体系里在很短的时间内大量生产并且生产费用低廉，对黄曲霉毒素的低成本、大规模检测有重要的应用价值，可以满足日益增长的黄曲霉毒素抗体的生产需要。纳米抗体是采用分子生物学手段，获得骆驼科动物体内的天然重链抗体可变区片段，并能与抗原特异性结合。目前，尚没有针对黄曲霉毒素B1的纳米抗体的相关报道。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。
为实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：
黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于：提取经黄曲霉毒素B1抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化得到。
上述方案中，所述pCANTAB 5E（his）载体是通过如下方法构建得到：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI-F: 5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(Sfi I)；下游引物：p5E N-P-H-R: 5’- GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCG GCCGCCCGTTTTC-3’ PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E（his）载体。
黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，具体操作方法如下：对羊驼免疫黄曲霉毒素B1抗原，提取经免疫后羊驼血液中的RNA，反转录为cDNA，设计特异性引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化，构得黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
上述方案中，所述特异性引物的末端需包含根据pCANTAB 5E（his）载体克隆位点附近序列设计的在VHH基因两端分别引入载体pCANTAB 5E（his）同源序列的引物序列，每条特异性引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E（his）同源位点，以在VHH基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB 5E（his）同源序列；所述特异性引物为：
R1:  5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTG CG -3’ 
F:   5-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；或
R2:  5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTG GG -3’
F:  5’-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’，其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E（his）同源的位点。
上述方案中，所述PCR扩增的反应体系为：
10× Ex taq Buffer                   5μl
50mM MgSO4                                           2μl
10 mM dNTP                           1μl
10 mM F引物                          1μl
10 mM R1引物(或R2引物)      1μl
Ex taq DNA 聚合酶               0.1μl
cDNA 模板                            2μl
ddH2O  补至总体系              50μl；
所述PCR扩增的程序为：
94℃ 2min；94℃30s，55℃30s，68℃1min，扩增30个循环；68℃5min；
其中，以R1为引物的PCR扩增反应次数：以R2为引物的PCR扩增反应次数为2:3。
上述方案中，所述VHH基因与pCANTAB 5 E（his）载体的连接方法为：将pCANTAB 5 E（his）载体经SfiⅠ/NotⅠ双酶切处理，然后与VHH基因进行In-fusion连接；所述的转化为：将前述连接产物加入到大肠杆菌TG1电转化感受态细胞中，混匀，电转化，电转化条件：0.1 cm 电转化杯，1.8 kV，200 Ω，25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入2YT 液体培养基吹打后转移，37℃缓慢振摇复苏1 h。
上述黄曲霉毒素纳米抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素B1纳米抗体的应用。
上述方案中，所述的噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素B1纳米抗体具体通过如下技术方案实现：将构建成功的黄曲霉毒素纳米抗体基因库通过M13KO7辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过吸附-洗脱的方法进行淘选，筛选出与黄曲霉毒素B1特异性结合而不和载体蛋白BSA结合的阳性孔，然后采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择灵敏度较高的克隆，最终筛选获得噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体。
黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。
上述黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15在ELISA检测黄曲霉毒素B1方面的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明所述黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法简单；筛选得到的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15具有耐有机试剂、耐高温等特性，稳定性好；
（2）本发明提供的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC50 为0.66ng/mL，对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为22.6%、0.95%、32.1%和26%；
（3）本发明提供的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15可应用于对黄曲霉毒素B1的ELLSA检测，能有效降低样品提取液中有机试剂等其他成分的干扰，从而提高检测准确度。
（4）本发明提供的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15为原核生物大肠杆菌表达，因此，能有效降低抗体生产成本。
具体实施方式
实施例1  黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建
1. 动物免疫
购买2岁的雄性羊驼一只，免疫黄曲霉毒素B1抗原（AFB1-BSA, Sigma公司）。将200μg黄曲霉毒素B1抗原与弗式不完全佐剂乳化后，对羊驼进行皮下多点注射。间隔2周免疫一次，每次免疫后7-10天对羊驼进行静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选取效价最高的一次免疫后，取血10mL，提取总RNA。
2.cDNA文库的构建
（1）提取总RNA：选取羊驼血清效价最高的一次免疫，免疫后7-10天，对羊驼进行静脉取血10mL，提取总RNA：采用Life Technology公司的LeukoLOCK总RNA分离试剂盒提取羊驼血液中的总RNA。
（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) 15为引物，按照Promega公司的反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链，获得cDNA文库。
3.黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建
（1）以步骤2中合成的cDNA为模板，R1、F或R2、F为引物，进行PCR扩增得到羊驼重链抗体可变区基因，即VHH基因：取cDNA 2μl，10×PCR Buffer 5μl，MgSO4（50mM）2μl，dNTP (10mmol/L) 1μl，F引物（10μmol/L)1μl，R1(或R2)引物(10μmol/L)1μl，DNA酶0.1μl，无菌纯水37.9μl至50μl，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃变性2min后；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸5min。
R1: 5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCATGGGGGTCTTCGCTGTG GTGCG -3’，
R2: 5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTG GG -3’，
F:  5’-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E（his）同源的位点；以R1、F为引物进行4个PCR扩增反应，以R2、F为引物进行6个PCR扩增反应。PCR 产物经过0.7％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收450bp大小的DNA片段。
（2）pCANTAB 5E（his）载体构建：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI-F: 5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(Sfi I)；下游引物：p5E N-P-H-R: 5’- GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGCCGCCCGTTTTC-3’PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E（his）载体。
（3）双酶切处理pCANTAB 5 E（his）：
SfiⅠ单酶切：
按照如下体系配制反应液：pCANTAB 5 E（his） vector      30μl
SfiⅠ                         1μl
10×M Buffer                10μl
ddH2O 补至总体系         100μl
50℃水浴2 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。
NotⅠ酶切：
按照如下体系配制反应液：
 pCANTAB 5 E （his）SfiⅠ单酶切回收产物      30μl
NotⅠⅠ                                 1μl
10×H Buffer                             10μl
ddH2O 补至总体系                    100μl
37℃水浴4 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收；
（4）VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5 E（his）载体的连接
按照如下体系进行In-Fusion连接：
SfiⅠ/NotⅠ双酶切处理的pCANTAB 5 E （his）vector     120ng
VHH基因                                                40ng
5×In-Fusion buffer                                       2μl
In-Fusion Enzyme                                        1μl
ddH2O补至总体系                                     10μl
37℃水浴15min后，放入50℃水浴15min，水浴后立即放在冰上5min，加入40μl TE缓冲液，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收，-20℃保存待用。
（5）连接产物的电转化
将上述连接产物取 5μl加入到50μl E. coli TG1电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的 0.1 cm 电转化杯 (Bio-RAD) 中，冰上放置10min，然后放在Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8 kV，200 Ω，25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入1 mL 2YT 液体培养基吹打后转移至一灭菌后的干净15 mL 摇菌管中，37℃缓慢振摇复苏1 h。取2μl菌液倍比稀释后涂布于LB 氨苄平板上，37℃倒置过夜，第二天数菌落个数计算库容量。
（6）黄曲霉毒素纳米抗体基因库的拯救：共进行十次上述的电转化，将复苏后的菌液全部转入200mL SB培养基中，于37℃ 250rpm振摇至OD600值为0.5时，加入1mL，1×1012 pfu的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置1h后，继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃ 10000rpm离心15min，将上清转移至无菌的离心瓶中，加入1/4体积的5x PEG/NaCl，于冰上静置2h后，4℃ 12000rpm离心20min，用10mL无菌的重悬溶液（含1×蛋白酶抑制剂，0.02% NaN3和0.5% BSA的PBS缓冲液）溶解沉淀得到拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
实施例2  黄曲霉毒素B1纳米抗体的筛选以及序列测定
1.   黄曲霉毒素B1纳米抗体的淘选
用AFB1-BSA（1μg/孔）及3% 的BSA-PBS溶液（用作阴性对照）分别包被ELISA 板，4℃过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用3％脱脂奶粉封闭1 h；PBST洗板3 次，在包被有AFB1-BSA的孔中加入上述拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库50 μl，37℃孵育1 h；PBST 洗板10次后，每孔加入100μl 、100ng/mL AFB1溶液，室温（20℃~30℃）震荡30min洗脱。将洗脱液转至包被有3%BSA-PBS溶液的孔中，37℃孵育1h（去除非特异性吸附）；孵育后，取上清侵染2mL生长至对数期的TG1菌液，37℃侵染20min，取1μl 、10μl 分别涂布LB氨苄平板上，并于37℃培养箱中静置过夜，次日数平板上的菌落数确定洗脱液中噬菌体滴度。另将上述剩余的被侵染后的TG1菌液转入6mLSB培养基中，加100mg/mL的氨苄青霉素1.5μl，37℃振摇1h，补加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，继续振摇1h后，加入1mL辅助噬菌体M13KO7（1×1012pfu/mL），37℃静置30min，转入100mL SB培养基，补加氨苄青霉素（100mg/mL）46μl，继续振摇2h后，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并于37℃振摇过夜。次日，将菌液于10000rpm 4℃离心15min，转移上清，并加入1/4体积PEG/NaCl溶液，于冰上孵育2h，12000rpm 4℃离心20min，用1%BSA-PBS溶液溶解沉淀，得到第一轮淘选扩增产物，并用于下一轮淘选。在随后几轮的淘选中，包被抗原AFB1-BSA的浓度分别为0.5μg/孔、0.1μg/孔、0.05μg/孔，洗脱液分别为500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL的AFB1溶液。
2.  阳性克隆的鉴定：
经过4轮淘选后，取2μl洗脱液倍比稀释后侵染生长至对数期的TG1菌液，涂布LB氨苄平板上，37℃倒置过夜。次日，随机挑取30个克隆分别于3mL SB-氨苄培养基中，37℃震荡培养6-8h，至OD600为0.6左右，加入30μl辅助噬菌体M13KO7（1×1012pfu/mL），37℃静置30min后继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并震荡培养过夜；次日，将菌液于10000rpm 4℃离心15min后，得到菌液上清。
用包被液配制AFB1-BSA至终浓度0.2μg/ml，包被96孔ELISA 板，每孔100μl，同时另取ELISA板，其中的32个孔用3%BSA包被，4℃包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用3％脱脂奶粉-PBS封闭1 h；取AFB1标准品储存液，用10%甲醇/PBS配制成100ng/mL、0ng/mL的工作液，分别加入到包被有AFB1-BSA抗原的孔中，再每孔加入50μl上述菌液上清，每种工作液浓度重复3次；在包被有BSA的孔加入10%甲醇/PBS和50μl上述菌液上清作为对照，轻摇板子混匀后，置37℃温箱反应1 h；PBST 洗板10次后，每孔加入100 ul用PBS按1：5000比例稀释的HRP/ANTI-M13，37℃保温1 h；PBST 洗板6次，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；加2mol/L H2SO4，每孔50μl中止反应，用酶标仪分别测定OD450值；对BSA不吸附，对AFB1-BSA有吸附，并且加入黄曲霉毒素后存在竞争的即为阳性噬菌体克隆，由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔，得到噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。
3.   黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的特性及测序分析结果如下：
采用间接竞争ELISA方法测定黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下：将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1五种不同标准品储存液，用10%甲醇/PBS梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50%时的标准品浓度，用IC50表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率（%）=（AFB1IC50/ 类似物IC50）×100%，所述类似物为AFB2、AFG1、AFG2或AFM1，得到黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15对于对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC50 为0.66ng/mL，对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为22.6%、10.95%、32.1%和26%。因此，黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15是一种抗黄曲霉毒素B1的特异性纳米抗体。经耐受性试验，黄曲霉毒素纳米抗体2014AFB-G15比常规鼠源与兔源抗体耐有机溶剂能力提高35%，耐高温能力提高46%，因此能有效降低检测时样品提取液中有机溶剂等其他成分的干扰，从而提高检测灵敏度。
黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的特征性序列测定：将筛选到的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的克隆菌液送至上海桑尼科技有限公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物R1：5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’。得到黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，编码基因序列为SEQ ID NO:8所示，其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。
实施例3  黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的制备
（1）获得能分泌黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的TG1菌液，使用Qiagen的DNA小量提取试剂盒提取质粒，转化到HB2151感受态细胞中，并涂布到LB氨苄平板上；
（2）挑取含有黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15质粒的HB2151菌落于100mLSB氨苄液体培养基中，250 rpm，37℃培养至OD600＝0.5-0.8，加入200μl 0.5M IPTG溶液诱导过夜。
（3）4℃，10 000 rpm，冷冻离心15 min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀采用渗透休克法进行可溶性蛋白提取，得到上清蛋白。将上清蛋白过0.22μm滤膜后，用平衡缓冲液（50mM磷酸盐，300mM 氯化钠，20mM咪唑；pH 7.4）透析过夜。
（4）采用His60 镍柱（Clontech Technology）纯化抗体：首先用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗镍柱，将步骤（3）中透析后的上清蛋白进样His60 镍柱（Clontech Technology）进行抗体纯化，用10倍柱体积淋洗缓冲液（50mM磷酸盐，300mM 氯化钠，40mM咪唑；pH 7.4）洗涤柱子，最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液（50mM磷酸盐，300mM 氯化钠，300mM咪唑；pH 7.4）洗脱抗体2014AFB-G15，收集洗脱液，装入透析袋，用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析2-3天后浓缩，分装于-20℃保存备用。
实验例4  黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的应用
1. 样品前处理：
称取5g不含黄曲霉毒素的玉米、花生、植物油、饲料空白样品各三份，分别加标AFB1 10μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，用15mL70%的甲醇水溶液于50℃超声提取10mim，静置后取上清，用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释5倍后待用。
2. 间接竞争酶联免疫分析
用包被缓冲液配制0.25 μg/mL AFB1-BSA 溶液，加入ELISA微孔板中，100 μL/孔，4℃过夜。次日，PBST洗板三次后，用200 μL 溶于PBS的3% 脱脂奶粉封闭微孔，37℃恒温箱反应1h。PBST 洗板三次，每孔加入50 μL 黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15（1.26μg/mL）和50 μL AFB1标准溶液或待测样品。37℃反应1h后，PBST 洗板三次，每孔加入100 μL，用PBS 按1:5000 稀释的兔抗E tag酶标二抗，37℃反应1小时。PBST洗板六次后，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；再加入50μL 2 M 硫酸终止反应，立即用酶标仪在450nm 下测定吸光值。根据样品测定的吸光值计算样品中AFB1的浓度，判断方法回收率。玉米、花生、植物油、饲料四个样品的平均回收率分别为92.8%、88.7%、97.3%、90.2%，可满足黄曲霉毒素检测对方法准确度的需求。
综上，黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15能有效识别黄曲霉素B1，可应用于黄曲霉毒素B1的ELISA检测等，对食品安全领域黄曲霉毒素监控有重要意义。
序列表
 
<110>中国农业科学院油料作物研究所
 
<120>一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15
 
<160>8
 
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213>羊驼
 
<400>1
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1                   5
 
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213>羊驼
 
<400>2
Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser
1                 5
 
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213>羊驼
 
<400>3
Ala Ala Gly Phe Ser Gly Asn Tyr Tyr Arg Thr Pro Asp Tyr
1                   5                      10                   14
 
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213>羊驼
 
<400> 4
ggacgcacct tcagtagcta cgcc   24
 
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>羊驼
 
<400> 5
attagctgga gtggtggtag c     21
 
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213>羊驼
 
<400> 6
gcagctggct ttagtggtaa ttactaccgc acacccgact ac    42
 
 
<210> 7
<211> 130
<212> PRT
<213>羊驼
 
<400> 7
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 
1                     5                             10                             15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
                              20                          25                             30
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg 
                          35                              40                              45
Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
                    50                          55                              60
Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Asn Arg Asp Asn Ala 
                    65                             70                               75
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
                    80                               85                              90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Phe Ser Gly Asn Tyr Tyr 
                         95                             100                           105
Arg Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
                           110                           115                           120
Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
                          125                           130
<210> 8
<211> 390
<212> DNA
<213>羊驼
 
<400> 8
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc   60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agctacgcca tgggctggtt ccgccaggct   120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcggct attagctgga gtggtggtag cacatactat   180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc aacagagaca acgccaagaa cacggtgtat  240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agctggcttt    300
agtggtaatt actaccgcac acccgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc  360
tcagaaccca agacaccaaa accacaagac                             390
 
 

Claims (10)

1.黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于：提取经黄曲霉毒素B1抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化得到；所述pCANTAB 5E（his）载体是通过如下方法构建得到：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI-F:5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(SfiI)；下游引物：p5E N-P-H-R: 5’- ATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTT TTC-3’PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E（his）载体。
2.权利要求1所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于，具体操作步骤为：对羊驼免疫黄曲霉毒素B1抗原，提取经免疫后羊驼血液中的RNA，反转录为cDNA，设计特异性引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化，构得黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于：所述特异性引物的末端包含根据pCANTAB 5E（his）载体克隆位点附近序列设计的在VHH基因两端分别引入载体pCANTAB 5E（his）同源序列的引物序列，每条特异性引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E（his）同源位点，以在VHH基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB 5E（his）同源序列，所述特异性引物为：
R1:  5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTG CG -3’
F:   5-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；或
R2:  5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTG GG -3’；
F:   5-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’，其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E（his）同源的位点。
4.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：
10× Ex taq Buffer               5μl
50mM MgSO4                                              2μl
10 mM dNTP                           1μl     
10 mM F引物                          1μl
10 mM R1引物或R2引物           1μl
Ex taq DNA 聚合酶                 0.1μl
cDNA 模板                             2μl
ddH2O  补至总体系               50μl；
PCR扩增程序为：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min，扩增30个循环；68℃ 5min；其中，以R1为引物的PCR扩增反应次数：以R2为引物的PCR扩增反应次数为2:3。
5.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于：所述VHH基因与pCANTAB 5 E（his）载体的连接方法为：将pCANTAB 5 E（his）载体经SfiⅠ/NotⅠ双酶切处理，然后与VHH基因进行In-fusion连接；所述的转化为：将前述连接产物加入到大肠杆菌TG1电转化感受态细胞中，混匀，电转化，电转化条件：0.1 cm 电转化杯，1.8 kV，200 Ω，25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入2YT 液体培养基吹打后转移，37℃缓慢振摇复苏1 h。
6.权利要求1所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素B1纳米抗体的应用。
7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素B1纳米抗体的应用，其特征在于：它是将构建成功的黄曲霉毒素纳米抗体基因库通过M13KO7辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过吸附-洗脱的方法进行淘选，筛选出与黄曲霉毒素B1特异性结合而不和载体蛋白BSA结合的阳性孔，然后采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择灵敏度较高的克隆，最终筛选获得噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体。
8.黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。
9.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15，其特征在于，其三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。
10.根据权利要求8~9所述的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15在对黄曲霉毒素B1的ELISA检测方面的应用。
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