CN103865846A

CN103865846A - 一种屎肠球菌及其制备方法

Info

Publication number: CN103865846A
Application number: CN201410067604.8A
Authority: CN
Inventors: 潘林福
Original assignee: YANGZHOU LYUBAO BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Jiangsu lvmu ecological environmental protection Co., Ltd
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: CN103865846B

Abstract

一种屎肠球菌及其制备方法，涉及微生物领域，具体涉及一种屎肠球菌及其应用。从屠宰的山羊瘤胃中采集菌样，外采用37±5℃、厌氧、避光的条件进行定向培育，通过琼脂平板分区反复划线分离纯化后取得屎肠球菌L-01。屎肠球菌L-01可作为动物微生物饲料添加剂应用，能有效抑制动物消化道致病菌，改善消化道微生态环境；增强动物体的免疫功能，并可作为抗生素替代品，可有效解决当前所面临的严重局面。

Description

一种屎肠球菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种屎肠球菌及其应用。

背景技术

当前由于抗生素滥用以及超级细菌的出现等等一系列问题，使人类不可回避的面临由此所造成的严重局面，当务之急，必须尽快研发抗生素替代品，为绿色、安全、高效的动物饲料和人类食品生产提供可靠的技术保障。益生素是近20年发展起来的一种新型饲料添加剂，它具有抗生素和酶的功能。益生素可以补充有益菌群，改善消化道菌群平衡，预防和治疗菌群失调症；可以刺激机体免疫系统，提高动物机体免疫能力；能够参与菌群生存竞争，协助机体消除毒素和代谢产物；可改善机体代谢，补充机体营养成分，促进畜禽生长。

屎肠球菌(Enterococcus faecium)是目前农业部令（2013年2045号）动物微生物饲料添加剂栏所允许使用的益生菌种类，研究表明该菌可作为动物微生物饲料添加剂应用，能有效抑制动物消化道致病菌，改善消化道微生态环境；增强动物体的免疫功能。

发明内容

本发明目的是为了解决当前抗生素的滥用以及超级细菌的出现等等一系列问题，提出一种利于改善动物机体代谢、补充机体营养成分、促进畜禽生长的屎肠球菌L-01。

本发明提出的屎肠球菌L-01 (Enterococcus faecium L-01)于2012年5月30保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M 2012194。

本发明还提出以上屎肠球菌L-01的制备方法，即从屠宰的山羊瘤胃中采集菌样，外采用37±5℃、厌氧、避光的条件进行定向培育，通过琼脂平板分区反复划线分离纯化后取得屎肠球菌L-01。

本发明从健康山羊屠宰后的瘤胃分离、纯化、培育、鉴定到1株屎肠球菌并保种，可作为动物微生物饲料添加剂应用，能有效抑制动物消化道致病菌，改善消化道微生态环境；增强动物体的免疫功能，并可作为抗生素替代品，可有效解决当前所面临的严重局面。

本发明筛选得到的菌株，与中国工业微生物菌种保藏管理中心等国家保种机构现存菌种来源及生物学特性不同。经过中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定，该菌株为屎肠球菌，且在中国工业微生物菌种保藏管理中心进行了遗传稳定性试验，证明该菌株性状可稳定遗传。在8-12h的酶活力动态变化过程中，α-淀粉酶活力与α-葡萄糖转苷酶活力均达到峰值并维持在较高水平。

本菌株分离源自屠宰后的健康山羊瘤胃，其发酵产物作为动物微生物饲料添加剂应用于养殖动物，尤其是对改善反刍动物，其相容性和功效最为理想，此外，对于仔猪消化道微生态环境稳态的建立也具有积极的调控作用。

附图说明

图1为本发明屎肠球菌L-01的菌株菌落照片。

图2、图3分别为本发明屎肠球菌L-01的菌株场发射扫描电镜照片。

图4为本发明屎肠球菌L-01菌株MRS培养基菌体形态照片。

图5为本发明屎肠球菌L-01菌株MRS培养基菌落形态照片。

图6为39℃淀粉酶（AMS）活力随时间变化的关系图。

图7为对硝基苯酚的标准曲线图。

图8为58℃α-葡萄糖转苷酶活力随时间变化的关系图。

图9为屎肠球菌L-01与相关种的16S rDNA序列系统发育树。

图10为屎肠球菌L-01与相关种的pheS基因序列系统发育树。

具体实施方式

一、菌株的筛选

1.筛选过程

从饲养的山羊屠宰的瘤胃中采集菌样，体外采用37±5℃、厌氧、避光的特定条件进行定向培育，通过琼脂平板分区反复划线分离纯化至单菌株L-01并驯化，研究其形态学及生物学特性。通过琼脂平板培养观察菌落特征、电子显微镜观察单菌株形态及相关关键酶活力测定。

1.1工作母液的配置：

先以下表比例配备营养底物：

成分	重量百分比(%)
		玉米	80
豆粕	6
		麸皮	10
食盐	1
		石粉	1
磷酸氢钙	2

再按5%的比例称取营养底物125g（2600r/min粉碎1.5min )与水混匀，电磁炉蒸煮状态下浸煮1h，两层纱布抽提两次后，抽提液2600r/min液体打浆1.5min后，500目尼龙绢过滤，最后定容至2.5L，得到工作母液。

1.2 人工培养液组成：参照Russell的配方加以改进。

还原剂（现用现配）：1N NaOH溶液 4mL；Na₂S·7H₂O 570mg 加蒸馏水至100mL。

常量元素：Na₂HPO₄ 5.70g ；NaH₂PO₄ 6.20g ； MgSO₄·7H₂O 0.60g 加蒸馏水至1000mL。

微量元素：CaCl₂·2H₂O 13.20g ；MnCl₂·4H2O 10.00g ；CoCl₂·6H₂O 1.00g；FeCl₃·6H₂O 0.8g 加蒸馏水至100mL。

缓冲液：NaHCO₃ 35.00g； NH₄HCO₃ 4.00g；加蒸馏水至1000mL。

培养液配制：常量元素 237mL；微量元素0.12mL；缓冲液237mL；还原剂49.5mL；葡萄糖10g，加蒸馏水至1000mL。

1.3 培养基配方

牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCI 1.5g，琼脂10.5g，加工作母液300mL，补充人工培养液至600mL。

1.4细菌分离纯化的培养方法

将上述固体培养基按照配方称取于三角烧瓶中，放在万用电炉上加热至沸腾，盖上透气筛在121℃下高压灭菌20min后取出，待温度降至50℃左右后倒板，约10-20min凝固。

从饲养的山羊屠宰的瘤胃中采集菌样，并将该瘤胃细菌液用灭菌生理盐水倍比稀释至10^-8次方，然后用接种环挑取菌液在固体培养基上分区划线分离，于 37±5℃环境温度、厌氧避光培养，待菌落生长出后挑取不同菌落继续进行划线分离，直至菌种纯化。

2.菌株的形态学研究

上述筛选所得菌株在固体培养基上照片如图5，MRS培养基，37℃，培养1天，菌落形态：乳白色，圆形，针尖状，表面光滑、凸起，不透明，边缘整齐。油镜下观察为球状，直径约为0.6μm，成对或堆状排列，革兰氏阳性（如图4）。由15000倍S-4800场发射扫描电镜照片可知该菌直径约0.5～0.8um（如图2、3）。

由图1可见：该菌在固体培养基上可见淡黄色圆形小菌落。

二、菌株的鉴定

1 序列扩增的分子生物学鉴定

1.1 细菌基因组DNA的提取

菌种在增菌液体培养中生长12～18 h，取1.5 mL菌液置于EP管中，5000 r/min离心5 min，提取细菌基因组DNA。

1.2 菌株16SrDNA 的扩增引物：

使用16SrDNA通用引物进行扩增，由大连宝生物工程有限公司合成。

反应体系：0.25uL Taq DNA 聚合酶，5uLl0×PCR反应缓冲液，4uL dNTP MasterMix，luLPrimer F(上游引物)，l uL Primer R(下游引物)，2uL 模板DNA，ddH₂ O补足50uL。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 S，55℃退火40 S，72℃延伸90 S，30个循环；72℃终延伸10 min。

1.3 PCR产物检测及l6S rDNA序列的测定

经过20g/L琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，若出现1.5 kb左右的单一条带，则证明已成功扩增目标l6S rDNA序列。将PCR扩增产物寄往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，然后将得到的16SrDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。

2菌株pheS基因引物及PCR反应条件

pheS：引物由大连宝生物工程有限公司合成。

pheS-21-F CAYCCNGCHCGYGAYATGC；

pheS-22-R CCWARVCCRAARGCAAARCC。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 S，50℃退火40 S，72℃延伸40 S，30个循环；72℃终延伸10 min。

3 序列分析与系统树的构建

采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌种与相关种的序列系统发育树，并进行1000次重复的Bootstraps统计学检验。

4 鉴定分析结果

4.1屎肠球菌 L-01与相关种的16S rDNA序列系统发育树：

采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示L-01与相关种的16S rDNA系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，（E., Enterococcus）。

由图9系统发育分析表明：菌株L-01与肠球菌属(Enterococcus sp.)内多个种聚在一个系统发育分支，序列同源性为98.3%以上，其中与E.faecium ATCC 19434^T(DQ411813)的序列同源性最高为99.9%。

经鉴定，屎肠球菌L-01的16S rDNA序列长度为1482bp，鉴定结果为肠球菌属。

4.2屎肠球菌L-01与相关种的pheS基因序列系统发育树：

采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示L-01与相关种的pheS基因系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值。

由图10系统发育分析表明：菌株L-01与屎肠球菌(Enterococcus faecium)聚在一个系统发育分支，序列同源性为97.4%，与其它肠球菌属菌种模式菌株的序列同源性在86.6%以下。

经鉴定，屎肠球菌L-01的pheS基因序列长度为509bp，鉴定结果为屎肠球菌。

三、屎肠球菌L-01菌株酶活性动态研究

1.菌液中α-淀粉酶活力的测定

测定方法：碘-淀粉比色法淀粉酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）

α-淀粉酶（AMS）活力单位定义：100mL菌液中的淀粉酶（AMS），在39℃与底物作用30分钟，水解10mg淀粉为1个单位。α-淀粉酶活力随时间变化见图6可知，在0-12 h的酶活力动态变化过程中，α-淀粉酶活力在8-12 h动态变化过程中持续升高。

2.菌液中α-葡萄糖转苷酶活力的测定-发色底物测定α-葡萄糖转苷酶活力

以无色的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（pNPG）作反应底物，经α-葡萄糖转苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷键后释放出对硝基苯酚（pNP），在碱性条件下后者是黄色的，最后通过监测405或410 nm下的pNP 产生量作为α-1，4-葡萄糖转苷酶活性大小的判定标准。

1）试剂的配制：

（1）1.25mmol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（pNPG）溶液：75.2mg pNPG溶于200mL

0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中。

（2）4mmol/L对硝基苯酚（pNP）溶液：111.3mg pNP溶于200mL 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中。

（3）0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）：16.4g 乙酸钠加12mL 乙酸，定容至1000mL。

（4）1mol/L碳酸钠溶液。

2）制作对硝基苯酚标准曲线

按上表分别取不同体积的对硝基苯酚（4mmol/L），用50mmol/L乙酸缓冲液（pH5.6）稀释成一系列浓度。然后在分光光度仪上测定410nm处的光密度，以浓度为横坐标，吸光光度值为纵坐标作曲线。

对硝基苯酚的标准曲线如图7。

3） α-1,4-葡萄糖转苷酶活力的测定

取0.8mL对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)(1.25mmol/L)，加入0.2mL菌液，迅速混匀后于58℃水浴中保温10min，取出并立即加入2mL 1mol/L的碳酸钠溶液终止反应，用分光光度计测定410nm波长处的光密度，在标准曲线上查出相当于对硝基苯酚的量，并计算酶活力。

酶活力单位定义为：1L菌液中的α-葡萄糖转苷酶，在58℃与对硝基苯酚-α-D葡萄糖苷作用10分钟，每分钟催化形成1umoL对硝基苯酚所需要的酶量为1个活力单位。

酶活力=(A×n)/(V×t)；

式中 V—酶液量（mL）；n—酶液稀释倍数；t—反应时间（min）。

α-葡萄糖转苷酶活力随时间变化见图8，由图8可知，在0-12 h的酶活力动态变化过程中，α-葡萄糖转苷酶活力在8-12 h的动态变化过程中持续升高。

总结：通过以上试验，证明本发明屎肠球菌L-01具有遗传稳定性好，菌株活力强，分泌的淀粉酶和转苷酶的酶活力高的特性。

由于以上特征，本发明可望应用于制备动物的饲料添加剂，养殖动物，猪、禽类、反刍动物、水产动物，可有效代替抗生素，发挥防病、抗病作用。

<110>扬州绿保生物科技有限公司

<120>屎肠球菌L-01及其制备方法

<160>2

<210>1

<211>1482

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>屎肠球菌L-01菌株的16S rDNA序列

<400>1

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcttcttttt ccaccggagc 60

ttgctccacc ggaaaaagag gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca 120

tcagaagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaatcn aaaccgcatg 180

gttttgattt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat ggacccgcgg tgcattagct 240

agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg 300

gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360

ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt 420

aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggat gagagtaact gttcatccct tgacggtatc 480

taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540

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ggcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780

agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840

ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>屎肠球菌L-01菌株的pheS基因序列

<400>2

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ttcagacgag atattgattc ggacacatac ttcaccagtc caagcacgga caatggaaaa 120

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cgatccagaa gaatattcag gttttgctt

Claims

1.屎肠球菌L-01 (Enterococcus faecium L-01)，其保藏编号是CCTCC M 2012194。

2.如权利要求1所述屎肠球菌L-01的制备方法，其特征在于从屠宰的山羊瘤胃中采集菌样，体外采用37±5℃、厌氧、避光的条件进行定向培育，通过琼脂平板分区反复划线分离纯化后取得屎肠球菌L-01。