CN103819523B - 7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法；所述方法包括如下步骤：式(III)化合物在碱性条件下去保护基得式(IV1)或(IV2)化合物；进一步去甲基得式(I)化合物，即所述7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷；其中，R₁为H或OH，R₂为I、Br或Cl，R₃为H或本发明合成的7-去氮-7-卤素-鸟嘌呤核苷是在DNA测序、标记、延伸等生物学领域广泛使用的基本原料，目前其销售价格很高，且合成方法复杂，难以控制；而本发明的合成方法所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

Description

7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷(简称鸟苷，包括dG-X和G-X的合成方法。

背景技术

DNA测序技术是现代生命科学和医学研究的重要手段之一。DNA测序从1977年的Sanger测序技术（一代测序）开始，在三十几年的时间里，飞速发展。测序的通量大幅提高而成本急剧下降，有人甚至认为其发展的速度打破了半导体工业界已有的摩尔定律预算的速度。二代高通量平行测序技术的出现是测序技术飞速发展的集中体现。采用第一代测序技术，人类基因组计划（HGP）耗资30亿美元完成人整个基因组（30亿个碱基）的序列测定。而目前的二代测序的最新技术仅需5000美元左右就能完成人整个基因组测序。

虽然如此，二代测序的成本和技术方面依然存在不足，不能满足基础科学和临床医学对测序的要求。单分子测序技术（三代测序技术）应运而生。三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，未能大规模应用。

目前市场上的高通量测序平台被少数几家国外产品所垄断，尤其令人忧虑的是，国外公司凭借对测序试剂的控制，几乎完全控制了国内的测序市场，即便是测序硬件上我们能有所突破，在测序试剂等配套产品上我们还将受制于人。因此，自主研发可适用于二代测序甚至是三代测序平台的测序试剂，将对改变目前的市场格局、建立我国自主的测序平台具有战略性的意义。为此，国家863、973和“十二五”生物技术发展规划都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展的对象。

用于测序的可逆终端一般都选取U,C,A,G四个碱基的核苷酸.我们在实际工作中发现用于合成四个不同碱基核苷酸的起始原料，即四个不同碱基(U,C,A,G)的含取代基核苷价格昂贵，尤其是7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷（包括鸟苷dG-X和G-X）不但非常昂贵而且合成方法很复杂，致使很多研究工作者尽量避免使用鸟苷(J.Org.Chem.2011,76,3457–3462)，这样使原本完美的研究工作变得有些遗憾。

发明内容

本发明的目的在于提供一种7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷(简称鸟苷dG-X和G-X)的合成方法；该方法合成原料简单、便宜，反应条件温和，操作简单，可适合大规模生产。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括如下步骤：

A、式（Ⅲ）化合物在碱性条件下去保护基得式（Ⅳ1）或（Ⅳ2）化合物；

B、所述式（Ⅳ1）或（Ⅳ2）化合物在碱性条件下去甲基得式（Ⅰ）化合物，即所述7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷；

其中，R₁为H或OH，R₂为I、Br或Cl，R₃为H或

优选地，步骤A中，R₃为H时，生成式（Ⅳ1）化合物；R₃为时，生成式（Ⅳ2）化合物。

优选地，所述式（Ⅲ）化合物通过在式（Ⅱ）化合物嘌呤碱基的7位上接上卤素原子制备而得。

优选地，所述式（Ⅱ）化合物通过式化合物G007与化合物或发生糖苷化反应制备而得，

优选地，所述化合物G007是通过如下步骤制备而得的：

A、化合物G005的合成：化合物Sm-1与Sm-2反应，得化合物G005；

B、化合物G006的合成：化合物G005在三氯氧磷的作用下，反应得到化合物G006；

C、化合物G007的合成：化合物G006在碱性条件下与异丁酰氯反应即得所述化合物G007。

第二方面，本发明还涉及一种7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，所述方法包括由前述的方法合成得到的式（Ⅰ）化合物进一步合成所述7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸；式（Ⅰ）中R1为H。

优选地，包括如下步骤：

A、化合物dG(AP₃)的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄（四（三苯基膦）钯）和TEA（三乙胺）存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式（Ⅰ）化合物反应，得化合物dG(AP₃)所述式（Ⅰ）化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1:（1.5～3）:（0.05～0.10）:（0.02～0.05）:（1.5～3）；

B、化合物dGTP(AP₃)的合成：化合物dG(AP₃)与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dGTP(AP₃)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸；所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮和dG(AP₃)的摩尔比为2:2:1。

第三方面，本发明还涉及一种7-去氮-7-丙炔胺-鸟嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括由前述的方法合成得到的式（Ⅰ）化合物进一步合成所述7-去氮-7-丙炔胺-鸟嘌呤核苷；式（Ⅰ）中R1为OH。

优选地，包括如下步骤：

在CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式（Ⅰ）化合物反应，得化合物G(AP₃)即所述7-去氮-7-丙炔胺-鸟嘌呤核苷；所述式（Ⅰ）化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1:（1.5～3）:（0.05～0.10）:（0.02～0.05）:（1.5～3）。

第四方面，本发明还涉及一种前述的合成方法制得的7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷在合成7-去氮-7-丙炔胺-鸟嘌呤核苷中的用途。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明合成了7-去氮-7-卤素-2'-去氧鸟嘌呤核苷(简称dG-I)和7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷(简称G-I)；该化合物是在DNA测序、标记、延伸等生物学领域广泛使用的基本原料；

（2）本发明提供的合成方法与专利CN201310489397.0相比，专利201310489397.0中所需要的核心原料只能进口，而本发明所需原料非常便宜，与专利201310489350.4相比，专利201310489350.4的第一步反应产率只有10%，本发明所使用的方法可以达到86%；在专利201310489350.4中生成G009时所用的原料含苄基保护的核糖价格昂贵，且产率只有45%，本发明所使用核糖价格极其便宜，且所使用的实验方法产率可以达到76%，因此本发明合成方法在大大提高了反应产率的同时，也大大降低了实验原料的成本反应原料均为常规的化学试剂，且最后一步反应处理时，本发明去除无机盐的方法更加简单高效。

（3）本发明方法得到的最终产物纯度高，较之前专利中，最后一步纯化采用有机溶剂洗涤的方法，难以除尽无机盐，本发明最后一步纯化采用水洗的方法，彻底洗出了无机盐，从而避免了产品中无机盐的存在，大大提高了产品的纯度，本发明的合成方法所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。

图1为7-去氮-7-碘-2'-去氧鸟嘌呤核苷(简称dG-I)的合成过程示意图；

图2为7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷(简称G-I)合成过程示意图；

图3为7-去氮-7-碘-2'-去氧鸟嘌呤核苷dG-I在合成dGTP(AP₃)中的用途；

图4为7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷G-I在合成GTP(AP₃)中的用途；

图5为7-去氮-7-碘-2'-去氧鸟嘌呤核苷dG-I的¹H-NMR；

图6为7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)的¹H-NMR；

图7为7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)的³¹P-NMR；

图8为7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)的HRMS谱图；

图9为DNA链延伸反应荧光扫描结果图；Lane1：Primer(Oligo1)；Lane2：含有dGTP(AP3)的链延伸产物。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征；

实施例1、7-去氮-7-碘-2'-去氧鸟嘌呤核苷dG-I的合成方法

本实施例中dG-I的合成示意图如图1所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

将Sm-2（12.6g，100mmol）溶于120mLDMF和20mL水的混合液中，室温搅拌15min后，加入Sm-1（12.7mL，100mmol），室温搅拌46h。旋出溶剂，固体溶于2.5mL水，过滤，真空干燥，得到12.9g，产率86%。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ=10.94(s,1H),10.35(s,1H),6.58(dd,J=3.4,2.2Hz,1H),6.15(dd,J=3.4,2.1Hz,1H),6.09(s,2H).

步骤二、

将G005（10.0g，66.6mmol）加入到100mLPOCl₃中，回流2h，冷却至室温后旋除溶剂后，将120mL冰水加入到反应中，并将固体过滤，将滤液用氨水调节至pH=2，并将沉淀物至于冰浴中2h后过滤，过滤的固体第一次用10mL冰水洗涤，第二次用30mL冰乙醚洗涤，抽干后得8.7g，产率78%。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ=11.43(s,1H,NH),7.07(d,1H,NHCHCH),6.46(s,2H,NH2),6.22(d,1H,CHNH)。

步骤三、

将G006（6.7g，39.88mmol）加入到280mL无水吡啶中，冰水浴下，缓慢滴加异丁酰氯（4.6mL，43.87mmol），冰水浴下搅拌20min,加入600μL甲醇淬灭，继续搅拌10min后旋出溶剂，再加入20mL乙醚，过滤，收集固体，依次用50mL80%冷甲醇/20%乙醚、10mL冷甲醇、10mL乙醚洗涤，真空干燥，得6.68g，产率70%。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)12.34(bs,1H),10.54(bs,1H),7.49(dd,J=2.4Hz,3.2Hz,1H),6.49(dd,J=1.6Hz,3.2Hz,1H),2.78(sept,J=6.8Hz,1H),1.08(d,J=6.8Hz,6H).

步骤四、

将氢氧化钾（3.47g，61.8mmol）粉末溶于500mL乙腈中，缓慢加入G007（6.66g，28.0mmol），室温搅拌5min，缓慢加入Sm-1（14.98g，35mmol），室温下搅拌20min。过滤，固体用10mL二氯甲烷洗涤，干燥。柱层析DCM:MeOH=10:1，得13.4g白色固体，产率76%。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ=10.29(s,1H),8.07-7.93(m,5H),7.66-7.56(m,4H),6.62(t,J=7.2Hz,1H,),5.84-5.81(m,1H),4.71-4.67(m,1H),4.59-4.44(m,3H),3.30-3.22(m,1H),2.79-2.72(m,1H),1.06(d,J=6.8Hz,6H).

步骤五、

将G008（8.23g，13.0mmol）溶于60mLTHF中，氮气保护，锡箔纸包裹后，加入NIS（3.04g，13.51mmol）于室温下搅拌1h，加入500mLDCM，用200mL水洗涤，旋除溶剂后，柱层析DCM:MeOH=10:1,得7.98g，产率81%。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ=10.29(s,1H),8.07-7.93(m,5H),7.66-7.56(m,4H),5.84-5.81(m,1H),4.71-4.67(m,1H),4.59-4.44(m,3H),3.30-3.22(m,1H),2.79-2.72(m,1H),1.05(d,J=6.8Hz,6H).

步骤六、

将G009（1.14g，1.5mmol）加入到0.5MMeONa/MeOH(20.0mL)中，回流3h后用冰醋酸中和至中性后柱层析DCM:MeOH=10:1,得化合物dG1-D490mg，产率80%。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.17(s,1H),6.36(dd,J=6.0,8.4Hz,1H),4.47(m,1H),3.99(s,3H),3.96(m,1H),3.77(dd,J=3.4,12.0Hz,1H),3.70(dd,J=3.7,12.0Hz,1H),2.55-2.64(ddd,J=6.0,8.4,13.4Hz,1H),2.20-2.26(ddd,J=2.4,5.9,13.4Hz,1H)。

步骤七、

将化合物dG₁-D（490mg,1.20mmol）置于25mL氢氧化钠溶液（2N）中回流5h，冷却后加入乙酸溶液中和，过滤，少量水洗涤，干燥得428mg白色固体即dG-I，产率91%。见图5所示：¹H-NMR(400MHz,MeOD)δ7.09(s,1H),6.35(dd,J=6.0Hz,J=8.0Hz,1H),4.42-4.44(m,1H),3.89-3.92(m,1H),3.65-3.74(m,2H),2.43–2.50(m,1H),2.19–2.24(m,1H).注：本方法同样适合7-去氮-7-溴和7-去氮-7-氯-2'-去氧鸟嘌呤核苷dG-Br/Cl的合成，不同之处在于第五步反应时，用NBS或BCS代替NIS即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例2、7-去氮-7-碘-鸟嘌呤核苷G-I的合成方法

本实施例中G-I的合成示意图如图2所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

将氢氧化钾（3.47g，61.8mmol）粉末溶于500mL乙腈中，缓慢加入G007（6.66g，28.0mmol），室温搅拌5min，缓慢加入Sm-1（20.44g，35mmol），室温下搅拌20min。过滤，固体用10mL二氯甲烷洗涤，干燥。柱层析DCM:MeOH=10:1，得16.77g白色固体，产率76%。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ=10.25(s,1H),8.11-7.95(m,9H),7.76-7.58(m,8H),6.64(t,J=7.2Hz,1H,),5.88-5.82(m,1H),4.74-4.66(m,1H),4.61-4.40(m,4H),1.09(d,J=6.8Hz,6H).

步骤二、

将G008（10.24g，13.0mmol）溶于60mLTHF中，氮气保护，锡箔纸包裹后，加入NIS（3.04g，13.51mmol）于室温下搅拌1h，加入500mLDCM，用200mL水洗涤，旋除溶剂后柱层析DCM:MeOH=10:1,得9.62g，产率81%。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ=10.29(s,1H),8.19-7.96(m,9H),7.68-7.52(m,8H),5.87-5.82(m,1H),4.75-4.65(m,1H),4.58-4.35(m,4H),1.10(d,J=6.8Hz,6H).

步骤三、

将G009（1.37g，1.5mmol）加入到0.5MMeONa/MeOH(20.0mL)中，回流3h后用冰醋酸中和至中性后柱层析DCM:MeOH=10:1,得化合物G-D506mg，产率80%。¹H-NMR(250MHz,DMSO-d₆):δ3.49-3.57(m,2H,H-C(5’)),3.80-3.82(m,1H,H-C(4’)),3.93(s,3H,OMe),4.01-4.03(m,1H,H-C(3’)),4.23-4.28(m,1H,H-C(2’)),5.01(t,J=5.5Hz,1H,OH-C(5’)),5.05(d,J=4.4Hz,1H,OH-C(3’)),5.25(d,J=6.2Hz,1H,OH-C(2’)),5.94(d,J=6.5Hz,1H,H-C(1’)),6.38(s,2H,NH2),7.31(s,1H,H-C(6)).

步骤四、

将化合物G-D（506mg,1.20mmol）置于25mL氢氧化钠溶液（2N）中回流5h，冷却后加入乙酸溶液中和，过滤，少量水洗涤，干燥得445mg白色固体即G-I，产率91%。¹HNMR(600MHz,DMSO-d₆):4.99(brs,1H,5’-OH),5.04(d,1H,J=3.2,3’-OH),5.26(d,1H,J=5.9,2’-OH),6.33(s,2H,NH2),7.14(s,1H,6-H),10.48(s,1H,NH).注：本方法同样适合7-去氮-7-溴和7-去氮-7-氯-鸟嘌呤核苷dG-Br/Cl的合成，不同之处在于第二步反应时，用NBS或BCS代替NIS即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例3、7-去氮-7-碘-2'-脱氧鸟嘌呤核苷dG-I在合成dGTP(AP ₃ )中的用 途

本实施例中dGTP(AP₃)的合成示意图如图3所示，具体合成方法分别包括如下步骤:

步骤一、

向一单口瓶中加入化合物dG-I(0.25g,0.4mmol)，再称取CuI(22mg;1mmol)和Pd(PPh₃)₄(48mg;0.04mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入10mlDMF，搅拌溶解，注入TEA(0.088g;0.8mmol)和三氟乙酰丙炔胺(0.2g;1.2mmol)，50℃搅拌13小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于100ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(乙酸乙酯):V(正己烷)=1:3]，得0.1g白色固体即dG(AP₃)，产率39%。见图6所示：¹HNMR(400MHz,MeOD)δ7.25(s,1H),6.38-6.42(m,1H),4.47–4.50(m,1H),4.33(s,2H),3.96(dd,J=3.6Hz,J=6.8Hz,1H),3.70–3.80(m,2H),2.48–2.55(m,1H),2.26–2.32(m,1H).

步骤二、

将化合物dG(AP₃)真空干燥12h，在手套箱中分别称取化合物dG(AP₃)(30mg,0.072mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(80mg,0.145mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(30mg,0.15mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL新蒸的三正丁胺，常温搅拌半小时后，把反应液注入2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮的无水DMF（0.25mL）溶液中，常温搅拌半小时。然后将该混合液注入到2中，搅拌1.5h。加入1mL3%碘（9:1Py/H2O）溶液，保持碘液颜色15min不退色。15min后加入2mL水，2h后，加入0.75mL3MNaCl溶液、20mL无水乙醇，-20℃冷冻12h，离心（20min,3200rpm）。倾去上清液，沉淀抽干溶剂后，加入浓氨水，室温搅拌5小时。减压旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18,5μm,4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mMTEAA和EtOH，0-20%EtOH(35min),可见检测器波长：650nm]，保留时间t=18min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18,5μm,9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mMTEAA和MeOH，0-15%MeOH(25min),紫外检测器波长：254nm]，保留时间t=15min。NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得12mg白色固体即dGTP(AP₃)。产率26%。dGTP(AP₃)的¹H-NMR、³¹P-NMR、HRMS谱图分别如图8、9所示，¹HNMR(400MHz,D₂O)δ7.45(s,1H),6.34(t,J=6.8Hz,1H),4.73(s,1H),4.11–4.20(m,3H),4.06(s,2H),2.53–2.58(m,1H),2.41–2.46(m,1H);见图7所示：³¹PNMR(D₂O,162MHz):-10.59(t,J=9.9Hz,1P),-11.24(d,J=17.3Hz,1P),-22.98(d,J=20.7Hz,1P).ESI-HRMS:calcforC₁₄H₁₉N₅O₁₃P₃[M-H]^-558.0192,found558.0179.注：本方法同样适合7-去氮-7-溴/氯-2'-脱氧鸟嘌呤核苷dG-Br/Cl在合成dGTP(AP₃)中的用途，不同之处在于第一步反应时，用dG-Br/Cl代替dG-I即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例4、7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷G-I在合成G(AP ₃ )中的用途

本实施例中G(AP₃)的合成示意图如图4所示，具体合成方法分别包括如下步骤:

向一单口瓶中加入化合物G-I(0.25g,0.4mmol)，再称取CuI(22mg;1mmol)和Pd(PPh₃)₄(48mg;0.04mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入10mlDMF，搅拌溶解，注入TEA(0.088g;0.8mmol)和三氟乙酰丙炔胺(0.2g;1.2mmol)，50℃搅拌13小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于100ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(乙酸乙酯):V(正己烷)=1:3]，得0.1g白色固体即G(AP₃)，产率39%。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.24(s,1H),6.38(t,J=0.8Hz,1H),4.49–4.46(m,1H),4.31(s,2H),3.94(d,J=1.6Hz,1H),3.78–3.68(m,1H),3.54–2.47(m,1H),2.3–2.24(m,1H).注：本方法同样适合7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷G-I在合成G(AP₃)中的用途，不同之处在于第一步反应时，用G-Br/Cl代替G-I即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例5、合成的dGTP(AP ₃ )参与DNA链延伸反应测试

所用测序模板序列如下：

5'GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGGOligo1Primer

3'CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCATGATCGCCATGTGCOligo2

其中Oligo1的5'端用荧光素Dylight800标记。

1）按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：10×Klenowbuffer10uL,BSA(10mg/mL)1uL,DMSO20uL,NaCl(1M)25uL,Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL,dUTP(10uM)6uL,模板DNA(853ng/uL)1.25uL,ddH₂O35.43uL，总体积100uL。

将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟，再置于75℃水浴中处理10分钟以灭活DNA聚合酶。

2）分离纯化：酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩为固体，加入20uLddH₂O和1uL0.1MNaOH，95℃处理5min后，立即冰水浴2min冷却，再进行电泳分析。

3)电泳分析:DNA链延伸反应荧光扫描结果图见图9所示，从图9中结果可以看出，dGTP(AP3)可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸。从而进一步证明所合成的dGTP(AP3)的结构是正确的。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (2)

1.一种7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下去保护基得式(Ⅳ1)或(Ⅳ2)化合物；

B、所述式(Ⅳ1)或(Ⅳ2)化合物在碱性条件下去甲基得式(Ⅰ)化合物，即所述7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷；

其中，R₁为H或OH，R₂为I，R₃为H或

步骤A中，R₃为H时，生成式(Ⅳ1)化合物；R₃为时，生成式(Ⅳ2)化合物；

所述式(Ⅲ)化合物通过在式(Ⅱ)化合物嘌呤碱基的7位上接上卤素原子制备而得，

所述式(Ⅱ)化合物通过式G007化合物与化合物或发生糖苷化反应制备而得。

2.如权利要求1所述的7-去氮-7-卤素鸟嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述化合物G007是通过如下步骤制备而得的：

A、化合物G005的合成：Sm-1与在酸性条件下反应，得化合物G005；

B、化合物G006的合成：化合物G005在三氯氧磷的作用下，反应得到化合物G006；

C、化合物G007的合成：化合物G006在碱性条件下与异丁酰氯反应即得所述化合物G007。