CN103816183A

CN103816183A - 间质血管层细胞和间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节炎中的应用

Info

Publication number: CN103816183A
Application number: CN201210466717.6A
Authority: CN
Inventors: 曹卫; 张丽; 卡尤姆; 周玉洁; 曾晓聆; 赵光宇; 关战军; 王新华
Original assignee: ZHENJING BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) CO Ltd
Current assignee: Shibiman Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2014-05-28
Also published as: WO2014075634A1

Abstract

本发明涉及间质血管层细胞和间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节炎中的应用。具体地，给需要的对象施用本发明的含有自体脂肪来源的间质血管层细胞和间充质祖细胞的药物组合物，对于骨性关节炎有显著的预防或治疗作用。间充质祖细胞具有很高的细胞因子分泌能力，可对体内机体的损伤进行修复：间质血管层细胞和间充质祖细胞具有成软骨分化及成骨化的能力。本发明还提供了一种含有间质血管层细胞和间充质祖细胞的药物组合物，以及预防和治疗骨性关节炎的方法。

Description

间质血管层细胞和间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节炎中的应用

技术领域

本发明属于干细胞及生物医药领域。具体地，本发明涉及间质血管层细胞和间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节炎中的应用。

背景技术

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。OA在60岁以上的人群中患病率可达50%，75岁以上的人群中则达80%。该病的致残率可高达53%(中华医学会骨科学分会，2007年《骨关节炎诊治指南》修订版)。OA好发于负重大、活动多的关节，如膝关节，因此称为膝骨关节炎（KOA），膝骨关节炎对人类健康危害严重，是造成老年人活动功能障碍的主要疾病之一。

目前膝骨关节炎（KOA）的总体治疗原则是通过药物及非药物治疗相结合，必要时施以手术治疗，从而达到减轻或消除疼痛，矫正畸形，改善或恢复关节功能，改善生活质量的目的。

药物治疗主要包括非甾体类抗炎药(NSAIDs)等镇痛药、关节腔内注射透明质酸（HA）或糖皮质激素、改善病情类药物及软骨保护剂等。这些药物在一定程度上可延缓病程、改善患者症状，但疗效有限，不能逆转病理过程，或修复软骨损伤，且大部分药物副作用明显。

当常规疗法无效时，出现关节畸形及关节功能障碍者，则必须进行外科手术治疗。外科治疗的途径主要通过关节镜(窥镜)和开放手术，虽然能够暂时性的缓解疼痛，但长远效果并不理想。

除此之外，组织工程方面的努力，例如自体软骨细胞移植或基质诱导的自体软骨细胞移植，对于退化关节组织的生物修复或再生提供了长期解决的可能性。然而，自体软骨细胞移植或基质诱导的自体软骨细胞移植的一个主要局限是无法治疗较大的软骨缺损，其对供体位点造成的破坏，去分化以及软骨细胞有限的生存时间等因素的影响，并不适用于KOA患者。

正是由于异体软骨细胞移植的免疫排斥作用十分强烈，本领域目前尚缺乏预防或治疗膝骨关节炎的方法，因此迫切需要探寻新颖的治疗和修复策略。

发明内容

本发明的目的就是提供间质血管层细胞和间充质祖细胞在预防或治疗膝骨关节炎中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs）的用途，它们被用于制备预防和/或治疗骨性关节炎的药物组合物。

在另一优选例中，所述的骨性关节炎选自下组：膝骨关节炎、脊柱骨关节炎、髋骨关节炎、或其组合。

在另一优选例中，所述的骨性关节炎为膝骨关节炎。

在另一优选例中，所述的间质血管层细胞为间质血管层细胞群。

在另一优选例中，所述的间充质祖细胞为间充质祖细胞群。

在另一优选例中，所述的间质血管层细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(i)30%以上的细胞具有表面抗原CD29；

(ii)50%以上的细胞具有表面抗原CD73；

(iii)85%以上的细胞具有表面抗原CD49d；

(iv)55%以上的细胞具有表面抗原CD90。

在另一优选例中，35%以上的细胞具有表面抗原CD29。

在另一优选例中，55%以上的细胞具有表面抗原CD73。

在另一优选例中，90%以上的细胞具有表面抗原CD49d。

在另一优选例中，60%以上的细胞具有表面抗原CD90。

(v)85%以下的细胞具有表面抗原CD34；

(vi)15%以下的细胞具有表面抗原CD45。

在另一优选例中，80%以下的细胞具有表面抗原CD34。

在另一优选例中，12%以下的细胞具有表面抗原CD45。

在另一优选例中，所述的间质血管层细胞分泌选自下组的细胞因子：干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、人转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、或其组合。

在另一优选例中，间质血管层细胞分泌的干细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.5ng/ml，较佳地≥0.8ng/ml。

在另一优选例中，间质血管层细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥35pg/ml，较佳地≥40pg/ml。

在另一优选例中，间质血管层细胞分泌的人转化生长因子β(TGF-β)的浓度≥150pg/ml，较佳地≥180pg/ml。

在另一优选例中，间质血管层细胞分泌的白介素-2(IL-2)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。

在另一优选例中，间质血管层细胞分泌的白介素-10(IL-10)的浓度≥15pg/ml，较佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml，最佳地≥40pg/ml。

在另一优选例中，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(i)95%以上的细胞具有表面抗原CD90；

(ii)95%以上的细胞具有表面抗原CD73；

(iii)95%以上的细胞具有表面抗原CD29；

(iv)95%以上的细胞具有表面抗原CD49d。

在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原CD90。

在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原CD73。

在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原CD29。

在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原CD49d。

(v)2%以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；

(vi)2%以下的细胞具有表面抗原Actin；

(vii)2%以下的细胞具有表面抗原CD34；

(viii)2%以下的细胞具有表面抗原CD45；

(viiii)2%以下的细胞具有表面抗原CD14。

在另一优选例中，1%以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。

在另一优选例中，1%以下的细胞具有表面抗原Actin。

在另一优选例中，1%以下的细胞具有表面抗原CD34。

在另一优选例中，1%以下的细胞具有表面抗原CD45。

在另一优选例中，1%以下的细胞具有表面抗原CD14。

在另一优选例中，所述的间充质祖细胞分泌选自下组的细胞因子：血管内皮生长因子(VEGF)、人转化生长因子α(TGF-α)、人转化生长因子β(TGF-β)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生因子(PDGF)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥10pg/ml，较佳地≥15pg/ml。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的人转化生长因子β(TGF-β)的浓度≥300pg/ml，较佳地≥400pg/ml。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的浓度≥30ng/ml，较佳地≥40ng/ml。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.4ng/ml，较佳地≥0.5ng/ml。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的血小板衍生因子(PDGF)的浓度≥0.008ng/ml，较佳地≥0.01ng/ml。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的白介素-2(IL-2)的浓度≥25pg/ml，较佳地≥30pg/ml。

在另一优选例中，间充质祖细胞分泌的白介素-10(IL-10)的浓度≥30pg/ml，较佳地≥40pg/ml。

在本发明的第二方面，提供了一种用于预防和/或治疗骨性关节炎的药物组合物，所述的药物组合物包括：有效量的间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs），以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为皮下注射试剂。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

在另一优选例中，所述间质血管层细胞的浓度为0.1-100×10⁴个/ml，较佳地为1-10×10⁴个/ml，更佳地为2×10⁵个/ml。

在另一优选例中，所述间充质祖细胞浓度为0.1-100×10⁴个/ml，较佳地为1-10×10⁴个/ml，更佳地为2×10⁵个/ml。

在本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗骨性关节炎的方法，包括步骤：给需要的对象施用间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs）、或施用含有间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs）的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物，优选人。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(1)给需要的对象施用间质血管层细胞；和

(2)给需要的对象施用间充质祖细胞。

在另一优选例中，施用部位为所述对象的关节腔内。

在另一优选例中，步骤(1)与步骤(2)之间间隔时间为1个月以上，和/或3个月以上。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了SVF与haMPCs混合疗法治疗KOA流程。

图2显示了SVF的表面抗原检测结果，图2A-图2I分别显示CD34、CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD45、Actin、HLA-DR抗原的检测结果。

图3为haMPCs的VEGF分泌量的变化；图3A显示LPS刺激24h后haMPCs的VEGF分泌量的变化；图3B显示低氧刺激对haMPCs的VEGF分泌量的影响。

图4显示haMPCs成软骨诱导实验结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，间质血管层细胞和间充质祖细胞在预防或治疗骨性关节炎中具有极为优异的效果。具体地，给需要的对象施用本发明的自体脂肪来源的间质血管层细胞和间充质祖细胞，或施用含有自体脂肪来源的间质血管层细胞和间充质祖细胞的药物组合物，对于骨性关节炎有显著的预防或治疗作用。间充质祖细胞具有很高的细胞因子分泌能力，在体内合适条件下可对机体的损伤进行修复：间质血管层细胞和间充质祖细胞具有成软骨分化及成骨化的能力。本发明还提供了一种预防和治疗骨性关节炎的方法以及含有间质血管层细胞和间充质祖细胞的药物组合物。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95%以上“指≥95%,“0.2%以下”指≤0.2%。

骨性关节炎

如本文所用，术语“骨性关节炎”与“osteoarthritis”或“OA”抗原互换使用。

骨性关节炎是一种慢性关节疾病，它的主要改变是关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生，表现在关节疼痛和活动不灵活，X线表现关节间隙变窄，软骨下骨质致密，骨小梁断裂，有硬化和囊性变；关节边缘有唇样增生；后期骨端变形，关节面凹凸不平；关节内软骨剥落，骨质碎裂进入关节，形成关节内游离体。

在本发明中，所述的骨性关节炎可以是任选自下组的骨性关节炎：膝骨关节炎、脊柱骨关节炎、髋骨关节炎、或其组合。本发明所述的骨性关节炎优选为膝骨关节炎。

脂肪

自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。

在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。

间质血管层细胞

如本文所用，术语“间质血管层细胞”、“SVF”、或“间质血管碎片”可以互换使用。

间质血管层细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。SVF能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。SVF是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化，从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞，可分化为多种谱系的细胞，是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞，

本领域的技术人员能够使用通用的方法进行SVF的分离和纯化。

如本文所用，术语“分离方法”、“SVF的分离方法”可以互换使用，都指从原始的脂肪组织中获得分离的SVF的方法和过程。对于获得的SVF的脂肪细胞材料，首先进行洗涤，除去血细胞；脂肪破碎，消化；去除未消化的组织，获得含SVF的滤液；离心得到SVF。得到的SVF可以用于进一步传代、培养或冻存。

在一个优选的实施例中，分离SVF可以包括步骤(但不限于)：将吸脂后的脂肪用PBS反复冲洗两次，然后在37℃条件下用胶原酶消化30min，1200g离心10min后即获得高密度的SVF碎片，其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外，SVF中也包括一些血管来源的细胞，如白细胞和红细胞等，各种细胞之间具有协同效应。

间质血管层细胞的抗原检测

用本发明使用的SVF具有很高的纯度，基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。

SVF具有多种特异性抗原和受体，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。

CD34抗原是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2%，更佳地，≤0.2%。

CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1%。

CD29、CD73、CD49d、CD90等主要存在于脂肪间充质祖细胞表面。

带有CD29的SVF在总干细胞的比例优选为≥30%，更佳地≥32%，最佳地≥35%。

带有CD73的SVF在总干细胞的比例优选为≥50%，更佳地≥60%，最佳地≥70%。

带有CD49d的SVF在总干细胞的比例优选为≥85%，更佳地≥90%，最佳地≥95%。

带有CD90的SVF在总干细胞的比例优选为≥55%，更佳地≥60%，最佳地≥65%。

本领域内技术人员可以使用通用的方法检测SVF的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。

脂肪来源的间充质祖细胞

如本文所用，术语“脂肪来源的间充质祖细胞”、“haMPCs”或“adiposetissue-derived mesenchymal progenitor cells”含义相同，可以互换使用。

本发明使用的脂肪来源的间充质祖细胞优选人来源的脂肪来源的间充质祖细胞；更优选人自体脂肪来源的间充质祖细胞。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法进行haMPCs的分离和培养，在一个优选例的实施例中，包括步骤：

a.分装脂肪：将抽取的脂肪装至离心管中，抽取的脂肪分两部分，一部分用胶原酶消化洗涤后，用于制备成SVF细胞悬液，直接进行现场回输；另一部分获得SVF后继续培养，以获得脂肪祖细胞；

b.脂肪分解：向离心管中加入酶剂，置恒温振荡器中，进行脂肪消化，待消化完毕，离心后弃去上层消化后的脂肪，收集沉淀并洗涤；

c.过滤：加细胞洗液，混匀，用细胞滤网过滤后细胞计数，离心，洗涤沉淀。过滤后的细胞即为血管基质层细胞SVF（stromal vasvular fraction Cells）。SVF是从脂肪组织中分离的多种细胞混合物，是由多种同种异质细胞组成的细胞群，其中包括MPCs样细胞，内皮（祖）细胞，血管平滑肌细胞以及其他部分的血液来源细胞，包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等；

d.SVF悬液制备：将过滤后的SVF细胞配制成5ml细胞悬液，用注射剂将悬液吸入后，将悬液注入100ml生理盐水袋中；

e.细胞培养：根据计数细胞的量调整接种密度接种至培养瓶置CO₂培养箱培养；

f.传代：接种3天左右出现少量贴壁间充质祖细胞，培养5-7天贴壁细胞呈集落时，消化传代，收集并计数细胞，原代贴壁情况1:1-2的比例传代，传代培养2至3周，收集细胞（自体脂肪来源的祖细胞）；

g.制备脂肪来源的祖细胞悬液：将收集的脂肪来源的祖细胞离心洗涤后，注入生理盐水，制成细胞悬液。

脂肪来源的间充质祖细胞的抗原检测

本发明使用的脂肪来源的间充质祖细胞具有极高的纯度和活性。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法对间充质祖细胞表面抗原进行检测，如过流式细胞仪法等。

脂肪来源的间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有：CD29、CD73、CD90、CD49d等。

带有CD73抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％，最佳地为100%。

带有CD90抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％，最佳地为100%。

带有CD29抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％，最佳地为100%。

带有CD49d抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％，最佳地为100%。

脂肪来源的间充质祖细胞的阴性指标包括：HLA-DR、Actin、CD34、CD45、CD14等。

带有HLA-DR抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≤2%，更佳地≤1%，更佳地≤0.5%，最佳地没有HLA-DR抗原。

带有Actin抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≤2%，更佳地≤1%，更佳地≤0.5%，最佳地没有Actin抗原。

带有CD34的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≤2%，更佳地≤1%，更佳地≤0.5%，最佳地没有CD34。

带有CD45的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≤2%，更佳地≤1%，更佳地≤0.5%，最佳地没有CD45。

带有CD14的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例≤2%，更佳地≤1%，更佳地≤0.5%，最佳地没有CD14。

本发明使用的haMPCs优选是可以大量分泌VEGF、TGF-ａ、TGF-β、GM-CSF、HGF、PDGF、IL-2、IL-4、IL-10等生子因子的人来源的haMPCs，并具有极强克隆形成能力和极低的免疫原性。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法对haMPCs进行使用、处理、施用等操作。如：每批haMPCs发放或使用之前，必须通过无菌、内毒素和支原体检查，以及DNA同一认定。每批发放的细胞都要符合细胞活力≥95%、细胞纯度(阳性指标≥95%，阴性指标<2%)。haMPCs急毒、过敏检测结果均呈阴性，均有一份相应的检测报告。

药物组合物及其应用

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的间质血管层细胞和间充质祖细胞，以及药学上可接受的载体。

通常，可将间质血管层细胞和间充质祖细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为7-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述间质血管层细胞和间充质祖细胞的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂。在另一优选例中，所述皮下注射试剂的间质血管层细胞的浓度为0.1-100×10⁴个/ml，较佳地为1-10×10⁴个/ml，更佳地为2×10⁵个/ml；和/或间充质祖细胞浓度为0.1-100×10⁴个/ml，较佳地为1-10×10⁴个/ml，更佳地为2×10⁵个/ml。

本发明还提供了一种使用本发明所述药物组合物的方法，在一个具体地实施例中，包括步骤：

(1)给需要的对象施用间质血管层细胞，优选的施用部位为所述对象的关节腔内；和

(2)给需要的对象施用间充质祖细胞，优选的施用部位为所述对象的关节腔内；优选的使用时间为步骤(1)之后的1个月，和/或2个月。

本发明所述的施用流程见图1。

本发明的主要优点如下：

(1)本发明的SVF和haMPCs在体内使用是安全的；

(2)本发明使用的haMPCs经LPS、低氧等刺激后，各种细胞因子的表达量会出现均明显上升，haMPCs具有较高的细胞因子分泌能力，在体内合适条件下能进行机体损伤修复；

(3)本发明的haMPCs具有典型的间充质干细胞特性，在体内的合适条件下具有潜在的分化能力，从而满足机体相对需求；

(4)本发明的SVF与haMPCs混合疗法中，haMPCs在特定诱导条件下可转化为软骨细胞，应用于预防或治疗骨性关节炎。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

SVF和haMPCs治疗膝骨关节炎（KOA）

例1：

患者女性，45岁，双侧膝关节疼痛3年余，晨僵，活动能力受限，上下楼梯困难，平地行走觉疼痛，X线检查提示有明显骨赘，关节间隙变窄，有硬化性改变。WOMAC评分92分。诊断：中度膝骨关节炎。

从KOA患者下腹部抽取约30ml脂肪，其中从10ml新鲜获取的脂肪组织中分离出血管基质部分，经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到SVF，对所述SVF进行表面抗原鉴定，鉴定结果见图2。

将每侧剂量均为5*10⁶个细胞/2ml的SVF注射于患者双侧关节腔内。剩余脂肪组织分离提纯后培养P2-P5代获得haMPCs。haMPCs冷冻保存，待解冻复苏后可再次培养，待首次注射后的第1、3个月再各接受一次双侧关节腔，每侧的量均为1*10⁷/个/2ml。

结果：患者症状明显改善，疼痛缓解，平地行走疼痛不明显，无晨僵出现，活动能力明显提高；X线检查提示关节面较前光滑；WOMAC评分为55分。

对照例：

患者男性，62岁，膝关节疼痛3年余，晨僵，活动能力受限，仅能从事轻松家务，上下楼梯困难；X线：中等量骨赘形成，关节间隙变窄，硬化性改变；WOMAC评分98分。诊断：中度膝骨关节炎。

从KOA患者下腹部抽取约30ml脂肪，分离出血管基质部分，经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到SVF，双侧关节腔内注射，每侧剂量为5*10⁶个/2ml。待首次注射后的第1、3个月重复上述操作，再次按照每侧5*10⁶个/2ml的剂量双侧关节腔内注射。

结果：患者症状改善不明显，疼痛稍缓解，仍有晨僵现象，活动能力稍提高；X线检查与前大致相同；WOMAC评分为86分。

结果表明：联合使用SVF和haMPCs，具有显著的治疗膝骨关节炎（KOA）的效果。

实施例2SVF及haMPCs的鉴定

1.流式检测

通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×10⁵/mL，800r/min(120g)，离心5min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至1mL，加入抗体5~10μL，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2~3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200至300μL的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测（图2）。

SVF的流式检测结果见表1。

表1

通过流式细胞仪对SVF进行细胞表面抗原标记表达的分析，结果表明：新鲜分离的祖细胞中SVF比例为60%，且造血祖细胞含量为70%，混合细胞较多。

haMPCs的流式检测结果见表2。

表2

抗体	比例（%）	抗体	比例（%）
				CD90	99.89	Actin	~0%阴性
CD29	99.96	DR	~0%阴性
				CD73	99.98	CD34	~0%阴性
CD49d	99.91	CD14	~0%阴性
						CD45	~0%阴性
		CD80	0.01
						CD86	0.01

2.细胞分泌因子的检测

将SVF及haMPCs在培养室培养48h，取上清，检测细胞分泌因子，脐带干细胞为对照组，检测结果见表3。

表3

细胞因子（单位）	hADMPCs	SVF	脐带干细胞
				VEGF（pg/ml)	16.80	23.73	18.14
TGF-β(pg/ml)	401.00	173.19	413.70
				GM-CSF(ng/ml)	41.87	60.03	63.35
HGF(ng/ml)	0.58	0.63	0.55
				PDGF(ng/ml)	0.01	0.01	0.02
IL-2（pg/ml）	34.23	38.23	33.56
				IL-10（pg/ml）	44.15	41.46	40.38

结果表明：SVF及haMPCs均有良好的分泌细胞因子的功能。其中，haMPCs分泌的TGF-β高达401.00pg/ml，远远高于SVF，与脐带干细胞相当。

实施例3

haMPCs刺激试验

（1）分别将新鲜及冻存的haMPCs置于完全培养基及5%FBS培养基中培养，并检测haMPCs分泌的VEGF。

结果显示（图3A），完全培养基培养的新鲜haMPCs组随着LPS浓度的增加，VEGF的浓度下降；5%FBS培养基培养的新鲜haMPCs组在200ng/ml时，VEGF与对照组浓度基本一样，100ng/ml和300ng/ml分别有所下降，完全培养基培养的冻存haMPCs组随着LPS浓度的增加，VEGF的浓度基本变化不大。整体来看，血清培养的要比完全培养基的VEGF要高。

（2）检测在低氧刺激下haMPCs的VEGF的分泌量，结果发现，低氧刺激下VEGF的分泌量是正常培养下中的2-3倍，且48小时的分泌量是24小时的2倍，VEGF的增量与细胞浓度的增量成正比（图3B）。

实施例3

haMPCs分化试验

采用GIBCO STEMPRO成软骨分化试剂盒制备成软骨分化培养基，将haMPCs消化离心获取P3代细胞，使用标准培养基制备1.6x10^7活细胞/mL的细胞悬液待用。用加样枪吸取5μL细胞悬液（细胞量8x10⁴），接种于多孔培养板板孔中心，置于CO₂培养箱中预培养2小时。

预培养结束后，在实验孔中添加1mL 37°C水浴锅预热的成软骨分化完全培养基，在对照孔中添加1mL 37°C水浴锅预热标准培养基，并将多孔培养板置于37°C，5%CO₂浓度的CO₂培养箱中进行培养。在培养过程中，每隔2-3天对相应板孔进行换液。经过足够培养时间后（7、14天），在当天配置4%福尔马林溶液（1mL 40%甲醛溶于9mL水中）和1%Alcian Blue染液（0.1g Alcian Blue溶于10mL 0.1N HCL中）。对各孔进行固定和染色处理。吸除培养基，DPBS洗涤一次，并将细胞使用4%福尔马林溶液固定30分钟。固定后用DPBS洗涤，然后加入1%Alcian Blue溶液(溶于0.1N的HCl)染色30分钟。使用0.1N的HCl洗涤三次，加入蒸馏水中和酸性，然后在光镜下对各实验组及对照组进行观察，保存图片。成功分化为软骨细胞的实验组经Alcian Blue染色后会因软骨细胞合成的蛋白聚糖而呈蓝色。

实验结果：在实验进行第7天对细胞生长状况进行观察，并选取A1、A3、C1孔拍照分析。经观察可见孔A1（图4.1）中细胞集中于接种的中心区域，细胞形态为圆形，与软骨细胞接近，细胞的贴壁紧密程度一般，但经过几次换液仍能保持贴壁状态；孔A3（图4.2）中的细胞形成了一个球状高度聚集的细胞团结构，在肉眼下可见一个乳白色小球状结构，该结构经过几次换液之后仍然存在，而且排除了污染的可能性；孔C1（图4.3）作为对照组加入标准培养基，细胞形态和标准的haMPCs贴壁细胞相符合。因此，从形态上来看，经分化培养基培养的haMPCs与对照组相比有比较明显的差异。

在实验进行第14天的Alcian Blue染色结果表明，C1孔（图4.6）没有出现明显蓝色染色；相比之下，A1（图4.4）孔出现了明显的蓝色染色，证明存在软骨细胞合成的粘多糖；而A3（图4.5）孔可能由于细胞过于致密，所以导致染色呈蓝黑色。因此，经分化培养基培养的haMPCs在经典染色条件下呈现了分化为软骨细胞的特征。

综上所述，本实施例表明，本发明的haMPCs在分化培养基的培养条件下在细胞形态学及经典化学染色处理呈现了软骨细胞的特征，表明haMPCs具备向软骨细胞的分化潜能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs）的用途，其特征在于，它们被用于制备预防和/或治疗骨性关节炎的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间质血管层细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(i)30%以上的细胞具有表面抗原CD29；

(ii)50%以上的细胞具有表面抗原CD73；

(iii)85%以上的细胞具有表面抗原CD49d；

(iv)55%以上的细胞具有表面抗原CD90。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间质血管层细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(v)85%以下的细胞具有表面抗原CD34；

(vi)15%以下的细胞具有表面抗原CD45。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间质血管层细胞分泌选自下组的细胞因子：干细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、人转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、或其组合。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(i)95%以上的细胞具有表面抗原CD90；

(ii)95%以上的细胞具有表面抗原CD73；

(iii)95%以上的细胞具有表面抗原CD29；

(iv)95%以上的细胞具有表面抗原CD49d。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：

(v)2%以下的细胞具有表面抗原HLA-DR；

(vi)2%以下的细胞具有表面抗原Actin；

(vii)2%以下的细胞具有表面抗原CD34；

(viii)2%以下的细胞具有表面抗原CD45；

(viiii)2%以下的细胞具有表面抗原CD14。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质祖细胞分泌选自下组的细胞因子：血管内皮生长因子(VEGF)、人转化生长因子α(TGF-α)、人转化生长因子β(TGF-β)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生因子(PDGF)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)。

8.一种用于预防和/或治疗骨性关节炎的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：有效量的间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs），以及药学上可接受的载体。

9.一种预防和/或治疗骨性关节炎的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs）、或施用含有间质血管层细胞（SVF）和间充质祖细胞（haMPCs）的药物组合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)给需要的对象施用间质血管层细胞；和

(2)给需要的对象施用间充质祖细胞。