CN103815168A - 一种海参用抗溶藻弧菌营养增强剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参用抗溶藻弧菌营养增强剂的制备方法，其包括以下步骤：增菌、洗涤后收集菌体；再经β-丙内脂灭活处理后于37℃放置2小时使其水解；再喷雾干燥到营养饲料中，干燥24~36h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：2~10，产物水份含量为2~5%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂；利用本发明实施例所述方法配制的海参用抗溶藻弧菌营养增强剂，适用于海参的育苗池和养成池；处理过程简单，耗时少；制备成本低于传统方法，本发明粉剂保存时间长，无污染。本发明对解决大批量海参养殖的溶藻弧菌的防治具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明主要涉及海产品疾病检测技术领域，具体涉及海产品致病微生物防治营养粉，尤其是一种海参用抗溶藻弧菌营养增强剂的制备方法。
背景技术
我国海域辽阔，自然条件优越，海洋资源十分丰富。但目前开发利用的程度还很低。这也说明我国开发利用海洋资源的潜力巨大，辽宁海域是中国重要的海洋生物资源、渔业资源宝库，其盛产海参、扇贝、贻贝、牡蛎和鱼、虾以及藻类等，带动海洋经济发展。加强多边和双边的海洋开发国际合作，集中集约开发利用海域及海岛资源，合理配置优势海洋产业，科学高效开发海洋资源，积极开展科研与试验、开发与利用，海水养殖标准化是合理开发海水养殖资源的重要手段，研究制定海产品养殖标准，合理开发海水滩涂养殖资源，提高养殖海产品疾病是当今养殖业的重点内容。
海产品养殖是一项高风险的养殖业，传统的小户的海产品养殖给养殖户带来了巨大的市场和技术风险。为了将养殖户养殖风险降到最低，开展对各类养殖业，包括鱼、虾、蟹、海参、鲍鱼、贝类、海藻等各类海产品的疾病防治工作任务举足轻重。有报道称，霍乱弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等有害细菌，是引起海产品各种疾病的罪魁祸首。
世界海参养殖以刺参（温带种）和糙海参（热带种）为主要品种。除中国、日本、韩国主要养殖刺参外，其他国家均以糙海参为主要养殖对象。近年来，随着自然资源的减少和消费需求的增加，海参的人工养殖在一些国家逐渐兴起。其中，中国和日本是主要的养殖国家，印度、印度尼西亚、越南、菲律宾、韩国、埃及等也有小规模的增养殖。
刺参(Apostichopus japonicus)是我国有记载的20余种食用海参中价值最高、惟一分布于黄渤海域的温带种。其蛋白质含量高,糖类丰富,脂类含量低,且不含胆固醇,具有很高的营养保健和药用价值,被人们视为重要的海珍品,因而具有重要的市场价值。近年来,海参消费需求量的逐年增加导致了世界范围内海参自然资源的过度开发和种群数量的急剧下降，因此，海参的人工养殖也随之发展起来。随之而来的是海参养殖中遇到的各类问题。
溶藻弧菌病是指由各种类型溶藻弧菌所引起的对人类、以及海洋生物等不同形式的总称。溶藻弧菌可引起刺参溃疡病，发病症状为：患病刺参体表溃疡，粘液增多，吐肠，1/4出现肿嘴，最后自溶死亡。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科（Vibrionaceae），弧菌属（Vibrio），革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连成“C”或“S”形，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧海生弧菌，适宜温度为17～35℃。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作为一种革兰氏阴性嗜盐菌,广泛存在于世界各地海水和海产品中,是许多海水养殖动物的致病菌。近年来在养殖生产上出现了较为严重的耐药性现象,给养殖业带来了很大的危害,这很可能与溶藻弧菌生物被膜的形成有关。溶藻弧菌还能引起人类食物中毒。溶血毒素、耐热性肠毒素（ST）和不耐热性肠毒素（LT）是致病性微生物中常见的致病因子。
发明内容
由背景技术可见,提高刺参自身的免疫力,增强其抗病力是解决刺参病害问题的重要途径。本研究为达到防治养殖业中海参患病的目的，避免在海参疾病防治中使用抗生素，本发明所述的海参用抗溶藻弧菌营养增强剂的制备方法，采用以下技术方案实现：其包括以下步骤：
（1）增菌：从溶藻弧菌标准菌株的单一菌落中，挑取一菌环，接种到营养肉汤培养基中，3-5%的体积比接种，进行发酵，32~37℃培养24~48h，至菌悬液菌含量的终浓度为107~1010cfu/g；制得发酵产物；
（2）洗涤：将步骤（2）获得的发酵产物，以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌1~5min后，以4000~8000rpm转数离心2~5min，以收集菌体；
（3）灭活处理：在收集的菌体中，按1:50的质量比加入PBS缓冲液，再向混合液体中，按1：1000~4000重量比加入β-丙内脂，100rmp振摇条件下，于4℃放置24h，然后于37℃放置2小时使其水解；
（4）干燥：上述步骤（3）所得的灭活产物喷雾干燥到营养饲料中，干燥24~36h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：2~10，产物水份含量为2~5%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂；
所述的营养饲料为：黄粉虫沙50～70份；马尾藻粉：25～40份；海蒿子15～35；大豆蛋白10～15份；鱼粉：5～10份；螺旋藻2～5份；贻贝粉2～5份；低聚壳聚糖：1～4份；复合多维1～4份；复合多矿1～4份。
对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下：其步骤包括菌种复苏的步骤：溶藻弧菌标准菌株菌落接种在肉汤培养基中，或者溶藻弧菌培养基中，36±1℃培养16~24h。
对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下：所述的溶藻弧菌培养基，其配制方法如下：
①取亮氨酸15g溶解于100mL蒸馏水中，过滤除菌；
②取酵母浸膏3g，氯化钠10g，胆酸钠2g，柠檬酸铁1g，硫代硫酸钠10g，氯化钙1g，蒸馏水900mL，121℃下灭菌20min；
③待所述培养基逐渐冷却后，加入除菌的亮氨酸溶液；
④调节所述溶液的pH至8.0，冷却备用。
对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下：按1：4000重量比加入β-丙内脂。
本发明中，上述产品制备方法中，均未限定方法的其他等效条件，因其可根据现有技术确定，也未限定所用试剂的级别，因其对结果影响小，并可以通过配制或商业途径购买获得，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。
本发明的优点是：适用于海参的育苗池和养成池；处理过程简单，耗时少；制备成本低于传统方法，本发明粉剂保存时间长，无污染。本发明对解决大批量海参养殖的溶藻弧菌的防治具有重要的现实意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
（1）菌种复苏：溶藻弧菌标准菌株菌落在培养基上呈光滑、凸起、直径1~3mm、边缘整齐的黄色。将溶藻弧菌标准菌株接种在溶藻弧菌培养基中，37℃培养18h，
其中，所述的溶藻弧菌培养基，其配制方法如下：
①取亮氨酸15g溶解于100mL蒸馏水中，过滤除菌；
②取酵母浸膏3g，氯化钠10g，胆酸钠2g，柠檬酸铁1g，硫代硫酸钠10g，氯化钙1g，蒸馏水900mL，121℃下灭菌20min；
③待所述培养基逐渐冷却后，加入除菌的亮氨酸溶液；
④调节所述溶液的pH至8.0，冷却备用。
（2）增菌：从步骤（1）获得的溶藻弧菌标准菌株的单一菌落中，挑取一菌环，接种到营养肉汤培养基中，5%的体积比接种，进行发酵，36℃培养30h，至菌悬液菌含量的终浓度为107~1010cfu/g；制得发酵产物；
（3）洗涤：将步骤（2）获得的发酵产物，以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌2min后，以8000rpm转数离心3min，以收集菌体。
（4）灭活处理：在收集的菌体中，按1:50的质量比加入PBS缓冲液，再向混合液体中，按1：3500重量比加入β-丙内脂，100rmp振摇条件下，于4℃放置24h，然后于37℃放置2小时使其水解；
（5）干燥：上述步骤（4）所得的灭活产物喷雾干燥到营养饲料中，干燥25h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：10，产物水份含量为2%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂。
所述的营养饲料为：黄粉虫沙50份；马尾藻粉：40份；海蒿子35；大豆蛋白15份；鱼粉：10份；螺旋藻5份；贻贝粉5份；低聚壳聚糖：4份；复合多维1份；复合多矿4份。
实施例2
（1）菌种复苏：溶藻弧菌标准菌株菌落在培养基上呈光滑、凸起、直径1~3mm、边缘整齐的黄色。将溶藻弧菌标准菌株接种在溶藻弧菌培养基中，36℃培养18h，
其中，所述的溶藻弧菌培养基，其配制方法如下：
①取亮氨酸15g溶解于100mL蒸馏水中，过滤除菌；
②取酵母浸膏3g，氯化钠10g，胆酸钠2g，柠檬酸铁1g，硫代硫酸钠10g，氯化钙1g，蒸馏水900mL，121℃下灭菌20min；
③待所述培养基逐渐冷却后，加入除菌的亮氨酸溶液；
④调节所述溶液的pH至8.0，冷却备用。
（2）增菌：从步骤（1）获得的溶藻弧菌标准菌株的单一菌落中，挑取一菌环，接种到营养肉汤培养基中，4%的体积比接种，进行发酵，37℃培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为107~1010cfu/g；制得发酵产物；
（3）洗涤：将步骤（2）获得的发酵产物，以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌2min后，以5000rpm转数离心2min，以收集菌体。
（4）灭活处理：在收集的菌体中，按1:50的质量比加入PBS缓冲液，再向混合液体中，按1：5000重量比加入β-丙内脂，100rmp振摇条件下，于4℃放置24h，然后于37℃放置2小时使其水解；
（5）干燥：上述步骤（4）所得的灭活产物喷雾干燥到营养饲料中，干燥30h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：7，产物水份含量为4%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂。
所述的营养饲料为：黄粉虫沙60份；马尾藻粉：30份；海蒿子30；大豆蛋白15份；鱼粉：7份；螺旋藻4份；贻贝粉4份；低聚壳聚糖：2份；复合多维2份；复合多矿2份。
实验例3
（1）菌种复苏：溶藻弧菌标准菌株菌落在培养基上呈光滑、凸起、直径1~3mm、边缘整齐的黄色。将溶藻弧菌标准菌株接种在溶藻弧菌培养基中，36±1℃培养16~24h，
其中，所述的溶藻弧菌培养基，其配制方法如下：
①取亮氨酸15g溶解于100mL蒸馏水中，过滤除菌；
②取酵母浸膏3g，氯化钠10g，胆酸钠2g，柠檬酸铁1g，硫代硫酸钠10g，氯化钙1g，蒸馏水900mL，121℃下灭菌20min；
③待所述培养基逐渐冷却后，加入除菌的亮氨酸溶液；
④调节所述溶液的pH至8.0，冷却备用。
（2）增菌：从步骤（1）获得的溶藻弧菌标准菌株的单一菌落中，挑取一菌环，接种到营养肉汤培养基中，5%的体积比接种，进行发酵，37℃培养28h，至菌悬液菌含量的终浓度为108cfu/g；制得发酵产物；
（3）洗涤：将步骤（2）获得的发酵产物，以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌1min后，以4000rpm转数离心5min，以收集菌体。
（4）灭活处理：在收集的菌体中，按1:50的质量比加入PBS缓冲液，再向混合液体中，按1：2000重量比加入β-丙内脂，100rmp振摇条件下，于4℃放置24h，然后于37℃放置2小时使其水解；
（5）干燥：上述步骤（4）所得的灭活产物喷雾干燥到营养饲料中，干燥26h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：5，产物水份含量为2~5%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂。
所述的营养饲料为：黄粉虫沙50份；马尾藻粉：30份；海蒿子15；大豆蛋白15份；鱼粉：8份；螺旋藻5份；贻贝粉4份；低聚壳聚糖：2份；复合多维2份；复合多矿2份。
实验例4
（1）菌种复苏：溶藻弧菌标准菌株菌落在培养基上呈光滑、凸起、直径1~3mm、边缘整齐的黄色。将溶藻弧菌标准菌株接种在溶藻弧菌培养基中，36±1℃培养16~24h，
其中，所述的溶藻弧菌培养基，其配制方法如下：
①取亮氨酸15g溶解于100mL蒸馏水中，过滤除菌；
②取酵母浸膏3g，氯化钠10g，胆酸钠2g，柠檬酸铁1g，硫代硫酸钠10g，氯化钙1g，蒸馏水900mL，121℃下灭菌20min；
③待所述培养基逐渐冷却后，加入除菌的亮氨酸溶液；
④调节所述溶液的pH至8.0，冷却备用。
（2）增菌：从步骤（1）获得的溶藻弧菌标准菌株的单一菌落中，挑取一菌环，接种到营养肉汤培养基中，5%的体积比接种，进行发酵，37℃培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为1010cfu/g；制得发酵产物；
（3）洗涤：将步骤（2）获得的发酵产物，以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌3min后，以4000rpm转数离心5min，以收集菌体。
（4）灭活处理：在收集的菌体中，按1:50的质量比加入PBS缓冲液，再向混合液体中，按1：1000重量比加入β-丙内脂，100rmp振摇条件下，于4℃放置24h，然后于37℃放置2小时使其水解；
（5）干燥：上述步骤（4）所得的灭活产物喷雾干燥到营养饲料中，干燥26h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：5，产物水份含量为5%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂。
所述的营养饲料为：黄粉虫沙70份；马尾藻粉：25份；海蒿子35；大豆蛋白15份；鱼粉：8份；螺旋藻5份；贻贝粉2份；低聚壳聚糖：4份；复合多维4份；复合多矿4份。
利用本发明实施例1~4所述方法配制的海参用抗溶藻弧菌营养增强剂，适用于海参的育苗池和养成池；处理过程简单，耗时少；制备成本低于传统方法，本发明粉剂保存时间长，无污染。本发明对解决大批量海参养殖的溶藻弧菌的防治具有重要的现实意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种海参用抗溶藻弧菌营养增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）增菌：从溶藻弧菌标准菌株的单一菌落中，挑取一菌环，接种到营养肉汤培养基中，3-5%的体积比接种，进行发酵，32~37℃培养24~48h，至菌悬液菌含量的终浓度为107~1010cfu/g；制得发酵产物；
（2）洗涤：将步骤（2）获得的发酵产物，以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌1~5min后，以4000~8000rpm转数离心2~5min，以收集菌体；
（3）灭活处理：在收集的菌体中，按1:50的质量比加入PBS缓冲液，再向混合液体中，按1：1000~4000重量比加入β-丙内脂，100rmp振摇条件下，于4℃放置24h，然后于37℃放置2小时使其水解；
（4）干燥：上述步骤（4）所得的灭活产物喷雾干燥到营养饲料中，干燥24~36h，灭活产物与营养饲料总重量比为1：2~10，产物水份含量为2~5%，制得海参用抗溶藻弧菌营养增强剂；
所述的营养饲料为：黄粉虫沙50～70份；马尾藻粉：25～40份；海蒿子15～35；大豆蛋白10～15份；鱼粉：5～10份；螺旋藻2～5份；贻贝粉2～5份；低聚壳聚糖：1～4份；复合多维1～4份；复合多矿1～4份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤包括菌种复苏的步骤：溶藻弧菌标准菌株菌落接种在肉汤培养基中，或者溶藻弧菌培养基中，36±1℃培养16~24h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的溶藻弧菌培养基，其配制方法如下：
①取亮氨酸15g溶解于100mL蒸馏水中，过滤除菌；
②取酵母浸膏3g，氯化钠10g，胆酸钠2g，柠檬酸铁1g，硫代硫酸钠10g，氯化钙1g，蒸馏水900mL，121℃下灭菌20min；
③待所述培养基逐渐冷却后，加入除菌的亮氨酸溶液；
④调节所述溶液的pH至8.0，冷却备用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，按1：4000重量比加入β-丙内脂。
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