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CN103764817A - 重组猪流感病毒及其应用 - Google Patents

重组猪流感病毒及其应用 Download PDF

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CN103764817A CN201280041712.7A CN201280041712A CN103764817A CN 103764817 A CN103764817 A CN 103764817A CN 201280041712 A CN201280041712 A CN 201280041712A CN 103764817 A CN103764817 A CN 103764817A
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Abstract

本文公开了重组、嵌合型猪流感病毒，其包含来自多于一种流感病毒亚型的血凝素节段。本文还描述了制备重组流感病毒、包含该重组流感病毒的免疫原性组合物的方法、刺激针对流感病毒的免疫反应的方法以及治疗和预防流感病毒感染的方法。

Description

重组猪流感病毒及其应用
技术领域
本发明一般涉及流感病毒和免疫原性组合物以及治疗和预防流感感染的方法。具体来说，本发明涉及表达多于一种血凝素(HA)亚型的重组、嵌合型猪流感病毒。
发明背景
猪流感(SI)是由A型和C型流感病毒引起的猪的急性呼吸道疾病。A型流感病毒是节段化的负链RNA病毒，且可从多种其他动物宿主物种分离，包括鸟、人、马、鲸和貂。尽管整个流感病毒很少跨越物种屏障，但基因节段可以通过基因重排或遗传漂移过程跨越该屏障。猪支持人和鸟A型流感病毒的复制，并被假定为通过用作不同宿主物种特异性病毒间重排的“混合容器”在种间传播中起重要作用(Scholtissek,Eur.J.Epidemiol.(1994)10:455-458)。这可能导致能跨越物种屏障传播至人的流感病毒的产生。
流感病毒体包含含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋形核衣壳)和内衬以基质蛋白(M1)的外部脂蛋白包膜。A型流感病毒的基因组由8个节段化的负义单链RNA分子组成。每个节段都具有节段特异性RNA包装信号，其由5’端和3’端的非编码区和短的编码区组成。8个节段化的RNAs编码11种病毒蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)以及形成核衣壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其为从含脂包膜突出的两种表面糖蛋白；非结构蛋白(NS1)、核输出蛋白(NEP，也称为NS2)、促凋亡因子PB1-F2。HA对病毒结合和进入细胞至关重要，并且为主要的中和抗体靶标，然而NA在子代病毒释放中起作用，并且为病毒增殖所必需。基因组的转录和复制在核内发生，并且通过在质膜上出芽而发生组装。病毒可以在混合感染期间重排(reassort)基因。
尽管存在可用的疫苗，多种猪流感病毒(SIV)亚型在猪群体中仍持续传播。目前，H1N1、H3N2和H1N2为在北美猪群体中引起疾病的主要亚型。H3N2亚型的SIVs通过人、鸟间的重排产生，并且典型的猪病毒正经历快速进化，且通常引起比典型的H1N1SIV更严重的疾病。当前的SIV疫苗并不提供针对多抗原SIV变体的交叉保护。
因此，仍然需要开发治疗和预防猪流感感染的有效策略。
发明概述
本发明涉及具有来自两种或更多种SIVs亚型的HAs的重组、嵌合型流感病毒，以及其制备和使用方法。在优选的实施方案中，重组病毒缺失NA节段的全部或部分，以便阻止病毒增殖。因为NA为病毒增殖所必需，可以通过使病毒在唾液酸酶存在下生长而在培养物中提供NA的功能。可以将表达多于一种HA类型的重组病毒用于免疫原性组合物中以刺激针对流感病毒的免疫反应，以及用于治疗和预防流感病毒感染。因为存在来自不同SIVs亚型的HAs，可以将包含嵌合型流感病毒的组合物用来提供针对多种流感株的广泛覆盖。
具体来说，本文的发明人发现包含H1和H3，并且保留了NA3’端和5’端病毒RNA特异性包装信号但缺少NA节段其余部分的嵌合型病毒，可在培养物中有效生长，并且在猪体内为减毒的，因为在猪体内不存在唾液酸酶。NA包装信号得到大量保留以用于有效包装。此类嵌合型构建物可以用作有效和安全的、活的减毒疫苗。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含来自多于一种流感亚型的多于一个血凝素(HA)节段(节段5)的重组、嵌合型猪流感病毒。具体来说，所述病毒包含来自第一流感亚型的节段1-5、7和8以及来自第二流感亚型的第二节段5。另外，所述第一流感亚型的神经氨酸酶(NA)节段(节段6)的全部或部分缺失，使得成为减毒病毒。
在某些实施方案中，第二节段5包含来自所述第一流感亚型的NA包装序列，其位于所述第二节段5的3’端以及任选地5’端。在其他的实施方案中，NA包装序列包含来自3’NA UTR和3’NA编码序列的3’NA包装序列，以及任选地，来自5’NA UTR和5’NA编码序列的5’NA包装序列。
在另外的实施方案中，上述流感病毒来自A型流感病毒。在某些实施方案中，流感病毒包含来自H1N1亚型的HA节段和来自H3N2亚型的HA节段。在某些实施方案中，第一流感亚型为H1N1，如A/swine/Saskatchewan/18789/02。在其他实施方案中，第二流感亚型为H3N2，如A/Swine/Texas/4199-2/98。
在其他实施方案中，本发明涉及包含来自H1N1流感亚型的节段1-5、7和8以及来自H3N2流感亚型的节段5的减毒、重组猪流感病毒。另外，来自H1N1流感亚型的节段6的全部或部分缺失，并且H3N2节段5侧翼为来自H1N1亚型的NA包装序列。所述包装序列包含来自3’NA UTR和3’NA编码序列的3’NA包装序列以及来自5’NA UTR和5’NA编码序列的5’NA包装序列。在某些实施方案中，H1N1亚型为A/swine/Saskatchewan/18789/02，并且H3N2亚型为A/Swine/Texas/4199-2/98。
在另外的实施方案中，本发明涉及包含任何一种上述重组病毒和药学可接受的赋形剂的组合物。在某些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。在其他的实施方案中，本发明涉及诱发脊椎动物个体体内的免疫反应的方法，包括给予所述个体所述组合物。在其他的实施方案中，本发明涉及治疗或预防脊椎动物个体体内的流感感染的方法，包括给予所述个体治疗有效量的所述组合物个体。在其他的实施方案中，本发明涉及针对流感病毒给个体接种疫苗的方法，包括给予所述个体有效量的所述组合物个体。在某些实施方案中，所述个体为猪个体。
在其他的实施方案中，本发明涉及这样的重组构建物，其包含：(a)猪流感H3N2亚型HA节段；和(b)位于所述H3N2HA节段的3’端以及任选地5’端的猪流感H1N1亚型NA包装序列。在某些实施方案中，所述H3N2HA节段侧翼为H1N1NA包装序列，所述包装序列包含来自3’NAUTR和3’NA编码序列的3’NA包装序列以及来自5’NA UTR和5’NA编码序列的5’NA包装序列。在其他的实施方案中，所述H1N1亚型为A/swine/Saskatchewan/18789/02，并且所述H3N2亚型为A/Swine/Texas/4199-2/98。
在另外的实施方案中，本发明涉及制备重组、嵌合型流感病毒的方法，包括用(a)包含来自H1N1流感亚型的节段1-5、7和8的单独的质粒；和(b)上述的重组构建物转染宿主细胞，以及在引起产生所述重组、嵌合型流感病毒的条件下培养所述宿主细胞。
在其他的实施方案中，本发明涉及用以下物质转化的细胞：(a)包含来自H1N1流感亚型的节段1-5、7和8的单独的质粒；和(b)如上所述的重组构建物。
在另外的实施方案中，本发明涉及制备组合物的方法，包括将任何上述的重组、嵌合型猪流感病毒与药学可接受的赋形剂组合。
在其他的实施方案中，本发明涉及制备流感疫苗的方法，包括：(a)使任何一种上述的重组、嵌合型猪流感病毒增殖；(b)纯化所述病毒；和(c)将纯化的病毒与药学可接受的赋形剂组合。
在其他的实施方案中，本发明涉及这样的试剂盒，其包含任何一种上述重组病毒或上述组合物的一个或多个容器。
鉴于本文的公开，本发明的这些和其他的实施方案容易为本领域技术人员理解。
附图说明
图1A和1B描述了用于本发明的不同流感节段。图1A描述了野生型A型流感H1N1SIV病毒——A/swine/Saskatchewan/18789/02(本文中称为“SK02”)的8个节段以及按实施例中所述制备的重组、嵌合型减毒病毒(本文中称为“SIV-606”)的8个节段。图1B为图1A中称为“H3-HA”的节段的图示。图1B中描述的HA节段来源于H3N2A型流感病毒——A/Swine/Texas/4199-2/98(本文中称为“Tx98”)，并且包含来自SK02的3’端和5’端NA包装信号。
图2显示了SIV-606和SIV/SK02的生长曲线。
图3A-3C显示了感染了高和低剂量的SK02(图3A)、Tx98(图3B)和SIV-606(图3C)的猪的体温。
图4显示了感染了高和低剂量的SIV/SK02、SIV Tx98和SIV-606的猪的肺病毒滴度。
图5A和5B(SEQ ID NOS:1和2)分别显示了来自SIV SK02的HA的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:AY619961.1)。
图6A和6B(SEQ ID NOS:3和4)分别显示了来自SIV SK02的NA的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:AY619960.1)。
图7A-7C(SEQ ID NOS:5,6和7)显示了来自SIV SK02的基质核苷酸序列(图7A)以及M2(图7B)和M1(图7C)的氨基酸序列(GenBank:AY619959.1)。
图8A和8B(SEQ ID NOS:8和9)分别显示了来自SIV SK02的NP的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:AY619958.1)。
图9A-9C(SEQ ID NOS:10,11和12)显示了来自SIV SK02的非结构蛋白核苷酸序列(图9A)以及NEP(图9B)和NS1(图9C)的氨基酸序列(GenBank:AY619957.1)。
图10A和10B(SEQ ID NOS:13和14)分别显示了来自SIV SK02的PA的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:AY619956)。
图11A和11B(SEQ ID NOS:15和16)分别显示了来自SIV SK02的PB1的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:AY619955.1)。
图12A和12B(SEQ ID NOS:17和18)分别显示了来自SIV SK02的PB2的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:AY619954.1)。
图13A和13B(SEQ ID NOS:19和20)分别显示了来自SIV Tx98的HA的核苷酸序列和氨基酸序列。
图14A-14C显示了接种SIV-606的猪体内的SIV/SK02特异性血清IgG滴度(图14A)；SIV/Tx98特异性血清IgG滴度(图14B)；以及H1N1Halifax特异性血清IgG滴度(图14C)。
图15A-15C显示了接种SIV-606的猪体内的SIV/SK02特异性鼻IgA滴度(图15A)；SIV/Tx98特异性鼻IgA滴度(图15B)；以及H1N1Halifax特异性鼻IgA滴度(图15C)。
图16A-16C显示了接种SIV-606的猪体内的SIV/SK02特异性BALFIgA滴度(图16A)；SIV/Tx98特异性BALF IgA滴度(图16B)；以及H1N1Halifax特异性BALF IgA滴度(图16C)。
图17A和17B显示了用SIV/SK02(图17A)和SIV/Tx98(图17B)攻击的未接种的对照猪以及接种了SIV-606的猪的直肠温度。
图18A和18B显示了未接种SIV/SK02和SIV/Tx98的猪以及接种了SIV-606的猪体内的肺组织病变百分比(图18A)和肺病毒载荷(图18B)。
图19A-19E显示了以下猪体内的组织病理学病变：未接种的、未攻击的猪(图19A)；接种了MEM并进行攻击的猪(图19B)；接种了SIV-606并用SIV/SK02攻击的猪(图19C)；接种了MEM并用SIV/Tx98攻击的猪(图19D)；以及接种了SIV-606并用SIV/Tx98攻击的猪(图19E)。
发明的详细描述
除非指出并非如此，本发明的实施将采用本领域技术范围内的病毒学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。此类技术在文献中有完整说明。参见，例如，Fundamental Virology,Current Edition,vol.I&II(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.);Handbook of ExperimentalImmunology,Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.,BlackwellScientific Publications);T.E.Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman and Company);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,最新版本);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(current edition);Methods In Enzymology(S.Colowickand N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)。
以下氨基酸缩写用于整个文本中：
丙氨酸:Ala(A)  精氨酸:Arg(R)
天冬酰胺:Asn(N)天冬氨酸:Asp(D)
半胱氨酸:Cys(C)谷氨酰胺:Gln(Q)
谷氨酸:Glu(E)  甘氨酸:Gly(G)
组氨酸:His(H)  异亮氨酸:Ile(I)
亮氨酸:Leu(L)  赖氨酸:Lys(K)
蛋氨酸:Met(M)  苯丙氨酸:Phe(F)
脯氨酸:Pro(P)  丝氨酸:Ser(S)
苏氨酸:Thr(T)  色氨酸:Trp(W)
酪氨酸:Tyr(Y) 缬氨酸:Val(V)
1.定义
在本发明描述中，将采用以下术语，且旨在按如下所示加以定义。
必须注意，如本说明书和所附的权利要求中所使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文明确指示并非如此。因此，例如，提及“A型流感病毒”包括两种或更多种此类病毒的混合物，以此类推。
如本文中所使用，术语“流感病毒”是指具有节段化的反义RNA基因组的正粘病毒科的包膜病毒的成员(Knipe and Howley(eds.)FieldsVirology,4th edition,Lippincott Williams and Wilkins,Philadelphia,Pa.,2001)。术语流感病毒可以包括任何流感(如A、B或C型流感)病毒株，
其能引起动物或人个体体内的疾病。具体来说，该术语包括选自H1-H15和N1-N9的任何A型流感病毒亚型，诸如但不限于H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H9N2和H5N1，或H和N的任何组合。大量的流感分离物已得到部分或完全测序。参见，例如，流感序列数据库(Influenza SequenceDatabase,ISD)(网站为flu.lanl.gov;由Macken et al.,"The value of adatabase in surveillance and vaccine selection."Options for the Control ofInfluenza IV.A.D.M.E.Osterhaus,N.Cox&A.W.Hampson(Eds.)Amsterdam:Elsevier Science,2001,103-106描述)和GenBank数据库，尤其是流感病毒资源数据库(Influenza Virus Resource)(网站为ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)。所述ISD和GenBank数据库含有A、B和C型流感基因组节段的完整序列。
本文使用术语“来源于”来确定分子的原始来源，但不试图限制产生该分子的方法，例如，方法可以为，通过化学合成或重组方法。
流感病毒分子为来源于流感病毒的分子，包括但不限于来自A、B或C型流感亚型的任何不同分离物的如本文中定义的多肽、蛋白、多核苷酸、寡核苷酸和核酸分子。所述分子不必在物理上来源于谈及的特定分离物，而是可以为合成或重组产生的。
已知多种流感病毒分离物的核酸和多肽序列。代表性的流感序列提供在本文的图5-13中。来自在不同物种中发现的流感分离物的其他代表性序列，包括8个流感节段的其他序列，在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库和创建于fludb.org的流感研究数据库(Infleunza Research Database)中列出，所述8个流感节段包括编码血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶碱性蛋白1和2(PB1和PB2)、基质膜蛋白1和2(M1和M2)、核蛋白(NP)和非结构蛋白1和2(NS1和NEP，也称为NS2)的那些节段。对于流感病毒的序列比较和遗传多样性的讨论及系统发育分析，还参见Ferguson et al.(2003)Nature422:428-433;Lin et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,9654-9658;Nguyen et al.(2005)J.Virol.79:4201-4212;Ha et al.(2002)EMBO J.21:865-875;和Chan et al.(2004)J.Microbiol.Immunol.Infect.37:135-144。
如本文中所使用，术语“猪流感病毒”是指来自引起猪流感的正粘病毒科的A型或C型流感病毒。虽然正粘病毒具有3个类群：A型、B型和C型，仅A型和C型流感病毒感染猪。猪流感病毒的亚型包括H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H9N2和H5N1。在某些实施方案中，猪流感病毒为从猪分离的流感病毒。为了本发明的目的，猪流感病毒为野生型猪流感病毒或来源于野生型猪流感病毒的重组、嵌合型流感病毒。
如本文中所使用，短语“野生型猪流感病毒”是指流行的、天然传播的并引起典型的疾病暴发的猪病毒类型。野生型猪流感病毒的实例包括但不限于A/swine/Saskatchewan/18789/02、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/HongKong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。
术语“HA基因”是指编码从流感的含脂包膜突出的血凝素(HA)表面糖蛋白的基因。HA为一种由A型流感病毒和其他病毒的节段化的基因组编码的分子。“猪流感病毒HA基因”为从猪流感病毒分离的HA基因，如来自任何上述病毒株的HA基因。代表性的猪HA基因的多核苷酸和氨基酸序列可以参见公共序列数据库如GenBank。例如，来自H1N1的HA基因包括但不限于GenBank登录号AY619961.1(参见图5A和5B)；GQ457549.1；GQ457548.1；GQ457547.1；CY091769.1；CY091745.1；CY091737.1；CY091729.1；GU721143.3；JF820285.1；JF820277.1；JF707784.1；CY087136.1；CY087104.1；CY087096.1；CY087080.1；CY087072.1；CY087064.1；CY087056.1；CY087048.1；CY086863.1；CY086839.1；CY086353.1；CY086006.1；CY085990.1；CY085982.1；CY085974.1；CY085966.1；CY085958.1；CY085950.1；CY085942.1；CY085934.1；CY085926.1；CY085918.1；CY085910.1；CY085902.1；CY085894.1；CY085886.1；CY085878.1；CY085870.1；CY085854.1；CY085846.1；CY085838.1；CY085830.1；CY085822.1；CY085814.1；CY085806.1；CY085798.1；CY085790.1；CY085782.1；CY085774.1；CY085766.1；CY085758.1；CY085742.1；CY085726.1；CY085718.1；CY085710.1；CY085702.1；CY085694.1；CY085686.1；CY085670.1；JF833344.1；JF833343.1；JF833341.1；JF833339.1；JF833338.1；JF833337.1；JF833335.1；JF916682.1；JF812292.1；JF812291.1；JF812290.1；JF812287.1；JF812284.1；JF812281.1；JF812280.1；JF812279.1；JF812278.1；JF812273.1；JF812272.1；JF812271.1；AF091317.1；AF091315.1；AF091314.1。
来自H3N2的HA基因包括但不限于图13A和13B中所示的序列；以及GenBank登陆号AY377927.2；CY092324.1；AF153233.1；JN105973.1；HQ315643.1；FJ519977.1；FJ519976.1；FJ519975.1；FJ519974.1；FJ519973.1；FJ519972.1；FJ519971.1；GU937743.1；JF833345.1；JF833340.1；JF833336.1；JF833334.1；JF812293.1；JF812289.1；JF812277.1；JF812276.1；JF812275.1；JF812274.1；CY045575.1；CY045567.1；CY045559.1；CY045551.1；HQ825243.1；HQ825235.1；HQ825229.1；HQ825226.1；HQ825223.1；HQ825218.1；HQ825210.1；HQ825210.1；HQ825198.1；HQ825190.1；HQ825182.1；HQ825174.1；HQ825166.1；JF312065.1；JF312064.1；CY086920.1；JF312073.1；JF312072.1；JF312071.1；JF316643.1；JF263536.1；JF263535.1；HQ734204.1；HQ734201.1；HQ734198.1；HQ734195.1；HQ734192.1；HQ734189.1；HQ734186.1；CY077942.1；CY077934.1。
术语“NA基因”是指编码从流感的含脂包膜突出的神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的基因。NA为一种由A型流感病毒和其他病毒的节段化的基因组编码的分子。“猪流感病毒NA基因”为从猪流感病毒分离的NA基因，如来自任何上述病毒株的NA基因。代表性的猪NA基因的多核苷酸和氨基酸序列可以参见公共序列数据库如GenBank。例如，来自H1N1的NA基因包括但不限于AY619960.1(参见图6A和6B)；JF833356.1.；JF833355.1；JF833353.1；JF833351.1；JF833350.1；JF833349.1；JF833355.1；JF833347.1；JF812315.1；JF812314.1；JF812313.1；JF812310.1；JF812307.1；JF812304.1；JF812303.1；JF812302.1；JF812301.1；JF812294.1；FJ791299.1；FJ791298.1；FJ791297.1；FJ791296.1；FJ791295.1；FJ791294.1；FJ791293.1；FJ791292.1；FJ791291.1；FJ791290.1；FJ791289.1；FJ791288.1；FJ791287.1。
术语“NA包装信号”是指NA的3’端和5’端病毒RNA特异性包装信号，其提供病毒RNA到病毒粒子的有效整合。包装信号存在于5’端和3’端非翻译区(UTRs)中，并且延伸到NA节段的编码区内。优选地，用于产生重组、嵌合型病毒的NA包装信号仅包括足够包装的NA区，且不包括整个NA编码序列。NA包装信号在以下将更详细地描述。
如本文中所使用，短语“感染复数”或“MOI”为每个感染细胞的病毒的平均数目。通过用加入的病毒数目(加入的ml x PFU)除以加入的细胞数目(加入的ml x细胞/ml)确定MOI。
如本文中所使用，术语“减毒的”指相对于野生型流感病毒，诸如本文描述的重组、嵌合型病毒的流感病毒变体展现出复制效率的可测量的减少。可以测定流感病毒的复制效率，例如，通过测量MDCK细胞中的噬斑大小、通过测量多个生长周期的病毒滴度或通过从感染的肺组织分离病毒并测量滴度。
术语“多肽”和“蛋白”是指氨基酸残基聚合物，且不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等包括在该定义中。全长蛋白及其片段都包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本发明的目的，“多肽”是指这样的蛋白，其包括对天然序列的修饰如缺失、添加和取代，只要该蛋白保持期望的活性。这些修饰可以为有意的，如通过定点突变，或可以为偶然的，如通过对产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增而产生的错误。
“基本上纯的”通常是指分离物质(重组病毒、化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽组合物)以便该物质构成其所存在的样品的主要百分比。通常在样品中，基本上纯的组分构成样品的50%，优选80%-85%，更优选90-95%。纯化目的分子的技术为本领域熟知且包括，例如，离子交换层析、亲和层析和依密度沉降。
当提及多肽时，通过“分离的”表示，所指出的分子是单独的，且与自然界中该分子所存在的整个有机体分离，或者在基本上没有相同类型的其他生物大分子的情形下存在。就多核苷酸而言，术语“分离的”为全部或部分缺乏自然界中通常与其相关的序列的核酸分子；或如在自然界中存在，但具有与其相关的异源序列的序列；或从染色体分离的分子。
“同源”是指两个多核苷酸或两个多肽部分间的百分比同一性。当序列在该分子的指定长度上展现至少约50%的序列同一性，优选至少约75%的序列同一性，更优选至少约80%-85%的序列同一性，更优选至少约90%的序列同一性，且最优选至少约95%-98%的序列同一性时，两条核酸或两条多肽序列为彼此“基本上同源的”。如本文中所使用，基本上同源的还指显示出与指定序列的完全同一性的序列。
一般来说，“同一性”分别指两条多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的一致性。可以通过以下方式确定百分比同一性：经序列比对直接比较两个分子间的序列信息、对两条比对序列间的精确匹配数计数、除以较短序列的长度，以及将结果乘以100。容易获得的计算机程序可用来帮助分析，如ALIGN、Dayhoff、M.O.Atlas ofProtein Sequence and Structure M.O.Dayhoff ed.,5Suppl.3:353358,National biomedical Research Foundation,Washington,DC，其采用了Smithand Waterman Advances in Appl.Math.2:482489,1981的用于肽分析的局部同源性算法。用于确定核苷酸序列同一性的程序可获自WisconsinSequence Analysis Package,Version8(可获自Genetics Computer Group,Madison,WI)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，其也依赖于Smithand Waterman算法。可使用生产商建议的和以上提及的WisconsinSequence Analysis Package中描述的默认参数容易地利用这些程序。例如，可以利用Smith and Waterman的同源性算法、采用6个核苷酸位置的默认记分表(scoring table)和空位罚分确定特定核苷酸序列与参照序列的百分比同一性。
本发明上下文中建立百分比同一性的另一方法为利用爱丁堡大学拥有版权的、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发的并且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)销售的MPSRCH程序包。可以采用来自该套程序包的Smith Waterman算法，其中默认参数被用于记分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，且空位为6)。从该数据产生的“匹配”值反应“序列同一性”。其他合适的用于计算序列间的百分比同一性或相似性的程序通常为本领域已知，例如，另一比对程序为使用默认参数的BLAST。例如，可以利用以下默认参数使用BLASTN和BLASTP：遗传密码=标准;滤除=无;链=两条链;阈值=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50条序列;排序方式=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss protein+Spupdate+PIR。可容易地得到这些程序的详细信息。
可选地，可以通过以下方式确定同源性：在同源区域间形成稳定双链的条件下使多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，并确定消化片段的大小。可以在例如，为该特定系统确定的严紧条件下，在Southern杂交实验中确定基本上同源的DNA序列。确定合适的杂交条件处于本领域技术能力范围内。参见，例如Sambrook et al.,同上;DNA Cloning,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上。
本文使用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅指该分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链DNA，以及三链、双链和单链RNA。其还包括多核苷酸的修饰(如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式。更具体而言，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、任何其他类型的多核苷酸——其为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷，含有非核苷酸骨架的其他聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNAs))和聚吗啉(可从Anti Virals,Inc.,Corvallis,Oregon,asNeugene购得)聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，只要该聚合物含有这样构型的核苷碱基：其允许碱基配对和碱基堆积，诸如在DNA和RNA中发现的构型。不试图在长度上区分术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”，并且这些术语可交换使用。因此，这些术语包括例如，3'-脱氧-2'、5'-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3'P5'磷酰胺酯、2'-O-烷基取代的RNA、双链和单链DNA，以及双链和单链RNA、DNA：RNA杂聚物以及PNAs和DNA或RNA间的杂聚物，并且还包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记、甲基化、“帽”、用类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代、核苷酸间的修饰，例如，具有不带电的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的那些、具有带负电的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，以及具有带正电的连接(例如，氨基烷基磷酸酰胺、氨基烷基磷酸三酯)的那些、含有侧基(pendant)部分诸如例如，蛋白(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂的那些、具有修饰的连接的那些(例如，α端基异构核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。具体来说，DNA为脱氧核糖核酸。
“来源于”指定序列的多核苷酸是指这样的多核苷酸序列，其包含与该指定的核苷酸序列区域对应（即相同或互补）的至少约6个核苷酸，优选至少约8个核苷酸，更优选至少约10-12个核苷酸，且甚至更优选至少约15-20个核苷酸的连续序列。所述来源的多核苷酸不必物理上来源于目的核苷酸序列，而是可以以任何方式生成，包括但不限于，化学合成、复制、反转录或转录，其基于多核苷酸源自的区域中碱基序列提供的信息。正因如此，其可以代表原始多核苷酸的正义或反义取向。
本文使用的描述核酸分子的“重组体”指基因组、RNA、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，其借助其来源或操作与在自然界中与其相关的多核苷酸的全部或部分不相关。结合病毒使用的术语“重组体”指通过操作病毒基因组产生的病毒。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”以及其他指示作为单细胞实体培养的微生物或较高等真核细胞系的此类术语是指可以或已用作重组病毒和载体或其他转移的核酸的受体的细胞，并且包括转染的原始细胞的原始子代。
“编码”选定多肽的“编码序列”或序列，为当置于合适的调控序列(或“控制元件”)控制下时，在体内转录并翻译为多肽的核酸分子。可以通过5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的RNA或cDNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'端。
典型的“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录强化子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3'端)、翻译起始的优化序列(位于编码序列的5’端)以及翻译终止序列。
“可操作地连接的”是指这样的元件布置，其中配置了如此描述的组件以便执行它们的通常功能。因此，给定的可操作地连接至编码序列的启动子在存在合适的酶的情况下能影响编码序列的表达。启动子不必与编码序列连续，只要其能发挥功能来指导其表达即可。因此，例如，插入的未翻译但已转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且所述启动子序列仍然可以被认为“可操作地连接”至编码序列。
“由…编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分含有来自由所述核酸序列编码的多肽的至少3至5个氨基酸，更优选至少8至10个氨基酸，且甚至更优选至少15至20个氨基酸的氨基酸序列。
“表达盒”或“表达构建物”是指能指导目标序列或基因的表达的组件。表达盒通常包括如上所述的控制元件，如可操作地连接至目标序列或基因(以便指导其转录)的启动子，且常常还包括聚腺苷酸化序列。表达盒可以包含在质粒构建物内。除了表达盒组件外，质粒构建物还可以包含一个或多个可选标志物——允许所述质粒构建物作为单链DNA存在的信号(例如，M13复制起点)、至少一个多克隆位点以及“哺乳类”复制起点(例如，SV40或腺病毒复制起点)。
使用的术语“转染”是指细胞摄取外来核酸。当外源核酸被引入至细胞膜内时，细胞被“转染”。多种转染技术通常为本领域已知。参见，例如，Graham et al.(1973)Virology,52:456,Sambrook et al.(1989)MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,and Chu etal.(1981)Gene13:197。此类技术可被用来引入一个或多个外源DNA部分至合适的宿主细胞内。该术语指遗传物质的稳定和瞬时摄取，并且包括肽或抗体连接的核酸的摄取。
“载体”能转移核酸序列至靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、粒性载体和脂质体)。通常，“载体构建物”、“表达载体”和“基因转移载体”指能指导目标核酸表达以及可以转移核酸序列至靶细胞的任何核酸构建物。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。
对抗原或组合物的“免疫反应”是个体体内发展的对存在于目标组合物中的抗原的体液和/或细胞免疫反应。为了本发明的目的，“体液免疫反应”是指由抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要的方面涉及由细胞溶解性T细胞(“CTL”s)引起的抗原特异性反应。CTLs具有针对存在的与由主要组织相容性复合体(MHC)编码的并表达于细胞表面上的蛋白相关的肽抗原的特异性。CTLs帮助诱导和促进胞内微生物的摧毁或感染了此类微生物的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及由辅助T细胞引起的抗原特异性反应。辅助T细胞作用以帮助刺激非特异性效应细胞的功能并聚集非特异性效应细胞的活性，所述非特异性效应细胞针对这样的细胞：其呈递与其表面上的MHC分子相关的肽抗原。“细胞免疫反应”还指细胞因子、趋化因子以及由活化的T细胞和/或其他白细胞产生的其他此类分子，包括来源于CD4+和CD8+T细胞的那些分子的产生。
引发细胞免疫反应的组合物或疫苗通过在细胞表面呈递与MHC分子相关的抗原，可以用来敏化脊椎动物个体。细胞介导的免疫反应针对表面呈递抗原的细胞或表面呈递抗原的细胞附近。另外，可以生成抗原特异性T淋巴细胞以允许免疫宿主的未来防护。
可以通过多种测定方法确定特定抗原刺激细胞介导的免疫反应的能力，诸如通过淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定、CTL细胞毒性细胞测定或通过测定敏化个体体内抗原的特异性T淋巴细胞。此类测定为本领域熟知。参见，例如，Erickson et al.,J.Immunol.(1993)151:4189-4199;Doeet al.,Eur.J.Immunol.(1994)24:2369-2376。最近的测量细胞介导的免疫反应的方法包括测量细胞内细胞因子或由T细胞群分泌的细胞因子，或通过测量表位特异性T细胞(例如，通过四聚物技术)(McMichael,A.J.,andO’Callaghan,C.A.,J.Exp.Med.(1998)187:1367-1371;Mcheyzer-Williams,M.G.,et al,Immunol.Rev.(1996)150:5-21;Lalvani,A.,et al,J.Exp.Med.(1997)186:859-865的综述)。
因此，本文使用的免疫反应可以为刺激抗体(例如，中和抗体，其通过结合至毒素和病原体阻止诸如进入细胞并复制的病毒的病原体，通常保护细胞免受感染和损伤)产生的反应。目标抗原还可以引发CTLs产生。因此，免疫反应可以包括一种或多种下述效应：通过B细胞产生抗体；和/或活化特异性针对存在于目标组合物或疫苗中的抗原的抑制性T细胞和/或记忆/效应T细胞。这些反应可以用来中和感染，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，以提供对免疫宿主的防护。可以利用本领域熟知的标准的免疫测定和中和测定确定此类反应。(参见，例如，Montefiori et al.J.Clin Microbiol.(1988)26:231-235;Dreyer et al.,AIDSRes Hum Retroviruses(1999)15:1563-1571)。哺乳动物的先天免疫系统还通过免疫细胞上的Toll样受体和类似的受体分子的活化识别和响应病原有机体的分子特征。先天免疫系统活化后，多种非适应性免疫反应细胞被活化，例如，以产生多种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。通过先天免疫反应活化的细胞包括单核细胞和类浆细胞谱系(MDC,PDC)的未成熟的和成熟的树状细胞，以及γ、δ、α和βT细胞和B细胞等。因此，本发明还包括免疫反应，其中所述免疫反应包括先天反应和适应性反应。
“免疫原性组合物”为包含抗原分子的组合物，其中将所述组合物给予个体导致所述个体体内出现如上所述的免疫反应。
“抗原”是指含有一个或多个可刺激宿主的免疫系统以产生如上所述的免疫反应的表位(线型、构象型或二者均存在)的分子，如蛋白、多肽或其片段，或减毒病毒。该术语可与术语“免疫原”交换使用。术语“抗原”表示两种亚单位抗原(即，单独的，且与自然界中该抗原有关的整个有机体分离的抗原)，以及杀死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。类似地，体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，诸如在基因治疗和核酸免疫应用中的寡核苷酸或多核苷酸，也包括在本文抗原的定义中。
通过“脊椎动物个体”表示脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人和其他灵长类，包括非人的灵长类如黑猩猩和其他猿和猴类物种；家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳类如狗和猫；实验动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟，包括驯养的鸟、野生的鸟和猎鸟如鸡、火鸡和其他鹑鸡类的鸟、鸭、鹅等。该术语不指示特定年龄。因此，本文试图包括成体和新生个体。
通过“治疗有效量”在免疫原性组合物情形下指诱导用于抗体产生或用于治疗或预防流感病毒感染的免疫反应的免疫原即重组、嵌合型流感病毒的量。此类反应通常引起个体体内出现针对组合物的抗体介导的和/或分泌性或细胞性免疫反应。通常，此类反应包括但不限于一种或多种下述效应；来自任何免疫类型如免疫球蛋白A、D、E、G或M的抗体产生；B和T淋巴细胞的增殖；为免疫细胞提供活化、生长和分化信号；辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞群的扩增。
“肠胃外给药”是指在消化道外引入身体，如通过皮下、肌内、皮内或静脉内给药。这与递送至粘膜表面（如经口、鼻、阴道或直肠）形成对比。“粘膜给药”是指通过任何粘膜表面引入身体，如经胃内、肺、经皮、肠、眼睛、鼻内、口、阴道、直肠、气管内等。
如本文中所使用，“治疗”是指任何以下情形：(i)感染或再感染的预防，如在常规疫苗中，(ii)症状的减轻或消除，以及(iii)从感染个体大幅或完全清除流感病毒。可以预防性(感染前)或治疗性(感染后)实现治疗。
2.实施本发明的模式
在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于特定构思或运行参数，因为其当然可以发生变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，且并不意图限制。
尽管类似或等同于本文描述的那些方法和材料的多种方法和材料可用于实施本发明，本文描述了优选的材料和方法。
本发明提供了具有受损的体内复制能力的减毒的重组、嵌合型猪流感病毒、制备此类减毒的猪流感病毒的方法以及此类病毒在疫苗和药物制剂中的应用。此类病毒能产生免疫反应并产生免疫力，但不引起疾病或引起较少和/或较低严重性的症状，即，该病毒具有减少的毒力。因此，它们是活病毒疫苗的完美候选者。此外，因为存在来自不同SIVs亚型的HA，包含嵌合型流感病毒的组合物可用来提供针对多种流感株的广泛覆盖。
具体来说，本发明涉及重组、嵌合型流感病毒(其包含来自多于一种流感亚型的HA节段，并且包含NA节段的全部或部分缺失)、包含该病毒的免疫原性组合物，以及刺激针对流感病毒的免疫反应的方法和干扰流感病毒复制的方法。
为了进一步理解本发明，下文提供了关于重组、嵌合型流感病毒的产生及在组合物中将其用于治疗和/或预防流感病毒感染的方法的更为详细的论述。
A.重组、嵌合型流感病毒
野生型猪流感病毒通常包含8个节段化的基因组，其中所述节段命名如下：
节段 基因产物名称
pB2(聚合酶(碱性)蛋自2)
2 PBl(聚合酶(碱性)蛋自1)
腆(聚合酶(酸性)蛋自)
4 HA(血凝素)
NP(核蛋削
6 NA(神经氨酸酶)
7 Ml(基质蛋自1);M2(基质蛋自2)
NSl(非结构蛋自1);NEP，也称为NS2(非结构蛋自2)
本文描述的重组、嵌合型流感病毒包含来自两种或更多种流感病毒亚型的两个或更多个HA节段(节段4)。所述重组流感病毒可以包含来自任何流感病毒亚型的HAs，并且优选来自A型流感病毒，选自H1-H15和N1-N9，诸如但不限于H1N2、H1N1、H3N2、H3N1、H9N2和H5N1或H和N的任何组合。特别优选来自感染猪的病毒的HA节段。代表性猪HA基因的多核苷酸和氨基酸序列可以参见公共序列数据库如GenBank。例如，来自H1N1的HA基因包括但不限于GenBank登录号AY619961.1(参见图5A和5B)；GQ457549.1；GQ457548.1；GQ457547.1；CY091769.1；CY091745.1；CY091737.1；CY091729.1；GU721143.3；JF820285.1；JF820277.1；JF707784.1；CY087136.1；CY087104.1；CY087096.1；CY087080.1；CY087072.1；CY087064.1；CY087056.1；CY087048.1；CY086863.1；CY086839.1；CY086353.1；CY086006.1；CY085990.1；CY085982.1；CY085974.1；CY085966.1；CY085958.1；CY085950.1；CY085942.1；CY085934.1；CY085926.1；CY085918.1；CY085910.1；CY085902.1；CY085894.1；CY085886.1；CY085878.1；CY085870.1；CY085854.1；CY085846.1；CY085838.1；CY085830.1；CY085822.1；CY085814.1；CY085806.1；CY085798.1；CY085790.1；CY085782.1；CY085774.1；CY085766.1；CY085758.1；CY085742.1；CY085726.1；CY085718.1；CY085710.1；CY085702.1；CY085694.1；CY085686.1；CY085670.1；JF833344.1；JF833343.1；JF833341.1；JF833339.1；JF833338.1；JF833337.1；JF833335.1；JF916682.1；JF812292.1；JF812291.1；JF812290.1；JF812287.1；JF812284.1；JF812281.1；JF812280.1；JF812279.1；JF812278.1；JF812273.1；JF812272.1；JF812271.1；AF091317.1；AF091315.1；AF091314.1。
来自H3N2的HA基因包括但不限于GenBank登录号AF153233.1(参见图13A和13B)；AY377927.2；CY092324.1；JN105973.1；HQ315643.1；FJ519977.1；FJ519976.1；FJ519975.1；FJ519974.1；FJ519973.1；FJ519972.1；FJ519971.1；GU937743.1；JF833345.1；JF833340.1；JF833336.1；JF833334.1；JF812293.1；JF812289.1；JF812277.1；JF812276.1；JF812275.1；JF812274.1；CY045575.1；CY045567.1；CY045559.1；CY045551.1；HQ825243.1；HQ825235.1；HQ825229.1；HQ825226.1；HQ825223.1；HQ825218.1；HQ825210.1；HQ825210.1；HQ825198.1；HQ825190.1；HQ825182.1；HQ825174.1；HQ825166.1；JF312065.1；JF312064.1；CY086920.1；JF312073.1；JF312072.1；JF312071.1；JF316643.1；JF263536.1；JF263535.1；HQ734204.1；HQ734201.1；HQ734198.1；HQ734195.1；HQ734192.1；HQ734189.1；HQ734186.1；CY077942.1；CY077934.1。
任何上述HAs或其他容易获得的HA序列都可以用于本发明。
另外，所述重组、嵌合型流感病毒通常包含编码神经氨酸酶的NA基因组节段(节段6)的突变，以便病毒复制受损。突变可以包括损害病毒复制的缺失、倒位、插入或取代。在某些实施方案中，所述病毒变体包含NA节段的全部或部分缺失，以便阻止病毒增殖。因为NA为病毒增殖所必需，可以通过使病毒在唾液酸酶存在下生长而在培养物中提供NA的功能。优选地，在所述重组病毒中保留NA包装序列，其位于NA序列侧翼的3’端以及任选地5’端非翻译区(UTRs)并延伸到编码序列内。
具体来说，特定顺式作用包装信号存在于3’端和5’端(UTRs)，其延伸到大多数（如果不是所有节段）包括NA节段的编码区内，所述包装信号通过从细胞糖缀合物和病毒糖蛋白去除唾液酸，负责从感染细胞释放病毒。每种病毒RNA主要由编码序列(以反义方向)组成，两端侧翼均为19至58个碱基长度的UTRs。在这些UTRs中，分别形成每个节段的最3’和5’末端的远端12个和13个非编码碱基在病毒株以及8个节段自身间高度保守。这些远端保守的序列彼此部分互补，且可以退火形成该节段的转录和复制必不可少的凸出的双链结构。所述UTRs具有有助于RNA包装的顺式作用信号，因为将真正的UTRs连接到异源RNA上可以使得该RNA能够包装到流感病毒粒子内并通过流感病毒粒子转导。至少一些节段如NA、HA和NS的最佳包装不仅需要UTRs，还需要短部分的编码区域。
报道构建物的缺失分析表明有效包装所需的最少序列延伸超出每个UTR，包括节段任一端的邻近的编码序列的9至80个碱基(Fujii et al.,J.Virol.(2005)79:3766–3774;Fujii et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)100:2002–2007;Watanabe et al.,J.Virol.(2003)77:10575–10583)。编码区3’端的序列似乎比5’端的序列发挥更大的定量效应。因此，这些区域对包装和维持野生型NA RNA以及突变型NA RNAs（例如，具有内部缺失和/或插入的RNAs）有用。因此，本发明的重组、嵌合型病毒至少包含来自3’UTR以及3’NA编码区的一部分的包装信号，并且优选包含来自NA序列的3’和5’UTRs以及3’和5’端部分的包装信号。
定位包装信号的方法是已知的。具体来说，Gog et al.,Nucl.Acids Res.(2007)35:1897-1907发现了位于节段的末端区域的统计上高度显著的密码子簇，其具有低于流感病毒基因组内预期的同义变异，其中存在的具体包装信号是已知的。这些区域的同义突变分析证实了它们的方法在单核苷酸水平上鉴定病毒基因组中功能上重要的顺式作用元件(即包装信号)的能力。然后，可以利用这些方法容易地确定各种病毒株和亚型的NA节段的包装信号。可以利用本领域已知的技术进行重组病毒RNA节段的包装效率的确定。参见，例如Dos et al.,Virology(2005)341:34-46。
通常，用于本发明的NA包装序列包含来自3’UTR的、邻近NA编码序列的至少19个核苷酸，优选19-30个核苷酸如19、20...25...30...35个核苷酸，以及来自5’UTR的、邻近NA编码序列的至少28个核苷酸，优选28-50个核苷酸，如28、29、30...35...40...45...50个核苷酸。所述NA包装序列还包含至少来自编码序列的3’端，且任选来自NA节段的编码区的每一端的约145至250个，优选150-200个核苷酸。因此，例如，流感病毒包装序列可以包含对应于NA病毒RNA的3'端的序列，包括对应于NA编码区的N端序列，例如，A型NA病毒RNA的3'端的至少150个核苷酸，如150、151、152、153、154、155...160...165...170...175...180...185...190个等，并且任选地，对应于NA病毒RNA的5'端的包装序列，包括对应于NA编码区的C端的序列，例如，150、151、152、153、154、155...160...165...170...175...180...185...190个等。
在一个具体的实施方案中，可以提供这样的构建物：其包含来自一种猪流感亚型的HA节段，以及来自另一猪流感亚型的、位于所述HA节段的3’端以及任选地5’端的NA包装序列。如实施例中所描述，制备了包含侧翼为H1N1包装序列的H3N2HA的构建物。该具体构建物包含H3N2HA序列，其侧翼为来自3’UTR的、邻近H1N1NA序列的19个核苷酸，来自3’NA编码区的183个核苷酸和来自5’UTR的、邻近该NA序列的28个核苷酸，以及来自5’NA编码区的157个核苷酸。然而，NA编码区的剩余部分缺失。通常，使用的包装序列与骨架病毒同源。因此，如果H1N1亚型用作骨架(即，除NA节段的全部或部分外的所有H1N1节段都存在于重组病毒中)，则将保留来自H1N1的NA包装序列，并用来自不同亚型的HA序列如H3N2HA序列方便地取代H1N1NA序列的剩余部分。
如有需要，不是缺失，而是可以将NA编码区突变，以便阻止病毒增殖。可以通过取代合适的核苷酸以产生期望的氨基酸变化，在体外诱变NA区。此类变化可以包括产生单个氨基酸改变的少至一个核苷酸的改变，或可以包括几个核苷酸的改变。可以通过定点突变的标准方法产生突变。可以利用能杂交至亲本核苷酸序列(通常为对应于RNA序列的cDNA)的错配引物，在低于错配双链的解链温度的温度下产生突变。可以通过保持引物长度和碱基组成在相对窄的限制内和通过保持突变碱基位于中心来产生特异性引物。参见，例如，Innis et al,(1990)PCRApplications:Protocols for Functional Genomics;Zoller and Smith,MethodsEnzymol.(1983)100:468;Wu(Ed.),Meth.In Enzymol.Vol.217,San Diego:Academic Press(1993);Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492。
NA突变(例如，NA编码序列的、除具有包装信号的序列外的全部或部分缺失)优选为阻止病毒增殖的突变。
可以确定减毒流感病毒的复制效率，例如，通过在马丁达比狗肾(MDCK)细胞中测量噬斑大小、通过测量多个生长周期的病毒滴度或通过从感染的肺组织分离病毒并测量滴度。例如，本发明的减毒猪流感病毒允许所述减毒病毒，以0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1的感染复数(MOI)，或者0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI，生长至低于细胞培养物中野生型猪流感病毒约1至约100倍,约2至约90倍,约5至约80倍,约20至约80倍,或约40至约80倍,约1至约10倍,约1至约5倍,约1至约4倍,约1至约3倍,约1至约2倍,约3至约15倍的滴度，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍的滴度，所述细胞培养物为，例如MDCK细胞；人细胞(例如，PerC6——一种来源于用腺病毒5的E1区转化的人胚胎成视网膜细胞的生产细胞系)；小鼠；鸡(例如，鸡胚成纤维细胞)；大鼠、鸟；或猪(例如，PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL13或SJPL细胞)。可以通过在感染后约2至10天、3至7天、3至5天或2、3、5、6、7、8、9、10天或者当病毒在MDCK细胞上产生噬斑时进行的来自猪或猪细胞的上清液的BALF的血凝试验确定复制效率。在一个实施方案中，将本发明的减毒猪流感病毒的生长与特定标准或参照如，野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98进行比较。减毒性的另一种测量方法为相对于如上述的参照野生型病毒株，在无唾液酸酶下培养病毒并测量滴度。
除了HA序列和上述的包装序列，所述重组、嵌合型流感病毒还包含剩余的病毒节段——节段1-3、5、7和8，即编码PB2(节段1)、PB1(节段2)、PA(节段3)、NP(节段5)、M1和M2(节段7)、NS1和NEP(节段8)的节段。这些节段以及来自多种流感病毒分离物的节段4(编码HA)和6(编码NA)的核酸和多肽序列是已知的。代表性的流感序列显示在本文的图5-13中。来自多种物种中所见的流感分离物的8个流感节段的其他代表性序列在国家生物技术信息中心数据库和流感研究数据库（其网站为fludb.org）中列出。对于序列比较和流感病毒的遗传多样性和进化分析的讨论，也参见Ferguson et al.(2003)Nature422:428-433;Lin et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,9654-9658;Nguyen et al.(2005)J.Virol.79:4201-4212;Ha et al.(2002)EMBO J.21:865-875;和Chan et al.(2004)J.Microbiol.Immunol.Infect.37:135-144。
任何这些序列及其变体都可以用来制备所述重组、嵌合型流感病毒。因此，本发明包括上述序列的变体，所述变体与上述序列展现至少约80-100%(包括这些范围内的任何百分比同一性)的序列同一性，如与其展现81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。
上述节段可以来源于任何不同的猪流感病毒，包括但不限于A/swine/Saskatchewan/18789/02、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/HongKong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。
在一个具体的实施方案中，H3N2HA被用于取代H1N1骨架中的H1N1NA序列的全部或部分。因此，产生的重组病毒包含两种组分——HAs和病毒节段的剩余部分。参见，图1。
可以使用已知的方法从病毒RNA中分离上述节段的每一段。例如，可以通过筛选来自感染了病毒的细胞的cDNA和/或基因组文库，或通过从已知包含基因的载体得到该基因来获得核酸。例如，可以从来源于感染个体的病毒RNA的基因组文库分离目标多核苷酸。可选地，可以从感染哺乳动物或从收集自感染个体的生物样品(例如，鼻、鼻咽、喉或结膜分泌物、血液或肛门拭样)分离流感病毒。一旦得到病毒，即可利用已知的技术进行增殖，诸如Mochalova et al.,Virology(2003)313:473-480;Lin etal.,Virology(1997)233:402-410;Hardy et al.,Virology(1995)211:302-306;Hinshaw et al.,J.Gen.Virol.(1978)41:115-127中所描述的技术。还可以直接从所考虑的流感病毒得到核酸。
因此，特定核苷酸序列可以从具有期望序列的载体得到或利用本领域已知的不同寡核苷酸合成技术完全或部分合成，诸如合适时使用的定点突变和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，例如，Sambrook,同上。一种获得编码期望序列的核苷酸序列的方法为，通过使在常规的自动化多核苷酸合成仪中产生的重叠的合成寡核苷酸的互补组退火，然后用合适的DNA连接酶连接，并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。参见，例如，Jayaraman et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4084-4088。另外，寡核苷酸指导的合成(Jones et al.(1986)Nature54:75-82)、寡核苷酸指导的已有核苷酸区的突变(Riechmann et al.(1988)Nature332:323-327和Verhoeyen et al.(1988)Science239:1534-1536)以及利用T4DNA聚合酶的缺口寡核苷酸的酶促填补(Queen et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033)可以用来产生修饰的分子。
诸如PCR的扩增方法可以用来扩增包含不同节段的多核苷酸。在一个实施方案中，这些节段被逆转录为cDNA并利用RT-PCR进行扩增。参见，例如，Hoffmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:6108-6113。来自每个节段的cDNA被克隆以提供分离的用于制备所述重组、嵌合型流感病毒的质粒。在一些实施方案中，可以使用克隆载体pHW2000(Hoffmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:6108-6113)。然而，所述节段可以克隆至任何合适的载体。许多克隆载体为本领域技术人员已知，并且合适克隆载体的挑选是选择的关键。用于克隆的重组DNA载体和它们可以转化的宿主细胞的实例包括噬菌体λ(大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非大肠杆菌的革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母菌)、YCp19(酵母菌)和牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。通常参见，DNACloning:Vols.I&II,同上;Sambrook et al.,同上;B.Perbal,同上。
然后可以通过任何本领域熟知的方法产生包含来自多于一种流感亚型的多于一种HA序列的重组、嵌合型减毒流感病毒。优选地，反向遗传学方法被用来产生重组病毒。反向遗传学方法利用从流感病毒感染的细胞分离的RNA聚合酶复合物转录含有突变的人工流感病毒基因组节段。利用辅助病毒将合成的RNA节段并入到病毒粒子内，然后挑选包含期望改变的病毒。用于流感病毒的反向遗传学方法描述于，例如，Enamiet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1990)87:38023805;Enami and Palese,J.Virol.(1991)65:2711-13;Luytjes,Cell(1989)59:1107-13;Fodor et al.,J.Virol.(1999)73:9679-9682;Gao et al.,J.Virol.(2008)82:6419-6426;Quinlivan etal.,J.Virol.(2005)79:8431-8439;和美国专利第5,578,473号、第6,974,686号和第7,037,707号。
最近开发的反向遗传学系统完全基于cDNA，其允许操作流感病毒基因组。参见，例如Palese et.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:11354;Neumann and Kawaoka,Adv.Virus Res.(1999)53:265;Neumann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96:9345;Fodor et al.,J.Virol.(1999)73:9679。在一种技术中，在存在纯化的NP、PB1、PB2和PA蛋白的情况下，于体外从cDNA构建物转录修饰的病毒RNA转录本。然后将产生的合成RNP转染到先前感染了流感辅助病毒的细胞内。该辅助病毒通常具有条件性生长缺陷，诸如宿主范围限制或温度敏感性，其允许随后挑选转染子病毒。例如，宿主范围性辅助病毒已被成功用来回收合成的NA和PB2基因。参见Enami,同上，和Subbarao,J Virol(1993)67:7223-28。
在优选的实施方案中，8质粒系统被用来产生减毒流感病毒。参见，例如Hoffmann et al.,Vaccine(2002)20:3165-3170;Hoffmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:6108-6113;和美国专利公开第20040029251号。在该实施方案中，所述质粒具有期望流感病毒的8个节段，如2个HA节段以及编码聚合酶酸性蛋白(PA)的节段、编码聚合酶碱性蛋白1和2(PB1和PB2)的节段、编码基质蛋白1和2(M1和M2)的基质(M)节段、编码核蛋白(NP)的节段和编码非结构蛋白1和2(NS1和NEP)的非结构(NS)节段，其被共转染至合适的细胞内，从而产生本文所述的重组、嵌合型病毒。还参见美国专利第6,951,754号，其描述了用于利用pol I-pol II系统产生减毒流感病毒的8质粒双启动子反向遗传学系统。
活减毒病毒疫苗制剂的制备利用常规方法完成，包括在允许病毒生长至足够进一步使用的滴度的任何基质中培养所述重组、嵌合型病毒。通常，病毒在细胞、含胚卵中和/或动物体内增殖，然后纯化。通常，利用已知的技术将流感病毒培养在鸡胚胎或哺乳动物细胞中，如马丁达比狗肾(MDCK)细胞、马丁达比牛肾(MDBK)细胞、猪细胞或非洲绿猴肾(Vero)细胞。参见，例如Mochalova et al.,Virology(2003)313:473-480;Linet al.,Virology(1997)233:402-410;Hardy et al.,Virology(1995)211:302-306;Hinshaw et al.,J.Gen.Virol.(1978)41:115-127。代表性的猪细胞包括猪肾细胞系、猪睾丸细胞系和猪肺细胞系，诸如但不限于PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、SJPL细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞和PK-2a/CL13细胞。
在另一实施方案中，所述重组、嵌合型猪流感病毒培养在鸡细胞，例如，来源于例如6-14天龄的含胚卵的鸡胚成纤维细胞中增殖。在其他的实施方案中，幼含胚卵或未成熟的含胚卵可以用来使本发明的病毒增殖。未成熟的含胚卵包括小于10天龄卵的卵。未成熟的含胚卵还可以为由于改变生长条件而人为地模拟未成熟的卵的卵，例如，改变孵化温度；药物处理；或任何其他导致产生发育迟延的卵的改变。可以在含胚卵的不同位置，例如，尿囊腔中使猪流感病毒增殖。
在具体的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒在任何基质中增殖，所述基质允许该病毒生长至与测定的野生型猪流感病毒株的滴度相当的滴度。优选地，在唾液酸酶存在下培养病毒体，因为所述重组、嵌合型病毒中的NA节段存在缺陷。
优选地，在配制疫苗前高度纯化病毒。通常，纯化过程将引起细胞DNA、其他细胞成分和外源因子的大量去除。还可以使用大量降解或变形DNA的方案。参见，例如，Mizrahi,ed.,Viral Vaccines,Wiley-Liss,NewYork(1990)。纯化方法为本领域已知且可以包括以下一种或多种，例如，梯度离心、超速离心、区带超速离心、连续流超速离心和层析法，如离子交换层析、体积排阻层析和液相亲和层析、聚乙二醇或硫酸铵沉淀。
B.抗病毒组合物
可以将重组、嵌合型流感病毒以及随后灭活的重组、嵌合型流感病毒配制在组合物中，用于递送至个体以抑制感染或促进针对流感病毒的免疫反应。因此，可以配制活的重组猪流感病毒疫苗或免疫原性制剂或灭活的重组猪流感病毒疫苗或免疫原性制剂。活的疫苗或免疫原性制剂可以是优选的，因为在宿主体内的繁殖引起与天然感染中所发生的类似的类型和幅度的延长刺激，并因此给予大量的、长期的免疫力。此类活的重组猪流感病毒疫苗制剂和免疫原性制剂的产生可以利用常规方法完成，包括如上所述的增殖。当配制为活病毒疫苗时，可以使用约102至108的范围，每剂量应当优选使用约103至107，更优选104pfu至约5x106，且最优选104至107pfu。
可以利用常规技术“杀死”减毒病毒来制备灭活的疫苗制剂。灭活的疫苗为“死的”，意指它们的感染力被破坏。理想地，在不影响其免疫原性的情况下破坏病毒的感染力。为了制备灭活的疫苗，按如上所述培养和纯化所述减毒病毒。然后利用本领域已知的几种方法中的一种灭活纯化的病毒。此类方法包括化学或物理方法。灭活流感病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种下述试剂处理病毒：洗涤剂、甲醛、福尔马林、β-丙内酯或UV光。病毒灭活的其他方法为本领域已知，例如二乙胺、乙酰基丫丙啶或γ照射。参见，例如美国专利第6,635,246号；第5,891,705号；第5,106,619号和第4,693,981号。
本发明的组合物可以包含非流感抗原或抗原组合或与非流感抗原或抗原组合共给予，如与组合型流感疫苗共给予。制备此类制剂的方法描述于，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Easton,Pennsylvania,18Edition,1990。可以制备本发明的组合物用于经粘膜递送、肠胃外递送，例如，作为液体溶液或悬浮液的注射剂。还可以制备适合于注射前溶解于或悬浮于液体介质的固体形式。还可以将制剂乳化或将活性成分封装在脂质体介质内。有活性的免疫原性成分通常与兼容的药学介质混合，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及以上的组合。另外，若需要，所述介质可以含有微量的辅助性物质，如湿润剂或乳化剂和pH缓冲剂。
如果用来调节免疫反应，还可以将其他增加组合物效力的佐剂添加到制剂中。佐剂可以包括例如，胞壁酰二肽、阿夫立定(avridine)、氢氧化铝、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、油、水包油乳剂、皂苷、细胞因子及本领域已知的其他物质。
为了增加疫苗的免疫原性，还可以使用载体。合适的载体包括大的、缓慢代谢的大分子如蛋白，包括血清白蛋白、钥孔虫戚血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白和本领域技术人员熟知的其他蛋白；多糖，如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素珠等；聚合氨基酸如聚谷氨酸、聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；以及灭活的病毒粒子。
此外，可以以中性或盐形式将流感分子配制到组合物中。药学可接受的盐包括酸酸加成盐(以活性多肽的游离氨基形成)，并且所述酸加成盐以无机酸或有机酸形成，所述无机酸为，例如，盐酸或磷酸，所述有机酸为，诸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。由游离羧基形成的盐还可以来源于无机碱，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
制剂含有“治疗有效量”的活性成分，即，能在给予所述组合物的个体体内获得期望的反应的量。在流感感染的治疗和预防中，例如，“治疗有效量”优选为预防、减少或改善流感症状的量。所需的精确剂量存在差异，这取决于治疗个体；治疗个体的年龄和一般状况；个体的免疫系统合成抗体的能力；期望的防护程度；治疗病症的严重程度；所选的具体病毒制剂及其给药方式，以及其他因素。本领域技术人员可以容易地确定合适的有效量。因此，“治疗有效量”落入相对广的范围，其可以通过常规试验确定。所述重组、嵌合型流感病毒通常为所述组合物的约1%至约95%(w/w)，或者根据需要甚至更高或更低。
适合其它给药方式的其他制剂包括栓剂，并且在一些情形下，包括气雾剂、鼻内制剂、口服制剂和缓释制剂。对于栓剂，介质组合物包括常规的粘合剂和载体，如聚烷基二醇(polyalkaline glycol)或甘油三酯。此类栓剂可以由含有约0.5%至约10%(w/w)，优选约1%至约2%的活性成分的混合物构成。口服介质包括常用的赋形剂，例如，药用等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠纤维素、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末形式，且含有约10%至约95%，优选约25%至约70%的活性成分。
鼻内制剂通常包含不造成鼻粘膜刺激，也不显著干扰纤毛功能的介质。本发明可以采用稀释剂如水、盐水或其他已知的物质。鼻用制剂还可以含有防腐剂，诸如但不限于氯丁醇和苯扎氯铵。可以存在表面活性剂以增加鼻粘膜对个体蛋白的吸收。
通过将蛋白并入载体或介质内产生受控或缓慢释放的制剂，所述载体或介质为，诸如脂质体、不可吸收的非渗透性的聚合物如乙烯醋酸乙烯共聚物和HYTREL共聚物、可膨胀的聚合物如水凝胶、可吸收的聚合物如胶原，以及某些多元酸或多元酯如用来产生可吸收缝线的那些、聚磷腈、藻脘酸盐、微粒、明胶纳米球、壳聚糖纳米粒子等。还可以利用植入的本领域熟知的小型泵递送所述流感病毒。
C.给药
通常将本发明的组合物直接给予患者。可以通过以下方式完成直接递送：肠胃外注射(例如，皮下、腹腔内、静脉内、肌内注射或注射至组织间隙)，或经粘膜给药，如通过气管内、直肠、经口(例如，片剂、喷雾)、阴道、局部、经皮(transdermal)(参见例如WO99/27961)或经皮肤(transcutaneous)(参见例如WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(参见例如WO03/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜给药。还可以通过直接转移至皮肤表面局部给予免疫原性组合物。可以不利用任何装置，或通过利用绷带或绷带样装置使裸露的皮肤接触所述免疫原性组合物(参见，例如，美国专利第6,348,450号)来完成局部给药。
优选的给药模式为肠胃外、粘膜或粘膜和肠胃外免疫的组合。甚至更优选的给药模式为以1-3周的间隔，经肠胃外、粘膜或粘膜和肠胃外免疫的组合总共给予1-2次接种。优选的给药途径包括但不限于经口递送、肌内递送以及经口和肌内递送的组合。
在一个实施方案中，治疗流感病毒感染的方法包括经粘膜将包含本发明的流感病毒的第一免疫原性组合物给予有需要的个体，然后肠道外给予治疗有效量的包含本发明的流感病毒的第二免疫原性组合物。
所述免疫原性组合物可以用来引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。优选地，免疫反应特征为诱导血清IgG和/或IgA免疫反应。
在包括共给予的任何方法中，可以以任何次序递送不同的组合物。因此，在包括递送多种不同组合物或分子的实施方案中，无需在其他免疫原性物质前递送所述流感病毒。例如，引发步骤可以包括递送一种或多种多肽，并且加强可以包括递送一种或多种减毒的流感病毒。可以在多次给予流感病毒后多次给予其他物质。可以以任何次序进行给药。因此，可以将流感病毒和其他免疫原性物质的任何组合用来引发免疫反应。
D.剂量方案
可以按照单剂量方案或多剂量方案进行剂量处理。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同的或不同的途径给予多种剂量，例如肠胃外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和肠胃外增强等。
优选的剂量方案增加抗体反应的亲合力，产生具有中和特征的抗体。体外中和测定可以用来测试中和抗体(参见例如Asanaka et al.,J.of Virol.(2005)102:10327;Wobus et al.,PLOS Biology(2004)2;e432;和Dubekti etal.,J.Med.Virol.(2002)66:400)。
E.确定免疫反应效力的测试
评估治疗性治疗效力的一种方法包括在给予本发明组合物后监测感染。评估预防性治疗效力的一种方法包括在给予本发明组合物后监测针对该组合物中的抗原的免疫反应。
检测治疗性治疗效力的另一种方法包括在给予本发明组合物后监测感染。检测预防性治疗效力的一种方法包括在给予本发明组合物后，监测针对该组合物中的抗原的全身性(如监测IgG1和IgG2a的产生水平)和粘膜性(如监测IgA的产生水平)免疫反应。通常，在免疫后但在攻击前确定血清特异性抗体反应，然而，在免疫和攻击后确定粘膜特异性抗体反应。
可以于宿主给药前，在体外和体内动物模型中评估本发明的免疫原性组合物。可以通过用所述免疫原性组合物攻击感染的动物模型，例如豚鼠或小鼠或猪，在体内确定本发明的免疫原性组合物的效力。所述免疫原性组合物可以来源于与攻击株相同的或不同的病毒株。优选的免疫原性组合物来源于与攻击株相同的病毒株。特别有用的小鼠模型包括这样的模型：其中在腹膜内免疫后进行腹膜内攻击或鼻内攻击。体内效力小鼠模型包括但不限于利用猪病毒株的鼠感染模型和鼠病模型，所述鼠病模型为利用小鼠适应性病毒株如对小鼠特别毒的病毒株的鼠模型。
所述免疫反应可以为TH1免疫反应和TH2反应中的一种或两种。所述免疫反应可以为改善的或增强的或改变的免疫反应。所述免疫反应可以为全身免疫反应和粘膜免疫反应中的一种或两种。优选地，所述免疫反应为增强的全身和/或粘膜反应。
增强的全身和/或粘膜免疫反映在增强的TH1和/或TH2免疫反应当中。优选地，增强的免疫反应包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。优选地，粘膜免疫反应为TH2免疫反应。优选地，粘膜免疫反应包括IgA产生的增加。
活化的TH2细胞增加抗体产生，并因此对响应细胞外感染具有价值。活化的TH2细胞可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫反应可以引起IgG1、IgE、IgA和用于未来防护的记忆B细胞的产生。
TH2免疫反应可以包括以下中的一种或多种：与TH2免疫反应相关的细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)中的一种或多种的增加，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生的增加。优选地，增强的TH2免疫反应包括IgG1产生的增加。
TH1免疫反应可以包括以下中的一种或多种：CTLs的增加、与TH1免疫反应相关的细胞因子(如IL-2、IFNγ和TNFβ)中的一种或多种的增加、活化的巨噬细胞的增加、NK活性的增加，或IgG2a产生的增加。优选地，增强的TH1免疫反应包括IgG2a产生的增加。
本发明免疫原性组合物，尤其是本发明的包含一种或多种抗原的免疫原性组合物可以单独或与其他抗原组合使用，任选与能引发Th1和/或Th2反应的免疫调节剂组合使用。
为了有效处理感染，本发明免疫原性组合物优选引发细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。该免疫反应优选诱导持久性(例如，中和)抗体以及暴露于一种或多种传染性抗原后能快速响应的细胞介导的免疫。例如，患者血液样品中的中和抗体证据被认为是防护的替代参量，因为它们的形成对TBE感染的病毒消除至关重要(参见Kaiser and Holzmann,Infection28;78-84)。
F.试剂盒
本发明还提供了包含一个或多个本发明组合物的容器的试剂盒。组合物可以为固体形式、液体形式或可以为冻干的。组合物的合适容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。可以由多种材料制备容器，包括玻璃或塑料。容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以为静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。
所述试剂盒还可以包含第二容器，其含有药学可接受的缓冲液如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。其还可以含有对最终用户有用的其他材料，包括其他药学可接受的配制溶液如缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器或其他递送装置。所述试剂盒还可以包含含佐剂的第三组分。
对于粘膜途径，可以包装所述组合物用于鼻内给药，如通过鼻用喷雾、鼻用滴剂、凝胶或粉末。参见，例如Almeida&Alpar,J.Drug Targeting(1996)3:455-467;Agarwal&Mishra,Indian J.Exp.Biol.(1999)37:6-16或在本领域熟知的吸入装置内给药。
所述试剂盒还可以包含包装说明书，其含有诱导免疫或治疗感染的方法的书面指导。所述包装说明书可以为还未批准的包装说明书草稿，或可以为食品和药物管理局(FDA)或其他监管机构批准的包装说明书。
本发明还提供已装满了本发明的免疫原性组合物的递送装置。
3.实验
以下为执行本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例仅用于说明目的，并且不试图以任何方式限制本发明的范围。
已进行了努力来确保所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但无疑会允许存在一些实验误差和偏差。
实施例1
包含H1和H3HA的重组病毒的产生
具有8个节段化的基因组的重组、嵌合型A型流感病毒按如下所详述制备。该病毒包含猪H1N1病毒的7个节段，其NA节段的大部分被侧翼为NA包装序列的H3HA编码区序列取代。因此，该病毒包含来自两种不同类型的猪流感的HAs——H1HA和H3HA。因为NA为病毒增殖所必需，通过使病毒在唾液酸酶(神经氨酸酶)存在下生长来提供NA的功能。
具体来说，为了产生携带两种不同HA分子的重组猪流感病毒，用来自H3N2A型流感病毒——A/Swine/Texas/4199-2/98(本文中称为“SIVTx98”)的H3HA节段取代了H1N1猪流感病毒——A/swine/Saskatchewan/18789/02(本文中称为“SIV SK02”，获自PrairieDiagnostic Services,加拿大萨斯喀彻温大学西部兽医学院(WesternCollege of Veterinary Medicine))(图1A)的NA节段。来源于SIV-Tx98的H3HA开放阅读框(ORF)侧翼为NA包装信号，该NA包装信号包含来自SIV-SK02(H1N1)病毒株的3’端的202nt(来自3’UTR的19nt和来自3’NA编码区的183nt)，和5’端的185nt(来自5’UTR的28nt和来自5’NA编码区的157nt)(图1B)。编码侧翼为NA包装信号的H3HA的质粒pHW-SIV-NA-H3HA通过修饰原始质粒pHW-SIV/SK-NA构建。简单地说，利用pHW-SIV/SK-NA作为模板，并采用以下引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增3’和5’端的NA节段特异性包装信号(分别为202nt和185nt)：扩增3’NA包装信号——采用5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID NO:21)和5’-GTCATTTCCGGGAAGTTTTTGCACCCAAGTATTGTTTTCGTAG-3’(SEQ ID NO:22)；扩增5’NA包装信号——采用5’-GCTGAAATCAGGATACAAAGATTGAGGCCTTGCTTCTGGGTTG-3’(SEQ ID NO:23)和5’-ACAGGTGTCCGTGTCGCG-3’(SEQ ID NO:24)。利用pHW-Tx98HA作为模板，并采用5’-CTACGAAAACAATACTTGGGTGCAAAAACTTCCCGGAAATGAC-3’(SEQ ID NO:25)和5’-CAACCCAGAAGCAAGGCCTCAATCTTTGTATCCTGATTTCAGC-3’(SEQ ID NO:26)作为引物，通过PCR扩增来自SIV/Tx98的H3HA胞外域(不包括信号肽序列)。通过重叠PCR将3段PCR产物连接在一起。最终，通过NaeI/NheI消化该PCR产物，并取代pHW-SIV/SK-NA相应的节段。对构建的质粒进行DNA测序以确保在重叠PCRs期间未引入另外的突变。
将该构建物插入克隆载体pHW2000(Hoffmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:6108-6113)来产生质粒606。克隆载体pHW2000含有225bp的人pol I启动子序列和33bp的鼠终止子序列，它们被两个BsmB1位点隔开。所述pol I启动子和终止子元件侧翼为截短了的人巨细胞病毒的极早期(immediate-early)启动子和编码牛生长激素的基因。
在10mU/ml的霍乱弧菌唾液酸酶存在下，将pHW2000载体与质粒606和包含来自SIV-SK02病毒株(如Masic et al.,J.Gen.Virol.(2009)90:375-385中所描述)的PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS节段的7种质粒共转染，这引起称为“SIV/SK-606或SIV-606”的重组、嵌合型病毒的成功回收。利用8质粒反向遗传学系统回收该SIV/H1H3SIV突变病毒，所述系统描述于Hoffmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:6108-6113中。简单地说，在6孔盘中以相同的密度(2.5×105细胞/孔)共培养293T和MDCK细胞，并于37℃、5%CO2下维持在含有10%FBS的DMEM中24hrs。转染前1小时，用新鲜Opti-MEM(Invitrogen)替换含有FBS的培养基。为了回收SIV/SK-606，通过Transit-LT1转染试剂(Mirus,Madison,Wisconsin)用8种质粒构建物(pHW-SIV/SK-PB2、pHW-SIV/SK-PB1、pHW-SIV/SK-PA、pHW-SIV/SK-HA、pHW-SIV/SK-NP、pHW-SIV-NA-H3HA、pHW-SIV/SK-M和pHW-SIV/SK-NS)转染细胞。6小时后，用1ml的新鲜Opti-MEM替换转染混合物。转染后24小时，将含0.4%BSA的1ml Opti-MEM、2μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶和10mU/ml霍乱弧菌神经氨酸酶(Sigma,N6514)加入至转染细胞。转染后96小时收集上清液。第三次连续传代后观察MDCK细胞上的致细胞病变效应(CPE)，并通过血凝试验确认病毒存在。实施例2
SIV/SK-606的表征
为了确认该重组病毒SIV/SK-606在其基因组中具有H1和H3HA节段，从纯化的病毒体分离出了病毒RNA。简单地说，通过超速离心收集组织培养物上生长的病毒，并使其经历蔗糖梯度离心(Masic et al.,J.Gen.Virol.(2009)90:375-385)。对于RNA纯化，按照生产商的指导用Trizol(Invitrogen)处理纯化的病毒体。利用特异性扩增病毒RNAs的Uni12引物(Hoffman et al.,Arch.Virol.(2001)146:2275-2289)进行反转录。通过利用H1特异性引物(Fw5'TGGCCAAACCATGAGACAAC3'(SEQ ID NO:27)和Bw5'GGCGTTATTCCTCAGTTGTG3'(SEQ ID NO:28))以及H3HAs特异性引物(Fw5’CGCAATCGCAGGTTTCATAG3’(SEQ ID NO:29)和Bw5’CAACCCAGAAGCAAGGCCTCAATCTTTGTATCCTGATTTCAGC3’(SEQ ID NO:30))进行PCR。
虽然代表H1HA节段的PCR产物仅在SK02和SIV-606基因组中检测到，但在Tx98和SIV-606病毒RNA提取物中观察到代表H3HA节段的PCR条带。这些数据证明SIV-606的基因组包含H1和H3HA节段。
为了检测是否两种HAs都得到表达，利用H1HA、H3HA和M1的特异性抗体对感染病毒的细胞裂解物进行Western印迹分析。简单地说，用野生型SIV/SK02、野生型SIV/Tx98或SIV-606以0.01的MOI感染MDCK细胞。感染后48小时，制备细胞裂解物，并利用H1HA(抗HA(A/California/06/2009)(H1N1)单克隆抗体,eEnzyme(Maryland,USA)、H3HA(抗多血凝素(H3N2)抗体,兔IgG,eEnzyme(Maryland,USA)和M1(Shin et al.,J Gen Virol(2007)88:942-950)的特异性抗体进行Western印迹分析。
在所有感染病毒的细胞中都检测到M1蛋白，然而，仅在感染SK02和SIV-606的细胞中见到H1HA，并且在Tx98和SIV-606样品中见到H3HA。总之，这些数据证明H3节段被整合到SIV-606的基因组中，并且两种HAs都得到表达。
为了观察重组病毒的形态，进行了负染透射电子显微镜观察。大多数的病毒体展现为约100nm直径的球形包膜的粒子，其类似野生型病毒的形态。
在MDCK细胞中研究了SIV-606的复制潜力。在唾液酸酶存在下，SIV-606形成与野生型病毒大小相似的噬斑。相反，SIV-606在无唾液酸酶下不能生长，表明重组病毒的复制依赖于唾液酸酶。还测定了SIV-606的生长潜力和动力。如图2所示，SIV-606在24h.p.i.时达到稳定水平，与野生型病毒一样。SIV-606生长至7x106PFU/ml的滴度，比野生型病毒低约1log。这些结果表明尽管SIV-606具有稍低的滴度，其在细胞培养物中生长至相对高的滴度，这使得病毒能够增殖。
实施例3
SIV-606在猪内的致病性
在猪体内评估了SIV-606的致病性。35只4周龄的SIV阴性猪被随机分成7组，每组5只猪。用含1x105或1x106PFU/ml SK02WT、SIV-606或Tx98的4ml MEM经气管内感染这些猪。对照组内的动物仅用培养基模拟感染(表1)。每天监测直肠温度。感染后第5天，将猪安乐死，并进行尸体剖检。如图3A-3C中所示，感染野生型病毒的猪在感染后第1天具有增加的体温，并且体温在随后逐渐降低。然而，感染了SIV-606的猪相比对照组未显示升高的体温。尸体剖检时，记录肉眼可见的肺组织病变。模拟的、SIV-606高剂量和低剂量感染的猪未显示任何典型的肉眼可见的肺组织病变。相比之下，在感染了高和低剂量SK02和Tx98的猪的心叶内观察到特征为紫色至紫红色实变区的总病变。与这些结果一致，可从感染了低和高剂量SK02的所有动物的肺组织重新获得中值滴度分别为2.4x104PFU/ml和2.6x104PFU/ml的SK02野生型病毒。类似地，可从低和高剂量组中感染了Tx98病毒的所有猪的肺组织分离中值滴度分别为1x104PFU/ml和3.4x104PFU/ml的野生型病毒。然而，仅从低剂量组的1只猪和高剂量组的3只猪检测到非常低滴度(中值滴度分别为0和20PFU/ml)的SIV-606病毒。这些结果证明SIV-606病毒在猪体内为高度减毒的，并因此可以用作活的、减毒的猪流感疫苗。
表1.病毒感染的猪分配、剂量和途径
实施例4
猪体内SIV-606的防护效应
为了确定SIV-606是否具有免疫原性，以及是否能提供针对SIV感染的防护，在猪体内进行了以下接种和病毒攻击研究。23只H1N1和H3N2血清阴性猪被随机分成5组(n=5,除了第5组中n=3外)(表2)。两组猪被给予MEM，且两组猪被经气管内接种4×106PFU的SIV-606病毒。猪在第21天接受第二次接种。第二次接种后10天(第31天)，用SIV/SK02或SIV/Tx98经气管内对猪进行攻击，并在感染后第5天将其安乐死。于第一次接种前，在第一次接种后21天和第二次接种后10天(病毒攻击前)收集血清。在第0天、第21天和第31天测量抗原特异性血清IgG和鼻IgA。
第一次接种后，血清中的SIV/SK02特异性IgG显著增加，并在第31天测量到第二剂量的SIV-606加强了IgG反应(图14A)。针对SIV/Tx98或异源H1N1Halifax210病毒株(在2009年流行病期间分离)的血清IgG，在一次接种后略微增加，且在第二次接种后显著增加(图14B和14C)。
为了评估上呼吸道和下呼吸道的粘膜表面处H1N1和H3N2流感病毒的特异性IgA抗体的存在，从所有组的猪收集了鼻拭样和支气管肺泡灌洗液(BALF)样品，并通过ELISA测试。SIV-606的第一次接种诱导鼻分泌物中中等的IgA水平，且第二次接种加强了SIV/SK02、SIV/Tx98和Halifax210的特异性IgA诱导(图15A、15B和15C)。类似地，BALF中的IgA滴度在第一次接种后维持低水平，并在第二次接种后显著增高(图16A、16B和16C)。
在第31天病毒攻击后，每天测量直肠温度，测量5天直至尸体剖检。感染后第一天，用MEM接种并用SIV/SK02攻击的猪开始发烧，平均直肠温度为40.9℃。相比之下，用SIV-606接种并用SIV/SK02攻击的猪在这5天内具有39.1℃至39.6℃的正常体温(图17A)。类似地，接种了MEM并用Tx98攻击的猪的体温在感染后第1天升至40.1℃，然后在第二天降至39.6℃，并在感染后第5天回复至39.3℃。在接种了SIV-606并用Tx98攻击的猪体内未见到发烧(图17B)。在感染后5天期间，该组的体温在39.2℃至39.7℃间波动。
尸体剖检时，检测了SIV诱导的总肺组织病变，并通过病变与总肺面积相比所占的表面百分比打分(图18A)。未接种组并用SIV/SK02或SIV/Tx98攻击的所有猪都显示SIV典型总病变，其显示为主要在尖叶和心叶中所见的深紫色实变区的清晰界线。这两组的平均分值分别为8.6和14.6。相比之下，接种了SIV-606并用SIV/SK02或SIV/Tx98攻击的猪的肺没有总肺组织病变。
为了测量肺内的病毒荷载(图18B)，在尸体剖检时收集了来自右尖叶、心叶和膈叶的组织。在来自未接种并用SIV/SK02攻击的组内的所有猪的肺组织中均检测到病毒(平均病毒滴度为1.90×104PFU/克)。在未接种并用SIV/Tx98攻击的组内，仅从1只猪分离到病毒。在接种了SIV-606并用SIV攻击的猪的肺组织中未检测到病毒。
利用尸体剖检中采自右尖叶、心叶和膈叶的肺组织样品检测了组织病理学病变。如图19B和19D所示，在未接种并用病毒攻击的组的肺组织中观察到病理学病变。组织病理学病变包括由于细支气管上皮坏死引起的支气管上皮减少、弥补细支气管上皮坏死的细支气管上皮肥大和增生、中性粒细胞浸润穿过粘膜并进入细支气管内腔、细支气管周和血管周的淋巴细胞浸润、间质增厚和细支气管相关的淋巴组织的增生。相比之下，在接种SIV-606并受到攻击的组的肺组织中未观察到组织病理学变化(图19C和19E)。两个SIV-606接种的组都维持健康的细支气管上皮和蜂窝结构，其具有轻微的间质增厚，这类似于未接种其未攻击的组中所示的组织(图19A)。
表2.病毒攻击的猪分配
Figure BDA0000470047880000411
因此，本文公开了重组、嵌合型流感病毒，以及用于治疗和预防流感的组合物和方法。尽管相当详细地描述了本发明优选的实施方案，应当理解可以在不脱离所附权利要求确定的本发明的精神和范围的情况下进行明显的改变。
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Claims (29)

1.一种重组、嵌合型猪流感病毒，其包含来自多于一种流感亚型的多于一个血凝素(HA)节段(节段5)，其中所述病毒包含来自第一流感亚型的节段1-5、7和8以及来自第二流感亚型的第二节段5，并且其中所述第一流感亚型的神经氨酸酶(NA)节段(节段6)的全部或部分缺失，使其成为减毒病毒。
2.如权利要求1所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述第二节段5包含来自所述第一流感亚型的NA包装序列，所述NA包装序列位于所述第二节段5的3’端以及任选地5’端。
3.如权利要求2所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述NA包装序列包含来自3’NA UTR和3’NA编码序列的3’NA包装序列，以及任选地，来自5’NA UTR和5’NA编码序列的5’NA包装序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述流感病毒来源于A型流感病毒。
5.如权利要求4所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述流感病毒包含来自H1N1亚型的HA节段和来自H3N2亚型的HA节段。
6.如前述权利要求中任一项所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述第一流感亚型为H1N1。
7.如权利要求6所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述H1N1亚型为A/swine/Saskatchewan/18789/02。
8.如前述权利要求中任一项所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述第二流感亚型为H3N2。
9.如权利要求8所述的重组、嵌合型猪流感病毒，其中所述H3N2亚型为A/Swine/Texas/4199-2/98。
10.一种减毒、重组猪流感病毒，其包含来自H1N1流感亚型的节段1-5、7和8以及来自H3N2流感亚型的节段5，其中来自所述H1N1流感亚型的节段6的全部或部分缺失，其中所述H3N2节段5侧翼为来自所述H1N1亚型的NA包装序列，其中所述包装序列包含来自3’NA UTR和3’NA编码序列的3’NA包装序列以及来自5’NA UTR和5’NA编码序列的5’NA包装序列。
11.如权利要求10所述的减毒、重组猪流感病毒，其中所述H1N1亚型为A/swine/Saskatchewan/18789/02，并且所述H3N2亚型为A/Swine/Texas/4199-2/98。
12.一种组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的重组病毒以及药学可接受的赋形剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其进一步包含佐剂。
14.诱发脊椎动物个体体内免疫反应的方法，包括给予所述个体权利要求12或13所述的组合物。
15.治疗或预防脊椎动物个体体内流感感染的方法，包括给予所述个体治疗有效量的权利要求12或13所述的组合物。
16.针对流感病毒给个体接种的方法，包括给予所述个体有效量的权利要求12或13所述的组合物。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述个体为猪个体。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述流感病毒为猪流感病毒。
19.一种重组构建物，其包含
(a)猪流感H3N2亚型HA节段；和
(b)猪流感H1N1亚型NA包装序列，其位于所述H3N2HA节段的3’端以及任选地5’端。
20.如权利要求19所述的重组构建物，其中所述H3N2HA节段侧翼为H1N1NA包装序列，该包装序列包含来自3’NA UTR和3’NA编码序列的3’NA包装序列以及来自5’NA UTR和5’NA编码序列的5’NA包装序列。
21.如权利要求20所述的重组构建物，其中所述H1N1亚型为A/swine/Saskatchewan/18789/02，并且所述H3N2亚型为A/Swine/Texas/4199-2/98。
22.制备重组、嵌合型流感病毒的方法，包括用以下物质转染宿主细胞：(a)包含来自H1N1流感亚型的节段1-5、7和8的单独的质粒；和(b)权利要求19-21中任一项所述的重组构建物，以及在引起所述重组、嵌合型流感病毒产生的条件下培养所述宿主细胞。
23.用以下物质转化的细胞：(a)包含来自H1N1流感亚型的节段1-5、7和8的单独的质粒；和(b)权利要求19-21中任一项所述的重组构建物。
24.制备组合物的方法，包括将权利要求1-11中任一项所述的重组、嵌合型猪流感病毒与药学可接受的赋形剂组合。
25.制备流感疫苗的方法，包括：
(a)使权利要求1-11中任一项所述的重组、嵌合型猪流感病毒增殖；
(b)纯化所述病毒；和
(c)将纯化的病毒与药学可接受的赋形剂组合。
26.一种试剂盒，其包含权利要求1-11中任一项所述的重组病毒或者权利要求12和13所述的组合物的一个或多个容器。
27.权利要求12或13所述的组合物在诱发脊椎动物个体体内免疫反应的方法中的用途。
28.权利要求12或13所述的组合物在治疗或预防脊椎动物个体体内流感感染的方法中的用途。
29.权利要求12或13所述的组合物在针对流感病毒给个体接种的方法中的用途。
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