CN103717201A - Cb1受体拮抗剂作为角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及至少一种CB1受体拮抗剂作为角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的非治疗性化妆用途。其还涉及用于治疗色素沉着过度症的CB1受体拮抗剂。其还涉及用于美白皮肤和/或黏膜的非治疗性化妆方法，包括将CB1受体拮抗剂口服施用或局部应用到皮肤和/或黏膜上的步骤，还涉及选择角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的方法。

Description

CB1受体拮抗剂作为角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的用途

本发明涉及CB1受体拮抗剂在用于皮肤和/或体毛和/或头发的漂白和/或脱色的组合物中的化妆和/或皮肤病学用途。

人的头发与皮肤的颜色取决于许多因素，特别是季节、种族血缘、性别和年龄。其主要由角质形成细胞中黑色素细胞所产生的黑色素的浓度来决定。黑色素细胞是特化细胞，其通过特定的细胞器——黑素体——合成黑色素。这种黑色素合成，或黑色素生成，是α-MSH（α-促黑激素）与其受体MC1R之间相互作用的结果，这种相互作用激活了通过MITF转录因子诱导酪氨酸酶的信号级联放大。

黑色素生成是特别复杂的，并且示意性地包括下列主要步骤：

酪氨酸 → 多巴 → 多巴醌 → 多巴色素 → 黑色素

酪氨酸酶（单酚二羟基苯丙氨酸：氧氧化还原酶/EC 1.14.18.1）是参与该反应序列的必需酶。特别地，它催化酪氨酸的转化反应以获得多巴（二羟基苯丙氨酸）和多巴的转化反应以获得多巴醌。

在表皮中，黑色素细胞包括在表皮黑色素单位中，该表皮黑色素单位包含被大约36个相邻的角质形成细胞包围的黑色素细胞。所有个体在没有光类型区别的情况下对给定皮肤面积具有大致相同数量的黑色素细胞。在色素沉着方面，种族差异并非由于黑色素细胞的数量，而是由于他们的黑素体的性质。黑素体聚集成复合体并具有小尺寸。它们是高度特化的细胞器，其唯一的功能是制造黑色素。它们产生于称为前黑素体的球形囊泡形式的内质网。前黑素体含有无定形的蛋白质底物，但是不含有黑素原性酶。在前黑素体成熟过程中，该无定形底物组织化为沿黑素体纵向轴取向的原纤结构。黑素体的四个发展阶段是有区别的，对应于黑化的强度。黑色素均匀地沉积在黑素体的内部原纤网络上，并且细胞器的不透明度增加直到发生饱和。当黑色素在黑素体中合成时，后者从核周区域移动到黑色素细胞树突的末端。借助于吞噬作用，树突末端被角质形成细胞占据，膜被降解，并且黑素体在角质形成细胞中重新分布。

在他们生命的不同时期，一些人证明在皮肤上，更特别在手上出现了更深和/或更高度着色的瘢点，这使得皮肤呈现不均匀的外观。这些瘢点特别是由于位于皮肤表面的角质形成细胞中的高浓度的黑色素。

为了治疗色素瘢点，非常特别地寻求使用高度有效的无害局部脱色物质。

熊果苷、烟酰胺和曲酸已知作为用于皮肤脱色的药剂。

尽管认为不存在不依赖于α-MSH和MC1R的其它黑色素生成途径，申请人令人惊讶地发现，活化CB1大麻素受体能够刺激黑色素生成，并且CB1大麻素受体拮抗剂具有阻止该受体的天然配体（内源性大麻素）具有黑色素生成刺激效果的性质。换句话说，申请人已经能够证明CB1大麻素受体拮抗剂抑制了这种受体的天然配体的促着色效果。CB1受体拮抗剂由此能够抑制黑色素的生物合成。

该CB1和CB2受体属于G蛋白耦联跨膜受体超家族。该CB1受体通过存在于6号染色体上的CNR1基因编码。内源性大麻素是活性类脂，其已知是这些CB1和CB2受体的配体。主要的内源性大麻素之一是花生四烯酸乙醇胺或AEA（N-花生四烯酰乙醇胺）。AEA的该合成依赖于N-酰基磷脂酰乙醇胺（NAPE）-特异性磷脂酶D（NAPE-PLD）酶，而其降解经通过FAAH（脂肪酸酰胺水解酶）酶的水解反应而发生。甲基花生四烯酸乙醇胺或mAEA（R(+)-花生四烯酰基-1’-羟基-2’-丙基酰胺）是AEA的不可水解的类似物，并且与AEA类似，它是CB1、CB2和TRPV1受体激动剂配体。内源性大麻素进入该细胞是可饱和的和能量依赖性的，并且它经内源性大麻素膜转运蛋白（EMT）而发生。

AEA和与该化合物结合、输送该化合物、合成该化合物并水解该化合物的蛋白质是内源性大麻素系统（ECS）的一部分。已经在人类和小鼠中在大量皮肤和相关结构的细胞类型（如表皮角质形成细胞、真皮肥大细胞、皮脂腺细胞和毛囊的上皮细胞）中识别出内源性大麻素（Maccarrone等人, J Biol Chem, 2003；Dobrosi等人, FASEB J, 2008）。已经表明，ECS的组分控制皮肤细胞的增殖、分化、凋亡和细胞因子产生，这表明该系统在表皮稳态中有作用。此外，在皮肤中激动剂配体如AEA结合到大麻素受体导致炎症过程中的减少，而拮抗剂恶化炎症皮肤发作，如过敏性皮炎类型的病理学病况。

已知某些CB1受体拮抗剂能够减少食物摄入或降低肥胖个体的体重（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 453-457），或能够有助于戒烟（J Pharmacol Exp Ther. 2005 Mar;312(3):875-83）。然而，从未如本发明中将这些化合物描述为作用于黑色素细胞或能够在黑色素产生中具有效果。

Magina等人（Arch Dermatol Res. 2011）描述了在将角质形成细胞和黑色素细胞的共培养物暴露在UV辐射下之后抑制黑色素生成。这些共培养物中使用的黑色素细胞是特别的，因为在这种情况下它们是人黑素瘤细胞，即癌细胞。作者提出了以下假设：对黑色素生成的这种效果是由于角质形成细胞分泌的内源性大麻素介体的作用并作用于周围的黑色素细胞。但是，在该文献中并未提到使用CB1受体拮抗剂能够抑制黑色素生成。

由此，本发明的主题是至少一种CB1受体拮抗剂作为角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的非治疗性化妆用途。

根据本发明，CB1受体拮抗剂是抵制这种受体的活化，并且特别抵制用这种受体的天然配体（特别是内源性大麻素如花生四烯酸乙醇胺）获得的生物应答的诱导的任何简单或复杂的天然或合成来源的物质或化合物。CB1受体拮抗剂由此可以通过以下方式起作用：通过结合到存在于人体中特别是皮肤中的CB1大麻素受体上，和通过抵制其活化（随后可以使用术语CB1受体拮抗剂配体），或通过降解这种受体的天然配体，或通过减少或抑制这种配体的内源性合成或释放（随后可以使用术语CB1受体的功能性拮抗剂）。在这种情况下，CB1拮抗剂将阻止内源性大麻素如花生四烯酸乙醇胺或某些其类似物，例如mAEA或ACEA（花生四烯酰基-2’-氯乙基酰胺）诱导生物应答。

对本发明的目的而言，“抵制”受体的活化或生物应答的诱导的物质或化合物是降低或部分或完全抑制这种活化或这种诱导的物质或化合物。

优选地，本发明的CB1受体拮抗剂是CB1受体拮抗剂配体或CB1受体的功能性拮抗剂。

可以使用本领域技术人员已知的任何方法，特别是使用与所述化合物或所述物质的功能活性测量联合的测量选择性受体亲和力（称为“结合”法）的方法（特别参见J. Med. Chem. 2007, 50, 3851-3856），或使用受控释放内源性大麻素的方法（称为“释放”法）来评价简单或复杂物质或化合物的CB1受体拮抗剂性质。

术语“角蛋白材料”意在指（面部的、身体的、头部的）皮肤和黏膜、头发、睫毛、眉毛和指甲。术语“角蛋白材料”优选意在指皮肤和/或黏膜。

术语“美白剂”意在指能够美白角蛋白材料和/或减少角蛋白材料的色素沉着的任何物质或化合物。

术语“抗褐变剂”意在指能够防止或减少角蛋白材料的自然着色，即“基础”自然着色或自然事件（暴露于UV辐射、慢性老化等等）诱发的自然着色的任何物质或化合物。

术语“自然着色”意在指暴露于阳光或暴露于UVA和/或UVB辐射导致的皮肤着色或色素沉着。

如上定义的CB1受体拮抗剂优选选自5-(4-氯苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-N-(哌啶-1-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺（也已知为名称SR1、SR141716或利莫那班，或为CAS号158681-13-1，并特别由Sigma Aldrich公司销售，或由Sanofi Aventis公司以商品名Acomplia™或Zimulti™销售），TM38837（由7TM Pharma公司开发），1-(2,4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-N-(1-哌啶基)吡唑-3-甲酰胺（以编号AM251和CAS号183232-66-8已知），4S-(-)-3-(4-氯苯基)-N-甲基-N’-[(4-氯苯基)磺酰基]-4-苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-1-甲脒（carboxamidine）（以名称伊必那班、编号SLV319与BMS-646,256和CAS号464213-10-3已知），4-[6-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1-苯并呋喃-3-羰基]苯甲腈（以编码LY-320,135和CAS号176977-56-3已知并由Eli Lilly公司开发），N-((2S,3S)-3-(3-氰基苯基)-4-(4-乙氧基苯基)丁-2-基)-2-甲基-2-(5-甲基吡啶-2-基氧基)丙酰胺（以编号MK-9470和CAS号945850-36-2已知），8-氯-1-(2,4-二氯苯基)-1,4,5,6-四氢-N-1-哌啶基苯并[6,7]环庚[1,2-c]吡唑-3-甲酰胺（以编号NESS-0327和CAS号494844-07-4已知），5-(4-溴苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-乙基-N-(1-哌啶基)-1H-吡唑-3-甲酰胺（以名称溴乙那班或SR147778和CAS号288104-79-0已知并由Sanofi Aventis公司开发），N-[(1S,2S)-3-(4-氯苯基)-2- (3-氰基苯基)-1-甲基丙基]-2-甲基-2-((5-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)丙酰胺（以名称泰伦那班或MK-0364和CAS号701977-09-5已知并由Merck公司发现）和5-(4-氯苯基)-3-[(E)-2-环己基乙烯基]-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-1H-吡唑（以名称VCHSR已知）。

所有这些化合物是已知的CB1受体拮抗剂（特别参见以下文献：J Med Chem 1999, 42:769-776；Journal of medicinal chemistry 47 (3):627–43；Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 1998, 284(1):291-7；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (23):9800–5；Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2003, 306(1):363-70；Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2004 Sep, 310(3):905-14和Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2007, 321(3):1013-22）。

皮肤的亮白或美白或其色素沉着的减少可以直观评估或使用皮肤或头发的着色的物理测量方法评估，该方法是本领域技术人员公知的（特别是使用比色测量系统(L*，a*，b*)）。

如上定义的CB1受体拮抗剂可以以相对于该组合物总重量的0.00001重量%至10重量%、优选0.001重量%至5重量%且特别为0.01重量%至1重量%的浓度存在于组合物中。

优选地，如上定义的CB1受体拮抗剂用作皮肤和/或黏膜的美白剂和/或用作减少皮肤和/或黏膜的色素沉着和/或抑制黑色素生成的药剂，优选通过CB1受体的失活或通过降解它们的天然配体。

本发明还涉及其用于治疗色素沉着过度症的如上定义的CB1受体拮抗剂，所述色素沉着过度症选自黑斑病、褐黄斑、小痣、衰老性着色斑、雀斑、擦伤和/或烧伤和/或瘢痕和/或皮炎和/或接触过敏导致的炎症后色素沉着过度；痣，遗传决定的色素沉着过度，代谢或药物相关来源的色素沉着过度，以及黑素瘤。

术语“治疗”是指预防、降低或减少。

衰老性着色斑，也称为光化或日光性着色斑、老年斑或老人斑或通常还称为“老年角质瘤”、“墓地雏菊”或“墓地之花”，是迄今为止最常见的色素性病变。其存在随着个体年龄而加剧，并且其本身相当特别地在已经曝光的皮肤区域上显现，如面部、手背、上肢且特别为前臂的背面，背部，特别是上背部。

有利地，本发明的用途特别能够通过在均匀分布的意义上调节并规范黑色素细胞在真皮-表皮基底层中的分布来消除衰老性着色斑。

黑斑病（或褐黄斑）由几乎总是对称地在前额上、在面颊上和在上唇上延伸的色素沉着层组成。其覆盖颧骨并有时覆盖太阳穴，但通常远离鼻子末端、眼睑和下巴。小扁豆状斑通常散布在主层之间。其通过暴露于阳光而加剧，并有时通过暴露于阳光而被触发。

色素沉着过度症也包括在炎症后的色素沉着过度的情况。炎症后色素沉着过度相当独立于炎症的程度，并更多地取决于造成该炎症的创伤的性质。在某些病变，如热烧伤后，炎症后色素沉着过度可能是严重的。炎症后色素沉着过度可以持续数月，或甚至数年。

用于本发明的用途的组合物特别适合于局部应用或适合于口服施用并另外含有生理学上可接受的介质。本发明的CB1受体拮抗剂，单独或以混合物形式，以及包含它们的组合物，可以通过局部应用到角蛋白材料上或通过口服施用来使用。该组合物特别是化妆组合物或皮肤病学组合物。

术语“适合于局部应用”或“适合于口服施用”分别意在指“适于局部应用”或“适于口服施用”。

根据本发明，术语“生理学上可接受的介质”意在指化妆品上或药学上可接受的介质，该介质与皮肤（包括头皮）、头发、黏膜和/或眼睛相容。

术语“化妆品上可接受的介质”意在指不具有令人不快的气味或外观且在局部应用到皮肤或皮肤附件时不会导致使用者产生任何不可接受的刺痛、紧绷或发红的介质。

生理学上可接受的介质将适于将该组合物应用到其上的载体的性质，并还适于意在将该组合物包装于其中的形式，特别是在环境温度和大气压下的固体或流体。

该组合物还可以包括所有的常用化妆品添加剂，如水、溶剂、油、蜡、颜料、填料、表面活性剂、化妆或皮肤病学活性剂、UV遮光剂、聚合物、胶凝剂、防腐剂和香料。

自不必说，本领域技术人员将小心地选择这种或这些任选的附加化合物和/或其量，以使得本发明的化合物的有利性质不会或基本不会受所设想的添加的不利影响。

本发明的组合物可以具有化妆品和皮肤病学领域中通常使用的所有剂型；其特别可以是水、水-醇或油性溶液（其任选被凝胶化）的形式，任选包含两相的洗剂类分散体的形式，水包油或油包水或多相乳液的形式，水性或油性凝胶的形式，液体、糊状或固体无水产物的形式，使用球粒的在水相中的油分散体的形式，这些球粒可能是聚合纳米粒子，如纳米小球或纳米胶囊，或更好为离子和/或非离子类型的类脂囊泡。

本发明的另一主题是用于美白皮肤和/或黏膜的非治疗性化妆方法，包括将包含在生理学上可接受介质中的如上定义的CB1受体拮抗剂的组合物局部应用到皮肤和/或黏膜上，或口服施用。

优选地，该方法是用于将皮肤和/或黏膜脱色的方法。

在该方法中，该CB1受体拮抗剂可以以相对于该组合物总重量的0.00001重量%至10重量%、优选0.001重量%至5重量%且特别为0.01重量%至1重量%的浓度存在。

该化妆方法可以包括单次应用或施用。根据另一个特定实施方案，该应用或施用在一天或更长时间，并通常在适当情况下具有一个或多个中断期的至少4周，或甚至4至15周的延长时期内每天重复2至3次。

本发明的另一主题是选择角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的方法，包括：

a）预先选择CB1受体拮抗剂的步骤，

b）当与所述拮抗剂接触的黑色素细胞所产生的黑色素的量显著小于或等于没有与这种CB1受体拮抗剂接触的黑色素细胞所产生黑色素量时，最终选择作为美白和/或抗褐变剂的CB受体拮抗剂的步骤。

“CB1受体拮抗剂”如上定义。

可以使用本领域技术人员已知的任何方法，特别是使用与所述化合物或所述物质的功能活性测量联合的测量选择性受体亲和力（称为“结合”法）的方法（特别参见J. Med. Chem. 2007, 50, 3851-3856），或使用受控释放内源性大麻素的方法（称为“释放”法）来评价产品的CB1受体拮抗剂性质。

选择性受体亲和力测量可以通过以下方法进行：令CB1受体（或包含这些受体的细胞膜）与标记的配体（例如放射性标记的、免疫荧光的等等的配体）接触，除去没有结合到受体的标记配体并测定已结合到受体的标记配体的量。

为证实其CB1受体拮抗剂性质的化合物或物质的功能活性测量可以通过以下方法进行：加入福斯高林和所述化合物或所述物质后，测量细胞培养物（即黑色素细胞的培养物或黑色素细胞与角质形成细胞的共培养物或色素沉着的重建表皮或皮肤外植体）所产生的环状AMP（cAMP）的量。如果在加入该化合物或该物质后没有观察到cAMP的量增加，那么可以确认其CB1受体拮抗剂性质。环状AMP事实上是一种已知化合物，其合成在CB1受体活化后被抑制。已知福斯高林提高cAMP合成。

内源性大麻素的受控释放的方法将通过以下方法进行：令化合物或物质与细胞培养物（即黑色素细胞的培养物或黑色素细胞与角质形成细胞的共培养物或色素沉着的重建表皮或皮肤外植体）接触，并测量产生的内源性大麻素的量。

在步骤b）中，可以对黑色素细胞的培养物或对黑色素细胞与角质形成细胞的共培养物或对色素沉着的重建表皮或对皮肤外植体测量黑色素细胞所产生的黑色素的量。在步骤b）中，可以向这些细胞培养物的任意一种中以预定浓度添加步骤a）中预先选择的CB1受体拮抗剂，并测量存在于这些培养物中的黑色素细胞所产生的黑色素的量。对未添加CB1受体拮抗剂的这些细胞培养物的任意一种进行受控测量。

任选地，在步骤b）中，在测量黑色素细胞所产生的黑色素的量之前，可以对上面提到的细胞培养物施以应激，特别是暴露于UVA和/或UVB辐射。

选择方法的步骤b）中作为角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的CB1受体拮抗剂的最终选择可以通过以下方法进行：将与所述CB1拮抗剂接触的黑色素细胞所产生的黑色素的量与没有与所述CB1受体拮抗剂接触的黑色素细胞所产生的黑色素的量进行比较。如果降低了没有与所述CB1受体拮抗剂接触的黑色素细胞所产生的黑色素的量至少10%、优选至少20%和甚至更优选至少30%，则该CB1受体拮抗剂由此可选择作为减少角蛋白材料的色素沉着的活性剂。

单独培养黑色素细胞或与角质形成细胞共同培养黑色素细胞的条件以及制备色素沉着重建表皮的方法（特别参见EP 1 878 790）是本领域技术人员已知的。

根据本领域技术人员已知的方法进行测量由黑色素细胞，任选与角质形成细胞共培养的或存在于色素沉着重建表皮中的黑色素细胞所产生的黑色素的量（参见例如Xiao等人, Arch Dermatol Res 2007; 299: 245-57）。优选地，通过分光光度法且甚至更优选通过在450 nm下的分光光度法进行这种测量。

该选择方法能够特异性选择能够用作用于皮肤和/或体毛和/或头发的美白或脱色的药剂的化合物或物质。这些产品具有通过使CB1受体失活来抑制或减少皮肤和/或体毛和/或头发的黑色素生成或色素沉着的特性。

在该说明书和在下面的实施例中，除非另行提到，百分数是重量百分数，写作“……至……”形式的数值范围包括所述上限与下限。在成形前，以本领域技术人员容易确定的次序和在本领域技术人员容易确定的条件下将各成分混合。

附图图例：

图1：通过在未辐射的PREs上以0.1至0.5 µM系统应用来评价溶解在DMSO中的SR141716（利莫那班）。该评价与安慰剂（DMSO）相比进行，并与参比的脱色活化剂lucinol比较。

图2：通过在UV辐射过的PREs上以0.1至0.5 µM系统应用来评价溶解在DMSO中的SR141716（利莫那班）。该评价与安慰剂（DMSO）相比进行，并与参比的脱色活化剂lucinol比较。

实施例1：CB1受体拮抗剂的脱色效果的证明

　 1 ．材料与方法

　 1.1. 受试化合物

花生四烯酸乙醇胺（AEA）和甲基花生四烯酸乙醇胺（mAEA）由Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）提供。

　 1.2. 所用试剂

化合物SR1 = N-哌啶基-5-(4-氯苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-3-吡唑甲酰胺（特异性CB1受体拮抗剂）由Sanofi-Aventis Recherche（Montpellier, France）提供。

　 1.3. 细胞培养和处理

将从包皮分离并由Promocell（Heidelberg, Germany）提供的正常人表皮黑色素细胞（NHEMs）在适当的培养基M2（Promocell）中在5% CO₂下在潮湿气氛中在37℃下培养24小时。

将AEA和其它化合物直接添加到培养基中。每次处理后二十四小时，使用台盼蓝染料排除法测量细胞活力（Maccarone等人, 2003）。

该mAEA和AEA以1 µM的浓度体外试验并比较。当与0.1 µM的SR1结合使用时，该mAEA也以此浓度使用。

　 1.4. 测定黑色素细胞的黑色素含量

根据本领域技术人员已知的方法测量存在于NHEM细胞中的黑色素的量（Xiao等人, Arch Dermatol Res 2007; 299: 245-57）。根据这种方法，将该NHEM细胞用胰蛋白酶处理并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。该样品随后再次悬浮在200微升的MilliQ水中并加入1毫升乙醇:乙醚混合物（1:1，体积/体积）以除去除黑色素之外的不透明物质。15分钟后，将样品在600 g下离心5分钟。将沉淀空气干燥并溶解在200微升1 N的氢氧化钠中。样品随后在80℃下加热一小时并冷却。

使用Sigma Chemical Co.提供的标准黑色素对照以验证试验的线性范围，通过450 nm下的分光光度法测定黑色素的量。相对于对照表示黑色素的量。

　 1.5. 统计分析

给出的结果是各自一式三份进行的3次独立试验的平均值（具有其标准偏差）。它们通过方差分析来比较（ANOVA）。

　 2 ．结果

　 2.1. 受试化合物的脱色效果的证明

。

通过CB1受体，花生四烯酸乙醇胺及其类似物mAEA显著提高了黑色素细胞（NHEMs）中黑色素的量。

使用SR1（一种已知的CB1受体拮抗剂）防止了mAEA具备其促着色效果并因此能够抑制该皮肤的色素沉着。

　 2.2. 结论

鉴于这些结果，化合物SR1因此可用作皮肤的美白或抗褐变剂。

实施例 2 ：化妆组合物

脱色或美白霜

成分	量 ( 以克计 )
		SR1	5.00
鲸蜡硬脂醇聚醚30	7.00
		硬脂酸甘油酯	2.00
鲸蜡醇	1.50
		聚二甲基硅氧烷	1.50
液体石蜡	15.00
		甘油	20.00
防腐剂	适量
		软化水	适量100.00克

在将该霜剂应用到皮肤上之后，观察到皮肤色素沉着减少。

实施例 3 ：在色素沉着重建表皮（ PREs ）上的脱色效果的评价

使用正常人黑色素细胞和角质形成细胞在胶原载体（BPER [重建表皮的生物敷料]）上重建色素沉着表皮。

在重建8天后获得该表皮；选择的黑色素细胞具有预计的光类型IV.1。

一些表皮每天用安慰剂处理，其它用不同浓度（0.1 µM和0.5 µM）的试验产物SR141716处理。

在两种浓度下与其单独溶剂（安慰剂）并与500 μM下的参照脱色活性剂lucinol比较来评价试验产物。

由此处理的重建表皮任选用UV辐射照射。

各试验条件一式四份进行。

对HES染色后的组织切片评价处理后的表皮的组织学品质，以确定该处理对表皮的影响。并且，研究了黑色素细胞的生理学以检测任何黑色素-细胞毒性。如果没有注意到组织学变化或产品的任何黑色素毒性效应，通过图像分析量化组织切片上的黑色素，由此对脱色进行量化。

结果分析

随后进行通过黑色素的显微量化的脱色的量化，并能够描述试验化合物的促着色活性。

在组织切片上将存在于表皮中的黑色素染色（Fontana Masson染色）并随后通过图像分析量化。为此，使用显微镜在其整个宽度上拍摄各表皮。每块表皮获得大约10张照片（白光，放大20倍）。

使用定制设计的图像分析软件对黑色素占据的面积进行量化。简而言之，根据其颜色将每个图像划分为4个区域（管腔（lumen）、角质层、活表皮和BPER）。将存在于该表皮中黑色颗粒形式的黑色素的阈值定为从红色角度看表皮的最暗区域。随后量化整个表皮或活层中黑色素所占据的像素。

这种量化考虑到了被黑色素占据的面积以及表皮中黑色素的平均定位。

将下面的结果表示为对于在标准共培养基中培养的对照的百分比相对刺激。

没有UV辐射：

受试化合物	%	值
			DMSO 1/1000 SYST D17	100	10.5263158
Lucinol 30 µM SYST D17	10.5263158	1.31578947
			SR141716 0.1 µM SYST D17	64.4736842	6.57894737
SR141716 0.5 µM SYST D17	72.3684211	5.26315789

表1。

结果显示在图1中。

观察到SR141716以剂量依赖方式在色素沉着重建表皮中诱导了黑色素产生的大量减少。

采用UV辐射：

受试化合物	%	值
			DMSO 1/1000 SYST D15	100	10.6382979
DMSO 1/1000 150 mJ/cm² UVB SYST D15	131.914894	12.7659574
			Lucinol 50 µM 150 mJ/cm² UVB SYST D15	31.9148936	4.25531915
SR141716 0.1 µM 150 mJ/cm² UVB SYST D15	76.5957447	8.5106383
			SR141716 0.5 µM 150 mJ/cm² UVB SYST D15	55.3191489	8.5106383

表2。

结果显示在图2中。

观察到SR141716以剂量依赖方式在色素沉着重建表皮中诱导了黑色素产生的大量减少。

Claims (9)

1.至少一种CB1受体拮抗剂作为角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的非治疗性化妆用途。

2.前述权利要求中所要求保护的用途，其特征在于所述拮抗剂选自5-(4-氯苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-N-(哌啶-1-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺、1-(2,4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-N-(1-哌啶基)吡唑-3-甲酰胺、4S-(-)-3-(4-氯苯基)-N-甲基-N'-[(4-氯苯基)磺酰基]-4-苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-1-甲脒、4-[6-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1-苯并呋喃-3-羰基]苯甲腈、N-((2S,3S)-3-(3-氰基苯基)-4-(4-乙氧基苯基)丁-2-基)-2-甲基-2-(5-甲基吡啶-2-基氧基)丙酰胺、8-氯-1-(2,4-二氯苯基)-1,4,5,6-四氢-N-1-哌啶基苯并[6,7]环庚[1,2-c]吡唑-3-甲酰胺、5-(4-溴苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-乙基-N-(1-哌啶基)-1H-吡唑-3-甲酰胺、N-[(1S,2S)-3-(4-氯苯基)-2-(3-氰基苯基)-1-甲基丙基]-2-甲基-2-((5-(三氟甲基)吡啶-2-基)氧基)丙酰胺和5-(4-氯苯基)-3-[(E)-2-环己基乙烯基]-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-1H-吡唑。

3.如权利要求1和2中任一项所要求保护的用途，作为皮肤和/或黏膜的美白剂。

4.如权利要求1至3中任一项所要求保护的用途，作为减少皮肤和/或黏膜的色素沉着的药剂。

5.如前述权利要求中任一项所要求保护的用途，作为抑制黑色素生成的药剂。

6.如权利要求1和2中任一项所定义的CB1受体拮抗剂，其用于治疗色素沉着过度症，所述色素沉着过度症选自黑斑病、褐黄斑、小痣、衰老性着色斑、雀斑、擦伤和/或烧伤和/或瘢痕和/或皮炎和/或接触过敏导致的炎症后色素沉着过度；痣、遗传决定的色素沉着过度、代谢或药物相关来源的色素沉着过度、以及黑素瘤。

7.用于美白皮肤和/或黏膜的非治疗性化妆方法，包括将包含在生理学上可接受介质中的如权利要求1和2中任一项所定义的CB1受体拮抗剂的组合物局部应用到皮肤和/或黏膜上，或口服施用。

8.如权利要求7中所要求保护的方法，其特征在于所述CB1受体拮抗剂以相对于所述组合物总重量的0.00001重量%至10重量%的浓度存在。

9.选择角蛋白材料的美白和/或抗褐变剂的方法，包括：

a）预先选择CB1受体拮抗剂的步骤，

b）当与所述拮抗剂接触的黑色素细胞所产生的黑色素的量显著小于或等于没有与这种CB1受体拮抗剂接触的黑色素细胞所产生黑色素的量时，最终选择作为美白和/或抗褐变剂的CB1受体拮抗剂的步骤。

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