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CN103667338B - 一种玉米基因组定点改造方法 - Google Patents

一种玉米基因组定点改造方法 Download PDF

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高彩霞
梁振
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Abstract

本发明公开了一种玉米基因组定点改造方法。本发明的方法包含以下步骤：使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过玉米细胞的自身DNA修复功能，最终实现玉米目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失。实验证明，本发明方法能够成功地对玉米进行基因突变。

Description

一种玉米基因组定点改造方法
技术领域
本发明涉及一种玉米基因组定点改造方法。
背景技术
玉米是世界上最重要且广泛种植的农作物之一，对玉米基因组的改造有利于玉米基因组的研究，对提高产量，增强其对病虫害的抗性和农业发展有重要意义。目前，玉米突变体的创制和染色体改造主要是通过EMS诱变，物理诱变，转座子插入和染色体工程来获得，但这些方法费时费力，盲目性较大。当前的植物基因组工程（Genomeengineering）技术中，主要通过锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）来做基因改造，但是这些技术操作过程复杂，成本高，技术难度较大，因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的玉米基因改造新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米基因组定点改造方法。
本发明提供的一种实现玉米目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在玉米中对目的基因进行改造的，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶；该方法包含以下步骤：使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过玉米细胞的自身DNA修复功能，最终实现玉米目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失；
所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-Nx-NGG-3’，NGG中N表示A、G、C和T中的任一种，Nx中N表示A、G、C和T中的任意种，x=20；
所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。
上述方法中，所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-NX-NGG-3’中NX片段互补结合的RNA片段。
上述任一所述的方法中，所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQIDNo.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示DNA转录出来的RNA。
上述任一所述的方法中，所述使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向玉米组织中直接转入所述向导RNA和带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。
上述任一所述的方法中，所述使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向玉米组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在玉米组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因在玉米组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。
上述任一所述的方法中，所述向导RNA的表达盒由U3启动子和所述向导RNA的编码基因组成；所述向导RNA的编码基因由所述能够与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成。
上述任一所述的方法中，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因中，所述Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示；
所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列具体如SEQIDNo.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示；
所述玉米组织具体为玉米原生质体。
一种用于实现玉米目的基因的靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造试剂盒也属于本发明的保护范围，包括如下（1）和（2）：
（1）SEQIDNo.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因、或SEQIDNo.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因、含有SEQIDNo.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体、或含有SEQIDNo.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体；
（2）含有如下DNA片段的重组克隆载体：依次由U3启动子、两个BbsI酶切位点和骨架RNA片段的编码DNA依次连接而成；
所述骨架RNA片段的编码DNA的核苷酸序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示。
上述试剂盒中，所述（2）中所述DNA片段如SEQIDNo.3中自5’末端起第1位至第876位核苷酸所示。
本发明的方法能够成功地对玉米进行定点改造。
附图说明
图1为gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的target-sgRNA-1定点突变结果。
图2为gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的target-sgRNA-2定点突变结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表达载体pJIT163在文献“Guerineau,F.,Lucy,A.&Mullineaux,P.Effectoftwoconsensussequencesprecedingthetranslationinitiatorcodonongeneexpressioninplantprotoplasts.PlantMolecularBiology18,815-818（1992）”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
pEasy-Blunt载体购自北京全式金生物技术有限公司。
玉米品种HiII在文献“Armstrong,C.L.,Green,C.E.&Phillips,R.L.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhightypeIIcultureformationresponse.MaizeGenet.Coop.NewsLett.65,92–93(1991)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
玉米原生质体制备和转化所用溶液如表1-表5所示。
表150ml酶解液
表2500mlW5
表3250mlWI
表410mlMMG溶液
表54mlPEG4000溶液
上述表1-表5中的%表示质量体积百分含量，g/100ml。
实施例1、载体的构建
一、Cas9核酸酶重组表达载体的构建
对酿脓链球菌Cas9（SpCas9，S.pyogenesCas9）基因进行密码子优化，并在基因编码序列的两端添加核定位信号（NLS）和BamHⅠ/MfeⅠ限制性内切酶位点，使优化后的Cas9可更好地在玉米中表达和定位。
两端添加NLS和限制性内切酶酶切位点且密码子优化后的Cas9基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。SEQIDNo.1中，自5’末端起第1位至第6位为BamHⅠ酶切识别位点，第4213位至第4218位为MfeⅠ酶切识别位点，第10位至第36位为Cas9蛋白N端NLS序列，第4162位至第4209位为Cas9蛋白C端NLS序列，第37位至第4161位为Cas9蛋白的编码基因。SEQIDNo.1中自5’末端起第7位至第4212位核苷酸编码的蛋白如SEQIDNo.2所示，此蛋白即为带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。
BamHⅠ和MfeⅠ双酶切SEQIDNo.1所示的DNA分子，得到基因片段；BamHⅠ和MfeⅠ双酶切表达载体pJIT163，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒（即Cas9表达载体），将其命名为pJIT163-2NLSCas9。将pJIT163-2NLSCas9送测序，结果正确。
二、带有玉米U3启动子和玉米gRNA骨架编码序列的载体pU3-gRNA的构建
（一）人工合成带有玉米U3启动子和玉米gRNA骨架编码序列的U3-gRNA片段，该片段如SEQIDNo.3所示。
SEQIDNo.3中自5’末端起第1位至第764位核苷酸所示的序列为U3启动子的编码序列，第787位至第870位核苷酸为玉米gRNA的骨架编码序列；在玉米U3启动子和玉米gRNA骨架编码序列间含有两个BbsI酶切位点，待突变靶序列的识别序列可插入这两个酶切位点之间。
（二）合成如下引物：
F:5’-GAATTCCATCTAAGTATCTTGGT-3’；（SEQIDNo.4）
R:5’-GGTACCAAAAAAAGCACCGACTCGG-3’。（SEQIDNo.5）
以U3-gRNA片段为模板，F和R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该产物的序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第1位至第876位核苷酸所示。
PCR体系（50ul）：5×FastpfuBuffer10μl，1μldNTPs（10mM），2μlF（10μM），2μlR（10μM），0.5μl合成的U3-gRNA（100ng/μl），1μlFastpfuDNA聚合酶（2.5U/μl），水33.5μl。
PCR程序：95℃，2min；95℃20s，56℃20s，72℃15s，35循环；72℃，5min。
（三）将PCR扩增产物连接pEasy-Blunt载体，得到重组质粒，将其命名为pU3-gRNA，将pU3-gRNA送测序，结果正确。
实施例2、gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的定点突变
一、靶标片段如下：
target-sgRNA-1：5’-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’；（SEQIDNo.6）
（GenbankNo.AY172635的ZmIPK基因自5’末端起第338位至第360位核苷酸）
target-sgRNA-2：5’-CCAGGGATCCGTCTCCTTCTCCC-3’。（SEQIDNo.7）
（GenbankNo.AY172635的ZmIPK基因自5’末端起第675位至第697位核苷酸）
（下划线部分表示PAM序列，PAM为原型间隔序列毗邻基序）
二、含有sgRNA-1,sgRNA-2核苷酸片段的pU3-gRNA质粒的制备
sgRNA-1,sgRNA-2是分别能与靶标target-sgRNA-1，target-sgRNA-2互补结合的RNA的编码DNA。
（一）设计并合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物：
sgRNA-1F:5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’；（SEQIDNo.8）
sgRNA-1R:5’-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’。（SEQIDNo.9）
sgRNA-2F:5’-AGCAGGGAGAAGGAGACGGATCCC-3’；（SEQIDNo.10）
sgRNA-2R:5’-AAACGGGATCCGTCTCCTTCTCCC-3’。（SEQIDNo.11）
（二）将sgRNA-1F和sgRNA-1R、sgRNA-2F和sgRNA-2R分别进行退火形成有粘性末端的双链DNAsgRNA-1和sgRNA-2,分别将其插入到pU3-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有sgRNA-1和sgRNA-2的pU3-gRNA重组质粒,将其命名为pU3-gRNA-sgRNA-1和pU3-gRNA-sgRNA-2，将pU3-gRNA-sgRNA-1和pU3-gRNA-sgRNA-2送测序，结果正确。
三、转化gRNA：Cas9系统至玉米原生质体
将pJIT163-2NLSCas9和pU3-gRNA-sgRNA-1或pU3-gRNA-sgRNA-2质粒转化至玉米HiII原生质体，具体过程如下：
(一)玉米苗的培养
将玉米种子在水中浸泡过夜，将浸泡后的种子转移到放有吸水纸的培养皿中加水，光照处理3天，使其发芽（大约1cm）。土壤种植发芽的玉米种子，24℃，10-11天暗培养，得到玉米苗。
（二）原生质体分离
1、取玉米苗幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成宽度0.5-1mm的丝，将其放入50ml酶解液中消化5小时（先抽真空酶解0.5h，再10rpm缓慢摇晃4.5h），得酶解产物。
注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
2、加30mlW5稀释酶解产物，用75um尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中（50ml）。
注：尼龙滤膜要浸泡在体积百分含量为75%的酒精水溶液里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min再用于过滤。
3、将管中的溶液23℃，150g离心3min，弃上清，得原生质体。
4、加10mlW5重悬原生质体，150g离心3分钟，弃上清。
5、加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。
注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检（×100），原生质体数为2×105个/ml-1×106个/ml。
（三）玉米原生质体转化
1、加10ugpJIT163-2NLSCas9和10ugpU3-gRNA-sgRNA-1，或，10ugpJIT163-2NLSCas9和10ugpU3-gRNA-sgRNA-2质粒于2ml离心管，用枪头吸取200ul步骤（二）制备的原生质体轻弹混匀，静置3-5min，再加220ulPEG4000溶液，轻弹混匀，避光诱导转化15min。
2、加880ulW5（室温）颠倒混匀，100g离心3min，弃上清，得沉淀。
3、向沉淀中加1mlWI，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中（每个孔中已预先加入1mlWI），23℃培养过夜。
（四）PCR/RE实验分析gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的突变结果
在玉米原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以其为模板，进行PCR/RE（PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion）实验分析。PCR/RE分析方法参考文献“Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant,6(4):1365-1368,(2013)”。
PCR扩增引物如下：
ZmIPK-1F:5’-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3’；（SEQIDNo.12）
ZmIPK-1R:5’-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3’；（SEQIDNo.13）
ZmIPK-2F:5’-GCTTGTGCTCCAGGAGTTCGTC-3’；（SEQIDNo.14）
ZmIPK-2R:5’-CAGTCTCGTATCCTGGCATCTTGG-3’。（SEQIDNo.15）
ZmIPK-1F和ZmIPK-1R用于扩增含有target-sgRNA-1的片段，ZmIPK-2F和ZmIPK-2R用于扩增含有target-sgRNA-2的片段。
PCR/RE实验结果如图1和图2所示。
图1为gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的target-sgRNA-1定点突变结果。图1a中，泳道1和2为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体含有target-sgRNA-1的PCR产物经内切酶SacI酶切结果，泳道3为野生的原生质体含有target-sgRNA-1的PCR产物经内切酶SacI酶切结果，泳道4为野生型的原生质体PCR产物。
回收图1a中泳道1和2中不被SacI切开的条带（即星号标记的条带）进行测序，含有target-sgRNA-1的条带的测序结果如图1b所示。
图1b中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。M1-M12分别是target-sgRNA-1靶标片段的12种突变。
图2为gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的target-sgRNA-2定点突变结果。
图2a中，泳道1和2为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体含有target-sgRNA-2的PCR产物经内切酶BamHI酶切结果，泳道3为野生的原生质体含有target-sgRNA-2的PCR产物经内切酶BamHI酶切结果，泳道4为野生型的原生质体PCR产物。
回收图2a中泳道1和2中不被BamHI切开的条带（即星号标记的条带）进行测序，含有target-sgRNA-2的条带的测序结果如图2b所示。
图2中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。M1-M8分别是target-sgRNA-2靶标片段的8种突变。
图1a与2a结果表明，在ZmIPK基因的两个靶位点target-sgRNA-1、target-sgRNA-2都发生了碱基插入/删除（insertion/deletion，indel）类型的突变，根据条带强度用软件计算的突变效率分别为在16.4%和19.1%。

Claims (4)

1.一种实现玉米目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在玉米中对目的基因进行改造的，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶；该方法包含以下步骤：使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过玉米细胞的自身DNA修复功能，最终实现玉米目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失；
所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-Nx-NGG-3’，NGG中N表示A、G、C和T中的任一种，Nx中N表示A、G、C和T中的任一种，x＝20；
所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA，所述骨架RNA片段与Cas9核酸酶结合；
所述使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向玉米组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在玉米组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因在玉米组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶；
所述向导RNA的表达盒由U3启动子和所述向导RNA的编码基因组成；所述向导RNA的编码基因由所述能够与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成；
所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示；
所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQIDNo.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示DNA转录出来的RNA；
所述U3启动子的编码序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第1-764位核苷酸所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-NX-NGG-3’中NX片段互补结合的RNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因中，所述Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示；
所述玉米组织具体为玉米原生质体。
4.一种用于实现玉米目的基因的靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造试剂盒，包括如下(1)和(2)：
(1)SEQIDNo.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因、或SEQIDNo.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因、含有SEQIDNo.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体、或含有SEQIDNo.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体；
(2)含有如下DNA片段的重组克隆载体：依次由U3启动子、两个BbsI酶切位点和骨架RNA片段的编码DNA依次连接而成；
所述骨架RNA片段的编码DNA的核苷酸序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示；
所述(2)中所述DNA片段如SEQIDNo.3中自5’末端起第1位至第876位核苷酸所示。
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